腸内細菌叢は神経変性の可能性をもつバイオフィルム関連アミロイドを産生する

2024年5月17日 16:30

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出版：2024年5月16日
腸内細菌叢は神経変性の可能性をもつバイオフィルム関連アミロイドを産生する

https://www.nature.com/articles/s41467-024-48309-x

アリアドナ・フェルナンデス＝カルベット、レティシア・マティージャ＝クエンカ、...ジャイオネ・バレ著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、論文番号：4150（2024）この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
アミロイド凝集を伴う加齢性神経変性疾患は、現代医学の最大の課題の1つである。消化管マイクロバイオームの変化は、神経疾患の病因において積極的な役割を果たしている。ここでは、腸内細菌叢のバイオフィルム関連タンパク質（BAPs）のアミロイド形成特性と、シヌクレイン病に対するその意味を解明する。ヒト腸内細菌叢から単離した不溶性画分において、BAPがアミロイド様線維として自然に集合していることを明らかにした。BAP遺伝子はアクセサリーゲノムの一部であり、マイクロバイオームの多様性を明らかにしている。驚くべきことに、腸内細菌叢における特定のBAP遺伝子の存在量は、パーキンソン病（PD）の発症率と相関している。培養ドーパミン作動性ニューロンと線虫モデルを用いて、BAP由来のアミロイドがαシヌクレインの凝集を誘導することを報告する。我々の結果は、シャペロンを介したオートファジーがBAPアミロイドによって損なわれることを示している。実際、BAP線維を野生型マウスの脳に接種すると、PDの主要な病理学的特徴が促進される。したがって、今回の研究結果は、BAPアミロイドをα-シヌクレイン症の潜在的な標的およびバイオマーカーとして利用する可能性を立証するものである。

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はじめに
消化管（GI）の微生物叢は、微生物の最大の貯蔵庫（約1000種）を含み、人体で最も豊富なバイオフィルムを構成している1。バイオフィルムでは、細菌細胞が基質に付着し、自己産生された細胞外高分子マトリックス（ECM）を分泌することで、環境や宿主の刺激から身を守っている2。機能性アミロイドは、多様な細菌におけるECMの構造成分である3,4,5。アミロイド線維の整然としたβ鎖構造は、ストレスの多い条件に対する抵抗性をもたらす。また、アミロイド生成タンパク質の重合は、核形成に依存した自己組織化プロセスで起こるため、ECMを構築するためのエネルギー効率の高い戦略である6。バイオフィルム・マトリックスの構成成分として、同定、精製、研究されたアミロイドの数は増えている5。しかし、腸内細菌のバイオフィルムを構成するアミロイドの組成に関するデータは不足しており、健康状態や疾患におけるアミロイドの生物学的役割はまだ不明である。キュリー・フィンブリアは、腸内細菌が産生する細菌アミロイド系の中で最もよく特徴付けられているもののひとつである。アミロイド線維へのタンパク質サブユニット（CsgA）の分泌と重合を厳密に制御するには、csgBAC-csgDEFG遺伝子によってコードされる専用の線維形成装置が必要である7,8,9。完全な細菌ゲノムの利用可能性から、csg遺伝子に相同な配列が、腸内細菌科、プロテオバクテリア属、バクテロイデーテス属、ファーミキューテス属など、消化管微生物叢の最も代表的なメンバーの細菌に広く分布していることが示されている10,11。しかし、腸内バイオフィルムにおけるキュリの存在については議論があり、感染後に検出されるキュリに対する抗体の存在など、間接的な証拠のみがこの主張を裏付けている11,12,13。腸内病原体では、アミロイド形成ドメインを持つ細胞表面タンパク質の、より複雑でないモデル（facultative amyloidsと命名）が報告されている。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のBapと腸球菌（Enterococcus faecalis）由来のEspは、典型的な通性アミロイドである14,15,16。これらのタンパク質はN末端ドメインにアミロイド形成能を持つ短い領域を持つ。タンパク質分解によって切断されると、N末端領域はβシートに富んだコンフォメーションに切り替わり、酸性条件下で重合して、バイオフィルム形成を促進するフィブリル構造を形成する15,16,17,18。BapとEspは、バイオフィルム関連タンパク質（BAPs）と名付けられたタンパク質ファミリーに属する。BAPは高分子量の表面タンパク質である。これらのタンパク質はタンデムリピートのコアドメインを含んでいる。BAPはグラム陽性菌とグラム陰性菌に広く分布し、バイオフィルム形成と病原性に関連した役割を担っている19,20,21。したがって、腸内細菌叢が腸内バイオフィルムの構造成分としてアミロイド様特性を持つBAPを発現しているのではないかと推測したくなる。

アミロイド構造の決定における最近の進歩により、繊維構造の多様性が明らかになってきた22。しかし、多くのアミロイド構造には共通する特徴があるため、アミロイド間の乱雑な種間相互作用の可能性がある。宿主が腸アミロイドに暴露されることで、分子模倣のメカニズムを通じて病気を誘発する機会がもたらされる可能性がある。最近、腸内細菌叢とその変化（ディスバイオーシス）が脳の代謝と機能に影響を及ぼすことが証明された23。さらに、さらに驚くべきことに、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、プリオン病などの神経変性疾患の病因病理学にも、ディスバイオーシスが関与している24,25,26,27。

これらの神経変性疾患はすべて、PD患者ではα-シヌクレイン（α-Syn）、AD患者ではアミロイドβ（Aβ）および高リン酸化タウ、ALS患者ではTDP-43といった、異常に加工された、あるいはミスフォールドしたタンパク質（アミロイド）の沈着を伴う進行性の神経細胞喪失と機能障害を共通して示す。タンパク質のミスフォールディングを引き起こす原因物質や発症の分子基盤は、まだ十分に解明されていない。

ここでは、学際的なアプローチを用いて、腸内細菌叢におけるBAPの分布と神経変性疾患への影響について検討した。同定されたBAPのサブセットについて、一連のインシリコ実験、生化学実験、生物物理学実験、遺伝学実験を行い、アミロイド形成能を検証した。また、ヒトの糞便微生物叢にBAP関連アミロイド凝集体が存在することを示す証拠も得た。in vitroおよびin vivoのα-シヌクレイン障害モデルを用いて、BAPアミロイド形成ドメインがα-シンの凝集を誘導し、PDの主要な病理学的特徴を促進することを証明した。最後に、コントロールとPDの腸内細菌叢から得られた大規模メタゲノムデータを再解析した結果、BAPをコードする遺伝子の存在とPDとの間に相関関係があることが明らかになり、BAPがPDのメカニズムに寄与している可能性が示唆された。

研究結果
BAP様遺伝子はマイクロバイオームのアクセサリーゲノムの一部である
BAPはアミロイド原性ペプチドを産生することが示されている15,16。我々は、ヒトの微生物叢におけるBAP様遺伝子の存在が、ヒトの健康に影響を及ぼす可能性のあるアミロイドの供給源になりうると考えた。ヒト腸内細菌叢におけるBAPの存在を評価するために、BAPファミリーのタンパク質モデルを示すS. aureus Bap配列をクエリーとして用いて、ヒト腸データベース28に対してローカルBLASTP検索を行った。その結果、S. aureus Bapと13～56％の同一性を持つ30個のタンパク質が同定された（表S1）。興味深いことに、これら30個のタンパク質のうち19個が、BAPファミリーを定義するパラメーターである、高分子量の表面タンパク質と繰り返しドメインの存在という基準を満たしていた（図1a）。乳酸菌目（Lactococcus lactis、Lactobacillus acidophilus、L. johnsonii、Enterococcus faecalis、E. faecium、Streptococcus salivarius）、腸内細菌目（Escherichia coli、E. fergusonii、Citrobacter freundii、Enterobacter hormaechei、Chania multitudinisentens、Providencia alcalifaciens）、Bacillales（S. hyicus、Terribacillus goriensis）が多い。

図1：BAP様遺伝子はマイクロバイオームのアクセサリーゲノムの一部である。
図1
a 腸内細菌叢由来のBAP。 b 健常人を含むコホートにおける、マッピングされた100万リードあたりのBAPコード遺伝子のキロ塩基あたりのリード数（RPKM）： MB23986、MB23991、MB24012、MB24013、MB24014、MB24015、MB24359、MB24360、MB24367、MB24368、MB24377、MB24384、MB24385、MB24386およびIBS患者： MB23970、MB23972、MB23974、MB23976、MB23978、MB23980、MB23982、MB23984、MB23987、MB23988、MB23989、MB23992、MB23994、MB23996、MB23998、MB24000、MB24002、MB24003、 mb24004, mb24006, mb24008, mb24010, mb24016, mb24355, mb24357, mb24361, mb24363, mb24365, mb24369, mb24371, mb24373, mb24375, mb24378, mb24380, mb24382. c 分類群の存在量を種レベルで正規化したヒートマップ。

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BLASTP解析によりヒト微生物叢におけるBAPの存在は確認されたが、ヒト集団におけるBAPコード遺伝子の存在量と分布は推定できない。そこで、健常人と過敏性腸症候群患者（IBS）のコホート研究から得られたヒト糞便サンプル中のBAP様遺伝子を定量化するため、ショットガンシーケンスを行った（表S2および表S3）。図1bは、49のヒトサンプルに11の異なるBAP遺伝子が存在することを示しているが、これらの遺伝子を保持すべき細菌種はより広く存在していた（図1c）。これらの結果は、BAP遺伝子がアクセサリーゲノムの一部である可能性を示唆しており、bap遺伝子とesp遺伝子の両方が、それぞれ黄色ブドウ球菌とフェカリス菌の特定の分離株に存在する病原性アイランドにコードされていることを示した先行研究の結果と一致している20。残りのBAP様遺伝子がアクセサリー遺伝子レパートリーに属することを確認するため、パンゲノムアプローチを用いてBAP遺伝子を対応する細菌種のコアゲノムまたはアクセサリーゲノムにマッピングした。この目的のために、メタゲノム解析および単離されたゲノムとそれに対応するパンゲノム解析（https://www.ebi.ac.uk/metagenomics）29のバイオーム特異的コレクションを含むMGnifyプラットフォームを使用した。我々は、Unified Human Gastrointestinal Genome (UHGG) v2.0.1バイオーム30に着目し、対応する生物種クラスターに存在する全ゲノムにおけるBAP様遺伝子の有無を決定した。Supplementary Datasetに示した細菌種の存在／非存在バイナリマトリックスを、対応するBAP様遺伝子リファレンスで照会した。その後、特定の種クラスターにおける特定のBAP様遺伝子を持つ株の割合を計算した。図S1は、E. faecalisと同様に、すべての解析種のBAP様遺伝子が腸内細菌叢のアクセサリーゲノムにコードされていることを示している。グラム陽性菌種のBAP様遺伝子はグラム陰性菌種のものより少ない。これらの結果から、BAP様遺伝子はヒトの腸内に生息する細菌種のアクセサリーゲノムにコードされていることが示された。

BAPドメインはバイオフィルム形成を仲介するアミロイド様構造を形成する
微生物叢由来のBAPオルソログのアミロイド形成傾向を予測するために、5つのよく知られたアルゴリズム、すなわちWALTZ、AGGRESCAN、TANGO、MetAmyl、FoldAmyloid31,32,33,34,35を用いて厳密な計算解析を行った。少なくとも4つのアルゴリズムによって予測されたアミロイド形成領域が、さらなる解析のために考慮された。その結果、BAPはアミロイドの性質に適合するドメインを持つことがわかった（図2aおよび表S4）。C-DAGシステムを用いて、予測されたドメインのアミロイド形成性を確認した36。各タンパク質の最も代表的なドメインを含む22のBAP由来ドメインをクローニングし、pExportプラスミド中でCsgAのシグナル配列に融合させた（図2aおよび表S5）。使用したプラスミドはその後、キメラ輸出に必要なcsgG遺伝子を発現するcurli欠損大腸菌VS39に導入した。また、アミロイド形成ドメインの原型となるS. aureus Bap_BとE. faecalis Esp_Nドメイン、および凝集しないS. aureus Bap_AとE. faecalis Esp_Cドメインも加えた16。細胞外アミロイド様凝集体の存在を解析するため、BAP由来ドメインを発現する菌株のコンゴーレッド（CR）色素結合能を測定した（図2b）。定量的CR結合アッセイを用いて細胞に結合したCRを定量したところ、BAP由来ドメインを発現する大腸菌26株中19株が、pExportプラスミドを含まない大腸菌よりも有意に多量のCRを結合した（図S2a）。アミロイド様線維の存在をさらに確認するため、透過型電子顕微鏡（TEM）で細胞外物質の超微細構造を広範囲に分析した。図2cに示すように、繊維状の細胞外物質はCR陽性株と関連しており（図2c）、これは金標識抗His抗体と特異的に反応した（図S2b）。一方、CR陰性株Bap_CM2では繊維状構造は検出されなかった（図2c）。

図2：BAPドメインはアミロイド様構造を形成する。
図2
a BAPの模式図。N末端ドメイン（AおよびB）、コアCリピートおよびカルボキシ末端ドメイン（D）。色の線は、使用したアルゴリズムのうち5つ（赤）または4つ（オレンジ）によってアミロイド形成性が予測されたアミノ酸ストレッチを表す。ダッシュボックスはC-DAGシステムで発現したアミロイド形成領域を示す。 b アミロイドドメインをエクスポートする大腸菌のコンゴ赤色結合。Bap_B（1）とEsp_N（3）を陽性対照として用いた。Bap_A (2)およびEsp_RC (4)は陰性対照として用いた。 c 陰性染色した繊維状構造の透過電子顕微鏡写真。代表的な実験の画像を示す。pH 7.0（青）および pH 4.5（赤）のリン酸-クエン酸緩衝液に懸濁したアミロイドドメインの同期光散乱（d）、Th-T 発光蛍光（e）および CR 吸光スペクトル（f）。g pH 4.5でインキュベートした後のアミロイドドメインの代表的な透過型電子顕微鏡写真を示す。スケールバー、0.5μm。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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バイオフィルム形成におけるアミロイド形成ドメインの役割を解明するために、予測されるアミロイドドメインの一部と、ペプチドグリカンに固定するためのLPXTGモチーフを含む黄色ブドウ球菌のclumping factor A（R_ClfA）のカルボキシ末端ドメインからなるキメラタンパク質を構築した。キメラタンパク質はバイオフィルム陰性バックグラウンド（S. aureus Δbap）で発現させた。その結果、キメラをS. aureus Δbapで異種発現させると、バイオフィルム形成が誘導された（図S3）。全体として、腸内細菌叢由来のBAPオルソログはアミロイド形成特性を持つドメインを持ち、腸管で発現させるとバイオフィルム形成を仲介する可能性があると結論した。

BAPドメインはアミロイド様特性を持つフィブリルβシートに富んだ構造に集合する
個々のBAPドメインのアミロイド様特性を実験的に証明するために、最も有望な候補（統計的に有意なCR結合を示すもの、p値＜0.01）を選択し、対応する組換えドメインを作製した（図2aおよび表S6）。ネガティブコントロールとして、CR と結合しない Bap_CM2 ドメインを含めた。精製した組換え可溶性タンパク質を酸性および中性pH緩衝液中でインキュベートし、光散乱法によって高分子構造の形成を分析した37。光散乱シグナルの増加は、rBap_TGとrBap_CM2 を除き、試験した条件の少なくとも1つですべての組換えタンパク質で観察され、凝集体は小さいか検出されなかった（図2d）。凝集体の二次構造含量は、アミドI領域（1700-1600 cm-1）のFTIRスペクトルを記録することで評価した。スペクトルをデコンボリューションすると、ほとんどの場合、シグナルは1620-1630 cm-1に発生するバンドが支配的で、これは分子間βシートの存在に起因することがわかった（図S4）。このシグナルは、pH 4.5におけるほとんどの凝集体の吸光度スペクトルに最も寄与していた（図S4a, b）。rBap_LL、rBap_FM、rBap_CIでは、中性pHで約1625cm-1のバンドがスペクトルを支配している。興味深いことに、反平行βシートバンド（～1690 cm-1）はrBap_CF、rBap_ECl、rBap_LAでのみ検出され、検出されたβストランドは平行分布をとる傾向があることが示唆された（図S4）。全体として、我々のデータは、BAP由来のアミロイド原性ドメインが超分子βシートに富んだ構造に集合していることと一致している。次に、アミロイドを示す色素Thioflavin-T（Th-T）とCRを用いて、検出された凝集体のアミロイド性を確認した。rBap_LL、rBap_FM、rBap_CI、rBap_EFg、rBap_LAドメインでは、中性および酸性条件下でインキュベートした後、強いTh-T蛍光シグナルが観察された（図2e）。一方、rBap_EFm、rBap_CFおよびrBap_EClは、酸性条件下でインキュベートするとTh-T蛍光発光強度がわずかに増加した。rBap_LL、rBap_FM、rBap_CIおよびrBap_LAは、中性および酸性のいずれのpH値においても、スペクトルが〜540 nmにレッドシフトした（図2f）。一方、rBap_EFm、rBap_EFgおよびrBap_EClは、酸性pHでインキュベートした場合にのみCR結合を示した（図2f）。これらの結果は、Th-T蛍光シグナルの発光と一致している。中性条件下では、rBap_LJでスペクトルのわずかな赤方偏移が観察された。最後に、アミロイド様凝集体の形態学的特徴をTEMを用いて調べた。陰性染色により、rBap_LL、rBap_FM、rBap_CIおよびrBap_LAは、中性および酸性のpH条件下で、線維状の特徴を持つ超分子構造に会合することが明らかになった（図2gおよび図S4c）。フィブリルの長さは3μm（rBap_LLとrBap_LA）から0.2μm（rBap_EFg）であった。rBap_SS2, rBap_LJ, rBap_CM2を除き、残りのタンパク質は酸性pHで基本的に原線維形態を示した（図2g）。まとめると、この結果は、線維状および原線維状アミロイド様構造の形成が、ほとんどのBAP由来のドメインに内在する特徴であることを示している。rBap_LJ、rBap_SS2およびrBap_TGによって形成されたBAPドメインは、少なくともアッセイした条件下ではアミロイド特性を示さなかった。

BAPアミロイド様構造はヒト糞便微生物叢に存在する
組換えBAPがアミロイド様線維を形成することを証明した後、これらのアミロイド構造がヒトの腸内で自然に検出されるかどうかを考えた。そこで、メタゲノム解析に用いたのと同じコホートの糞便サンプルを密度勾配と微分遠心分離にかけ、糞便微生物叢を分離し、その後に不溶性タンパク質画分を精製した。アミロイド線維が洗剤に溶けないことを利用して、サンプルを1％SDS中で数回インキュベートし、純度を高めた。次に、フィルター保持アッセイを用いて、SDS安定アミロイドの存在を検査した。酢酸セルロース膜はアミロイド凝集体を保持するが、可溶性タンパク質はフィルターを通過する38。BAP（E.faecalis由来のEsp_N、S.aureus由来のBap_B、L.lactis由来のBap_LL、L.acidophilus由来のBap_LA）に対する抗体を用いた免疫学的検出により、Espのアミロイド様繊維がサンプルの26％（8/30）、Bap_LLがサンプルの3％（1/30）、Bap_LAがサンプルの6％（2/30）で検出された（図3および図S5a）。予想通り、Bap_Bはヒト腸内細菌叢サンプルからは検出されなかった。アミロイドシグナルの特異性は、BAP陽性サンプルのギ酸処理およびトリフルオロ酢酸／ヘキサフルオロイソプロパノール処理に対する感受性を調べ（図S5b）、また広域抗生物質処理で腸内細菌叢を枯渇させたマウスの糞便サンプルを用いて決定した（図S5c）。また、BAP陽性のアミロイドサンプルの大部分が、CsgAオリゴマー39を含む一過性の折りたたみ種を認識する抗アミロイドオリゴマー（A11）抗体、および／またはアミロイド線維に共通し、プレフィブリルオリゴマーには存在しないエピトープを認識する抗アミロイド線維OC抗体とも反応することが示された（図3および図S5d）。これらの結果はすべて、ヒト微生物叢の不溶性画分にアミロイド形成特性を持つBAP構造が存在することを示している。

図3：BAPアミロイド様構造はヒト糞便微生物叢に存在する。
図3
a フィルタートラップとドットブロットアッセイを用いたヒト糞便サンプル中のアミロイドの検出。SDS耐性アミロイドを、酢酸セルロース膜を用いた96ウェルドットブロット装置で真空ろ過した。その後、BAPに対する4種類の抗体を用いてイムノブロットを行った： Esp_N、Bap_LL、Bap_B、Bap_LA。抗アミロイドオリゴマー（A11）および抗アミロイド線維OC抗体は、アミロイドコンフォメーションを検出するために使用した。

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BAP由来のアミロイド形成ドメインは、線虫PD筋モデルにおいてヒトα-Synの凝集を促進する。
BAP由来のドメインがアミロイド様構造を形成することから、これらのドメインがα-Syn凝集を異種的に誘導できるかどうかを調べた。PD40のモデルとして線虫C. elegans NL5901を用いた。線虫NL5901にC-DAGシステムから得た個々の大腸菌VS39株を与え（図2b）、α-Syn凝集を評価することにより、PD発症に対するBAP関連アミロイドドメインの影響をスクリーニングした。α-Syn凝集体の数を定量したところ、BAP由来のアミロイド様線維を与えた線虫の大部分は、大腸菌VS39を与えた動物よりも、目に見えるα-Syn凝集体の数が有意に多かった（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001）（図4a, b）。興味深いことに、非アミロイドドメインBap_CM2を発現する大腸菌を与えた線虫は、α-Syn凝集体の数の増加を示さなかった。さらに、α-Syn凝集体の増加が動物の体力に影響するかどうかを調べるため、液体培地中で運動アッセイを行った。線虫のスラッシング（単位時間あたりの体の屈曲回数41）を測定することにより、α-Syn凝集体を蓄積した線虫の大部分（70%）は、大腸菌VS39を与えた動物に比べて運動性が損なわれていることが示された（図4c）。アミロイド特性に対するBAPの影響を制限し、細菌背景に関連するバイアスを回避するため、線虫NL5901の通常給餌プレートに非病原性大腸菌OP50株を添加した。大腸菌OP50株に、プロトタイプBAPアミロイドBap_BとEsp_N（rBapB-PFFとrEspN-PFF）、単量体Bap_BとEsp_Nタンパク質（rBapB-MONとrEspN-MON）、非アミロイドドメインrBap_CM2のプレフォームドフィブリル（PFF）を添加した。線虫NL5901を蛍光顕微鏡で分析すると、あらかじめ形成されたBAPアミロイドを与えた動物ではα-Syn凝集体の数が有意に増加したが、rBapB-MON、rEspN-MON、rBap_CM2を与えた線虫では増加しなかった（***p < 0.001; *p < 0.05）（図4d, e）。免疫蛍光の結果と一致して、生化学的解析では、BAPアミロイド様線維を与えられた線虫においてα-Synタンパク質のレベルが増加していることが明らかになった（図4fおよび図S6a）。驚くべきことに、α-Syn RNA発現レベルは影響を受けなかった（図S6b）。以上の結果から、腸内細菌叢由来のBAPアミロイドは線虫PD筋モデルにおいてα-Syn凝集を誘導することが示された。

図4：BAP由来のアミロイド形成ドメインは線虫PDモデルにおいてヒトα-Syn凝集を促進する。
図4
a BAPアミロイドを発現する大腸菌VS39を与えた線虫NL5901の頭部で蛍光顕微鏡により得られたα-Syn筋凝集体の代表的な画像。スケールバー、10μm。 b ワームあたりのα-Syn筋封入体の定量化。Bap_EFm, Bap_ECl (N = 18); Bap_FM, Bap_LL (N = 16); Bap_LJ, Bap_PA, Bap_CM2 (N = 12)を除き、各条件につきN = 25匹。 c 1分間あたりの屈曲数（BBPM）としてワームを破砕する表現。Bap_LA, Bap_EFr, Bap_SH (N = 21); Bap_FM, Bap_LJ (N = 18); Bap_CI, Bap_EFm, Bap_ECl, Bap_PA, Bap_CM2 (N = 13)を除く各条件につきN = 25匹。 d 組換えBAPタンパク質を与えた線虫NL5901におけるα-Syn凝集体の代表画像。e ワームあたりのα-Syn筋内封入体の定量。rBap-PFF（N = 15）、rEspN-PFF（N = 18）、rBapB-MONおよびrEspN-MON（N = 12）、非アミロイドドメインrBap_CM2（N = 18）。f Bap_BおよびEsp_Nアミロイドを発現させた大腸菌を与えた線虫NL5901のタンパク質画分におけるα-Syn:YFPの免疫検出（上図）。矢印はα-Syn単量体を、*は亜単量体を示す。α-Synの検出には抗GFP抗体を用いた。染色したSDS-PAGEをローディングコントロールとして用いた（下パネル）。パネル（図4b、c、e）については、データは平均値で示し、エラーバーは平均値のSEで示した。パネル（図4b、c、e）については、データは一元配置分散分析（***p < 0.0001）とボンフェローニの多重比較検定を用いて分析した。すべてのパネルについて、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。MW; 分子量。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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プロトタイプBAPアミロイドはヒト神経細胞において細胞内α-syn凝集体の形成を誘導した
BAP様アミロイドが交差播種プロセスにおいてα-syn凝集に直接影響を与えるかどうかを調べるために、rBapB-PFFまたはrEspN-PFFを超音波処理した後に生成した種子を、それらが自己凝集する濃度よりも低い濃度でin vitroで単量体α-synとインキュベートした（図S7a）。予め形成されたフィブリル（α-Syn-PFF）の添加を陽性対照として用いた。その結果、Bap_BとEsp_Nアミロイドはα-Syn-PFFと同様にα-Synの線維化を促進した（図5a-c）。α-Syn凝集に対するrBap-PFFの効果は用量依存的であり、あらかじめ形成された線維の超音波処理によって生じた小さなシードが必要であった（図S7b）。一方、ヒトα-Synを過剰発現し、ニューロンに分化するヒト神経芽腫細胞株SH-SY5Yを用いて、in vivo交差播種を試験した42。まず、BAPアミロイドは細胞の生存率に影響しないことが示された（図S8a）。次に、あらかじめ形成されたアミロイド線維がニューロンに取り込まれるかどうかを調べた。そのために、分化したSH-SY5Y細胞をGFPタグ付きrBapB-PFFと24時間インキュベートした43。経時的な蛍光顕微鏡分析により、処理後6時間で、内在化したrBapB-PFFがLysoTrackerTM Redと共局在することが明らかになった（図S9a）。この観察から、BAPアミロイドは内在化され、エンドソーム経路を経て核周辺リソソームに向かって処理される可能性が高いことが示唆された。次に、細胞内のBAP様アミロイドがα-Synの凝集を誘導するかどうかを調べた。rBapB-PFFとrEspN-PFFを添加し、細胞を10日間培養した後、免疫蛍光顕微鏡で、分化した細胞で形成された大きな核周囲封入体を含むα-Syn凝集体の形成を確認した。対照的に、未処理細胞および単量体BAPタンパク質、非アミロイドドメインrBap_CM2とインキュベートした細胞では、分散した小さな凝集体がわずかに観察された（図5dおよび図S9b）。α-Syn凝集体の定量から、細胞あたりの凝集体数はBAP線維で処理した場合に有意に多いことが示された（図5e）。次にBAPアミロイドがα-Synと共局在するかどうかを調べた。蛍光色素ProteoStat（rBapB-PST）で標識したBAPアミロイドを用いてSH-SY5Y細胞を処理した15。α-Synの免疫染色により、rBapB-PSTとα-Synの共局在が観察された（図5f）。rBapB-PSTシグナルとの合併の可能性を避けるため、免疫蛍光二重染色によってBAPとα-Synの共局在を直接可視化した。再び、BAPアミロイドはα-Synと共局在し、rBapB-PFFシグナルとα-Synシグナルは完全に重なって見えた（図5f）。

図5：BAP由来のアミロイドは、SH-SY5Y細胞におけるα-Synの凝集と毒性シヌクレイン症を悪化させる。
図5
a PBS（N＝3）、rBapB-PFF（N＝4）、rEspN-PFF（N＝4）およびα-Syn-PFF（N＝3）（10：1モル比）存在下でのα-Syn凝集を、Th-T蛍光により経時的に測定した。指数関数的ラグフェーズ（b）および半値最大値（c）に達するまでの時間。データは、Dunnettの多重比較検定による一元配置分散分析を用いて解析した。***d BAPアミロイドで10日間処理したSH-SY5Yにおけるα-Synの免疫染色。ハイライト部分の高倍率を示す。e 細胞あたりのα-Syn封入体の定量。SH-SY5YをrBapB-PFF（N = 34）およびrEspN-PFF（N = 37）で処理した。陰性対照として、単量体rBapB-MON（N = 32）、rEspN-MON（N = 30）および非アミロイドドメインrBap_CM2（N = 20）を用いた。f Bap-PST（左パネル）または抗Bap抗体（右パネル）を用いたBapBとα-Synの共局在化。下段にはハイライト領域の拡大図を示す。g pS129-α-Syn陽性SH-SY5Y細胞の割合。rBapB-PFF（N = 23、細胞数 N = 329）；rEspN-PFF（N = 25、細胞数 N = 310）；Ø、非処理（N = 21、細胞数 N = 328）。 h pS129-α-Syn（赤）および全α-Syn（緑）免疫染色の代表的な画像。強調領域の高倍率を下のパネルに示す。i BAPアミロイドで処理したSH-SY5Y細胞抽出物中のα-Synの検出。無染色ゲル部分をローディングコントロール（LC）として示す。MW；分子量。データは一元配置分散分析（***p < 0.0001）を用い、Bonferroniの多重比較検定で分析した（e-g）。すべてのパネルについて、データは平均値で示し、エラーバーは平均値のSEで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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内因性α-Syn凝集体の特徴をさらに明らかにするために、セリン129でリン酸化されたα-Syn（P-S129）に特異的な抗体を用いて、rBapB-PFFおよびrEspN-PFFで処理したSH-SY5Y細胞をプローブした。α-Synのこの翻訳後修飾は、PD脳のレビー小体に見られる。免疫蛍光染色により、P-S129α-Syn陽性細胞の数は、rBapB-PFFおよびrEspN-PFFアミロイド添加後、未処理の対照細胞よりも有意に多いことが確認された（図5g, h）。興味深いことに、P-S129α-SynはrBapB-PFFまたはrEspN-PFFで処理したニューロンの核に強く蓄積した（図5h）。最後に、Triton X-100可溶性およびTriton X-100不溶性細胞溶解画分のイムノブロット解析により、BAP由来のアミロイドとインキュベートした細胞の不溶性画分に、より高レベルのα-SynおよびP-S129 α-Synが存在することが確認された（図5iおよび図S10）。BAPアミロイド様凝集体で処理すると、SH-SY5Y α-Syn細胞においてリン酸化凝集体の数が増加することから、この細胞培養モデルにおける内因性α-Syn凝集体はレビー小体様の特徴を示すと結論した。

BAP様アミロイドの脳内接種によりα-シンの病態生理が促進される
BAPは線虫のPDモデルでも神経細胞でも可溶性内因性α-Synの凝集と線維化を効率的に促進することから、我々はBAP様アミロイドがマウスモデルにおいてα-Syn病態とPDの特徴を誘導するかどうかを検討した。これまでの研究で、マウスに線維状α-Synを脳室内に注射すると、パーキンソン病（PD）様のレビー小体（LB）病態が誘導されることが証明されている44,45。これに基づき、C57BL6/C3H F1マウスの線条体に注入したrBapB-PFF（10μg/マウス）の短期安定性を測定した。注射後24時間および72時間におけるBap凝集体の免疫染色解析から、rBapB-PFF凝集体は安定であり、注射部位以外の部位に局在していることが示された（図S11a-c）。マウスの運動機能を長期的に解析した結果、rBapB-PFFの脳内注射により、細かい運動能力が損なわれることが示された（図6a）。アミロイドrBapB-PFFを単回注射した動物は、負の走性試験において、注射後90日で始まり、180日（p≦0.05）および210日（p≦0.05）で有意になる進行性の成績低下を示し、60日（p≦0.05）で早期のロータロッド欠損を示し、210日（p≦0.05）まで維持された（図6a）。さらに、rBapB-PFFを注射したマウスは、ワイヤー懸垂試験の成績が悪かった（図6a）。これらの行動変化は、線条体後部のドーパミン作動性神経支配の片側喪失（18％；＊p≦0.05）（図6b, e）とSNpcのドーパミン作動性ニューロンの26％喪失（＊p≦0.05）（図6c, f）と関連していた。さらに、同側線条体では神経細胞密度（NeuN染色で観察）が有意に10％減少した（*p≤0.05）（図6d）。その結果、同側の扁桃体におけるリン酸化α-Syn染色の増加は統計的に有意ではなかった（図S12a）。しかしながら、rBapB-PFF投与マウスの同側および対側のSNpcでは、対照マウスよりも有意に高いレベルのリン酸化α-Synが観察された（*p≦0.05）（図6g、h）。同側のSNpcでミクログリアの活性化（Iba-1染色）またはアストロサイトの活性化（GFPA染色）の有無を評価した。Iba-1およびGFAP陽性細胞はrBapB-PFF注射マウスでは影響を受けなかったことから、神経変性はBap線維に対する神経炎症反応とは無関係であることが示唆された（図S11d、eおよびS12b）。細胞培養モデルにおけるサイトカイン放出の解析からも、BAPアミロイドは炎症活性化を引き起こさないことが示唆された（図S8b）。これらの結果から、BAPアミロイドはα-Syn病態を悪化させ、微細運動障害を引き起こすことが示唆された。

図6：BAP様アミロイドの脳内接種により、C57BL6/C3H F1マウスのα-Syn病態生理が亢進する。
図6
a 振り向き時間、ワイヤーハング、騎乗時間を定量化することにより運動機能を評価。青い棒はrBapB-PFFを注射したマウス。N = 12. 両側検定なしのt検定、*p = 0.031, **p = 0.0023, *p = 0.038, *p = 0.0177, **p = 0.005, *p = 0.049, *p = 0.0178。棒グラフは平均値および平均値の標準誤差を表す。b前線条体TH神経支配は光学密度により定量した。Ø、N=5；rBap-PFF、N=11。**c SNpcにおけるTH免疫反応性ニューロンの立体構造学的定量化。Ø、N=7；rBap-PFF、N=11。*d 線条体NeuNを光学密度により定量した。Ø, N = 5; rBap-PFF, N = 7。*e 線条体後部のTH染色の画像。 f SNpcの冠状切片におけるドーパミン作動性ニューロンのTH染色。 g rBapB-PFF注射マウスの同側（IL）SNpcにおける神経細胞内リン酸化α-Syn封入体の代表画像。 h 中脳の対側（CL）およびILにおけるSer129リン酸化α-Syn濃度測定の定量化。Ø、N = 6; rBapB-PFF、N = 10。**p = 0.047、*p = 0.011。データは両側Mann-Whitney検定を用いて解析した（b-d, h）。 i α-syn、hsc70、lamp2A遺伝子のmRNAレベル。N = 5, **p = 0.0041. j α-SynとLAMP-2Aの発現を分析したウェスタンブロット。 k β-アクチンを基準として、α-SynとLAMP2Aの総レベルを定量した。N = 5, *p = 0.0476, **p = 0.004。データは片側Mann-Whitney検定を用いて解析した（i, k）。 l α-Syn半減期の平均。α-Synの消失は3回の実験の平均値として定量した。*n SH-SY5Yにおけるα-SynおよびLAMP-2A発現を分析したウェスタンブロット。 o β-アクチンを基準にして、総α-SynおよびLAMP2Aレベルを定量した。N = 3, p = 0.05。データはKruskal-WallisとDunnの多重比較検定を用いて解析した（l, o）。すべてのパネルにおいて、データは平均値で示され、エラーバーは平均値のSEである。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。マウスにrBapB-PFF（赤棒）、単量体rBapB-MON（灰色棒）またはPBS（白棒）を静脈内注射した。分子量。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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α-Syn病理学に関連するメカニズムを調べるために、BAPアミロイドで処理したマウスの中脳におけるα-Syn mRNA発現レベルを評価したところ、それは影響を受けていないことがわかった（図6i）。しかし、α-Synタンパク質発現レベルは有意に増加した（78％；p≦0.05）（図6j, k）。ヒト由来のドーパミン作動性細胞では、α-Synは主にシャペロンを介したオートファジー（CMA）によってリソソームで分解される。BAPアミロイドを投与したマウスの中脳で、CMA経路の2つの主要タンパク質、LAMP-2AとHsc70のmRNA発現量を測定した。LAMP-2A 発現タンパク質レベルの減少（19％；P≤0.05）に伴い、lamp-2a mRNA発現の有意な減少（55％；P≤0.05）が見られた（図6i-k）。BAPアミロイドによってCMAが損なわれたことを確認するために、細胞モデルでα-Synターンオーバーを評価した。対照条件下ではα-Syn半減期は36.6時間であったが（図6l、m）、rBapB-PFF暴露によりα-Syn半減期は57.8時間（57％；p≦0.05）に有意に増加し（図6l、m）、それに伴ってα-Syn発現レベルも増加した（103％；p≦0.05）（図6n、o）。α-Synターンオーバーの減少は、LAMP-2A発現レベルの減少（21％）と関連していた（図6n, o）。この結果は、細胞および動物モデルにおいて、アミロイドrBapB-PFFによってCMA活性が損なわれることを示している。

特異的BAP遺伝子はPD患者のマイクロバイオームに濃縮されている
BAPがPDに関連した病態を誘発すること、およびBAP遺伝子が微生物群のアクセサリーゲノムにコードされていることから、特定の菌株のみがBAPアミロイドを産生する可能性があることを考慮して、BAPをコードする遺伝子の存在がPDを患う患者と関連しうるかどうかを調べた。この目的のために、PD患者490人と神経学的に健常な対照234人のコホートを対象とした最近の大規模メタゲノム研究を利用した46。メタゲノミクスデータの包括的解析を行い、BAP様遺伝子領域の存在と、その存在がPDと関連しているかどうかを調べた。メタゲノミックショットガンシークエンス生データ（BioProject ID PRJNA834801）を再解析し、表S2に示したBAPコード遺伝子の存在を確認した。

二項ロジスティック回帰の結果、PD患者はbap_FM（OR：2.2、p＜0. 05）、esp（OR：3.2；p＜0.01）、bap_EFm（OR：4.6；p＜0.01）、bap_ECo（OR：1.7；p＜0.05）、bap_EFg（OR：1.9；p＜0.01）およびbap_LJ（FC：2.6；p＜0.001）といったBAP遺伝子を有するオッズ比が有意に高かった（図7a）。また、PDメタゲノム46で実質的に濃縮されていることが示されているcsgA遺伝子の濃縮（OR: 1.5; p < 0.05）も見いだされた。解析は性別、年齢、収集方法、総配列数などの変数で調整し、bap_EFm、esp、bap_EFm、bap_ECo、bap_EFg、bap_LJなどのBAP遺伝子とPDとの関連について有意性を保持した（表S7およびS8）。BAP遺伝子は神経学的に健常な対照群でも認められたが、サンプルあたりのこれらの遺伝子の存在量（RPKM）はPD患者よりも有意に低かった（図7bおよび表S9）ことから、微生物叢におけるBAPコード遺伝子の濃度も考慮すべき変数であることが示唆される。あるいは、BAPコード株を保有する神経学的に健康な対照群が、将来PDを発症する可能性も否定できない。結論として、これらの結果は、いくつかのBAP遺伝子がPDと関連している可能性を確認し、これらの遺伝子をPD疾患のバイオマーカーとして使用する可能性を開くものである。

図7：PD患者のマイクロバイオームでは特定のBAP遺伝子が濃縮されている。
図7
a パーキンソン病患者（PD）（N = 490）と神経学的に健常な対照（NHC）（N = 234）の腸内細菌叢の細菌種におけるbap遺伝子の存在割合。データは、Rの二項分布によるglm()関数を用いた二元ロジスティック回帰により再解析した：オッズ比：95％CI：95％信頼区間；P：P値。b メタゲノムデータ解析から得られたNHC患者とPD患者のRPKMのlog2として計算された相対存在量を報告するバイオリンプロット。BAP陽性サンプルを解析対象とした。PD群とNHC群間のRPKMにおける統計的に有意な差を同定するために、MaAsLin2検定を用いて線形回帰を行った。多重検定補正にはBenjamini-Hochberg FDR法を用いた。対照としてcsgAの相対量を用いた；esp, **p = 0.003; bapEFm, **p = 0.002; bapLJ, ***p = 0.0001; bapEFm, *p = 0.016; bapECo, *p = 0.014; csgA, *p = 0.015。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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考察
神経微生物学の分野の出現に伴い、腸内バイオフィルムに発現・分泌されるアミロイドは、神経変性に関連する活性分子として働くことが提唱されてきた47,48,49。しかし、消化管のアミローム全体の解析は見落とされており、疾患における腸アミロイドの役割を明らかにすることを目的とした研究はまだ不足している。ここで我々は、腸内細菌叢におけるBAPアミロイド様構造の存在を同定し、α-Syn凝集と病理に影響を及ぼすことを明らかにした。さらに、BAP関連遺伝子の濃縮がPDメタゲノムの特徴であると思われる証拠を提供する。

多細菌のバイオフィルムは、消化管表面と相互作用することが示されている50,51,52。バイオフィルムは主に回腸と盲腸に見られ、それほどではないが遠位結腸にも見られるが、糞便粒子にも付着している53,54。ほとんどの関連研究は、腸内バイオフィルムの一部を形成する細菌の組成を決定することに焦点を当てているが、バイオフィルム・マトリックスの構成要素に関する知識は不完全である。完全な細菌ゲノムが利用可能になったことで、バイオフィルム関連タンパク質が腸内細菌に広く分布していることが明らかになった（図1a）。グラム陽性菌由来のBAPは、主にN末端領域に凝集しやすいドメインが予測されるモジュール構造を持っている。タンパク質分解によってアミロイド形成ペプチドを含むN末端ドメインが遊離され、その後アミロイド様線維構造に自己集合する。逆にグラム陰性菌では、BAPは凝集しやすいと予測されるドメインを持つタンデムリピートコアを示すように進化してきた。これらの非常に大きなタンパク質のアミロイドドメインが線維状構造へと集合する正確なメカニズムは不明である。タンデムリピートに局在するアミロイドになりやすい領域の存在は、リピートユニット間の分子間および分子内相互作用を促進し、タンパク質のアミロイド傾向を高め、結果として生じる線維の安定性を高める可能性がある55。

消化管のpHは非常に変化しやすく、胃管では1.7から4.7、小腸では5.9から7.8、大腸ではpH5からpH8の間で変動する56。pH値は宿主の細菌コロニー形成とバイオフィルム形成を左右する15,16,57,58。BAPのアミロイドドメインのほとんどは酸性の等電点を持ち（表S6）、酸性のpHで正味の電荷を持たないことが、タンパク質の可溶性状態からアミロイド様状態への変換を促進することを示唆している。注目すべきことに、Bap_LL、Bap_FM、Bap_CIは中性pHでもアミロイド形成挙動を示した。この発見は、細菌が様々な微小環境に適応できるようにするための重要な選択的利点である可能性がある。

我々は、ヒトの糞便サンプル中にBAPに関連したアミロイド生成構造が存在することを証明した。我々の知る限り、これはヒトの腸内細菌叢における細菌性アミロイドの存在を示す主要な実証の一つである。in-vivo感染モデルを用いて、消化管にカーリー構造が存在することが証明されたのみである11。しかし、カリーアミロイドの発現は、実験室では体内の温度よりも低い温度で誘導されるため、生体内でのカリーアミロイドの産生は疑問視されてきた。フィルタートラップ保持アッセイを用いて、腸内細菌叢から分離したSDS不溶性タンパク質画分中に、ギ酸およびTFA:HFIP処理に感受性を示すBAPアミロイド様構造を検出した。Espのアミロイド領域に対する抗体とアミロイドコンフォメーション抗体A11およびOCを併用することにより、Espアミロイド形成性構造の存在が明らかになった。解析は、健常人と過敏性腸症候群（IBS）患者のコホート研究から得られた便サンプルに対して行われた。IBS患者は健康な患者に比べてPD発症リスクが48％高い59,60。便秘はIBSの主な症状であり、腸管透過性の変化とマイクロバイオームの乱れがこの疾患の病因に関与している。同様に、消化管機能障害、特に便秘はPDにおける非運動性の症状であり、かなりの割合の患者において、運動症状の発現に数年先行する61。したがって、IBSはPDの前駆症状を規定する可能性があり、IBS患者のマイクロバイオームを解析することで、PDの発症や進行の引き金となる病因因子を同定できる可能性がある。本研究では、IBS患者の糞便サンプルからBAP関連アミロイドを同定した。さらに注目すべき点は、A11陽性10検体のうち8検体がIBS患者のものであったことである。従って、これらの患者を追跡調査し、IBS患者におけるアミロイドの存在とPD発症との関連性を明らかにすることは非常に興味深い。

神経変性疾患患者ではマイクロバイオームが変化しており、特定の微生物種の相対的存在量が機能的症状の重篤度と相関していることを示す研究が増えている62,63,64,65,66,67,68。PDの場合、30％の微生物種、遺伝子、パスウェイの存在量が変化していた46。研究間で一貫した所見として、PD患者ではラクトバチルス属、エンテロコッカス属、腸内細菌科のメンバーが増加している46,69,70。口腔や腸内で緩徐に増殖するバイオフィルムを形成するF. magnaは、PD患者の糞便中にも濃縮されている71。我々の研究から、BAP遺伝子はPD関連細菌種のアクセサリーゲノムの一部であることが示された。興味深いことに、PDメタゲノムにおいてBAP遺伝子の存在と存在量の濃縮が検出された。BAP遺伝子はマイクロバイオームのアクセサリー領域に位置しているようであり、特定の菌株のみがBAPアミロイドを産生できることを示唆している72。したがって、PDに関連するいくつかの菌種が発現するアミロイドが、この疾患の引き金および／または悪化させる重要な因子として作用しているのではないかと推測したくなる。対照群のマイクロバイオームでBAPアミロイドが検出されたという事実は、病原性アミロイドが病態を誘発するには腸内で閾値濃度に達する必要があることを示唆している。この仮説は、α-Synの交差播種が濃度依存的であることからも支持された（図S7）。BAPアミロイドの閾値濃度は、腸関門の擾乱を引き起こしたり、細菌組成の変化を誘導することによって腸内細菌コンソーシアムの生理機能を調節したり、あるいは種間アミロイド凝集を促進したりするなど、腸に付随的な影響を及ぼす可能性もあり、これらすべてが疾患発症を助長する環境を促進する可能性がある。

最近の研究では、多種多様なアミロイド繊維構造が存在することが示されているが22、細菌の機能性アミロイドは、特定の状況において中枢神経系（CNS）で病理学的な役割を果たしうる、ヒト分子の正統的な分子模倣体であると考えることができ、ヒトアミロイドタンパク質の重合の核となったり（交差播種）、炎症反応の呼び水となったりする47,49,73。これはクルリとヒトアミロイドAβの場合であり、どちらもTLR2依存性の機序によってマクロファージとミクログリアにおけるNos2産生（炎症の特徴）を刺激する74,75。しかし、このプロセスは、BAPアミロイドがα-Syn凝集を誘導する中心的なメカニズムではないようである。rBapB-MONまたはrBapB-PFFを間質注入してから72時間後、黒質pars compacta（SNpc）に神経炎症反応が見られなかったことから、LPS注入によって誘発されるものと同様の炎症機序は除外された76。さらに、rBapB-PFFを注射しても、注射から7ヵ月後には長期的なグリアの活性化や炎症マーカーの増加は見られなかった。しかし、PD発症における神経炎症の関与は、in vivo研究や死後PD脳解析によって支持されており77、α-Syn PFFモデルで報告された活性化と同様に、神経変性に先行してSNpcで神経炎症反応が起こっていた可能性は否定できない77,78。あるいは、細菌アミロイドは、交差播種と呼ばれる過程で、特定の非相同アミロイドの線維化を誘導する凝集核として働く可能性もある。最近の研究では、精製されたcurliアミロイドがin vivoでα-Synの凝集を触媒することが示されている64。また、in vitroの研究では、細菌アミロイドがAβの線維化に播種することが示されており、クロスシード凝集がADの発症に関与している可能性が示唆されている79。われわれの研究は、ヒトアミロイドの重合に効果的に関与しうるタンパク質のレパートリーを増やすものである。我々は、in vitroおよびin vivoモデルを用いて、BAPアミロイドがヒト神経細胞内でα-Synと共局在化し、ヒトα-Synの凝集を増加させることを示した。しかしながら、細菌アミロイドがヒトα-Synと共局在化して交差播種を行う正確なメカニズム、特にこのプロセスがその後の脳内でのアミロイド凝集にどのように影響するかについては、まだ不明である。

腸-脳軸は、神経内分泌細胞、免疫細胞の活性化、迷走神経を主要な神経伝達経路とする腸神経系（ENS）など、いくつかのメカニズムを通じて、消化管と中枢神経系との間で双方向の情報伝達手段を提供している80。恒常性維持時には、細菌がENSの求心性ニューロンを刺激し、その結果迷走神経シグナルが抗炎症反応を引き起こす。しかし、加齢81,82や病原体や疾患83,84による腸内細菌叢の変化など、特定の状況においては、腸管バリア機能が破壊され、腸管ニューロンと相互作用し、さらに興味深いことに、脳そのものに到達する可能性のある微生物叢由来産物の移動が可能になると考えられる。現在のデータでは、PDのプロセスはENSで始まり、迷走神経を介して下部脳幹に広がることが示唆されている85。したがって、BAPアミロイドやBAPを発現する細菌など、腸から移行した細菌由来の産物が、ENSを介して中枢神経系に作用を及ぼすか、あるいは「プリオン様」様式で脳に広がることによって直接的な影響を及ぼす可能性が考えられる。最近の研究で、腸内常在菌が迷走神経を介して脳に移行することが明らかになった86。アミロイドは脊髄ニューロンや迷走神経ニューロンなどの解剖学的経路を通って腸から脳へ移行する可能性があると仮定し87,88、本研究では、野生型非トランスジェニックマウスにBAPであらかじめ形成されたアミロイド（rBapB_PFF）を直接脳内接種することで、このシナリオを強制した。われわれは、中脳ドーパミン作動性ニューロンを含むいくつかの中枢神経核と結合している背側線条体を標的に選んだ。これまでの研究で、この領域にα-Syn-PFFを注射すると、α-Syn凝集体の形成、ドーパミン作動性ニューロンの消失、運動異常が起こることが示されている44。我々のデータでは、rBapB-PFFは間質注入の72時間後に脳内に広がり、SNpcにおけるrBapB-PFFの存在はほとんど検出されないことが示された（図S11）。これらの結果は、rBapB-PFFシードが可溶性α-Synモノマーをリクルートし、PD脳やα-Syn PFF動物モデル89,90で報告されている病的α-Synのプリオン様拡散を開始するという仮説を支持するものである。この効果はあらかじめ形成されたBAP線維を用いて観察されたものであるが、単量体タンパク質が時間の経過とともにin vivoで凝集し、将来的に滑膜病変を引き起こす可能性は否定できない。

PDではα-Syn分解経路が損なわれているという証拠が増えつつあり、特にPD中脳におけるLAMP-2Aの減少がいくつかの研究で報告されている91,92。さらに、in vitro研究では、シャペロンを介したオートファジー（CMA）機能の障害により、α-Synの分解が低下し、細胞内に蓄積することが示された91,93。我々は、BAPアミロイドへの暴露がα-Syn病理とCMA障害を引き起こすことを証明した。LAMP-2Aに対するrBapB-PFFの直接的な影響を否定することはできないが、α-Syn-PFFモデルの中脳でLAMP-2Aの減少が報告されていることから、今回のデータはCMA機能障害における病的α-Synの中心的役割を指摘している94。今回の結果は、BAPアミロイドモデル、α-Syn-PFFモデル、PDに共通するメカニズムを示唆している。

結論として、本研究は、アミロームの組成と疾患におけるその役割に関する現在の知識における重要なギャップを埋めるものであり、腸内細菌叢由来のバイオフィルム関連アミロイドとヒトの神経変性疾患との関連についての理解を前進させるものである。これらの知見は、早期診断や病態の初期段階をターゲットとしたより効果的な治療法にとって重要な意味を持つかもしれない。

方法
すべてのマウス実験は、CSICの倫理委員会およびラ・リオハ生物医学研究センター（CIBIR）の動物実験倫理委員会の機関プロトコルガイドラインに従って行われた。マウスは、国家ガイドライン（RD 53/2013）に従い、Commité de Ética y Bioseguridad del IdAB（Ref.番号1357/2022）およびCIBIRの動物実験に関する倫理委員会（許可番号LAE-04）で承認されたプロトコールのもとで維持され、National Institute of Health（NIH）のGuide for the Care and Use of Laboratoryに従って実施された。患者を対象とした研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、プロトコルはナバラ大学倫理科学委員会2020.153および222/2022の承認を得た。参加した患者は全員、研究への参加に同意した。参加者は、本研究への参加に対していかなる報酬も受け取っていない。

オリゴヌクレオチド、プラスミド、細菌株、培養条件
本研究で使用した細菌株、プラスミド、プライマーを表1および表4に示す。大腸菌は、Luria-Bertani（LB）ブロスまたはグルコース0.25%（w/v）添加Tryptic Soy Broth（TSBg）（Conda-Pronadisa）で培養した。必要に応じて、培地にアンピシリン（Amp）100μg/ml、エリスロマイシン（Erm）10μg/ml、クロラムフェニコール（Cm）20μg/ml、L-アラビノース0.2％（w/v）、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）1mMを添加した。

C-DAGシステムを用いたBAPドメインのライブラリー構築
C-DAGシステム用の大腸菌株コレクションを得るために、予測されるアミロイド原性ドメインのコードDNAをGeneArt（Invitrogen, ThermoFisher Scientific）で合成し、pExportプラスミドにNotI/XbaIクローニングした（表S5およびS10）。最終プラスミドコレクションを大腸菌VS39 pVS76株で形質転換し、Amp（100μg/ml）、Cm（20μg/ml）を含むLB寒天培地で陽性クローンを選択した。Amp（100μg/ml）、Cm（20μg/ml）、0.2 %（w/v）L-アラビノース、1 mM IPTG、および0.8 %（w/v）コンゴーレッド色素（CR）を含むLB寒天培地上で、タンパク質発現の誘導とアミロイド様物質の存在を評価した。コロニーの色調を評価するため、プレートを30℃で2日間培養した。C-DAG 株から生成した繊維に結合した CR の量を定量するために、37 ℃で培養した一晩培養液を、Amp100 μg/ml、Cm 20 μg/ml、0.2%(w/v)L-アラビノース、1 mM IPTG および 25 μg/ml の CR 染料を含む 150 μl の低塩 LB 培地に 1:30 で希釈し、平らな透明底の黒色 96 ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific）に入れた。大腸菌 VS39 pVS76 を CR 結合陰性対照として用いた。プレートを BioTek Synergy H1 マイクロプレートリーダー（37℃）に入れ、CR 蛍光（ex, 525 nm; em, 625 nm）と細菌増殖（Optic Density of 600 nm [OD600nm]）を、10 分毎に 16 時間、読み取り値の間に振盪（800 rpm）しながら読み取った。終点で、CR 蛍光:OD600nm 比を算出し、菌の増殖に応じて CR 蛍光値を正規化した。独立した実験を少なくとも 3 回行った。透過型電子顕微鏡（TEM）のために、アミロイド形成ドメインをエクスポートした大腸菌細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した後、2％（v/v）パラホルムアルデヒド（Sigma）で室温で1時間固定した。Formvar/カーボンコートしたニッケルグリッドを、固定したサンプルの一滴に5分間付着させ、PBSで3回すすいだ。2%(v/v)酢酸ウラニル(Agar Scientific, Stansted, UK)を用いてネガティブ染色を行った。観察は、日本電子 1011 透過電子顕微鏡で行った（図 S13）。

タンパク質の生産、精製、およびin vitroでの線維形成
組換え発現のために、高忠実度Phusion DNAポリメラーゼ（Thermo Scientific）および表S6に示すプライマーを用いて、pExportプラスミド（表S10）からコードDNAをPCR増幅した。PCR産物をアニーリングによりpET46-Ek/LICベクターまたはNcoI/XhoI制限酵素を用いてpET28aベクターにクローニングした。発現プラスミドを含む大腸菌BL21 DE3の一晩培養液を1:100に希釈し、OD600nmが0.6になるまで培養した。IPTGを最終濃度0.1または1mMになるように添加し、培養液を18℃で一晩または37℃で5時間振盪した（150rpm）。菌体採取のための遠心（6200×g、10分間）後、ペレットを溶解バッファー（1xリン酸バッファー、20mMイミダゾール、0. 2 mg/mlリゾチーム、20 µg/ml DNアーゼ、1 mM MgCl2、1 mM PMSF）に懸濁し、サイクルの間に氷上で30秒インキュベートして超音波処理し（30秒×3サイクル、振幅40 %、30秒×5サイクル、振幅50 %）、遠心分離した（20,200×g、30分間、4℃）。上清をろ過し（0.45μm）、10μg/mlのDNaseとRNaseを加えた。タンパク質をHisTrapTM FFカラム（GE Healthcare）を用いたNiアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製したBAPアミロイド原性ドメインの濃度は、Bradford Protein Assay（BioRad）によって決定した。Bap_SH、Bap_PA1およびBap_Ecoドメインは可溶性に精製できなかった。in vitro線維形成のために、精製したアミロイドドメインをpH4.5のリン酸-クエン酸緩衝液2mlで2μMに希釈し、ガラス管中で振盪（200rpm）しながら37℃でインキュベートした。

キメラタンパク質の作製とバイオフィルム表現型
BAPドメインは表S10に示すプライマーを用いて増幅した。S.aureus由来のBapのシグナルペプチドを、プライマー5'-GGATCCTTTATTTTGAGGTGAGTAAATATGGGおよび5'-AGCACTATTTTGTACTTCCGCを用いて増幅し、オーバーラップPCRによりBAPドメインに融合した。BAPドメインを細菌細胞壁に固定するために、LPXTGモチーフを含むクランピングファクターA（clfA）遺伝子のR領域をS. 得られた断片をpCN51ベクターにクローニングした。BAP-アミロイド生成ドメインを含むキメラタンパク質は、Pcad-cadCプロモーター（黄色ブドウ球菌Δbap95のカドミウム誘導性プロモーター）の制御下で発現させた。バイオフィルム形成アッセイでは、菌株を37℃で一晩培養し、TSBgで1:40に希釈した。細胞懸濁液を滅菌済み96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート（Thermo Scientific社製）に接種した。37℃で24時間静置培養後、ウェルを水で2回軽くすすぎ、乾燥させ、クリスタルバイオレットで数分間染色した。バイオフィルム形成能を定量するため、ウェルの底に付着したクリスタルバイオレットを、エタノール：アセトン（80：20 v/v）の溶液200μlで再懸濁し、595 nmでの吸光度を定量した。

糞便サンプルの採取とメタゲノム解析
本研究に参加した患者からのサンプルとデータは、ナバラ大学バイオバンクから提供され、倫理・科学委員会2020.153および222/2022で承認された標準操作手順に従って処理された（表S3）。サンプルはさらに処理するまで-80℃で保存された。過敏性腸症候群（IBS）の35人（17～82歳、平均45歳）と対照14人が研究に登録された。糞便サンプルはPBS 1Xでホモジナイズした。200mgの糞便サンプルからMaxwell® RSC Fecal Microbiome DNA Kitを用いて細菌DNAを抽出した。抽出は、ビーズビートによるメカニックディスラプションステップを導入した上で、メーカーの指示に従って行った。シーケンスライブラリーは、DNAをランダムに断片化した後、5'および3'アダプターをライゲーションして調製した。各フラグメントは、増幅によってクローン性の異なるクラスターに増幅された。イルミナSBSテクノロジーによるシーケンスに使用したテンプレート。生データから宿主DNAをフィルターアウトした。宿主DNAは、KneadData v0.74を用いて宿主参照ゲノムにマッピングすることでフィルターアウトした。Trimmomatic v0.38を使用して、イルミナシーケンスアダプターを除去し、低品質末端塩基をトリミングした。生データとトリミングデータの品質を評価するために、FASTQC v0.11.6を実行した。各分類群（Kingdom、Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species、Subspecies）のランクごとに、各分類群番号に割り当てられたリードの数と割合を計算した。種のレベルでの正規化されたタクソンの存在量は以下のように計算された：ここで、Ra: 分類群に割り当てられたリードカウント、Rt： G：分類群の平均ゲノムサイズ。Abundanceを計算した後、Abundanceの総和と比較した相対Abundanceを計算した。BAPの存在量は、マップされた100万リードあたりの1キロ塩基あたりのリード数（RPKM）として計算した。

フィルター保持アッセイ
微分遠心分離により糞便サンプルから微生物細胞を濃縮した。簡単に説明すると、糞便サンプルはPBS中で湿重量32,4 mg/mlに標準化し、10 mlの懸濁液を500×gで2分間、4℃で遠心分離し、食物残渣を除去した。上清を20μmの孔のメンブレンでろ過した。その後、ろ液を回収し、26,000×g、10分間、4℃で遠心した。ペレットを元の培養液の1/10量のTris緩衝液50 mM pH 8に懸濁し、トリプシン（1サンプルあたり2μg）を加えた。トリプシンによる消化は、37℃で2時間、振盪条件下で行った。不溶性タンパク質画分は、その後の2回の遠心分離（18,800×g、10分および18,800×g、30分）で分離した。アミロイド線維が洗剤に溶けないことを利用して、ペレットを1% SDSで洗浄し、純度を高めた。不溶性タンパク質をTris緩衝液50mM pH8で1：10に希釈し、50μlを0.45μM孔径の酢酸セルロース（Sterlitech）を用いた96ウェルドットブロット装置（Bio-Rad）で真空濾過した。得られた膜は、PBS-Tween 0,1%と5%(w/v)の脱脂乾燥乳で4℃で一晩ブロッキングした。BapとEspアミロイドを検出するために、rBap_B15に対するウサギポリクローナル抗体とrEsp_N16に対するニワトリポリクローナル抗体を用いた。Bap_LLおよびBap_LAアミロイドを検出するために、精製されたrBap_LLおよびrBap_LAタンパク質に対して上昇させたウサギポリクローナル抗体がProteogenix社から供給された。抗体は1:5.000に希釈した。抗アミロイド線維（OC）抗体（StressMarq; SPC-507S）と抗アミロイドオリゴマー（A11）抗体（StressMarq; SPC-506）をそれぞれ1:1.000に希釈して線維とオリゴマーを検出した。結合抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ（Invitrogen; ref: 31460, 1:5.000）、抗ニワトリ（Abcam; ref: Ab97135, 1:20.000）、抗マウス（Life technologies; ref: A16072, 1:5.000）抗体で検出した。便サンプル中のEspアミロイドを検出するために、6週齢のCD-1雌マウス（N = 3）に広域抗生物質処理（バンコマイシン0.5 g/l、ネオマイシン1 g/l、アンピシリン0.5 g/l）を行い、腸内細菌叢を枯渇させた。抗生物質処理後、rEspN_PFFを2日間経口投与した。マウス（N = 3）の糞便サンプルから精製したSDS耐性画分をフィルター保持アッセイにかけた。抗Esp_N抗体を用いてイムノブロッティングを行った。

タンパク質凝集体の調製
0.1Mクエン酸と0.2M Na2HPO4を混合し、pH4.5と7.7のリン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液を調製した。サンプルの緩衝液交換にはPD-10脱塩カラムを使用し、組換え精製したタンパク質をいずれかのpH緩衝液で最終濃度0.5 mg/mlに希釈した。タンパク質の凝集反応では、サンプルを600rpmの撹拌下、37℃で7日間インキュベートした。

光散乱
光散乱は、Jasco FP-8200蛍光分光光度計（Jasco Corporation、日本）を用いて、励起および発光帯域幅5 nmで、330 nmで励起し、320～340 nmの範囲で記録して測定した。

アミロイド色素の結合
タンパク質凝集体のアミロイド性を測定するために、チオフラビンT（Th-T）およびコンゴーレッド（CR）色素を用いた。Th-T結合アッセイでは、インキュベートしたタンパク質を25μM Th-Tを含むクエン酸/Na2HPO4緩衝液で1:10に希釈した。Th-Tの発光蛍光は、Jasco FP-8200蛍光分光光度計（Jasco Corporation、日本）を用いて、励起波長445 nm、460-600 nmの範囲で、励起および発光帯域幅5 nmで検出した。CR 結合アッセイでは、インキュベートしたタンパク質をクエン酸/Na2HPO4 緩衝液で 1:10 に希釈し、20μM CR を添加した。光吸収スペクトルは、Specord200 Plus 分光光度計（Analytik Jena, Germany）を用いて 375～700 nm で記録した。色素なしでインキュベートしたタンパク質のスペクトルは、散乱を差し引くために取得した。

フーリエ変換赤外分光法 (FTIR)
7日間のインキュベーション後、100μlの凝集タンパク質を12,000gで30分間遠心し、ペレットを10μlのMQ水に懸濁した。FTIRスペクトルは、Specac Golden Gate MKII ATRアクセサリーが付属したBruker Tensor 27 FTIR（Bruker Optics、米国）を用いて取得した。サンプルはATR結晶上に置き、N2フロー下で乾燥させた。各スペクトルは、アミドI領域（1700～1600 cm-1）を1 cm-1の分解能で測定した32回のデータ取得で構成される。データの取得と正規化は、OPUS MIR Tensor 27ソフトウェア（Bruker Optics、米国）を使用し、Min/Max正規化法で行った。データは、Peak Fitソフトウェアを用いた自動ピークフィッティングによってデコンボリューションされた。その結果、フィットしたバンドの面積、振幅、中心値がプロットされた。

透過型電子顕微鏡 (TEM)
凝集したタンパク質は、80 kVで動作するJEM 1400透過電子顕微鏡（日本電子株式会社）を用いて可視化した。試料調製は、10μlのインキュベートタンパク質をカーボンコート銅グリッドに10分間付着させ、余分な液体をフィルターペーパーで拭き取った。その後、2%(w/v)の酢酸ウラニルを加え、ネガティブ染色を行った。グリッドは、CCD GATAN ES1000W Erlangshenカメラ（Gatan Inc. 免疫金標識のために、試料をコートしたグリッドを洗浄し、1:10の抗ポリヒスチジン抗体（Sigma; ref: H1029）を含むPBSの滴上で45分間インキュベートした。PBSで洗浄後、グリッドを金標識（10nm）ヤギ-抗ウサギ二次抗体で45分間インキュベートした。

α-Synの交差播種
BAPアミロイドとヒトアミロイド間の交差播種を評価するために、活性ヒト組換えα-Synモノマー（SPR-321、StressMarq）を、1μM BAP前形成フィブリル（PFF）または10nM活性ヒト組換えα-Syn-PFF（SPR-322、StressMarq）を添加した2μM Th-Tを含む100μlのPBSに10μMに希釈した。すべてのPFFは、使用直前に超音波浴で1時間超音波処理した。サンプルは、直径1/8 "のテフロンボール（Polysciences, Inc. プレートは BioTek Synergy H1 プレートリーダーで 37 ℃で読み取り、Th-T 蛍光（ex, 440 nm; em, 475 nm）を 5 分毎に 30 時間測定した。Th-T蛍光強度はプラトー値で規格化した。Th-Tの発光スペクトルは、励起波長を440 nmに固定し、470～600 nm（5 nmステップ）の間で実験終了時に記録した。

線虫の維持とα-Syn凝集のin vivoモデル
線虫C. elegans NL5901 pkls2386[Punc-54::α-Syn::YFP + unc-119(+)]を、常食として大腸菌OP50の一晩培養300μlを播種した100 mm Nematode Growth Medium (NGM)寒天プレート上で23℃で生育させた（Brenner, 1974）。in vivoでのα-Syn凝集を解析するため、同調したL4ワームをNGMプレートから回収し、M9で3回洗浄した。食餌切り替えのため、L4ワームを50μg/mLのカナマイシンを添加した播種していないNGMプレート上で1時間インキュベートし、残存する大腸菌OP50を除去した後、再度洗浄した。次に、L4ワームを、細菌がアミロイド様線維を産生するか、精製アミロイド様線維を添加したOP50を添加した、播種したばかりのNGMプレートに移した。最初のタイプの飼料では、C-DAG系で形質転換した大腸菌VS39を、Amp（100μg/ml）、Cm（20μg/ml）、0.2 %（w/v）L-アラビノースおよび1 mM IPTGを含むLB寒天培地で培養し、細胞外BAP型アミロイド線維を産生させた。30℃で2日後、細菌をLBプレートから回収し、M9でOD600nmが4になるように再懸濁した。その後、500μlの再懸濁液をNGM寒天培地にプレーティングし、乾燥させてからワムシを餌につけた。代替飼料については、L4ワムシを前日に播種したNGMプレートに、一晩培養した大腸菌OP50と40μgのrBapB-PFFまたはrEsp_N-PFF予備形成繊維の混合物300μlを移植した。この条件下で、成虫を2日ごとに新しく播種したNGMプレートに移した。10日目に成虫をNGMプレートから回収し、10mlのM9で3回洗浄した。

線虫の運動解析
成虫を播種していないNGMプレートに移し、ミミズのクチクラからバクテリアを除去した。1時間後、1ウェルあたり〜10匹のミミズを200μlのM9とともに24ウェルプレートに移し、2分間回復させた後、Zeiss Stemi 508実体顕微鏡とZeiss Axiocam 208カラーカメラを用い、同じ設定で1分間泳ぐミミズの動画を記録した。記録されたミミズは、ImageJ (https://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html)のWrmTrckプラグインで追跡され、1分あたりの体曲げ量（BBPM）が測定された。少なくとも2回の独立した実験を行った。

線虫におけるα-Syn凝集の定量化
蛍光顕微鏡によるイメージングでは、1 mlのワムシ懸濁液を4 %（v/v）パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で20分間固定し、PBSで洗浄後、300 μlのPBSに再懸濁した。その後、固定したワムシ50μlをスライドガラスにマウントし、Leica DMi8蛍光顕微鏡と浜松ORCA Flash 4.0 LTカメラを用いて40倍で画像を撮影した。画像処理はIcyソフトウェア（https://icy.bioimageanalysis.org/）を用いて行った。α-Syn凝集体は、IcyソフトウェアのSpot Detectorツールを用いて、1群あたり少なくとも30個体について、頭部先端から咽頭球端までの間で定量した。α-Syn凝集のイムノブロット解析のために、9mLのワムシ懸濁液をペレット化し（800×g、1分間）、ワムシペレットを液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。解凍したワムシペレットを順次タンパク質抽出のために処理した96。簡単に説明すると、線虫ペレットを秤量し、秤量したペレット50 mgあたり150 μlの冷RIPA溶解バッファー（50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% (w/v) SDS, 0.5% (w/v) デオキシコール酸ナトリウム, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM PMSF, 1x protease inhibitor cocktail）に懸濁した。この懸濁液を、ガラスビーズ（0.2-0.3 μm）を1:1（v/v）の割合で含む2 mL-Lysing Matrix Tubeに移し、FastPrep-24™ 5Gホモジナイザー（MP Biomedicals）で機械的にホモジナイズした。ホモジネートを21,100×g、4℃で20分間遠心し、上清を清潔なチューブに移し、-80℃で保存した。タンパク質の量は、Bradford Protein Assay（BioRad）で測定した。5μgのタンパク質を負荷し、12% [w/v] SDS-PAGE無染色ゲル（BioRad）で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース膜に1Aで30分間転写した。膜をPBS中PFA 4%(v/v)で室温で30分間固定し、PBSで洗浄し、PBS-T（0.1%(v/v)Tween 20を含むPBS 1X）で希釈した5%(w/v)脱脂乳で4℃で一晩ブロックした。1:5.000(v:v)に希釈したマウス抗GFP(JL-8)一次抗体(Takara)で全α-Syn:YFPを検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス二次抗体（Thermo）を1:5.000に希釈した。抗体はPBS-Tに溶解した4%(w/v)脱脂乳で希釈した。

線虫からの定量的PCR
線虫からTRIzol試薬（Thermo Fisher）を用いて全RNAを抽出した。転写解析のために、同期化したL4動物からPrimeScript RT試薬キット（Takara）を用いてtotal RNAからcDNAを逆転写した。α-Synの定量的リアルタイムPCRは、プライマーH-aSyn-Fw（5'- CACAGGAAGGAATTCTGGAAGATA）およびH-aSyn-Rv（5'- GCTTCAGGTTCGT AGTCTTGAT）を用いて、Applied BiosystemsTM QuantStudio 5マシンでTB Green Premix Ex Taqキット（Takara）を用いて行った。値は、プライマーtba-1-qPCR-Fw（5'- AGGTACCACGTGCCGTATGT）およびtba-1-qPCR-Rv（5'- TTATGCAGATTGGAGCAGGCGG）を用いて、内部コントロールtba-1に対して正規化した。示したデータはすべて、独立した3反復の平均値である。

SH-SY5Y細胞の培養と神経細胞の分化
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞（ECAC： C末端HAタグを持つ完全長ヒト野生型α-Synを構成的に発現しているSH-SY5Y細胞（ECAC: 94030304）を、10％熱不活性化ウシ胎児血清（Sigma）、1％非必須アミノ酸（MEM NEAA）（Gibco）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）／F-12 with Glutamax 1x（Gibco）中で、37℃、5％CO2で培養した。ドーパミン作動性ニューロンへの細胞分化を誘導し、α-Syn凝集に対する細菌アミロイド効果を評価するために、SH-SY5Y細胞を、30μMレチノイン酸（RA）（Sigma）を添加した増殖培地を含む24ウェルプレートの13mm円形カバースリップ上に、1ウェル当たり2.5×103細胞で播種した。30μMのレチノイン酸(RA)(Sigma)を添加した増殖培地を24ウェルプレートに入れ、13mmの円形カバースリップ上に1ウェル当たり2.5×103個の細胞を培養した。その後、分化した細胞を10μg/ウェル（0.02μg/μl）のrBapB-PFFおよびrEsp_N-PFFで2日間処理し、RA含有増殖培地を2-3日ごとに交換しながら、処理後10日目まで細胞を維持した。免疫蛍光顕微鏡検査では、細胞をPBSで洗浄し、4%(v/v)PFAで室温で20分間固定し、100%メタノールで-20℃で15分間透過処理し、PBSで洗浄し、10%正常ヤギ血清（NGS）をブロッキング液として37℃で30分間インキュベートした。全α-Synを、1：200（v：v）に希釈したマウス抗α-Syn LB509抗体（Invitrogen；180215）で染色した。リン酸化α-Synはウサギ抗pS129-α-Syn EP1536Y一次抗体（Abcam；ab51253）を用いて1：200（v：v）に希釈して検出した。DNAは1:1000（v:v）に希釈したHoechst 33342で染色した。alexa-488で結合したヤギ抗ウサギ抗体（Invitrogen; ref: A11008）とalexa-568で結合したヤギ抗マウス抗体（Invitrogen; ref: A11031）を2% NGSで1:200（v:v）に希釈した。免疫染色後、カバースリップをPBSで洗浄し、スライドガラスにマウントした。固定したサンプルをLeica DMi8蛍光顕微鏡とHamamatsu ORCA Flash 4.0 LTカメラで100倍で撮像した。画像処理はIcyソフトウェアで行い、α-Syn凝集はIcyのSpot Detectorツールを用いて1群あたり少なくとも25個の細胞で定量した。各実験は3連で行った。

分化SH-SY5Y細胞のタンパク質抽出とウェスタンブロット解析
ウェスタンブロッティングのために、細胞を6ウェルプレートに4 x 104 cells/wellとなるように播種した。分化したSH-SY5Y細胞を、上記のように40μg/ウェルのrBapB-PFFおよびrEspN-PFFで処理した。処理後10日目に、6ウェルプレートを氷上に置き、細胞を冷PBS中で掻き出した。3ウェルから回収した細胞ホモジネートをプールし、1400g、5分間、4℃で遠心した。ペレットを量り取り、冷High-Salt Buffer（50 mM Tris base、750 mM NaCl、5 mM EDTA、1x protease inhibitor cocktail、1x phosphatase inhibitor cocktail [Thermo]）に100 mg/mlまで再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした後、18,800 × g、4℃で20分間遠心した。可溶性画分に相当する上清は-80℃で保存した。ペレットを、細胞ホモジネートの重量に応じて100 mg/mlになるように、1%(v/v) Triton X-100を加えた冷HSBに再懸濁し、4℃で20分間インキュベートした後、21,100 × g、4℃で10分間遠心した。ペレットを冷PBSで洗浄し、冷SDS/尿素（8M尿素、2%(v/v)SDS、1×プロテアーゼインヒビターカクテルおよび1×ホスファターゼインヒビターカクテル[Thermo]、50μg/mL DNase）に細胞ホモジネートの重量に応じて200mg/mLになるように再懸濁し、37℃で1時間インキュベートし、21,100×g、4℃で20分間遠心した。不溶性画分に相当する上清は-80℃で保存した。可溶性画分と不溶性画分を12% (w/v) SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレンに1 Aで30分間トランスファーした。膜をPBS中4%(v/v)のPFAで室温で30分間固定し、PBSで洗浄し、PBS-Tで希釈した5%(w/v)の脱脂乳で4℃で一晩ブロックした。全α-Synをα-Syn LB509一次抗体（Invitrogen；180215）で1：1000（v：v）に希釈して検出した。リン酸化α-Synは1:1000(v:v)に希釈したウサギ抗pS129-α-Syn EP1536Y一次抗体(Abcam; ab51253)で検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウス二次抗体（Thermo）を、それぞれ1:5000および1:2500（v:v）に希釈した。抗体は、PBS-Tに溶かした2%(w/v)の脱脂乳で希釈した。LAMP-2Aは抗LAM2A（Invitrogen 51-2200）を用いて検出した（図S14）。

α-シヌクレイン半減期の解析
BAP-アミロイドで処理したSH-SY5Y細胞において、50μg/mlシクロヘキシミド（Sigma-Aldrich）でタンパク質合成を阻害することにより、α-シヌクレインのターンオーバーを調べた。サンプルは12時間間隔で48時間まで除去した。等しい細胞数からのサンプル負荷量は、DNA含量の蛍光DAPIアッセイを用いて計算した。イムノブロッティングでは、同数の細胞を含む細胞溶解液をNuPAGE Novex 4%-12% Bis-Tris Gel（Invitrogen）で分離してロードし、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ブロットを抗ヒトα-シヌクレイン抗体LB509（1:1000）とインキュベートし、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ（1:5000）抗血清と増強化学発光を行った。α-シヌクレインのウェスタンブロットは、ImageJ解析ソフトウェアを用いて解析し、半減期は線形回帰モデルを用いて算出した；平均半減期は、個々の実験について引いた回帰直線から算出した。すべての実験は三重で行った（図S15）。

マウスと試験デザイン
8～9週齢の雄性C57BL6/C3H F1マウスをCharles River社から購入した。すべての動物は無作為にケージに分配され、どのような処置の前にも、研究に関与していない者によってケージが各群に無作為に割り付けられた。動物はステンレス製カバー付きのポリカーボネート製ケージに入れられ、1ケージあたり最大5匹まで飼育された。すべてのマウスは、標準的なペレット飼料（英国Special Diet Service社製）と通常の水道水を自由に摂取することができ、マウスは湿度（55±10％）と温度（22±2℃）を一定に保ち、12時間の明暗サイクルで飼育した。すべてのin vivo実験は盲検化され、データ収集と解析を担当する研究者も盲検化された。マウスには、滅菌PBSに超音波処理したrBap-PFFを2.5μlずつ、定位注射により背側線条体（合計10μg；頭蓋からAP＋0.2、ML-2.0、DV-3.4、-2.6）に注射した。対照動物には等量の滅菌PBSを注射した。動物は注射から7ヵ月後に犠牲となった。

行動評価
運動機能を評価するため、投与前、投与期間中および犠牲前に30日間隔で、マウスにワイヤーハングテスト、ロータロッドテスト、ネガティブジオタクシステストを行った。試験は同じ動物で行った。すべての試験は、行動における時間差をなくすため、点灯サイクルの09:00～13:00の間に実施し、試験と試験の間に30分間マウスを休ませた。マウスは試験の1時間前に試験室に慣れさせ、匂いの手がかりを最小限にするため、試験と試験の間に器具を70％エタノールで洗浄した。

ワイヤーハングテスト
神経筋力と運動協調性を評価するため、ワイヤーハングテストを行った。各マウスを従来の飼育ケージのワイヤーでできた蓋の上に置いた。蓋を軽く攪拌し、マウスが棒をつかむのを促した後、逆さまにした。マウスがワイヤーグリッドから落ちるまでの時間を測定し、2回の試行（15分間隔）の平均をとった。マウスが蓋の上に15分以上とどまった場合は、試行を中止した。

ネガティブジオタクシス
運動協調性は傾斜面で評価した。各マウスは、平面に対して45°の角度に設定されたワイヤーグリッド上に頭を下向きにして置かれた。動物の行動を30秒間観察し、以下のように採点した： 0 = 回って登る、1 = 回って固まる、2 = 動くが回らない、3 = 動かない97。0点であったすべての動物について、直立姿勢に180°回転して登攀を開始するまでの待ち時間を記録した。マウスが回転できない場合は、デフォルト値の30秒を障害の最大重症度とした。

ロータロッド
マウスを4～40rpmで加速するロッド(Rotarod LE8205、Panlab)に300秒以上乗せた。各マウスの滞留時間（秒）を落下までの潜時時間として記録し、10分間の休憩を挟んで4回テストを行った。

免疫組織化学
30μm厚の冠状脳切片をクライオスタットを用いて作製した。浮遊切片をTBSで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために3%水素ペルオキシダーゼでインキュベートした。その後、切片をブロッキング液（5％正常ヤギ血清と0.04％Triton X-100を含む0.1M TBS）でブロッキングし、一次抗体：抗チロシンヒドロキシラーゼ（Abcam；ref: ab112、希釈度1: 2.000）、抗α-Syn（phospho S129）（Abcam；ref: ab51253、希釈度1: 1.000）、抗NeuN（Abcam；ref: ab51253、希釈度1: 1.000）と4℃で24時間インキュベートした。翌日、脳切片を洗浄し、適切な種類のビオチン化二次抗体でインキュベートした。洗浄工程の後、切片をABC Peroxidase Staining Kit（Thermo Scientific）でインキュベートし、再度洗浄した後、3,3'-ジアミノベンジジン基質（Dako）の溶液で明らかにした。最後に、脳切片を顕微鏡用スライドにマウントし、脱水後、DPXマウントメディウムとカバースリップで覆った。黒質pars compacta（SNpc）中のドーパミン作動性（TH陽性）ニューロンの総数は、前述98のようにステレオロジーで評価した。TH免疫染色の線条体光学密度（OD）は、線条体ドパミン神経支配密度の指標として測定した。各動物について6つの代表的な吻側尾側切片（線条体の3つのレベル：前方、内側、後方）を調べ、線条体の関心領域を画定し、ImageJソフトウェアを用いてピクセル密度を推定した。リン酸化α-Syn封入体の存在は、SNpc、前頭皮質および視床に対応する複数の吻側尾側レベルの冠状切片（切片間隔120μm）上で20倍の倍率で評価した。リン酸化α-Syn染色は、SNpc、線条体、扁桃体の代表的な吻側尾側切片を10倍に拡大して測定した。関心領域はImageJソフトウェアを用いて描出され、ピクセル密度が推定された。アストログリア細胞とミクログリア細胞を評価するために、切片をそれぞれGFAP抗体とIba-1抗体で染色した。Iba1およびGFAP陽性細胞による免疫染色領域の割合の推定は、ImageJソフトウェアの閾値法を用いて行った。

ウェスタンブロット
凍結中脳を、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤混合物（Halt protease inhibitor cocktail, Thermo Scientific）、ホスファターゼ阻害剤（Halt phosphatase inhibitor cocktail, Thermo Scientific）およびDNAse（RQ1 DNase, Promega）を含む10 mM Tris/HCl（pH7.4）緩衝液中でホモジナイズした。タンパク質量は、ウシ血清アルブミンを標準物質として、Pierce BCA protein assay (Pierce BCA protein assay kit, Thermo Scientific)により測定した。μgのタンパク質をLDS緩衝液（Invitrogen）および還元剤（Invitrogen）で可溶化し、NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gels（Invitrogen）で分離し、PVDF膜に転写し、以下の一次抗体を用いてウェスタンブロットで分析した：抗α-Syn LB509（Invitrogen；180215）、抗LAMP-2A（Invitrogen；51-2200）、および抗ベータアクチン（Abcam；ab8227）抗体。膜は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートした。

定量的PCR
RNeasy Mini kit（Qiagen）を用い、製造元のプロトコールに従って中脳サンプルから全RNAを単離した。高容量 cDNA 逆転写キット（Applied Biosystems）を用いて逆転写（RT）を行った。逆転写酵素反応から得られた転写産物は、定量的リアルタイムPCRによってlamp-2aとhsc70の定量を分析した。qPCR実験は、NZYSpeedy qPCRマスターミックス（NZYtech社製）を用いて、StepOneTM Real-Time PCRシステム（Applied Biosystems社製）で行った。値はアクチンに対する標準ΔΔCt法を用いて算出した。lamp-2a（フォワード：5′-TATGTGCAACAAAGAGCAGA-3'；リバース：5′-CAGCATGATGTGCTTGAGA-3′）およびhsc70（フォワード：5′-ATTGATCTTGGCACCACCTA-3'；リバース：5′-ACATAGCTT-3'）に対するプライマー配列： 5′-ACATAGCTTGAAGTGGTTCG3′）およびマウスアクチン（フォワード：5′-TCTACAATGAGCTGCGTG-3'；リバース：5′-GGTGAGGATCTTCATGAGGT-3′）α-Syn（フォワード：5'-GCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGC-3'；リバース：5′-CTGTTGCCGCTGC-3'）： 5′-ctgttgccacaccatgcaccactcc3'）。

メタゲノム解析
バイオプロジェクトID PRJNA83480146でNCBI Sequence Read Archive (SRA)リポジトリから入手可能な、PDと診断された個体とNeurologically Healthy Controls (NHC)から得られた生のショットガンシーケンスデータを使用した。FastQC v0.12.1を用いてシーケンスリードの品質管理を行い、低品質リードやアダプター混入リードをフィルターした。FastQ Screen v0.15.3を用いて、サンプル内の他の生物のコンタミネーションの有無をチェックした。Cutadapt v4.34を用い、-trim-n, --quality-cutoff 25, -a CTGTCTCTTATA -A CTGTCTCTTATAでNextera transposaseアダプターを除去し、アダプターからフォワードリードとリバースリードをクリーンアップした。Centrifuge v1.0.4を用いて、一般的な分類学的プロファイリングと機能アノテーションを行った。BWA v0.7.17-r1188（デフォルトパラメータ）を用いて、BAP遺伝子領域を含む様々な細菌からなる参照ゲノムコレクションからなるカスタムデータベースに対して、高品質な150 ntペアエンドリードをアライメントした（Table S2）。このアラインメントプロセスにより、SAMtools v1.157を用いて位置情報を調べることで、サンプル中のBAPの存在割合を決定することができた。配列中のマッチ数が70未満のリードは削除した。Pysamを使用して、参照データベースに対するリードのアライメント品質を評価した。BAPの存在は、BAP様遺伝子（TNBAP）のリードの総数に基づいて、各サンプルおよび生物についてバイナリ変数として決定したTNBAP≧1をBAP陽性とみなした。

統計解析
2つのサンプル群間の特定の特徴における有意差を同定するために、ノンパラメトリックMann-Whitney検定またはパラメトリックT検定を用いた。2群間以上の有意差を同定するために、ノンパラメトリックのKruskal-Wallis検定またはパラメトリックの一元配置分散分析検定を用いた。各生物について、PD群とNHC群間のBAP様遺伝子の存在における統計学的有意差を同定するために、Rの二項分布付きglm()関数を用いて二値ロジスティック回帰を実施した。有意な関連が認められたPD関連BAP陽性種については、年齢、性別、および技術的変数（採便方法および全塩基配列数（標準化））でモデルを調整した。各生物についてPD群とNHC群間のRPKMの統計学的有意差を同定するため、MaAsLin2検定58を用いて線形回帰を実施した。多重検定補正はBenjamini-Hochberg FDR法を用いて行った。サンプルサイズを事前に決定する統計的方法は用いなかった。データは平均値で示し、エラーバーは平均値のSEで示した。解析はGraphPad Prism® version 6を用いて行った。P値＜0.05は有意とみなした。アスタリスクは統計的有意水準を示す： p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
シーケンスデータとメタデータは、European Nucleotide Archive (ENA)の研究アクセッションPRJEB66343からオンラインで入手可能である。PDと診断された個体および神経学的に健常な対照（NHC）のシーケンスデータは、BioProject ID PRJNA83480146でNCBI Sequence Read Archive（SRA）リポジトリから入手した。本研究で示されたすべてのデータは、本論文または補足情報で入手可能である。ソースデータは本論文とともに提供される。追加データは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。ソースデータは本論文とともに提供される。

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謝辞
著者らはMicroprogenコンソーシアムに感謝したい。特に患者の参加とナバラ大学バイオバンクの協力に感謝する。Iñigo Lasa教授とPaco García del Portillo教授の有益な批評に感謝する。Ainara Aginaga、Adrian Román、Samuel Peña、Idoia Glariaの技術サポートに感謝する。撮影はPlateforme IBiSA de Microscopie Electronique Université de Tours Imaging Facilityで行った。L.M.はUniversidad Pública de Navarraの博士研究員であった。本研究は、科学・イノベーション省よりPID2021-124248OB-I00、ナバラ州政府よりPC133-134-135 MICROPROGENの助成を受けた。L.A.-E.とJ.B.は、ISCIIIのMiguel Servet契約（CPII20/00027とCP19/00200）の支援を受けている。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Ariadna Fernández-Calvet、Leticia Matilla-Cuenca。

著者および所属
農業生物工学研究所（IDAB）。CSIC-Gobierno de Navarra, Avenida Pamplona 123, Mutilva, 31192, Spain

アリアドナ・フェルナンデス=カルベット、レティシア・マティージャ=クエンカ、ミリアム・セラーノ、アレハンドロ・トレド=アラナ、ジャイオネ・バジェ

スペイン、ログローニョ、ラ・リオハ生物医学研究センター、分子神経生物学研究室

マリア・イズコ & リディア・アルバレス・エルビティ

スペイン、ベラテラ、バルセロナ自治大学、バイオテクノロジー・バイオメディシナ研究所およびバイオキミカ・分子生物学部門

スザンナ・ナバロ＆サルバドール・ベントゥーラ

スペイン、マドリッド、プエルタ・デル・スール大学病院、HM CINAC（Centro Integral de Neurociencias Abarca Campal)

ハビエル・ブレサ

スペイン、マドリード、HMホスピタルス、衛生研究所

ハビエル・ブレサ

スペイン、ナバラ大学医学部、消化器科

マイテ・ヘライス

スペイン、パンプローナ、ナバーラ衛生研究所、IdiSNA

マイテ・ヘライス＆ゴルカ・アルコルタ・アランブル

スペイン、パンプローナ、ナバラ大学、CIMA LAB Diagnostics

ゴルカ・アルコルタ＝アランブル

スペイン、パンプローナ、ナバーラ政府、NASERTIC、個別化医療部門

セルジオ・ガレラ＆イゴール・ルイス・デ・ロス・モゾス

トランスレーショナル・バイオインフォマティクス・ユニット、ナバラバイオメッド、ナバラ病院（CHN）、ナバラ大学（UPNA）、IdiSNA、パンプローナ、スペイン

マリア・ルイサ・マンセゴ

貢献
構想 J.V.、L.A.-E.、A.T.-A. 実験計画、J.V.、L.A.-E.、S.V.、A.T.-A. 調査、A.F.-C.、L.M.-C.、M.S. 動物実験の実施、M.I.、L.A.-E. 神経生物学的解析、J.B., L.A.-E., M.I. 生物物理学的実験、S.N., S.V. ヒトサンプル採取、M.H. メタゲノム解析、G.A.-A. NHCおよびP.D.のメタゲノミクスデータの再解析、S.G.、I.R.dl.M.、M.L.M.、A.T.-A. 監修、J.V.、L.A.-E.、S.V.、I.R.dl.M.、A.T.-A. 最終原稿は全著者が承認した。

責任著者
Jaione Valle宛。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

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転載と許可

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この記事の引用
Fernández-Calvet, A., Matilla-Cuenca, L., Izco, M. et al. 腸内細菌叢は、神経変性の可能性を持つバイオフィルム関連アミロイドを産生する。Nat Commun 15, 4150 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-48309-x

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受領
2023年11月06日

受理
2024年4月26日

出版
2024年5月16日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-024-48309-x

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