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細胞生物学
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ケトン食は複数の臓器でp53依存性細胞老化を誘発する

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado1463

sung -jen wei https://orcid.org/0000-0001-6880-6850、joseph r. schell https://orcid.org/0000-0001-8264-566x、[...]、david gius https://orcid.org/0000-0001-9647-3571+18人の著者情報と所属。
科学の進歩
2024年5月17日
第10巻、第20号
DOI: 10.1126/sciadv.ado1463
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抽象的な導入
導入結果
結果
議論
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献と注記
抽象的な
ケトジェニックダイエット（kd）は、ケトン体の生成につながる高脂肪、低炭水化物の食事です、kdは、特定の健康状態を改善し、減量に人気がありますが、有害な影響も報告されていますここでは、2つの異なるkdのマウスを示し、異なる年齢で、心臓や腎臓を含む複数の臓器で細胞老化を誘導します。 2によるマウスダブルミニッツ2（MDM2）の不活性化を介して媒介され、p53の蓄積とp21の誘導を引き起こしますが、これは、p53およびカスパーゼ2ノックアウトマウスと、AMPK、p21、およびカスパーゼ2 に対する阻害剤を使用して確立されましたが、さらに、老化に関連する分泌表現型バイオマーカーは、KD 受けているマウスの血清およびkdの臨床試験の患者からの血漿サンプルで上昇しました、細胞老化は老化細胞薬剤破壊によって除去され、間欠的なkdによって防止されました、これらの重要な臨床的意味を持ち、kdの効果は、ある、個別の最適化がある可能性が高いことを示唆しています。
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導入
高脂肪・低炭水化物（ケトジェニック）食は、減量とその他の健康状態の両方のために、過去数十年にわたってますます人気が高まっている(1)。ケトジェニックダイエット（KD）では、炭水化物の摂取を最小限に抑えることで、肝臓でケトン体が産生され(2, 3)、それが代替エネルギー源として利用される(1)。KDは難治性てんかんの治療に有効であることが示されており(4)、がん(5)や神経変性疾患(6, 7)にも有益な効果をもたらす可能性がある。さらに、マウスモデルを用いた複数のKD研究により、抗炎症作用（8、9）、中年期の長寿（10、11）、神経（12、13）、代謝（14）、肥満（12）の表現型の改善が示されている。逆に、低炭水化物食はマウスにおいて炎症促進作用があり（15、16）、心線維症（17、18）や腎障害（19）のリスクを高めるという証拠もある。このような多様な結果をもたらすメカニズムや、どのような個体に副作用のリスクがあるのか、あるいは何らかの介入によってこれらのリスクを軽減できるのかについては、十分な情報が得られていない。
KDの特異的な変数と食事介入を受ける個人の変数との組み合わせが、有益な効果または有害な効果の決定にすべて寄与していることを示唆するのは妥当であると思われる。重要な変数には、個人の年齢、食事療法の期間および特定の組成が含まれる。複数の研究から、食事介入を開始する年齢が重要である可能性が示唆されている。例えば、12ヵ月齢のマウスにKDを実施したところ、中年期の死亡率が減少し、記憶力の改善(10, 11)と骨格筋の維持(20)がみられたが、対照的に、3週齢でKDを開始したマウスでは発育障害がみられた(21)。長期間のKDによる副作用の可能性も報告されている(1, 17, 22, 23)。特に、難治性てんかんの小児では、KDの使用は明らかに有益であるが(4, 24, 25)、KDを6年以上継続すると、腎結石、骨折、成長障害などのリスクが高まることがわかった(24, 26)。
ここで我々は、2つの異なるKDにおいて、マウスが多臓器の正常組織に老化細胞を蓄積することを示した。この2つの異なるKD、すなわちクリスクとココアバターをベースにしたKDを選んだのは、この2つの食餌は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比率が大きく異なるからである。KDによる細胞老化は年齢に依存せず、6週齢、16週齢、24週齢、52週齢から21日間のKDを行ったマウスで観察された。KDを受けたマウスは、リン酸化アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼα（pAMPKα）を介したp53の上昇と、カスパーゼ-2切断によるマウスダブルミニッツ2（MDM2）の不活性化を示し、p21の誘導と細胞老化をもたらした。老化に関連した分泌表現型（SASP）のマーカーは、21日間のKD後のマウス血清と、我々の研究機関［University of Texas Health Science Center at San Antonio (UTHSCSA)］で6ヵ月間のKD臨床試験を受けたヒト血漿で増加した。最後に、細胞老化は間欠的KD（IKD）レジメンの投与によって阻止された。細胞老化は臓器疾患の病態に関与していることから、この結果はKDの使用を理解する上で臨床的に重要な意味を持つ。
結果
2種類のKDが細胞老化を誘導する
35～42日齢（または約6週齢）で体重15g以上のC57BL/6雄性マウスを、対照食（脂肪から17％、タンパク質から25％、炭水化物から58％のカロリー）またはKD（脂肪から90.5％、タンパク質から9.2％、炭水化物から0.3％のカロリー）（表1）に無作為に割り付け、自由摂取させた後、7日後または21日後に安楽死させた。このKDの主な脂肪源は水素添加植物性ショートニング（Crisco）で、不飽和脂肪酸が約84%、飽和脂肪酸が14%であった。いずれの飼料もTeklad社製で、特に指定がある場合を除き、本研究のすべての実験に使用した。コントロールとKDのカロリー消費量は同じであったが（図1A）、21日後にKDのマウスで体重のわずかな増加が観察された（図S1A）。また、KDを受けたマウスがケトーシス状態にあることも確認した（図1B）。

図1. 2種類のKDは細胞老化を誘導する。
(AおよびB）コントロール（CTRL）またはCriscoベースのKDを受けたマウスにおけるキロカロリー消費量（A）および血清ケトンレベル（B）（各群n = 5マウス）。データは平均値±SEMで表した。P値は二元配置分散分析（ANOVA）により算出した。(CおよびD）コントロールまたは7日および21日のCriscoベースのKDにおける心臓（C）および腎臓（D）組織の老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）レベルを示すイムノブロット（n＝6マウス／群）。(EおよびF)対照食と21日間ココアバターKDの心臓(E)および腎臓(F)組織におけるSA-β-galを示すイムノブロット(n = マウス6匹/群)。(GおよびH)対照食対21日間Crisco-based KDの心臓(G)および腎臓(H)組織におけるSA-β-gal、ヒストンタンパク質macroH2A.1(H2AY)、およびヒストン3リジン9トリメチル化(H3K9me3)の免疫組織化学(IHC)染色(n = 4匹/群)。スケールバー、100μm。測定はすべて異なる生物学的サンプルについて行った。代表的なブロットと画像を示す。
食事 Inotiv Teklad Research Diets Inc.
コントロール ケトジェニック コントロール ケトジェニック
炭水化物 58% 0.3% 80% 0
タンパク質 25% 9.2% 10% 10
脂肪 17% 90.5% 10% 90
kcal/gram 3.1 6.7 3.8 6.7
表1. TekladとResearch Diets Inc.の食事組成。
脂肪からのカロリーの割合は両KDともほぼ同じであったが、脂質組成はかなり異なっていた。テクラッド・クリスコをベースとしたKDの脂肪酸組成は飽和14％、不飽和84％で、パルミチン酸（C16:0）10％、ステアリン酸（C18:0）4％、オレイン酸（C18:1）23％、リノール酸（C18:2）51％、α-リノール酸（C18:3）7～10％であった。対照的に、Research Diets Inc.のココアバターベースのKDは、飽和脂肪酸60％、不飽和脂肪酸40％で、ミリスチン酸（C14:0）0～4％、パルミチン酸（C16:0）25～34％、ステアリン酸（C18:0）34～40％、アラキジン酸（C20:0）1％、パルミトレイン酸（C16:1）0～4％、オレイン酸（C18:1）26～35％、リノール酸（C18:2）2～3％であった。
細胞老化は心臓や腎臓を含む臓器疾患に関与していることから（27-29）、広く用いられているバイオマーカーである老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）のアッセイを行ったところ、コントロールと比較して、心臓（図1C）、腎臓（図1D）、肝臓（図S1B）、脳（図S1C）のいずれにおいても、7日間および21日間のKD後に有意な増加が認められた。細胞老化の明らかな増加がKDによるものであり、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の割合を含む特定の食餌組成によるものではないことを確認するために、Research Diets Inc.のココアバター・ベースのKD（脂肪90％、タンパク質10％、炭水化物0％）をマウスに与えた。この実験のために、コントロールマウスには同じくResearch Diets Inc.のタンパク質適合食（脂肪から10％、タンパク質から10％、炭水化物から80％のカロリー）を与えた（表1）。対照群もKD群も自由摂食であったが、21日間にわたって両群間に体重の差は認められなかった（図S1D）。血清ケトンレベルもこのKDで有意に上昇し（図S1E）、心臓（図1E）、腎臓（図1F）、肝臓（図S1F、左）、脳（図S1F、右）でSA-β-galの上昇が見られた。
21日間のKDにおけるSA-β-galの増加は、抗SA-β-gal抗体による免疫組織化学（IHC）染色によって心臓および腎臓組織で確認された（図1、GおよびH）。さらに、細胞老化の2つのバイオマーカー（30, 31）、ヒストンタンパク質macroH2A.1（H2AY）とヒストン3リジン9トリメチル化（H3K9me3）も試験した。これらの実験では、21日間のKD後、H2AYとH3K9me3の増加がIHC（図1、GとH、より高倍率は図S1G）により、またH2AYのイムノブロット（図S1、HとI）により、コントロールと比較して示された。病理学的解析によると、心臓では細胞の15～20％、腎臓では細胞の10～15％がSA-β-gal陽性に染色され、これは急性心筋梗塞（32）、ブレオマイシン誘発肺細胞障害（33）、電離放射線（34）のマウスモデルで報告されているのと同様であった。
グルコース負荷試験およびインスリン負荷試験（それぞれGTTおよびITT）では、21日間のKD後、対照と比較してグルコース取り込みの欠損が認められたが（図S2A）、インスリン感受性には有意な変化は認められなかった（図S2B）。これは、KDは数週間後に耐糖能を低下させるが、インスリン感受性は一般にKD後数ヵ月までは影響を受けないという他の報告（35）と同様である。最後に、IDEXX BioAnalyticsによる血清分析では、遊離脂肪酸、トリグリセリド、低比重リポ蛋白、高比重リポ蛋白のすべてが、21日間KDを行ったマウスでは対照食を行ったマウスに比べて上昇した（図S2C）。
KDはp53を活性化しp21を誘導する
p53転写因子は、成長停止、DNA修復、アポトーシス、細胞老化など、様々な細胞ストレス応答において中心的な役割を果たしている(37)。最初の知見をさらに発展させるため、心臓（図2A）、腎臓（図2B）、肝臓（図S2D）、脳（図S2E）のタンパク質抽出物を抗p53抗体でプローブした。コントロールと比較して、7日間および21日間のKD後、すべての組織でp53の有意な増加が認められた。セリン-18でリン酸化されたp53も同様に増加した（図2、AおよびB、図S2、DおよびE）。これはヒトのリン酸化p53Ser15と類似しており、グルコース欠乏（40）のような細胞ストレスに応答してp53の転写活性を増加させる、確立された翻訳後修飾である（38、39）。KDがp53の転写を増加させ(10)、アセチル化(10,11)させることは以前にも報告されているが、今回の結果はそれらをさらに拡大し、p53タンパク質とリン酸化レベルの増加も示している。

図2. A KDはp53を活性化し、p21を誘導する。
(AおよびB）コントロール、7日間KD、21日間KD後の心臓（A）および腎臓（B）組織におけるp53、リン酸化p53Ser18（pp53Ser18）、p21、p16レベルを示すイムノブロット（各群n = 6マウス）。(CおよびD）コントロール対21日間KD後の心臓（C）および腎臓（D）組織におけるp53およびp21のIHC染色（各群n = 4マウス）。スケールバー、100μm。(E）対照食、7日間KD、および21日間KDのマウスの腎臓組織におけるp53、p21、およびp16 mRNAの逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）定量化（各群n＝3マウス）。P値は、両側Studentの不対t検定により算出した。(F)腎臓溶解液をビオチン標識した4タンデム反復p53 DNA結合配列（p21プロモーター由来）と混合し、ストレプトアビジンアガロースビーズを用いて回収し、p53抗体で免疫ブロットした（各群n = 3マウス）。GおよびH）クロマチン免疫沈降（ChIP）-qPCR解析は、コントロールおよび31日間KDマウスから単離した心臓（G）（各群n = 3マウス）および腎臓（H）（各群n = 5マウス）のp21プロモーター領域内の2つの既知のp53結合部位におけるp53およびphospho-p53Ser18の結合を示した。P値は、両側Studentの不対t検定により算出した。(I) RNA配列決定（RNA-seq）のために、対照食および21日間KDを行ったマウス（各群n = 3匹）から、心臓、腎臓、肝臓組織から全RNAを単離した。得られた数百の発現差遺伝子のリストは、QIAGEN ingenuity pathway analysis (IPA)ソフトウェアで処理し、活性化された上流制御因子を同定した。代表的なブロットと画像を示す。PPARα、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α。
次に、p16とp21を調べた。p16とp21もまた、細胞老化に関与することが示されている。21日間のKD後、心臓（図2A）、腎臓（図2B）、肝臓（図S2D）、脳（図S2E）で、p16ではなくp21の有意な発現上昇が観察された。また、心臓（図2C）および腎臓（図2D）において、IHCによりp53およびp21の両タンパク質レベルの上昇を確認した。IHC染色から測定したp21陽性核を持つ細胞数は、心臓で〜20％、腎臓で15〜20％であり、SA-β-galと同様であった。 最後に、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）を用いて、21日間KD後の腎臓における遺伝子発現の変化を測定したところ、観察されたタンパク質レベルの変化とほぼ一致していた（図2E）。
また、組織抽出液とp21プロモーターに由来するビオチン標識された4タンデム反復p53 DNA結合配列とを混合し、抗p53抗体で免疫ブロッティングすることにより、p53とp53 DNA結合配列との間の物理的相互作用を検証した（図2Fおよび図S2F）。これらの結果は、心臓（図2G）と腎臓（図2H）から単離した初代細胞で、p21プロモーターの2つの既知の結合部位に対するp53とリン酸化p53のクロマチン免疫沈降（ChIP）結合アッセイを用いて、in vivoでさらに検証された。これらの実験すべてにおいて、KD後にp53の相互作用が増加することが確認され、KDによりp21を介してp53が細胞老化を誘導することを示唆する追加データが得られた。
21日間のKD後のシグナル伝達と転写のさらなる変化を同定するために、心臓、腎臓、肝臓組織についてRNA配列決定（RNA-seq）を行い、数百の発現差のある遺伝子を同定した。QIAGEN ingenuity pathway analysis（IPA）ソフトウェアを用いてこれらを解析し、濃縮されたパスウェイと上流制御因子を同定した。その結果、p21、p53、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αが、コントロールと比較して下流標的の発現が増加することで示されるように、KD上で活性化された上流制御因子であることが示された（図2I）。
我々はまた、我々のRNA-seqデータを、細胞老化に関与する89のp53制御遺伝子の確立されたリスト(41)と比較したところ、3つの組織すべてで有意な濃縮が見られた（Fisherの正確検定によるP < 0.0001）（図S3、AからE）。IPA解析でも、ヒートマップで示されるように、細胞老化に関連する遺伝子の濃縮が示された（図S4、A〜C）。具体的には、サイクリンA2、有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、フォークヘッドボックスタンパク質M1、およびラミンB1がすべて減少し、一方でセルピン1（PAI-1）が増加していた（図S4、DからF）。最後に、IPA解析により、観察された代謝と細胞老化の変化に潜在的に寄与する複数の経路が同定された（図S4G）。
KDによる細胞老化はp53とp21に依存する
以上の結果から、持続的なKDがp53を介してp21を活性化し、最終的に多臓器で細胞老化を引き起こす経路が明らかになった。KDによる細胞老化のこの経路への依存性を調べるため、まずp53を21日間のKD後にp53ノックアウト（KO）マウス（Trp53tm1Tyj）(44)でp21とSA-β-galを測定して調べた。コントロールマウスや野生型（WT）マウスとは対照的に、KD後のp53ノックアウトマウスではp21もSA-β-galも上昇しなかった（図3、AおよびB、ならびに図S5、AおよびB）。同様に、21日間のKDは、IHCで示されるように、WTマウスではp53、p21、SA-β-galを誘導したが（図3C）、p53 KOマウスではこれらのタンパク質の上昇はほとんど見られなかった（図3D）。H2AYおよびH3K9me3のIHC染色は、対照食を与えたp53 KOマウスと比較したKDマウス（図S5、CおよびD）、あるいは対照食またはKDを与えたWTマウスと比較したKDマウス（図1、GおよびH）では観察されなかった。最後に、RT-qPCRを用いて、21日間のKD後のp53 KOマウスとWTマウスの心臓組織（図3E）と腎臓組織（図3F）におけるp21とglb1（SA-β-gal）の発現をさらに検証した。

図3. KDによる細胞老化はp53とp21に依存する。
(AおよびB）コントロール［野生型（WT）］またはホモ接合性p53ノックアウト（p53 KO）マウスのコントロールまたは21日間KD後の心臓（A）および腎臓（B）組織からのイムノブロット（各群n = 6マウス）。(CおよびD）コントロールまたは21日間KDを行ったWTマウス（C）およびp53 KOマウス（D）の腎組織におけるp53、p21およびSA-β-galレベルのIHC染色（各群n＝4マウス）。スケールバー、100μm。(EおよびF）コントロール対21日間KDのWTおよびp53 KOマウスの心臓（E）および腎臓（F）組織におけるp21およびglb1のmRNAレベル（各群n = 4マウス）。P値は、両側Studentの対にならないt検定により算出した。(GおよびH) p21を化学的に阻害するUC2288を15 mg/kgまたはビヒクルを1日おきに経口投与したコントロールまたは21日間KDを行ったマウスの心臓(G)および腎臓(H)組織のイムノブロット(n = 6匹/群)。代表的なブロットと画像を示す。
次に、p21 mRNAをp53とは独立して減少させるp21阻害剤UC2288を用いて、KDによる細胞老化のp21の増加への依存性を調べた(45)。21日間のKDの1日目から、UC2288を15mg/kgの用量で1日おきに経口投与した。KDでビヒクルのみを投与したマウスと比較して、UC2288を投与したマウスは、対照食マウスと同様にp21およびSA-β-galのレベルが有意に低かった（図3、GおよびH、図S5E）。これらのデータから、KDによる細胞老化は、p21のp53アップレギュレーションを介して起こることが示された。
KDはMDM2の切断を通してp53を活性化する
KDによるp53活性化の根底にある機序をさらに調べるため、核に局在するE3ユビキチンリガーゼ、MDM2を調べた。MDM2はp53の核外排出、切断、分解を促進する(46, 47)。KDを受けたマウスは、コントロールマウスと比較して、切断されたMDM2が有意に増加し、全長が減少した（図4、A、B、および図S5、FからI）。これらのデータは、MDM2の不活性化が、KDで観察されたp53の安定化と増加に寄与している可能性を示唆している。MDM2は、p53誘導死ドメインタンパク質1（PIDD1）、受容体相互作用タンパク質関連インターロイキン-1β変換酵素ホモログ1/線虫細胞死タンパク質3（ICH-1/CED-3）相同死ドメインタンパク質（RAIDD）、プロカスパーゼ-2（活性型カスパーゼ-2に切断される）からなるPIDDosome（48）として知られる複合体によって切断され、不活性化される（49）。コントロールと比較して、7日間または21日間のKDを受けたマウスは、PIDD1、RAIDD、および切断（活性）カスパーゼ-2の上昇を示した（図4、A、B、および図S5F）。

図4. A KDはMDM2の切断を通してp53を活性化する。
(AおよびB）対照食、7日間KD、および21日間KDを受けたマウスの心臓（A）および腎臓（B）におけるRAIDD、PIDD1、切断型カスパーゼ-2、および切断型MDM2レベルを示すイムノブロット（n＝各群6匹）。(CおよびD）コントロールまたは31日間KDを行ったマウスの心臓（C）および腎臓（D）組織のイムノブロット分析。この間、KDを行ったマウスには、選択的カスパーゼ阻害剤Z-VDVAD-FMK（Casp Inh）10mg/kgまたはビヒクルのいずれかを腹腔内注射で1日おきに投与した（n＝各群6匹）。(EおよびF）21日間のKDにおける心臓（E）および腎臓（F）溶解液中のカスパーゼ-2活性。P値は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Dunnettの多重比較検定により算出した。(GおよびH）対照食または21日間KDを受けたWT Casp2マウスおよびホモ接合型Casp2 KOマウスの心臓（G）または腎臓（H）における切断MDM2、p53、p21、およびSA-β-galを示すイムノブロット（各群n = 5マウス）。代表的なブロットを示す。
ベンジルオキシカルボニル-Val-Asp(OMe)-Val-Ala-Asp(OMe)-フルオロメチルケトン（Z-VDVAD-FMK）は選択的カスパーゼ阻害剤であり、カスパーゼ-2、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7を特異的に標的とする(50-52)。マウスにZ-VDVAD-FMK（10mg/kg）を31日間のKDの1日目に腹腔内注射し、その後2日おきに投与した。カスパーゼ阻害剤を投与されたマウスは、KD中にビヒクルのみを投与されたマウスと比較して、切断されたMDM2およびp53による細胞老化のマーカーのレベルが大幅に減少した（図4、CおよびD）。期待されたカスパーゼ-2活性の低下は、心臓（図4E）と腎臓（図4F）の組織溶解物を用いたin vitro活性アッセイで確認された。カスパーゼ-3またはカスパーゼ-7への未検出の依存性を除外するために、心臓と腎臓の溶解液を、切断されたカスパーゼ-3、カスパーゼ-7、および下流の標的であるポリ（アデノシン5′-二リン酸-リボース）ポリメラーゼに対する抗体でプローブした（図S6、AおよびB）。このことから、カスパーゼ-3もカスパーゼ-7も7日間あるいは21日間のKDでは活性化されないことが確認された。最後に、カスパーゼ-2がKDによる細胞老化に必要であることをさらに確認するために、カスパーゼ-2 KOマウス（53）を21日間のKDにかけたところ、コントロールと比較して、切断されたMDM2、p53、p21、SA-β-galの増加は見られなかった（図4、GとH、および図S6C）。これらの結果は、KDがカスパーゼ-2切断によってMDM2を不活性化し、それによってp53シグナル伝達軸を介して細胞老化を誘導できるという証拠を示している。
KDはAMPKを介してp53を活性化する
AMPKはp53の活性化因子としても確立されているため（54-56）、21日間のKD後の総レベルとpAMPKαレベルを調べた。その結果、心臓（図5A）と腎臓（図5B）の両方で、AMPKαのスレオニン-172におけるリン酸化が対照群と比べて増加していることがわかったが、AMPKαの総量には差がなかった。AMPK活性阻害剤として定評のあるドルソモルフィン（5mg/kg）を毎日腹腔内注射して21日間のKD期間を通してAMPK活性をブロックすると（57）、p53Ser18のリン酸化だけでなく、p21およびSA-β-galの誘導も阻止された（図5、CおよびD）。これらの結果は、AMPK の活性化も KD で誘導される細胞老化に必要であることを示唆している。

図5. KD は AMPK を介して p53 を活性化する。
(AおよびB）対照食または21日間KDを受けたマウスの心臓（A）および腎臓（B）組織における総AMPKαおよびホスホAMPKα-Thr172（pAMPKαThr172）レベルを示すイムノブロット（各群n = 6マウス）。(CおよびD）21日間KDを行ったマウスに、AMPK活性化阻害剤であるドルソモルフィン（DM）を5mg/kgまたはビヒクルで毎日腹腔内注射した。免疫ブロットは、p53、pAMPKαThr172、およびSA-β-galレベルを示す（各群n = 6マウス）。(EおよびF）21日間KDしたマウスに、上記と同様にDMを投与し、免疫ブロットはPIDD1、RAIDD、および切断MDM2のレベルを示す（n＝6マウス／群）。代表的なブロットを示す。
AMPK活性に加えて、PIDDosome、特にカスパーゼ-2活性が、KDによって誘導されるp53の増加と細胞老化に必要であることが示された（図4）。p53はPidd1の発現を制御することも示されているため（58）、次に、AMPK特異的化学阻害剤であるドルソモルフィンを毎日腹腔内注射して21日間のKDを通してAMPK活性をブロックすることにより、AMPKリン酸化がPIDDosomeのアップレギュレーションに必要であるかどうかを調べた。これらのマウスは、KD期間中、無処置のマウスと比較して、PIDD1、RAIDD、または切断型MDM2の増加を示さなかった（図5、EおよびF）。これらの実験は、AMPKの活性化がPIDDosomeだけでなくp53の増加にも必要であることを示しており、以前に報告されたように（58）、Pidd1発現の増加によって促進される正のフィードバックループの可能性を示唆している。
KDはSASPマーカーを誘導する
老化細胞は、炎症性サイトカインを分泌することによって、隣接する細胞や組織微小環境に悪影響を及ぼす可能性がある(37)。我々のKDモデルでこれに対処するため、酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いてSASPのバイオマーカーを測定した(59, 60)が、具体的には腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-6、C-Cモチーフケモカインリガンド5（CCL5）である。これらのサイトカインは様々な細胞から産生され、多面的な作用を持つが、老化細胞から頻繁に産生され、炎症性であることが示されている(61)。いずれも21日間のKD後、マウス血清中で有意に増加した（図6A）。また、7日間および21日間のKD後に採取した心臓、腎臓、肝臓の組織サンプルにおいても、SASPバイオマーカーが同様に発現上昇していることがわかった（図S6、D～F）。

図6. KDはSASPのマーカーを誘導する。
(A）コントロールまたは21日間KDを行ったマウスでELISAにより測定したマウス血清TNFα、IL-1β、IL-6、およびCCL5（各群n = 3匹）。P値は、両側Studentの対にならないt検定により算出した。(BおよびC）臨床KD試験において、ベースライン時および3ヵ月後および6ヵ月後に、雄（B）（n＝5、ベースライン時の4匹を除く）および雌（C）（n＝11）患者から採取した血漿中で、ELISA法により測定したTNFα、IL-1βおよびIL-6。P値は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Dunnettの多重比較検定により算出した。
この試験では、年齢、性別、健康状態が異なる患者がKDに割り付けられ、試験開始時（ベースライン）と3ヵ月後、6ヵ月後に空腹時血液サンプルが採取された。この試験の患者は、ケトーシス状態にあることを確認するためにモニターされた(62)。男性患者（図6B）と女性患者（図6C）の両方において、6ヵ月間のKD後に得られたサンプルは、ベースラインと比較してTNFαとIL-1βの有意な増加を示した。IL-6についても同様の傾向がみられ、女性患者では6ヵ月間のKD後に有意な増加がみられた（図6C）。対照的に、これらの炎症性バイオマーカーは、KD3ヵ月後では変化がないか、わずかな増加しかみられなかった。これらのデータは、21日間KDを行ったマウスで観察されたのと同様に、長期間のKDが様々な年齢、性別、健康状態のヒトにおいてSASPを誘発する可能性があることを裏付けている。最後に、我々はNIH 3T3細胞培養モデルを用いて、KDでp53が誘導する細胞老化に関与するのは、ケトンレベルの増加ではなく、脂質またはリポ蛋白の増加である可能性を示唆した（図S8A）。
KDは年齢とは無関係に細胞老化を誘導する
いくつかの研究は、KDを受ける年齢がその効果を決定する役割を担っていることを示唆しており、発育中のKDが有害な効果を示すものもある(21, 24)。そこで我々は、KDによる細胞老化が高齢マウスでも観察されるかどうかを調べた。そのため、21日間のKDを開始した16週齢、24週齢、52週齢のマウスを試験した。すべてのマウスで、年齢に関係なく、KDを行った心臓と腎臓の両組織において、年齢をマッチさせたコントロールと比較して、p53、p21、SA-β-galが有意に増加し（図7、A～F）、6週齢で21日間のKDを開始したマウスと同程度であった。

図7. KDは異なる年齢のマウスにおいて細胞老化を誘導する。
(A to F) 6週齢（コントロール）、16週齢［(A)と(B)］、24週齢［(C)と(D)］、および52週齢［(E)と(F)］でコントロールまたはKDを21日間行ったマウスの心臓および腎臓組織におけるp53、p21、およびSA-β-galレベルのイムノブロット測定（各群n = 5マウス）。代表的なブロットを示す。
最後に、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比率が大きく異なる2つのKDが、ともにSA-β-galを誘導することを示した（図1、CからF）。また、21日間のココアバターによるKDでは、心臓、腎臓、肝臓、脳でp53、pp53Ser18、p21、切断MDM2、RAIDD、PIDD1が増加した（図S7、AからD）。これらのデータは、年齢や脂質組成とは無関係に、持続的なKDによって細胞老化が誘導される可能性があり、食餌タンパク質の減少によるアーチファクトではないことを支持している。
KDによって誘導される細胞老化は時間依存的で可逆的である
KDによる細胞老化の特徴をさらに明らかにするため、KD4、7、21日後にマウスを安楽死させ、p53、p21、およびSA-β-galを測定した。その結果、3つのタンパク質はすべて、KD4日後では7日後および21日後に比べて最小限の増加しか認めなかった（図8、AおよびB）。重要な疑問は、KDによって誘導された老化細胞は、食餌を止めた後に消去されるかどうかである。そこで、KDによって誘導された細胞の老化がどれくらいの期間持続するかを調べるために、マウスを7日間のKDを行い、すぐに（以前の実験と同様に）、あるいは1、2、3週間通常の対照食に戻した後に安楽死させた。その結果、7日間のKD後、通常のコントロール食に戻すと、p53、p21、SA-β-galレベルは1週間後に減少し、通常食で2～3週間後にはコントロールレベルに向かって減少し続けることが観察された（図8、CおよびD）。

図8. KDによる細胞老化を防ぐ時間経過と介入。
(AおよびB）対照食、4日間KD、7日間KDおよび21日間KDを受けたマウスの心臓（A）および腎臓（B）組織におけるp53、p21およびSA-β-gal免疫反応性タンパク質レベルを示すイムノブロット（各群n = 5マウス）。(CおよびD）7日間KDを行った後、0、7、14または21日間通常の対照食（ND）に切り替えたマウスのイムノブロットアッセイ（n＝各群5匹）。(EおよびF）コントロールまたは21日間KDを行った後、ABT-263を50mg/kgまたはビヒクルで7日間毎日経口投与したマウスの心臓（E）および腎臓（F）タンパク質のイムノブロット分析（n＝6匹/群）。(GおよびH）対照食、31日間KD、または4日間KDおよび7日間対照食の3サイクルからなるIKDを行ったマウスの心臓（G）および腎臓（H）組織のイムノブロット分析（各群n＝6マウス）。代表的なブロットを示す。
IKDは細胞老化を誘導しない
これらのデータは、老化細胞はKDを中止すると消去されることを示しており、私たちはKD中に老化細胞の消去を促進するか、あるいは蓄積を防止するための介入を試みることになった。Navitoclax（ABT-263）は、BCL-2やBCL-xLを含む複数の抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質に結合して阻害することにより、老化細胞を選択的に除去する幅広いスペクトルの老化細胞溶解薬である(63)。この細胞溶解剤がKD誘発老化細胞を除去するかどうかを調べるため、マウスにABT-263を1日50mg/kgまたはビヒクルのいずれかを21日間のKD終了直後から7日間経口投与した。これらのマウスからのタンパク質抽出物は、ABT-263投与が老化細胞のほとんどをうまく除去したことを示唆している。一方、p53、p21、SA-β-galの上昇は、21日間のKDを終えて通常の対照食に戻した後、7日間ビヒクルのみを投与したマウスでは依然として観察された（図8、EおよびF、ならびに図S8、BおよびC）。
最近のいくつかの研究で、さまざまなIKDプロトコールによる有益性が報告されている。一日交替KDは心不全モデルマウスで心機能を改善し（64）、一週間交替KDは雄マウスで中年期の死亡率、加齢に伴う記憶喪失、その他の健康問題を減少させた（10）。IKDによってp53の活性化と細胞老化が回避されるかどうかを評価するため、4日間のKDと7日間の標準食を交互に3サイクル（IKD）、31日間のKD（陽性対照）、または標準食（陰性対照）にマウスを置いた。持続的KDとは対照的に、IKDはp53や細胞老化を増加させず（図8、GおよびH、図S8、DおよびE）、IKDは組織中のSASPバイオマーカーを増加させなかった（図S8、FおよびG）。これらのデータは、IKDは持続的KDよりも副作用が少ない一方で、健康に関連するエンドポイントにプラスの影響を与える可能性があることを示唆しているため、重要な臨床応用の可能性がある(10, 64)。
考察
KDの効果は複雑であり、その使用による健康関連の転帰は複数の因子に依存する可能性が高いことがますます明らかになってきている(65)。相反する報告の中には、KDが炎症促進作用があるのか抗炎症作用があるのかをめぐるものもあるようである。複数の発表が、ケトジェネシスで産生される主要なケトンであるβ-ヒドロキシ酪酸（β-HB）が抗炎症性であるという証拠を示しており(14, 66)、これがKDの有益な効果にメカニズム的な役割を果たす可能性を示唆している(8, 10)。これとは対照的に、KDsが炎症性であり、心線維症や腎臓障害などの臓器障害を引き起こすことを示したものもある(15-19, 67)。おそらく、脂質やリポ蛋白が増加するためであろうが、これらは有害であることが以前に示されている(68)。ある重要な研究では、短期間のKDは組織特異的な常在免疫細胞の活性化を通じてマウスの代謝を改善する一方、長期にわたる連続的なKDは全身性の炎症、肥満、耐糖能異常を誘発することを示し、この結果を決定する上で食事の期間が重要である可能性を示唆している(9)。
我々の研究はこの考えに基づき、長期間のKDによる有害な影響の少なくとも一端を説明する可能性のあるメカニズムを明らかにした。我々の実験では、KDがAMPKの活性化とカスパーゼ-2切断によるMDM2の不活性化を組み合わせることによってp53シグナル伝達を誘導し、最終的にp21の増加と多臓器における細胞老化を引き起こすことが示された（図S9）。
心臓や腎臓など、老化細胞の蓄積が全身の炎症や毒性の一因となるような重要な臓器で、このような変化が観察されたことから（3, 18, 19）、臨床的に重要な意味を持つと考えられる。この点に関して、長期間のKDが慢性炎症に起因する心線維症やミトコンドリア機能異常を促進することが2つの論文で示されており（18, 67）、細胞老化が関与するメカニズムは提唱されていないが、興味深い考えであることに変わりはない。さらに、KDを投与したマウスは肝障害、脂肪症、炎症、耐糖能異常、インスリン抵抗性を発症することが最近発表された(22)。これらすべてのデータと、我々のKDマウスが耐糖能の低下も示したことを考慮すると、KDによる代謝機能障害は、特定の条件下で細胞の老化を促進する可能性があるという仮説が成り立つ。老化細胞の蓄積は、それが誘導の増加によるものであれ、クリアランスの障害によるものであれ、加齢関連疾患、さらには老化そのものに関与しているというコンセンサスが高まっている(28, 29, 60, 69)。患者におけるSASP炎症性サイトカインの解析から、細胞の老化もまた、ヒトにおける持続的なKDと関連している可能性が示唆される。
我々のRNA-seqデータのIPA解析により、KDで制御が異なる複数の経路が同定され、それらは観察された代謝と細胞老化の変化に寄与している可能性がある（図S4G）。DNA損傷に関わるいくつかのパスウェイは複数の組織で発現が上昇し、細胞周期と複製に関わるパスウェイは発現が低下している。特にこれらの細胞周期とDNA複製経路のダウンレギュレーションは、これらの細胞が合成期（S期）に入るのに何らかの困難がある可能性を示唆している。KDによって誘発される間期の混乱はまだ文献に記載されていないが、がん治療など他の分野での食事療法の成功について、何らかの説明力を持つかもしれない。最後に、アテローム性動脈硬化症に関与する遺伝子の制御の差は、p53がその進行に複雑かつ組織依存的な役割を果たすことが知られていることから興味深い(70)。
我々の研究は、IKDが持続的KDによって誘導される老化細胞の蓄積を防ぐことができることを示した。この観察は他の研究（10, 64）の結果に基づいており、おそらく最終的な炎症性活性化を避けることによって、IKDは長期持続KDよりも有益である可能性を示唆している（9）。屈折発作に用いられるような持続的KDを受けた小児における老化細胞の蓄積が、記録されている長期的副作用に関与している可能性が推測されるため、これらのデータは臨床に関連する可能性がある(71-73)。7日間のKDを断続的に行った場合、中年マウスに有益な効果があることが報告されているため、我々は7日間のKDの可逆性を検証した(10)。その結果、1週間通常の食餌に戻した後、p53、 p21、SA-β-galが有意に減少したことから、IKDは継続的なKDに代わる臨床的介入の可能性が示唆された。
IKDは、臨床において特に重要であろう。というのも、このタイプのKDは、患者にとって遵守しやすく、持続的KDによる細胞老化のリスクを伴わずに、体重減少と健康パラメータの改善という多くの利点を提供できる可能性があるからである。この点に関しては、異なるマウスモデルにおいて、隔日および隔週IKDの両方が、継続的KDよりも健康パラメータを改善することが報告されている（10、64）が、3日/週IKDを用いた第3の研究では、継続的KDに比べて改善が弱まることが報告されている（74）。ヒトにおいてIKDが有益かどうか、またどのような条件で有益か、さらに最適なレジメンを決定するためには、さらなる研究が必要であることは明らかである。
本研究のin vivoマウス実験の結果および他の研究室からの結果は、KDの効果は複雑であり、潜在的な利益と副作用の両方が、時期、食事の構成、個体の遺伝学、内分泌因子、健康状態などの複数の要因に起因すると考えられることを補強している。このようなことから、KDの使用は個別化医療の全体的な範囲内で考慮されるべきであり、そこでは、個々の患者の変数を考慮に入れて、誰がこの食事介入から利益を得るか、また誰が得られないかを決定し、具体的なレジメンに従うことが提案される。
材料と方法
被験者
本臨床試験は、単一施設、6ヵ月間の層別無作為化比較試験である。18歳以上の過体重/肥満の成人60人のサンプルサイズが登録され、そのうち20人は2型糖尿病または慢性腎臓病を伴わない過体重/肥満であり（プロトコル番号HSC20190528H）、http://ClinicalTrials.gov（ClinicalTrials.gov ID：NCT05071287）に登録された。患者サンプルはすべて匿名化されており、ここでのデータに患者情報は提供されていない。この臨床研究は以前に発表されており、テキサス大学サンアントニオ健康科学センター（UTHSCSA）の施設審査委員会（Institutional Review Board）による臨床試験の承認と発表に必要な情報がすべて含まれている(62)。
マウスモデル
C57BL/6 (JAX系統番号000664)、B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J (JAX系統番号002101)、およびB6.129S4-Casp2tm1Yuan/J (JAX系統番号007899)のマウスをJackson Laboratoryから入手し、UT Health San AntonioのBarshop InstituteのAnimal Facilityにおいて、21±2℃、12時間:12時間の明暗サイクルで特定の病原体を含まない条件で維持した。Trp53とCasp2の遺伝子型解析のプロトコルは、Jackson Laboratoryが推奨する試薬と条件で実施し、最適化した。Trp53 WT、ヘテロ接合体、ホモ接合体のPCR産物のサイズはそれぞれ321、～110、321、～110塩基対（bp）である。Casp2 WT、ヘテロ接合体、ホモ接合体のPCR産物のサイズは、それぞれ304、220、304、220 bpである。Trp53とCasp2への依存性を評価する実験においてバックグラウンドの影響をコントロールするために、ヘテロ接合体系統からホモ接合体KOマウスとWTマウスを派生させ、KO群とコントロール群として用いた。
すべてのマウスは、ペレット状のげっ歯類用飼料と水に自由にアクセスできた。すべての実験において、マウスの年齢は一致させた。コホート内のすべてのマウスの体重が少なくとも15gになった時点で（35～42日齢）、4～6匹のマウス群に無作為に分け、各実験で指定されたように、KDまたは対照食を7、21、31日間、または循環的に自由摂取させた（4日間のKDと7日間の対照食を交互に）。異なる年齢のマウスに対するKDの影響を評価するために、16週齢、24週齢、および52週齢のC57BL/6雄性マウスをJackson Laboratoryから入手し、コントロールまたはKDのいずれかに割り付けた。マウスは安楽死させられ、与えられた食餌の終了後直ちに組織が採取された。ただし、KDによって誘導された細胞老化の持続性を調べる実験とABT-263老齢化作用の実験では、マウスはKDの後、指定された日数の間、コントロールの食餌を与えられた。
ケトジェネシスを誘導するために用いた主食は、Inotiv Teklad社製のCriscoベースのKD（TD.96355）で、脂肪90.5％、タンパク質9.2％、炭水化物0.3％（スクロース0％）からなる。対照食には、Teklad社の伝統的な配合飼料LM-485（No.7012）を用い、脂肪17％、タンパク質25％、炭水化物58％のカロリーで構成されている。代替KDには、脂肪から90％、タンパク質から10％のカロリーからなるココアバター・ベースのKD（D10070801）と、脂肪から10％、タンパク質から10％、炭水化物から80％のカロリーからなる対照食（D19082304）を用いた。
食餌消費量を測定するため、マウスを単独飼育し、21日間対照食またはKDのいずれかに割り付けた（各群n = 5匹）。1日の摂餌量は毎日午前10時30分に餌ペレットの重量を測定した。マウスには最初の3日間、14kcalの対照食とKDを与えた。3日後、マウスが成長し体重が増加した時点で、食餌量を20kcalに調整し、マウスが24時間以内に食べきれる量よりも多く利用できるようにした。
p21減弱剤UC2288は、5％ジメチルスルホキシド（DMSO）、40％ポリエチレングリコール300（PEG300）、5％Tween80をH2Oに溶解した溶液で調製した。雄マウスに21日間のKDを行い、ビヒクルまたはUC2288を15 mg/kgで1日目から2日目ごとに経口投与した（計11回）。
選択的カスパーゼ阻害剤であるZ-VDVAD-FMKは、H2O中5％DMSO、40％PEG300、5％Tween80を含む溶液で調製した。雄マウスに31日間のKDを行い、ビヒクルまたはZ-VDVAD-FMKのいずれかを10mg/kgで1日目に腹腔内注射し、その後2日おきに投与した（合計16回）。
選択的AMPK阻害剤であるドルソモルフィンは、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製した。雄マウスを21日間のKDに供し、実験1日目から毎日、5 mg/kgのドルソモルフィンを腹腔内注射で投与した（合計21回投与）。
老人溶解剤ABT-263は、H2O中5％DMSO、40％PEG300、5％Tween80を含む溶液に製剤化した。KD誘発老化の治療のために、雄マウスにKDを21日間与え、その後、ビヒクルまたはABT-263を1日あたり50mg/kgで7日間連続経口投与した（その間、対照飼料を与えた）。
すべての動物実験は、National Institutes of Health (NIH) Guidelines for Humane Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われ、UT Health San Antonio Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。
細胞株
ヒト胚性腎上皮293T細胞はLife Technologies社（Carlsbad, CA）から、NIH 3T3マウス線維芽細胞はAmerican Type Culture Collection社（Manassas, VA）から購入した。細胞はそれぞれの推奨培地中で、37℃、5% CO2（95%空気）、95%相対湿度で培養した。この研究で使用した細胞株はすべて、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit（Lonza）を用いてマイコプラズマがないことを確認し、COGcellデータベース（www.COGcell.org）と比較したショートタンデムリピートジェノタイピングを用いて細胞株の同定を定期的にチェックした。
ケトン体測定
マウス中のケトン体濃度は、Keto-Mojo GK+ Bluetooth Glucose & Ketone Testing Kit（Keto-Mojo）を用いて定量的に測定した。ケトン体検査ストリップをメーターにしっかりと挿入し、26ゲージの針で穿刺したマウスの伏在静脈部分の液滴にストリップの先端を近づけた。ストリップは毛細管現象によって全血を血流路に引き込む。β-HBはβ-HBデヒドロゲナーゼという酵素によってアセト酢酸に変換される。この酵素反応から生じる電流の大きさは、試料中に存在するβ-HBの量に比例する。
グルコースおよびインスリン負荷試験
マウスはGTTの前に6時間絶食させた。ITTの前には絶食させなかった。GTTとITTの両方が、Countour Next EZグルコメーターとグルコースストリップを用いて実施された。グルコース（1.5g/kg）またはインスリン（0.75U/kg）のボーラスをマウスに腹腔内注射した。その後、グルコースを2時間にわたってモニターした。
ウェスタンブロッティングおよびイメージング
プルダウンまたはイムノブロット用の細胞および臓器組織からの全タンパク質溶解液の調製は記載されている(75, 76)。タンパク質濃度はビシンコニン酸（BCA）プロテインアッセイキット（Pierce）で測定し、各サンプルから20μgをNuPAGE bis-tris 4～12％勾配SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Invitrogen）で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Bio-Rad）に転写した、 一次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識マウスまたはウサギ二次抗体（Cell Signaling Technology）でプローブし、強化化学発光（Thermo Fisher Scientific； SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate)を用いた。
免疫ブロットはProteinSimple FluorChem Mで、最適な露光が達成されるまでメンブレンを連続的に長く露光するAuto Exposure機能を使って画像化した。画像は、4×4ピクセルのビニング（832×626ピクセル画像）を用いて標準解像度で取得した。マルチチャンネルイメージングは、化学発光を加えた蛍光マーカーを即座に捕捉する。このシステムには、結果の視認性を高めるための3つのツールが含まれています：輝度コントロール（非線形ガンマ調整を使用）、露光ビュー、およびカラー反転。タンパク質定量のデンシトメトリー解析は、ImageJ software v0.5.5 (NIH; http://imagej.nih.gov/ij, Java 1.8.0- internal)によって決定された。
免疫組織化学
5種類のマウスタンパク質（SA-β-gal、H2AY、H3K9me3、p53、p21）のIHC染色は、Houston MethodistのDr. Mary and Ron Neal Cancer Centerで行った。ホルマリン固定パラフィン包埋マウスの組織ブロックは、UT Health San AntonioのLaboratory Medicineコアで標準的な方法で処理された。組織切片を3％過酸化水素で固定し、次いで蛋白質ブロッキング溶液（Avidin/Biotin Blocking Kit）を用いた。EnVision+システム、HRPポリマー（マウスまたはウサギ）、ジアミノベンジジン（DAB）基質（Dako）、DAB sparkle（Biocare）を用いて組織切片をインキュベートした。十分な発色が見られたら、スライドを水で洗浄して反応を止め、Meyer's hematoxylin（Dako）で対比染色し、Permount mounting medium（Richard-Allan Scientific）で覆った。顕微鏡写真は光学顕微鏡（Leica）で撮影した。代表的な画像を示す。
mRNA発現の定量的PCR分析
TRIzol試薬（Invitrogen）およびRNeasy Mini Plus Kit（QIAGEN）を用いて、マウスの臓器組織または細胞から全RNAを抽出・精製し、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit plus RNase inhibitor（Applied Biosystems）を用いて、説明書に従ってcDNAを調製した。使用したqPCRプライマーを表S1に示す。ABI QuantStudio 5 RT-PCRシステム（Applied Biosystems）を用いて、2×PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）およびバーコード付きMicroAmp Optical 384-Well Reaction Plateを使用した。 qPCR熱サイクリングは、50℃で2分間、95℃で10分間、95℃で15秒間、60℃で1分間を40サイクル行った。ΔΔCTデータは、QuantStudio Design & Analysis Software v1.5.1（Applied Biosystems）で解析した。
遺伝子クローニングと突然変異誘発
NIH 3T3マウス線維芽細胞から単離した全RNA（1μg）をHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。Trp53をコードするcDNA断片をExpand High Fidelity PCR System (Sigma-Aldrich)によりPCR増幅した。二本鎖DNA断片をSgf1およびMlu1-HF制限酵素で消化し、LigaFast Rapid DNA Ligation System（Promega）を用いてpCMV6-entry-mycDDK（OriGene）哺乳動物発現ベクターのSgf1およびMlu1制限部位にインフレームで順次挿入した。DNA配列は、自動ABI-3730xl DNA AnalyzerおよびABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いて、Psomagenにより確認した。すべてのプラスミドはQIAGEN（バレンシア）のHi-Speed Plasmid Midi Kitsを用いて調製した。
細胞導入
空ベクターコントロール（pCMV6-entry-mycDDK）またはマウスTrp53（pCMV6-Trp53-mycDDK）による293T細胞のトランスフェクションは、AmaxaのNucleofector Cell and Transfection Database（Lonza）に記載されているように、AmaxaのNucleofector 2b System（Lonza）を用いて行った。ヌクレオフェクション後、細胞をプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。その後、全タンパク質ライセートを抽出し、SDS-PAGEで分析し、タンパク質発現を確認するために特異的抗体で免疫ブロットした。
プルダウン
プルダウン研究のために、3mgのタンパク質ライセートをビオチン標識4タンデム反復p53 DNA結合配列（Biotin-TP53 4BS）と一晩4℃でインキュベートし、EZview Red Streptavidin Affinity Gelsを用いてプルダウンした。タンパク質複合体を改良1×ラジオイムノ沈降アッセイ（RIPA）で4回洗浄し、グリシン-HCl（pH3.5）で溶出し、トリス-HCl/NaCl（pH8.0）で中和した後、Amicon Ultra-0.5遠心フィルターユニット（分子量10-kDaカットオフ）を用いて濃縮した。サンプルを4～12% SDS-PAGEで分離し、指示した抗体で免疫ブロッティングした。
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降（ChIP）解析は既述の方法で行った(77)。簡単に説明すると、Multi Tissue Dissociation Kit 2 (No.130-110-203)とgentleMACS dissociator (No.130-093-235)を用いて、製造者の指示に従い、新鮮な単離マウス組織から初代心臓および腎臓細胞を解離させた(Miltenyi Biotec)。600万個の細胞を1％ホルムアルデヒド中、室温で15分間固定し、125mMグリシンを5分間加えてタンパク質/DNA架橋反応を停止させた。固定した細胞を1250g、3分間、4℃で遠心分離して回収し、冷PBSで2回洗浄した。細胞ペレットを、700μlのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋エチレンジアミン四酢酸（TE）プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む完全な剪断バッファーに再懸濁し、Bioruptor Pico（Diagenode）を用いて、架橋タンパク質／DNAを平均200～1000bpのサイズに剪断するために、低出力で30秒オン／30秒オフを10サイクル超音波処理した。剪断したクロマチンDNAのアリコートをインプットとして使用した。タンパク質/DNA断片を含むクロマチン抽出液（200μl）をRIPAバッファー（200mM NaCl）に調整し、5μgのマウス抗p53（Cell Signaling Technology）抗体または抗phospho-p53Ser15（Cell Signaling Technology）抗体を用いて、4℃で一晩、回転させながらChIPを行った。陰性コントロールとして通常のマウス免疫グロブリンG抗体を用いた。プロテインAでコートした磁気ビーズと4℃で6時間インキュベートした後、ビーズを洗浄バッファーRIPAバッファー、RIPAバッファー（200mM NaCl）、LiClバッファー、TEで4回洗浄した。ビーズを100μlのTE、2.5μlの10% SDS、5μlのプロテイナーゼK（10mg/ml）に再懸濁し、一晩インキュベートした（65℃）。クロマチンDNA断片を洗浄、脱架橋、溶出し、50μlの溶出バッファー中でMini溶出カラムを用いて濃縮した。リアルタイムqPCR（1:5希釈比）反応は、ABI QuantStudioTM 5 Real-Time PCRシステム（Applied Biosystems）を用いて、2セットのCdkn1a（p21）マウスプロモータープライマー（部位1、1.9kb；および部位2、2.8kb）を用いて行った。相対占有率は、見かけのChIP効率（免疫沈降されたDNA量の入力サンプルに対する比）を決定することにより算出し、コントロール領域で観察されたレベル（1.0と定義）に対して正規化した。
RNA-seq解析
RNA-seqのために、TRIzol試薬（Invitrogen）とRNeasy Mini Plus Kit（QIAGEN）を用いて、コントロールまたはKD21日目のマウスの心臓、腎臓、肝臓組織から、DNAを含まない全RNAを製造元の指示に従って単離した。総RNAサンプルの濃度はNanoDropで測定した。全RNAサンプルの品質はBioanalyzerで分析した。品質管理ステップに合格したサンプル（1μg/10μl）は（RNAインテグリティナンバー＞4）、その後、テキサス州サンアントニオ、UT Health San AntonioのGreehey Children's Cancer Research InstituteのGenome Sequencing Facilityで、適切なサンプル調製キットを用いてNovaSeq 6000イルミナシステムによりシーケンスライブラリーを作成する一連のステップにかけられる。シーケンスリードは、HiSAT2アライナーを用いてUCSC/mm9マウスゲノムにマッピングし、StringTieを用いて定量した。差次的発現解析はDESeq Rパッケージを用いて行い、得られた遺伝子リストに以下の有意基準を適用した： FPKM > 1、調整P < 0.05、fold change > 1.5。次に、QIAGEN IPAソフトウェアを用いて差次的発現遺伝子を処理し、パスウェイ濃縮、上流解析、および有意性スコアを決定した。
カスパーゼ-2酵素活性アッセイ
カスパーゼ-2酵素活性のin vitroアッセイは、Colorimetric Caspase-2 Assay Kit (Abcam)の説明書に従って行った。31日間KDで飼育したマウスから単離した4つの臓器組織（心臓、腎臓、肝臓、および脳）から全タンパク質溶解物を調製し、ビヒクルまたは選択的カスパーゼ阻害剤Z-VDVAD-FMKのいずれかを10 mg/kgで1日目に腹腔内注射し、その後2日ごとに投与した。組織溶解液（各100μg/50μl）を50μlの2×反応緩衝液（10mMジチオスレイトールを含む）に加え、5μlの4mMアセチル-Val-Asp-Val-Ala-Asp-パラ-ニトロアニリン（VDVAD-p-NA）基質（最終濃度200μM）と共に37℃で1時間インキュベートした。サンプルは96ウェルプレートリーダー（SpectraMax iD3、Molecular Devices）で405 nmで読み取った。VDVAD依存性カスパーゼ活性の倍数増加は、KDサンプルの結果を対照食のレベルと比較することにより決定した。
酵素結合免疫吸着アッセイ
ELISA免疫測定法は、適切なサイトカイン／ケモカインELISAキット（ELISAキットおよび検出限界については表2を参照のこと）を用いて、マウスの血清および組織溶解物、ならびにヒト血漿中のSASP分泌タンパク質TNFα、IL-1β、IL-6、およびCCL5／RANTESの濃度を、製造業者の説明書に従って測定した。定量データは、精製リコンビナントタンパク質から得られた直線用量反応標準曲線を用いて算出・解析した。
ELISAキット 検出限界
ヒト IL-1β ヒト IL-1β：BD OptEIA IL-1β ELISA セット II（番号 557953） 0.3 pg/ml
ヒト IL-6：BD OptEIA IL-6 ELISA セット（No.555220）0.7 pg/ml
ヒトTNFα BD OptEIA TNF ELISAセット（555212番） 0.3 pg/ml
マウスCCL5 シグマアルドリッチ RANTES/CCL5 ELISAキット（番号RAB007） 1 pg/ml
マウスIL-1β R&D IL-1 β/IL-1F2 クアンチカイン HS ELISA キット（番号 MHSLB00） 0.312 pg/ml
マウスIL-6：R&D IL-6 Quantikine ELISAキット（MHSTA50番号） 1.8 pg/ml
マウスTNFα R&D TNF-α Quantikine HS ELISA キット（番号 MHSTA50） 0.295 pg/ml
表2. サイトカイン/ケモカインELISAキットと検出限界。
統計解析
特に断りのない限り、分析はMicrosoft Excel v2308またはGraphPad Prism 10.1.0で行った。統計的差異は、二元配置分散分析（ANOVA）、一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定、または対になっていないStudentのt検定によって示されるように計算した。P値は両側で、検定はP < 0.05で有意とみなされた。すべての測定は異なるサンプルから行われ、複製は生物学的なものである。すべての実験は一貫して反復可能であった。各実験群の反復数（マウス）は、図の説明および補足資料に記載されている。免疫ブロット実験では、1群につき3匹のマウスを示した。
謝辞
資金提供 本研究は、米国国立がん研究所（National Cancer Institute）の助成金R01CA152601（D.G.）、R01CA214025（D.G.）およびU01CA268813（J.C.）、米国国立がん研究所（National Cancer Institute）のR01補助金、R01CA214025-05（E.S.C.）およびR01CA257148（R.T.）、米国国立老化研究所（National Institute on Aging）の研修助成金T32AG021890-20（J.R.S. )、Cancer Prevention and Research Institute of Texas, grants RR20012 (D.G.) and RP220650 (J.C.); Breast Cancer Research Foundation (J.C.); M. Neal and R. Neal (J.C.); 80/20 Foundation (K.S.); and Barshop Institute of Longevity and Aging Nathan Shock Centers of Excellence。
著者貢献： 構想： 方法論：S.-J.W.、N.H.、D.G.： S.-J.W.、M.V.、G.X.、W.H.C.、G.M.M.、P.S.、Y.D.、J.C.、N.H.、D.G. ソフトウェア： J.R.S. バリデーション： 形式分析：S.-J.W.、M.V.、W.H.C.、R.T.、K.S.、N.H.、D.G： S.-J.W.、J.R.S.、A.N.、W.Q.、B.L.、E.M.、D.G.調査： S.-J.W.、J.R.S.、E.S.C.、M.V.、G.X.、W.H.C.、P.S.、R.T.、W.Q.、G.M.M.、F.F.D.、B.L.、A.N.、Y.D.、A.S.、K.S.： S.-J.W.、M.V.、F.F.D.、W.Q.、Y.D.、A.S.、K.S.、J.C.、N.H.、D.G. データキュレーション： S.-J.W.およびJ.R.S. 執筆-原案： 査読および編集：S.-J.W.、J.R.S.、M.V.、E.M.、N.H.、D.G.： 視覚化：S.-J.W.、J.R.S.、E.S.C.、E.M.、J.C.、K.S.、N.H.、D.G.： 監修：S.-J.W.，J.R.S.，E.S.C.，E.M.，N.H.，D.G.．プロジェクト管理：S.-J.W.、M.V.、H.J.、J.C.、W.Q.、K.S.、N.H.、D.G： S.-J.W.、H.J.、W.H.C.、R.T.、W.Q.、K.S.、N.H.、D.G. 資金獲得： J.C.、K.S.、D.G.。
競合利益： 著者らは、競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 論文中の結論を評価するために必要なデータはすべて論文および/または補足資料に記載されている。RNA-seqデータのアクセッション番号はGEO： GSE233831である。
補足資料
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科学の進歩
第10巻｜第20号
2024年5月
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https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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受理 2024年4月12日
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謝辞
資金提供： 本研究は、米国国立がん研究所、助成金R01CA152601（D.G.）、R01CA214025（D.G.）およびU01CA268813（J.C.）、米国国立がん研究所R01補助金、R01CA214025-05（E.S.C.）およびR01CA257148（R.T.）、米国国立加齢研究所、研修助成金T32AG021890-20（J.R.S. )、Cancer Prevention and Research Institute of Texas, grant RR20012 (D.G.) and RP220650 (J.C.); Breast Cancer Research Foundation (J.C.); Philanthropic support from M. Neal and R. Neal (J.C.); 80/20 Foundation (K.S.); and Barshop Institute of Longevity and Aging Nathan Shock Centers of Excellence.
著者貢献： 構想： 方法論：S.-J.W.、N.H.、D.G.： S.-J.W.、M.V.、G.X.、W.H.C.、G.M.M.、P.S.、Y.D.、J.C.、N.H.、D.G. ソフトウェア： J.R.S. バリデーション： 形式分析：S.-J.W.、M.V.、W.H.C.、R.T.、K.S.、N.H.、D.G： S.-J.W.、J.R.S.、A.N.、W.Q.、B.L.、E.M.、D.G.調査： S.-J.W.、J.R.S.、E.S.C.、M.V.、G.X.、W.H.C.、P.S.、R.T.、W.Q.、G.M.M.、F.F.D.、B.L.、A.N.、Y.D.、A.S.、K.S.： S.-J.W.、M.V.、F.F.D.、W.Q.、Y.D.、A.S.、K.S.、J.C.、N.H.、D.G. データキュレーション： S.-J.W.およびJ.R.S. 執筆-原案： 査読および編集：S.-J.W.、J.R.S.、M.V.、E.M.、N.H.、D.G.： 視覚化：S.-J.W.、J.R.S.、E.S.C.、E.M.、J.C.、K.S.、N.H.、D.G.： 監修：S.-J.W.，J.R.S.，E.S.C.，E.M.，N.H.，D.G.．プロジェクト管理：S.-J.W.、M.V.、H.J.、J.C.、W.Q.、K.S.、N.H.、D.G： S.-J.W.、H.J.、W.H.C.、R.T.、W.Q.、K.S.、N.H.、D.G. 資金獲得： J.C.、K.S.、D.G.。
競合利益： 著者らは、競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 論文中の結論を評価するために必要なデータはすべて論文および/または補足資料に記載されている。RNA-seqデータのアクセッション番号はGEO： GSE233831。
所属
Sung-Jen Wei https://orcid.org/0000-0001-6880-6850
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルス・サンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。
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ジョセフ・R・シェル https://orcid.org/0000-0001-8264-566X
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。
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E. サンドラ・チョクロン https://orcid.org/0000-0002-4352-4731
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 調査、視覚化、執筆-レビューと編集。
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Mahboubeh Varmazyad https://orcid.org/0000-0002-3515-0354
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルス・サンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 概念化、調査、方法論、リソース、監督、検証、執筆-原案。
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Guogang Xu https://orcid.org/0000-0002-0139-6313
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 概念化、調査、方法論、視覚化。
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Wan Hsi Chen https://orcid.org/0000-0002-9788-883X
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： 役割：調査、方法論、プロジェクト管理、検証。
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グロリア・M・マルティネス
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： 概念化、調査、方法論。
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フェリックス F．Dong https://orcid.org/0009-0003-7454-7850
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： リソース。
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Prethish Sreenivas https://orcid.org/0000-0002-1260-4464
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割：調査。
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ロランド・トレビノ・ジュニア
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： 役割：調査、プロジェクト管理、検証。
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Haiyan Jiang
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割： プロジェクト管理および監督。
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ヤン・ドゥ https://orcid.org/0000-0003-0683-3989
精密医療センター、UTヘルス・サンアントニオ、サンアントニオ、テキサス州、米国。
看護学部、UTヘルスサンアントニオ、サンアントニオ、TX、USA。
役割： 役割：概念化、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、執筆-レビューと編集。
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アファフ・サリバ https://orcid.org/0000-0003-2576-4069
精密医療センター、UTヘルスサンアントニオ、サンアントニオ、テキサス州、米国。
役割： 調査およびプロジェクト管理。
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ウェイ・チアン
ヒューストン・メソジストがんセンター、ヒューストン、TX、USA。
ヒューストン・メソジスト研究所、ヒューストン、TX、USA。
役割： 正式な分析、調査、リソース、監督。
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ブランドン・ロレンサナ https://orcid.org/0009-0007-8188-6921
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 形式分析、調査、可視化。
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アリア・ナザルラ
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 概念化、調査、視覚化、執筆-レビューと編集。
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ジェニー・チャン https://orcid.org/0000-0002-0890-9302
ヒューストン・メソジスト癌センター、ヒューストン、TX、USA。
ヒューストン・メソジスト研究所、ヒューストン、TX、USA。
役割： 役割：概念化、調査、方法論、リソース、視覚化、執筆-レビューと編集。
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クマール・シャルマ https://orcid.org/0000-0002-7550-8525
精密医療センター、UTヘルスサンアントニオ、サンアントニオ、テキサス州、米国。
腎臓内科、医学部、UTヘルスサンアントニオ、サンアントニオ、TX、USA。
役割： 役割：構想、資金獲得、調査、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、可視化、執筆-レビューと編集。
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Erin Munkácsy https://orcid.org/0000-0002-0255-2576
UT Health San Antonio MD Anderson, Joe R. and Teresa Lozano Long School of Medicine, San Antonio, TX, USAのメイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 概念化、形式分析、視覚化、執筆（原案）。
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堀越伸夫 https://orcid.org/0000-0001-8464-8178
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオ、バーショップ長寿・加齢研究所。
役割 役割：概念化、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、視覚化、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。
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David Gius* https://orcid.org/0000-0001-9647-3571 gius@uthscsa.edu
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオMDアンダーソン、メイズがんセンター放射線腫瘍科。
米国テキサス州サンアントニオ、UTヘルスサンアントニオのバーショップ長寿・加齢研究所。
役割： 概念化、形式分析、資金獲得、方法論、プロジェクト管理、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。
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資金提供情報
米国国立老化研究所 トレーニンググラント T32AG021890-20
米国国立がん研究所 R01CA152601
米国国立がん研究所 米国国立がん研究所：R01CA214025
米国国立がん研究所 U01 CA268813
米国国立がん研究所 R01CA214025-05
米国国立がん研究所 R01CA257148
乳がん研究基金
テキサスがん予防研究所 RR20012
長寿・老化研究所 ネイサンショックセンターオブエクセレンス
テキサスがん予防研究所 RP220650
M.ニールおよびR.ニール博士からの慈善支援
80/20財団
備考
*
筆者。電子メール：gius@uthscsa.edu
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Sung-Jen Wei et al. ,ケトジェニックダイエットは多臓器においてp53依存性の細胞老化を誘導する.Sci. Adv.10,eado1463(2024).DOI:10.1126/sciadv.ado1463
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