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ヒトマイクロバイオーム
研究論文
2024年3月5日
ライフステージを超えたヒト腸内細菌叢の分類学的および代謝学的発展：世界規模のメタゲノム研究

https://journals.asm.org/doi/10.1128/msystems.01294-23


著者 Leonardo Mancabelli https://orcid.org/0000-0002-1744-2214, Christian Milani https://orcid.org/0000-0002-5062-3164, Rosita De Biase, Fabiana Bocchio, Federico Fontana, Gabriele Andrea Lugli, Giulia Alessandri, SHOW ALL (17 AUTHORS), Marco Ventura https://orcid.org/0000-0002-4875-4560 marco.ventura@unipr.itAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/msystems.01294-23
引用
PDF/EPUB

mシステムズ
第9巻 第4号
16 2024年4月
概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
情報＆貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
シェア
要旨
ヒトの腸内細菌叢はダイナミックな微生物群集であり、一生の間に様々な変化を遂げる。ヒトの生涯を通じて起こりうる微生物叢の変動を徹底的に調べるために、ヒトの全生涯を網羅するさまざまな年齢層にわたる健康な糞便サンプルのプール解析を行った。本研究では、公開されている79の研究とイタリアのコホート（Parma Microbiota project）から得られた新しい便サンプルのデータを統合し、6,653サンプルをショットガンメタゲノムアプローチで処理した。このアプローチにより、腸内細菌叢の種レベルの分類学的再構築が可能となり、ヒトの寿命にわたる代謝の可能性を調査することができた。分類学的見地から、我々の研究結果は、腸内細菌叢の微生物濃度が人生の最初の段階で徐々に増加し、青年期には比較的安定することを種レベルの精度で確認し、詳述した。さらに、この解析により、異なる年齢グループを代表する潜在的なコア微生物叢が同定され、加齢に関連した細菌パターンと、分類群の獲得や消失ではなく、生涯にわたる相対的な存在量という観点からの微生物叢の継続的な再編成が明らかになった。さらに、ショットガンアプローチにより、ヒト腸内細菌叢の機能的寄与に関する洞察が得られた。メタゲノム解析の結果、特に炭水化物と食物繊維の代謝における機能的な年齢差が明らかになり、マイクロバイオームの集合体が食事と共進化していることが示唆された。さらに、チアミンやナイアシンなどのビタミン合成と生後間もない時期との相関が確認され、ヒトの生理学、特に宿主の神経系と免疫系の機能においてマイクロバイオームが果たす役割の可能性が示唆された。
重要性
本研究では、ヒトの生涯にわたる腸内細菌叢のダイナミックな性質について包括的な知見を提供した。詳細には、公開データセットとParma Microbiotaプロジェクトからの新しいサンプルを組み合わせ、ショットガンメタゲノムアプローチに基づく大規模データセットを解析し、腸内細菌叢の発達と加齢との間の可能性のある関係の詳細な概要を得た。我々の発見は、微生物の豊かさの発達における主な段階を確認し、異なる年齢段階に関連する特定のコア微生物相を明らかにした。さらに、ショットガンメタゲノムアプローチにより、ヒトの寿命にわたるマイクロバイオームの機能的変化、特に食生活に関連した代謝の変化を明らかにすることができた。注目すべきことに、本研究では、生後早期のビタミン合成との正の相関関係も明らかになり、ヒトの生理学に微生物叢が影響を及ぼしている可能性が示唆された。
はじめに
ヒトの腸内細菌叢は、腸管に生息する微生物の豊富で多様なコンソーシアムであり(1-3)、代謝の健康状態から免疫機能まで、ヒトの生物学の多くの側面において重要な役割を果たしている(3-5)。細菌を主体とするこの複雑な群集は、微生物群集と宿主の発育との相互作用を反映し、個人の一生を通じてダイナミックな変化を遂げる(6, 7)。生後間もない頃、腸は徐々にコロニー形成され、その微生物相は非常にダイナミックで、分娩様式や母乳育児などの要因に影響される(8-10)。初期には放線菌とシュードモナドータ（以前はそれぞれ放線菌とプロテオバクテリアとして知られていた）が特徴的である(2, 11, 12)。小児の成長とともに、腸内細菌叢は大きく変化し（13、14）、母乳育児から固形食への食生活の変化に適応していく（15）。
現在、ヒトの思春期の腸内細菌叢に焦点を当てた研究は限られているが、この重要な時期に腸内細菌叢は大きな変化と進化を遂げることが広く示唆されている(16, 17)。実際、ホルモンの変化、食事の嗜好、ライフスタイルの要因が腸内微生物の生態系に影響を及ぼす可能性がある(18-21)。特に思春期には、腸内細菌叢は成人のものへと変化する傾向があり、バクテロイデス属、プレボテラ属、ブラウチア属、フェーカリバクテリウム属などのバクテロイデス門とバチロタ門（以前はそれぞれバクテロイデーテス門とファーミキューテス門として知られていた）に属する微生物属が増加するのが特徴である(22)。
乳幼児や青少年と比較して、成人には安定性と回復力が高いという特徴を持つ微生物叢が備わっている(23-25)。その構成は、食事(20, 26)や身体活動(27, 28)といった生活習慣に関連した因子の影響を強く受けている。成人の腸内細菌叢が多様で安定していることは、代謝や免疫の健康状態の改善と関連する一方、組成の不均衡は様々な病的状態と関連することが、数多くの研究で明らかにされている(1, 29, 30)。実際、成人の腸内細菌叢の主要な門と属の間のバランスは、宿主の健康を確保し、必須の代謝・免疫機能を果たす上で重要な役割を果たしている（1, 24）。
人生の後期になると、高齢者では腸内細菌叢の組成がまた変化し、特にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、アッケマンシア（Akkermansia）、クロストリジウム（Clostridium）クラスターIVのメンバーなどの有益な菌種が減少する。このような変化は、免疫機能、栄養吸収、虚弱体質や慢性疾患などの加齢関連疾患に対する感受性に影響を及ぼす可能性がある（31、33、34）。
このような背景から、生涯を通じた腸内細菌叢の詳細な進化を調査する統計的検出力のある包括的な研究は著しく限られており、主に特定の年齢層に焦点が当てられている(11, 35-39)。さらに、近年得られた豊富な知識にもかかわらず、重大な知識のギャップが残っている。現在のところ、既存の研究のほとんどは16S rRNA遺伝子プロファイリングアプローチに基づいており(40)、属レベルでの微生物叢組成の洞察は得られるものの、種レベルの分析に必要な正確さには欠けている(41)。
このような重大な知識のギャップを踏まえて、我々の研究は、ライフスパンにわたる健康なヒトのマイクロバイオームの研究に関して、公開されているショットガンメタゲノムデータセットに基づいて、最も広範な腸内細菌叢解析を行うことを目的としている。詳細には、様々な年齢層と地域を代表する6,653サンプルを網羅する非常に完全なデータセットを構築し、その中には現在も進行中の地域集団研究であるParma Microbiotaプロジェクトに由来する467サンプルも含まれている。このアプローチにより、種レベルでの分類学的組成とマイクロバイオームの機能性をより詳細に調査することが可能となり、年齢とマイクロバイオーム組成の複雑な関係を包括的かつ統計学的に頑健に調査することができる。
結果
データセットの選択
健康な人のヒトマイクロバイオームに関連する、一般に入手可能なショットガンメタゲノム研究の最大数を検索するために、広範なメタゲノムデータセット検索を行った。詳細には、イルミナのショットガンメタゲノム法に基づいて、健康なヒトの糞便サンプルを含む79の公開データセットからデータを収集した（図S1a；表S1）。詳細には、このプール解析では、報告されたメタデータから健康状態と個人の年齢を明確に特定できる研究のみを対象とした。さらに、Parma Microbiotaプロジェクトの一環として、467人の健康なイタリア人からの新鮮な糞便サンプルが収集され、配列が決定され、解析された（表S1）。したがって、プールされた解析には、出生から100歳を超えるまでの合計6,653の健康な糞便サンプルが含まれ（表S1およびS2）、すべての異なる年齢層（下記参照）を統計的にしっかりと表現している。
生涯にわたる個体内変動
このプール解析で収集された6,653の便サンプルは、METAnnotatorX2ソフトウェア(42)を用いて、マニュアルに報告されている標準的なフィルタリングパラメータに従い、ホモサピエンスのリードを除去して微生物叢組成を評価した。ダウンロードしたFastqファイルと配列決定したFastqファイルは、バイアスを防ぐために同じバイオインフォマティックパイプラインで処理され、その結果、品質とヒト配列フィルタリング後のサンプルあたりの平均が14,885,023 ± 16,560,451の合計110,384,672,113リードが得られた（表S2）。分類解析を最適化するために、シャローショットガンメタゲノムアプローチ(42, 43)に従い、各サンプルについて最大100,000リードのランダムサブセットを品質とヒト配列フィルター後に解析することにした。既報の通り、このアプローチにより、バイオインフォマティック・パイプラインの最適化が可能になり、正確な分類学的プロファイリングが実現した。さらに、解析したリードの総数のばらつきに起因する不一致を緩和することで、信頼性の高いプロファイル比較を促進する(42, 43)。
各サンプルの生物多様性を評価するために、METAnnotatorX2ソフトウェア（42）を使用して生成された結果を採用した。詳細には、ヒトの生涯を通じた種の豊かさの潜在的な変化を調べるために、世界保健機関（WHO）が提供するガイドライン（44）に従って、サンプルを4つの年齢グループ、すなわちG1（0～4歳）、G2（5～17歳）、G3（18～64歳）、G4（65歳以上）に分類した（図S1）。解析の結果、ペアワイズ・クラスカル・ワリス検定（P < 0.01）によって強調されたように、年齢とともに細菌種の存在量が増加することが明らかになった。具体的には、G1群（平均42±23）とG2群、G3群、G4群（それぞれ平均84±20、83±20、86±21）の間に大きな差があった（図1A）。G2、G3、G4群間で有意差は確認されなかった（図1A）。これらの結果は、ヒトの腸内細菌叢は人生の初期段階で発達的な変化を遂げ、宿主が小児期や青年期（5～17歳）に達するまで細菌種の面で複雑さを増していくという考え方を支持するものである(23)。その後、人生の後期になると、腸内細菌叢は安定に達し、細菌種の数は比較的一定に保たれる。加えて、サンプルをさらに年齢サブグループに細分化すると（図S1a）、G1a（0～1ヵ月）とG1b（1～6ヵ月）の間に有意差は認められず、不均一で複雑に変化する微生物叢の存在が示された（14）。さらに、G1c（6ヵ月～1年）群とG1d（1～4年）群では、G2a群（5～10年）に達するまで、種数が有意に増加する傾向を示し、腸内細菌叢は安定した状態を達成し、その後の年齢群でも持続するようである（ペアワイズ・クラスカル・ワリス検定 P > 0.05）（図S1a）。
図1

図1 微生物の生物多様性の評価。パネル(a)は、各年齢グループの被験者が同定した種の豊かさを表すひげプロット。X軸は各年齢層を表し、Y軸は種の数を表す。25パーセンタイルと75パーセンタイルがボックスを決める。ひげは1.5四分位範囲（IQR）で決まる。ボックス内の線は中央値を表し、四角は平均値を表す。異なる小文字は、ペアワイズ・クラスカル・ワリス検定分析により算出されたP < 0.05での有意差を示す。詳細には、同じ文字のグループは互いに有意差がなく、異なる文字のグループは統計的に異なると考えられる。パネル(b)は、各年齢グループの被験者によって識別されたシャノン指数によって算出されたアルファ多様性を表すひげプロットである。X軸は各年齢グループを表し、Y軸はシャノン指数を表す。25パーセンタイルと75パーセンタイルがボックスを決める。ひげは1.5 IQRで決まる。ボックス内の線は中央値を表し、四角は平均値を表す。異なる小文字は、ペアワイズ・クラスカル・ワリス検定分析により算出されたP < 0.05での有意差を示す。詳細には、同じ文字のグループは互いに有意差がなく、異なる文字のグループは統計的に異なると考えられる。パネル(c)は、PCoAのプール解析を年齢群別に細分化したものである。黒い行は、有意な適合（envit fit P < 0.005）を示した細菌種を示す。
異なるライフステージ間の個体間変動
Bray-Curtis非類似度行列に基づく主座標分析（PCoA）を用いて、年齢群間の個体間差異を評価した。詳細には、PERMANOVAに基づく統計解析（表S3）により、グループ間の明確な区分が明らかになった（ペアワイズPERMANOVA q < 0.01）。さらに、ペアワイズ擬似F値（表S2）の評価では、G1グループとそれ以外のグループとの間に明確な隔たりがあることが強調され、グループ間で不均一性を示した（図1B）。この区分は、G1グループサンプルの微生物叢組成が明瞭であることを示唆し、年齢と微生物叢構造の間に有意な関係があることを示した。年齢と細菌種を変数として考慮したさらなるフィッティング分析により、Bifidobacterium longumが重要な微生物分類群として同定された（envit fit P = 0.002, r² = 0.2751）。この菌種は、年齢の上昇と有意な負の関係を示し、G1グループと強く関連しているようであった。対照的に、有意なフィッティング（envit fit P < 0.005）を持つ他の細菌種は、年齢の増加と正の関係を示し、3つの異なるクラスターを形成した。Prevotella copri（最近Segatella copriに分類された）のようなPrevotella属の菌種が多く、最初のクラスターを特徴付けた。第二のクラスターはBacteroides uniformisとAlistipes putredinisが特徴的で、第三のクラスターはRuminococcus、Roseburia、Faecalibacteriumなど、成人の腸内細菌叢によく見られる多様な細菌属が見られた。これら3つのクラスターは、成人の典型的な腸内細菌型（45）を反映しているようだが、より詳細な種レベルの詳細が得られた。さらに、フィッティング解析により、Ruminococcus属に関連する腸内細菌型3は、ドライバー種の優位性があまり明確でない複雑な細菌群集で構成されている可能性が浮き彫りになった（46, 47）。
年齢パラメーターに加えて、バイオプロジェクトとサンプルの国家に関連する変数が微生物叢組成に及ぼす潜在的影響についてもPERMANOVA分析で検証した。この分析の結果、両パラメーターともq < 0.01となり、統計的有意性が示された。しかし、擬似F値で測定した効果量は、バイオプロジェクトと地理的出身地について、それぞれ16.7と11.4であった。これらの結果は、これら2つのパラメータが微生物叢の構成に統計的に有意な影響を与える可能性はあるものの、その影響は比較的緩やかであることを示唆している。この観察結果は、データセットが異質であることが一因であると考えられる。
ヒトの異なるライフステージに関連する可能性のある特異的細菌パターンの同定
METAnnotatorX2ソフトウェア（42）により、各サンプルの種レベルでの詳細な分類学的プロフィールを得ることができた。詳細には、このプール解析で採用したサンプルサイズにより、各年齢グループ内で年齢特異的なコア微生物叢を同定することができた（表S4）。コア微生物叢のメンバーは、年齢群ごとに、最小有病率50％、平均相対存在率0.1％以上という前提条件で定義された。これらの基準は、この分野の主な基準（48）に従い、種レベルでの分類学的複雑性を考慮して選ばれた。さらに、30％～50％の有病率と0.1％を超える平均相対存在量を持つ種を付属分類群と分類した。各年齢群のコア微生物叢は、G1群が最も単純なコア構成を示し、主にB. longumと大腸菌に代表される7種を含んでいた（表S4）。対照的に、G2、G3、G4グループは、それぞれ68種、57種、63種と、より大きく多様なコア微生物相を示した（表S4）。付随的な分類群もコアと同様の増加傾向を示し、腸内細菌叢は発育初期にはかなりの組成変動を示し、その後年齢が進むにつれて分類学的に安定した状態に移行するという仮説がさらに検証された（2, 23）。
生涯にわたってヒトの腸内細菌叢を構成する主に代表的な細菌種を決定するために、すべての年齢層にわたって中核微生物叢と付属微生物叢の両方に共通する細菌種を選択した（表1）。この広範なスクリーニングにより、すべてのコアに存在する唯一の菌種であるB. uniformisや、アクセサリー分類群として唯一の偏在種であるBacteroides fragilisを含む29菌種が得られた（表1）。注目すべきは、21の分類群がG1グループでのみ付属種として同定され、その後G2、G3、G4グループのコアメンバーへと移行したことである。このパターンは、微生物叢の発達が、分類群の獲得と喪失によって特徴づけられるだけでなく、それらの相対的な存在量の著しい再配列によっても特徴づけられることを示唆している。ある種の微生物が早期に獲得され、その後のライフステージで重要な役割を果たすことから、発生の初期段階における微生物叢の充実が重要な役割を果たすことが明らかになった。さらに、G1年齢群のコア微生物叢を代表する微生物分類群の中で、B. longumのみがG2年齢群でも高い頻度と豊富さを維持し、その後のG3、G4年齢群では減少し、アクセサリー分類群のひとつを構成している。これらの結果は、これらの分類群は寿命を通じて存続するが、動的な相互作用を示し、時間の経過とともに有病率が変化することを示唆した。このダイナミックな共存は、クライマックス状態に達する可能性のある複雑な生態系の形成を示唆している可能性がある(23)。
表1
表1 生涯にわたってヒト腸内細菌叢を構成する主な代表種
有病率50％以上、相対的平均存在量0.1％以上 相対的平均存在量
分類 G1
(N = 3,100) G2
(N = 366) G3
(N = 2,632) G4
(N = 555) G1
(N = 3,100) G2
(N = 366) G3
(N = 2,632) G4
(N = 555)
B. longum 69.71% 75.68% 36.17% 41.44% 9.03% 2.53% 0.55% 1.52
大腸菌 64.84% 43.44% 58.51% 54.77% 6.69% 0.87% 1.33% 2.26
バクテロイデス属 不明種 56.97% 96.72% 92.90% 88.47% 0.66% 1.23% 1.23% 1.19
Clostridium unknown_species 56.84% 96.45% 96.12% 95.86% 0.48% 0.53% 0.60% 0.58
Blautia unknown_species 53.42% 98.09% 98.52% 98.38% 0.58% 1.57% 2.08% 1.57
B. uniformis 51.81% 94.54% 89.40% 88.29% 2.99% 4.10% 3.40% 4.10
Ruminococcus unknown_species 50.58% 97.81% 97.26% 97.48% 0.45% 1.54% 1.68% 1.67
Blautia wexlerae 48.39% 92.62% 87.42% 84.50% 1.82% 1.77% 1.68% 1.45
Bifidobacterium unknown_species 46.87% 60.93% 31.08% 42.16% 0.58% 0.29% 0.11% 0.19
フラボニフラクター・プラウティ 46.87% 83.33% 66.53% 78.38% 0.57% 0.37% 0.29% 0.40
Phocaeicola vulgatus 42.06% 84.43% 72.49% 73.69% 1.31% 1.44% 1.15% 1.12
Bacteroides thetaiotaomicron 40.90% 84.70% 72.72% 73.87% 0.82% 0.78% 0.59% 0.74
Phocaeicola dorei 39.45% 80.60% 63.11% 66.13% 2.05% 1.51% 1.29% 1.37
Eubacterium unknown_species 38.71% 94.54% 95.90% 95.86% 0.26% 0.99% 1.48% 1.29
パラバクテロイデス・ディスタソニス 37.84% 82.51% 69.38% 77.48% 1.67% 1.15% 0.87% 1.07
Enterocloster unknown_species 37.23% 87.98% 90.35% 89.55% 0.12% 0.16% 0.22% 0.21
Roseburia unknown_species 36.74% 93.72% 95.59% 94.05% 0.22% 0.59% 1.14% 0.84
Faecalibacterium unknown_species 36.65% 93.44% 96.01% 94.77% 1.17% 4.11% 3.23% 3.39
Faecalibacterium prausnitzii 36.35% 92.62% 96.05% 93.69% 0.97% 3.41% 2.94% 3.12
Bacteroides xylanisolvens 35.84% 79.78% 56.34% 64.68% 0.52% 0.63% 0.56% 0.55
Phocaeicola unknown_species 35.68% 79.23% 79.71% 74.59% 0.21% 0.48% 0.65% 0.53
Anaerostipes hadrus 34.35% 82.51% 63.87% 58.38% 1.11% 1.23% 1.09% 1.09
B. fragilis 33.58% 43.44% 31.50% 37.48% 2.99% 1.25% 0.43% 0.78
Coprococcus unknown_species 33.55% 87.43% 88.87% 86.31% 0.14% 0.48% 0.75% 0.58
Agathobacter rectalis（旧名 Eubacterium rectale） 31.29% 90.71% 92.86% 87.39% 0.99% 3.23% 4.11% 2.70
Blautia massiliensis 31.03% 84.70% 75.68% 72.43% 0.41% 1.01% 0.77% 0.62
Dorea unknown_species 30.77% 89.89% 89.02% 85.95% 0.12% 0.39% 0.58% 0.41
Bacteroides ovatus 30.35% 68.58% 51.41% 51.53% 0.44% 0.33% 0.22% 0.23
Roseburia intestinalis 30.06% 80.60% 84.38% 81.26% 0.74% 0.65% 1.01% 0.76
a
詳細には、全年齢群にわたって中核微生物叢と付属微生物叢の両方に共通する細菌種のみを報告した。コア微生物叢に属する細菌分類群は太字で強調表示した。
さらに、加齢と有意に関連する細菌種を強調するために、専用の相関分析を行った。スピアマンの順位相関係数に基づく相関分析の結果、年齢と有意な関係（P < 0.01）を持つ分類群が合計104個見つかった（表S5）。これらの分類群のうち、少なくとも1つの年齢群において相対的存在量が有意に高いもの（多重比較分析 Tukey's (honestly significant difference) HSD P < 0.05、図2）に注目した結果、合計45の分類群が得られた。この中から、年齢と負の相関を持つ9分類群と正の相関を持つ36分類群を同定した（図2）。特に、負の相関を示した9つの分類群はG1群に多く、主にBifidobacterium breve、B. longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium pseudocatenulatumなどのBifidobacterium属に属する種に代表され、Veillonella parvula、Ruminococcus gnavus、E. coliなどの乳児期の微生物叢に特徴的な種も含まれていた（11, 12, 38）。注目すべきことに、相関値の増加は、高齢者に対応するG4グループの特徴的な分類群を除いて、年齢の増加に関連する傾向を示した。これらの分類群（Ruthenibacterium lactatiformans、Anaerotruncus unknown_species、Butyricicoccus unknown_speciesなど）は、G4群に多く存在するにもかかわらず、相関値の点でより不均一な分布を示し、この年齢群では腸内細菌叢組成のばらつきが大きくなっていることが示唆された。
図2

図2 細菌種とプール解析に含まれる個体の年齢との相関分析。詳細には、有意なスピアマンの順位相関係数を示し、ANOVA検定分析および多重比較分析Tukey's HSD検定によって算出された年齢群の少なくとも1つにおいて相対存在量が有意に高かった細菌分類群のみを報告した。
生涯にわたる微生物の機能的多様性の探索
健康な糞便サンプル6,653個を生涯にわたって分類学的に分析した結果、異なる年齢群に相関する可能性のある特定の細菌パターンが明らかになった。そこで、各マイクロバイオームサンプルを特徴づける遺伝的特徴を探るために、MetaCycデータベース（49）とEnzyme Commission（EC）分類に基づいて、微生物が駆動する代謝酵素反応のスクリーニングを行った。詳細には、メタゲノム解析によって明らかになった酵素反応を用いて、年齢と有意な関係を示す104菌種との相関解析を行った（上記参照）。その後、各年齢層と統計的に関連した中核および付属細菌分類群と、ヒトの食餌の様々な成分の代謝、または宿主にとって重要な主要微生物代謝産物の代謝に関与する主な主要酵素に焦点を当て（詳細は「材料と方法」を参照）、相関解析を行ったところ、年齢層と腸内細菌叢の代謝能力との間に特定の相関関係がある可能性が浮き彫りになった（図3）。詳細には、機能解析の結果、炭水化物の代謝に関与するECと4つの年齢群を特徴づける細菌種との間に異なる相関関係があることが明らかになり、G1群と比較してG2群、G3群、G4群の類似性がより高いことが強調された（図3）。不思議なことに、EC 3.2.1.23、すなわちβ-ガラクトシダーゼは、G2、G3、G4群と比較して、G1群と有意な正の相関を示した。この結果は、腸内細菌叢の組成と宿主の牛乳ベースの食事との間に関連性がある可能性を裏付けるものである。実際、乳幼児に関連するG1群は、ミルクベースの食事の影響を受けている可能性が高い。β-ガラクトシダーゼは、ミルクに含まれる一般的な炭水化物源である乳糖を分解するのに必須である(50)。同様に、G1グループを代表する細菌分類群は、食物繊維代謝に関与するEC酵素と主に負の相関を示した。この結果は、おそらく乳児の低繊維食と関連している可能性があり(51)、微生物-EC酵素と宿主の食事との関係の可能性を強調している。
図3

図3 プール解析で同定された細菌種と酵素反応との相関分析。赤色は負の相関、緑色は正の相関を示す。ヒトの食事に関与する主な主要酵素のみが統計的有意性を示し、スピアマンの順位相関係数が報告された。
さらに、ビタミンB群の生合成に関連する酵素の分析でも、マイクロバイオームの構成とヒトの寿命との間に特異的な相関関係があることが明らかになった。特にG1群では、G2、G3、G4群とは対照的に、チアミン、すなわち2.7.1.89、2.7.1.50、3.6.1.27、ナイアシン、すなわち2.7.1.23、6.3.5.1の生合成に関与する酵素と正の相関が認められた。この観察から、G1グループを特徴づける微生物群、例えばB. breve、B. longum、B. bifidum、V. parvula、E. coliの重要性と特異性が浮き彫りにされ、これらの微生物群は宿主の生理学的発達に影響を与えるこれらのビタミンの生合成に寄与している可能性がある。
宿主のライフスパンにわたるヒトマイクロバイオームに対する地理的起源の影響の可能性の調査
ヒトの腸内細菌叢における地理的出身地、特に出身大陸に基づく潜在的変異を同定するため、我々はMaAsLin2ソフトウェアに基づき、最も代表的な集団、すなわちヨーロッパ人集団を各対比較の参照として用いて、探索的かつ予備的な多変量統計解析を行った（52）（詳細は「材料と方法」を参照）。解析の結果、微生物叢プロファイルに顕著で有意な違いがあることが明らかになった（表S6）。詳細には、南米とアフリカの個体はヨーロッパの個体よりも有意差が大きく（図4）、北米のサンプルは有意差が最も少なかった（図4）。注目すべきは、南米とアフリカが同様の分類学的相関傾向を示したことで、Prevotella属、Prevotellamassilia属、Treponema属に属する細菌種とは正の相関を示し、Phocaeicola属、Bacteroides属、Alistipes属に属する細菌種とは負の相関を示した。不思議なことに、これらの傾向相関は異なる年齢群間で一貫しており、微生物叢組成がある程度時間的に安定していることを示している。食餌組成に関する正確な詳細が不明であるにもかかわらず、同定された微生物プロファイルは、個体によって異なる生活様式を反映している可能性があるという仮説を立てたくなる。実際、グローバル化の影響をあまり受けず、地元産の伝統的な食品を中心とした食生活を送る傾向があるアフリカや南米出身の人々は、プレボテラ属やトレポネーマ属に属する種が多いという特徴を持つ非都市化集団に近い微生物叢を示すようであった(53-56)。
図4

図4 MaAsLin2ソフトウェアによる細菌種、年齢層、地理的起源に基づく多変量解析。有意な正の相関は赤で、有意な負の相関は青で報告されている。
逆に、ヒトの食事に関与する主要酵素のECクラス構成に基づく多変量解析（図4；表S5）では、南米、アフリカ、アジアの出身者が、ヨーロッパと比較して、それぞれ18、11、11という最も多くの負の相関を有していることが示され、これらの集団のマイクロバイオームにおけるより広範な機能的多様性または異なる生態学的適応が示唆された（53, 57）。さらに、観察された負の相関は、異なる年齢層でも一貫しており、時間の経過とともにマイクロバイオームの機能性が安定したパターンを示すことが示唆された（図4）。これらの結果は、生活習慣が腸内細菌叢に大きな影響を及ぼし、その結果、腸内細菌叢が宿主に様々な影響を及ぼし、一般的にヒトの生涯を通じてその組成と機能性が安定を保つという考え方を裏付けるものと考えられる。これらの予備的な結果は、食事構成、薬物／抗生物質の使用、医療処置などの生活習慣要因に関する詳細なメタデータを含む、より正確なメタゲノム・データセットを用いてさらに調査する必要がある。このような側面をより深く理解することで、マイクロバイオームに対する生活習慣の影響や、ヒトの生涯を通じたさまざまな集団におけるその変動をより適切に解釈できるようになるであろう。
考察
ヒトの腸内細菌叢は、ヒトの健康に重要な役割を果たしていることが広く認識されているため、広範な科学的研究の焦点となっている。しかし、個人の生涯における腸内細菌叢の進化に関する知識は限られている。そこでわれわれは、ヒトの生涯を通じて腸内細菌叢がどのように進化してきたかを、公開データセットと新しいショットガンメタゲノムデータセットを用いてプール解析し、この複雑な生態系のダイナミックな性質を明らかにすることにした。合計6,653検体の糞便を対象としたプール解析では、微生物の多様性は生後間もない時期に増加し、その後青年期には比較的安定することが確認され、マイクロバイオームと宿主の加齢との間の継続的な相互作用が浮き彫りになった。さらに、このプール解析の統計的検出力により、細菌種レベルで加齢に関連したコア微生物叢の可能性を同定することができた。詳細には、人生の初期段階を代表するサンプルは最も単純なコア微生物叢組成を示し、主にB. longumと大腸菌種によって表された。対照的に、青年期と成人期のサンプルは、より広範で多様なコア微生物叢を示し、腸内細菌叢は発育の初期段階で組成がかなり変化し、その後、年齢が進むにつれて分類学的に安定に移行するという仮説を支持した。興味深いことに、初期段階ではアクセサリーとして分類されていた分類群が、その後の段階ではコア構成要素となることが多い。この変遷は、単に分類群の漸進的な獲得と喪失ではなく、相対的な存在量の変化によって特徴づけられる、微生物叢内のダイナミックな再編成を浮き彫りにしている可能性がある。
さらに、ショットガンメタゲノムアプローチにより、腸内細菌叢の機能的能力を調べることができた。具体的には、メタゲノム解析によって、特に炭水化物と繊維の代謝において、年齢と関連した機能的変化が明らかになった。これはおそらく、食事要因に影響されたマイクロバイオームと宿主の共進化を示している。さらに、機能解析から、ビタミンB群の生合成、特に生後間もない時期におけるチアミンとナイアシンの代謝との関連性が明らかになり、神経系や免疫系の機能など、ヒトの生理機能の形成に微生物叢が関与している可能性が示唆された(58, 59)。
さらに、探索的な予備的多変量解析により、ヒトの腸内細菌叢と個人の出身地との関係が調査された。解析の結果、大陸間の微生物叢プロファイルに違いがある可能性が明らかになった。詳細には、南米とアフリカの腸内細菌叢は、他の大陸と比較して明確な微生物組成を示し、おそらくグローバル化の影響を受けにくい伝統的な食生活が関係していると考えられた。これらの傾向は年齢層を超えて持続しており、時間的な微生物相の安定性を示している。同様に、特定のECクラスの解析から、地理的起源に関連した機能的多様性の可能性が示唆された。
このような知見は、ヒトの生涯を通じて腸内細菌叢が宿主と共進化していることを浮き彫りにし、宿主の生活習慣に対する細菌の適応と宿主の生理機能への潜在的影響を明らかにした。とはいえ、さまざまな年齢層にわたるサンプルの不均一な分布や、特に食事組成やライフスタイルに関する詳細なメタデータの欠如は、本研究の限界の可能性を示すものであり、より複雑なメタゲノム解析によって克服されるべきであり、生涯にわたる腸内細菌叢とヒトの健康との間の複雑な相互作用をより包括的に理解することを可能にする。さらに、細菌集団の分類に使用されるゲノムデータベースに基づく現在のアプローチでは、正確な種レベルの同定ができないことが多いが、微生物解析の重要なツールであることに変わりはない。しかし、現在進行中のゲノムデータベースの拡張と強化により、ヒト腸内細菌叢の微生物種同定の精度が大幅に向上することが期待される。このような進歩は、様々なライフステージにおけるヒトの健康における腸内細菌叢の役割の理解を深める上で極めて重要である。このような限界はあるものの、本研究のアプローチは、特にマーカー遺伝子に基づく他の方法（42, 60）と比較して、包括的な細菌プロファイルを得るのに有効であると考えられる。
材料と方法
プール解析に含まれるサンプルの選択と収集
このプール解析に基づく研究では、ヒト腸内細菌叢に関する研究から公開されている79のデータセットを検索し、37カ国から合計6,186サンプルを収集した（表S1）。特に、入力データのばらつきをできるだけ避けるため、イルミナシーケンスプラットフォームで得られたショットガンメタゲノムデータセットを選択した。さらに、Parma Microbiotaプロジェクト（Comitato Etico dell'Area Vasta Emilia Nord、Emilia-Romagna Region、Italy、ID 1107/2020/TESS/UNIPR）の一環として収集された467人のイタリア人成人健常人を含めた（表S1）。これらのイタリアの糞便サンプルは、採取後、直ちにDNA/RNAシールドバッファー（Zymo Research社、米国）で不活化され、その後、パルマ大学のプロバイオゲノミクス研究室に送られ、ショットガンメタゲノムによる細菌DNAライブラリーの解析と、生のシーケンスデータのバイオインフォマティクス解析が行われた。
シャローショットガンシーケンス
メーカーの指示に従い、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を用いてDNAライブラリー調製を行った。まず、各サンプルから1-ngのインプットDNAをライブラリー調製に使用し、断片化、アダプターライゲーション、増幅を行った。次に、イルミナライブラリーを等モルプールし、変性させ、1.5 pMの濃度に希釈した。次に、MiSeq装置（Illumina）で2×250-bp Output Sequencing Kitと1% PhiXコントロールライブラリーの意図的スパイクインを用いてDNAシーケンスを行った。
シーケンスリードの分類学的分類
シーケンシングおよびダウンロードしたリードの分類学的プロファイリングは、METAnnotatorX2バイオインフォマティックプラットフォーム（42, 61）を用いて行った。詳細には、fastqファイルをフィルタリングして、品質が25未満のリードを除去し、100 bp以上の長さのリードを保持した。その後、METAnnotatorX2のマニュアル(42)に従い、Bowtie 2ソフトウェア(62, 63)を用いてヒト宿主DNAのフィルタリングを行った。その後、METAnnotatorX2のマニュアル(42)に従い、National Center for Biotechnology Informationから取得したゲノムを手作業でキュレーションし、前処理したデータベースを用いて、MegaBLAST(64)により100,000リードの分類を行った。
機能予測
配列決定されたリードの機能プロファイリングは、METAnnotatorX2バイオインフォマティックプラットフォームを用いて行った(42, 61)。RAPSearch2ソフトウェア(65, 66)を用いて、MetaCycデータベース(リリース24.1)(49)に基づく代謝パスウェイを明らかにするために、リードの機能分類を行った。
統計解析
ORIGIN 2021 (https://www.originlab.com/2021) およびSPSSソフトウェア (www.ibm.com/software/it/analytics/spss/) を用いて統計解析を行った。詳細には、一対のクラスカル・ワリス検定分析により、種の豊かさとシャノン指数から算出されるアルファ多様性の違いを検証した。さらに、RStudio（http://www.rstudio.com/）の "vegdist "関数（vegan_2.5-7より）を用いて、種の存在量に基づくBray-Curtis非類似度行列によりサンプル間の類似度（β多様性）を算出した。β多様性は、Rsuiteパッケージの "ape "関数(67)を用いてPCoAで表現した。さらに、利用可能なメタデータと検出された様々な細菌種を、それぞれvegan（バージョン2.5-7）の "envfit "関数と "plot "関数を用いて、RStudios（http://www.rstudio.com/）を通してPCoA上で検定し、プロットした。PERMANOVA解析は、PCoA解析における母集団差のP値を推定するために、adonis2パッケージ（vegan_2.5-7より）を用いて、RStudio上で999個の並べ替えを用いて行った。さらに、"rcorr "関数（Hmisc_4.6-0; https://CRAN.R-project.org/package=Hmisc）を用いたスピアマンの順位相関係数を用いて、全サンプルの利用可能なメタデータと検出された様々な細菌種との相関分析を行い、統計的に有意な結果のみを保持した。統計的に有意な結果には、Benjamini and Hochberg補正(68)に基づき、RStudioを用いて "p.adjust "関数（基本パッケージstatsより）を用いて算出した偽発見率（FDR）補正を適用した。詳細には、メタゲノム解析で明らかになった代謝反応と104菌種との相関解析を行ったところ、宿主の年齢と有意な関係を示した。その後、分散分析（ANOVA）検定分析および多重比較分析Tukey's HSD検定により算出された、少なくとも1つの年齢群において有意に高い相対存在量を示した46の細菌分類群、およびヒト乳オリゴ糖、炭水化物、繊維など、乳幼児および/または成人ヒトの食事の様々な成分の代謝、あるいはビタミンB群や短鎖脂肪酸など、宿主にとって重要な主要微生物産物の代謝に関与する主な主要酵素に着目した。
さらに、MaAsLin2ソフトウェア(52)に基づく多変量統計解析を実施し、地理的起源に基づくヒト腸内細菌叢の潜在的変異を同定した。詳細には、多変量解析により、ヒト腸内細菌叢と宿主の地理的出身地との相関の可能性を調査した。解析の統計的検出力を強化するため、出身大陸に焦点を当てた。MaAsLin2ソフトウェアに基づく解析は、出身大陸、微生物叢組成、ヒトの食事に関与する主要酵素のEC組成（上記参照）を考慮し、各年齢層について別々に行った。さらに、各年齢グループの平均サンプル数が多いことを主な理由として、ヨーロッパ人を解析リファレンスとして選択した。その後、少なくとも1つの大陸グループにおいて、全年齢層にわたって有意な統計的相関を示す分類群に注目した。
謝辞
本研究は、"Programma Operativo Nazionale Ricerca e Innovazione" 2014-2020 (PON "R&I" 2014-2020)(プロジェクトARS01_00530)およびParma Microbiotaプロジェクトの一環としてFondazione Cariparmaの支援を受けた。M.V.は、"Fondo per il Programma Nazionale di Ricerca e Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN)", Ministero della Ricerca e dell'Università (20229LEB99)の助成を受けた。F.T.は、PROGETTO Ricerca Finalizzata, Ministero della Salute (RF GR-2018-12365988)の支援を受けた。
本研究の一部は、パルマ大学のハイパフォーマンス・コンピューティング施設を利用して実施。
L.M.：データキュレーション、形式分析、可視化、執筆-レビュー・編集、C.M.：概念化、執筆-レビュー・編集、R.D.B.：調査、データキュレーション、形式分析、F.B.：調査、データキュレーション、F.F.：ソフトウェア、G.A.L.：ソフトウェア、G.A. C.T.：ソフトウェア、A.V.：調査、F.D.C.：監修、A.N.：リソース、A.T.：リソース、O.B.：監修、T.M.：リソース、R.C.：リソース、F.T.：構想および監修、M.V.：プロジェクト管理、構想、執筆-校閲-編集。著者全員が最終原稿を読み、承認した。
補足資料
図S1 - msystems.01294-23-s0001.tif
プール解析のワークフローと、各年齢サブグループの被験者によって同定された種の豊かさ。
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凡例 - msystems.01294-23-s0002.docx
補足資料の凡例
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表S1 - msystems.01294-23-s0003.xlsx
プール解析に含まれる公開バイオプロジェクトのリスト。
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表S2 - msystems.01294-23-s0004.xlsx
プール解析に含まれるサンプルのメタデータ。
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表S3 - msystems.01294-23-s0005.xlsx
Bray-Curtis非類似度行列に基づくPERMANOVA統計解析により、年齢群間の個人間差を算出した。
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10.20 KB
表S4 - msystems.01294-23-s0006.xlsx
プール解析に含まれる被験者について算出された中核および付属微生物叢。
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23.14 KB
表S5 - msystems.01294-23-s0007.xlsx
プール解析で同定された細菌種と酵素反応との相関解析。
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30.01 KB
表S6 - msystems.01294-23-s0008.xlsx
MaAslin2ソフトウェアによる、細菌種、年齢群、および地理的起源に基づく多変量解析。
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