グラフェン・ファミリー・ナノ粒子の毒性：起源とメカニズムの総説（2016年10月31日）

要旨
グラフェン・ファミリー・ナノマテリアル（GFN）は、そのユニークな物理化学的特性から、多くの分野、特にバイオメディカル用途で広く用いられている。現在、多くの研究がGFNの生体適合性と毒性をin vivoおよびin introで研究している。一般に、GFNは動物や細胞モデルにおいて、異なる投与経路をたどり、生理的障壁を透過し、その後組織内または細胞内に分布し、最終的に体外に排泄されることにより、異なる程度の毒性を示す可能性がある。本総説は、いくつかの臓器や細胞モデルにおけるGFNの毒性作用に関する研究を集めたものである。また、横方向の大きさ、表面構造、官能基化、電荷、不純物、凝集、コロナ効果など、さまざまな要因がGFNの毒性を決定することを指摘する。さらに、GFNの毒性の基礎となるいくつかの典型的なメカニズムが明らかにされている。例えば、物理的破壊、酸化ストレス、DNA損傷、炎症反応、アポトーシス、オートファジー、ネクローシスなどである。これらのメカニズムでは、（toll様受容体）TLR、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）および腫瘍壊死因子α（TNF-α）依存性経路がシグナル伝達経路ネットワークに関与しており、酸化ストレスはこれらの経路において重要な役割を果たしている。本総説では、GFNsの毒性制御因子および毒性発現機序に関する利用可能な情報を要約し、GFNsの毒性発現機序を解明し、GFNsの生物学的安全性を向上させ、GFNsの広範な応用を促進するための示唆を得ることを目的として、GFNsのさらなる研究のための課題と示唆を提案する。

背景
結晶性グラファイトから単離されたグラフェンは、六角形に配置されたハニカム格子の単一原子厚の二次元シートからなる平坦な単分子層である[1]。グラフェンはそのユニークな構造、比表面積、機械的特性から、2004年の発見以来、その機能と応用に大きな注目が集まっている[2, 3]。グラフェンとその誘導体には、単層グラフェン、数層グラフェン（FLG）、酸化グラフェン（GO）、還元酸化グラフェン（rGO）、グラフェンナノシート（GNS）、グラフェンナノリボンなどがある。[4-7].GO は、グラフェン・ファミリー・ナノマテリアル（GFNs）の中でも最も重要な化学グラフェン誘導体の一つであり、その潜在的な生物医学的応用に注目が集まっている。グラフェン系材料は通常、数～数百ナノメートルのサイズを持ち、厚さは1～10 nmである[8, 9]。グラフェン材料は、その卓越した物理的・化学的特性から、エネルギー貯蔵、ナノ電子デバイス、バッテリー[10-12]、抗菌剤[13, 14]、バイオセンサー[15-18]、細胞イメージング[19, 20]、ドラッグデリバリー[8, 21, 22]、組織工学[23-25]など、さまざまな分野で広く利用されている。

GFNsの用途や生産量が増加するにつれて、GFNsへの意図しない職業曝露や環境曝露のリスクも高まっている[26]。また最近では、職業環境におけるGFNs曝露に関する調査がいくつか行われており、GFNsの職業曝露が作業員や研究者に潜在的な毒性を有することが示されたデータが公表されている[27-29]。GFNは、気管内投与[30]、経口投与[31]、静脈内注射[32]、腹腔内注射[33]、皮下注射[34]などによって体内に送達される。GFNは、血液-空気関門、血液-精巣関門、血液-脳関門、血液-胎盤関門などを透過し、肺、肝臓、脾臓などに蓄積することで、組織に急性および慢性の傷害を引き起こす可能性がある。例えば、一部のグラフェンナノ物質のエアロゾルは吸入され、呼吸器管に実質的に沈着する可能性があり、気管気管支気道を容易に貫通し、さらに肺の下部気道に移行して、その後の肉芽腫の形成、肺線維症、曝露者への健康への悪影響をもたらす [2, 29]。また、細胞（細菌、哺乳類および植物）[7, 40, 41]および動物（マウスおよびゼブラフィッシュ）[42]におけるGFNの生体適合性を評価し、土壌および水環境におけるGFNの影響に関する情報を収集した[43]。これらのレビューでは、GFNsの関連する安全性プロファイルとナノ毒性学について議論されているが、具体的な結論や毒性の詳細なメカニズムは不十分であり、毒性のメカニズムが完全に要約されているわけではなかった。最近の研究で示されたGFNsの毒性学的メカニズムには、主に炎症反応、DNA損傷、アポトーシス、オートファジー、壊死などが含まれ、これらのメカニズムは、GFNsの毒性を制御する複雑なシグナル伝達経路ネットワークをさらに探求するために収集することができる。GFNの毒性には、濃度、横方向寸法、表面構造、機能化など、大きく影響するいくつかの要因があることを指摘する必要がある。本総説では、GFNsの生物学的安全性を向上させ、GFNsの幅広い応用を促進するために、GFNsのさらなる研究のための示唆を提供し、毒性メカニズムを完成させることを目的として、さまざまな実験方法によるin vitroおよびin vivoでのGFNs毒性のメカニズムと制御因子に関する利用可能な情報を包括的に要約する。

GFNの毒性（in vivoおよびin vitro）
GFNは、さまざまな曝露経路や投与経路によって生理的バリアや細胞構造を透過し、体内や細胞内に入り込み、最終的にin vivoおよびin vitroで毒性を示す。様々な投与経路や侵入経路、様々な組織分布や排泄、さらには様々な細胞への取り込みパターンや位置が、GFNの毒性の程度を決定する可能性がある[44-46]。そのため、GFNsの毒性の発生と発現の法則をよりよく理解するためには、それらを明らかにすることが有用であろう。

投与経路
動物モデルにおける一般的な投与経路は、気道曝露（鼻腔内気腹、気管内注入、吸入）、経口投与、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射などである。作業環境におけるGFNの主な曝露経路は気道曝露であるため、ヒトのGFN曝露をシミュレートするために、マウスでは主に吸入と気管内注入が用いられている。吸入法は実際の曝露に最も近いシミュレーションが可能であるが、注入法はより効果的で時間を節約できる方法であり、GFNsは吸入法よりも注入法（気管内注入、胸膜内設置、咽頭吸引）の方がより長い炎症期間を引き起こすことが判明した[24, 30, 47, 48]。GFNは肺に沈着し、高濃度に蓄積することが調査され、気管内注入後、ゆっくりと消失しながら3ヵ月以上肺に留まった [49]。静脈内注射もグラフェンナノ材料の毒性評価に広く用いられており、グラフェンはマウスの体内を30分で循環し、肝臓と膀胱に作用濃度で蓄積する[32, 50-52]。しかし、GO誘導体の腸管への吸着はごくわずかであり、成体マウスへの経口投与では速やかに排泄された [31, 53]。ナノサイズのGO(350 nm)は、ミクロンサイズのGO(2 μm)と比較して、頸部の皮下注射後、皮下脂肪組織への単核細胞の浸潤が少なかった [34]。GOは、腹腔内注射後、注射部位近傍で凝集し、肝臓や脾臓の漿膜近傍に多数の小さな凝集体が沈着した [31, 33]。GFNの皮膚接触や皮膚透過に関する実験は、ここで検討した論文には見られず、グラフェンが無傷の皮膚や皮膚病変を透過すると結論付けるには十分な証拠がない。他のナノ材料の神経毒性や脳損傷の可能性を調べるために広く用いられている点鼻薬の投与経路については、今回検討した論文では言及されていない。

GFNの侵入経路
GFNは、体内に入った後、血液循環や生物学的障壁を通って様々な場所に到達し、その結果、臓器によって滞留の程度が異なる。GFNはナノサイズであるため、血液-空気関門、血液-精巣関門、血液-脳関門、血液-胎盤関門などの通常の生理的関門を通過して、より深い臓器に到達することができる。

血液と空気のバリア
肺は、気道を通じてグラフェンナノ粒子が人体に侵入する潜在的な入口である。吸入されたGOナノシートは、宿主防御の第一線である肺サーファクタント（PS）膜の超微細構造と生物物理学的特性を破壊し、潜在的な毒性を出現させる可能性がある[54]。凝集または分散した粒子は、肺胞内の肺胞内表面に沈着し、肺胞マクロファージ（AM）に取り込まれる。肺での排出は、粘液繊毛エスカレーター、AMs、または上皮層によって促進される [56-58]。しかし、吸入された小さなナノ粒子の中には、無傷の肺上皮バリアに浸潤し、肺胞上皮や間質に一過性に侵入するものもある [59, 60]。気管内に注入されたグラフェンは、気血関門を通過して肝臓や脾臓に再分布する可能性がある [61]。研究者や労働者は通常、吸入によってGFNを職業的に暴露しているため、血液-空気関門の研究が集中的に注目される可能性がある。血液-空気関門がGFNsの毒性にどのように関与しているかを明らかにすることは、研究上のホットトピックになる可能性がある。

血液脳関門
多数の膜受容体と高度に選択的な担体からなる血液脳関門の複雑な配置は、末梢血管内皮と比較して、血液循環と脳微小環境にわずかな影響しか及ぼさない[62]。血液脳関門のメカニズムに関する研究は、疾患やナノ毒性に関与する形で進展してきた。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析イメージング（MSI）により、平均直径342±23.5 nmのrGOは、血液脳関門の傍細胞稠度を低下させることにより、時間依存的に傍細胞経路を通って内皮間隙に浸透することが明らかになった[63]。さらに、100 nm以下の小さなサイズのグラフェン量子ドット（GQD）は、血液脳関門を通過することができる [64]。グラフェン物質がどのように血液脳関門を通過し、神経毒性を引き起こすかに関する研究は非常に稀であり、結論を出すにはさらなるデータが必要である。

血液-精巣関門
血液-精巣関門および血液-副睾丸関門は、哺乳類の体内で最も堅固な血液-組織関門であることでよく知られている[65]。直径54.9±23.1 nmのGO粒子は、腹腔内注射後に血液-精巣および血液-精巣上体関門を通過することは困難であり、マウスの精子の質は300 mg/kgの投与量であっても明らかに影響を受けなかった[66]。

血液-胎盤関門
胎盤バリアは、栄養素と代謝老廃物の交換を仲介し、重要な代謝機能を発揮し、ホルモンを分泌するため、妊娠の維持に不可欠である [67]。最近の総説では、胎盤はナノ粒子の胎児への移行、特に炭素質ナノ粒子の胎児への、および胎児への分布に対して、強固なバリアを提供しないことが示唆された［42］。rGOと金粒子（直径13 nm）は、静脈注射後、妊娠後期の胎盤と胎児にはほとんど存在しないか、存在しないことが示唆された[44, 68]。しかし、他の報告では、妊娠後期には経胎盤移行が起こることが示されている [69, 70]。ナノ物質の発生毒性には多くの関心が払われており、多くのナノ粒子が胎盤関門を通過し、胚の発達に強い影響を与えることが報告されている［71-75］。しかし、胎盤関門を通過したグラフェン物質への曝露に関する研究は不十分であり、今後、これらの粒子が胚にどのように移行するかを詳細に評価する必要がある。
これら4つの障壁は、文献の中で最も頻繁に言及されている障壁であり、他の障壁は最近の研究では評価されていない。例えば、皮膚障壁は、検索された数百のGFNs毒性研究のいずれにも言及されていない。さらに、GFNがこれらの障壁を通過するメカニズムはよくわかっておらず、より系統的な調査が早急に必要である。

GFNの組織内分布と排泄
グラフェンナノ粒子の吸収、分布、および排泄は、投与経路、物理化学的特性、粒子の凝集、GFNの表面コーティングなど、さまざまな要因によって影響を受ける可能性がある。

投与経路の違いはGFNの分布に影響を及ぼす。例えば、気管内投与されたFLGは気血関門を通過して主に肺に蓄積・保持され、4週間後には47%が残存した[61]。静脈内投与されたGOは、血液循環を通じて体内に入り、肺、肝臓、脾臓、骨髄に高度に保持され、10 mg kg/体重のGOを静脈内注射したマウスの肺では、炎症細胞浸潤、肉芽腫形成、肺水腫が観察された[49]。同様に、PEG化GO誘導体の高集積は、腹腔内注射後、肝臓と脾臓を含む細網内皮(RES)系で観察された。対照的に、GO-PEGとFLGは、経口投与による検出可能な消化管吸収や組織への取り込みを示さなかった[31]。
GFN のサイズ、用量、官能基などの特性の違いにより、グラフェンの分布プロファイルには常に一貫性がない。例えば、Zhang らは GO が主にマウスの肺に取り込まれることを見出したが[49]、Li らは GO がマウスの肝臓に蓄積することを観察した[76]。注目すべきは、直径10-30 nmの小さなGOシートは主に肝臓と脾臓に分布していたのに対し、大きなGOシート(10-800 nm)は主に肺に蓄積していたことである[49, 52, 77]。GOのサイズが血管のサイズより大きい場合、GOは通常、注射部位の近傍の動脈や毛細血管に滞留する。肺へのGOの蓄積は、注入量とサイズが大きくなるにつれて増加するが、肝臓への蓄積は有意に減少することが示された[78]。例えば、GO-PEGとGO-デキストラン(GO-DEX)の静脈内注射は、短期間の毒性を伴わずに、肝臓と脾臓を含む細網内皮系(RES)に蓄積する[31, 79]。さらに、血漿タンパク質の電荷と血漿タンパク質によるGOの吸着も、生体内分布に影響を与える[34]。
GFNの排泄およびクリアランスは臓器によって異なる。肺では、NGOがAMに取り込まれ、AMによってクリアランスされることが観察され、粘膜繊毛クリアランスまたはその他の方法で喀痰から排泄される可能性が示された[57]。また、気管内投与されたFLGの46.2 %が曝露28日後に糞便から排泄された[61]。肝臓では、ナノ粒子は胆道から十二指腸へと続く肝胆道経路を通って排泄される [80]。加えて、主に肝臓と脾臓に蓄積するPEG化GNSは、腎排泄と糞便排泄の両方によって徐々に排出される可能性が高い。最近概説されたように、200 nmより大きなGOシートは脾臓の物理的濾過によって捕捉されるが、小さなサイズ（約8 nm）は腎尿細管を通過して尿中に入り、明らかな毒性を示すことなく速やかに除去される［81］。GFNの排泄経路についてはまだ明確に説明されていないが、腎経路と糞便経路がグラフェンの主な排泄経路であるようである。
近年、ナノ毒性学的研究において、分布・排泄・毒性戦略が重要な位置を占めるようになっている。現在までに、グラフェンの生体内における分布と排泄に関して、いくつかの論文で論争を呼ぶ結果が報告されており、GFNのトキシコキネティクスの系統的な評価が依然として必要とされている。ナノ物質の代謝と排泄は長期的なプロセスであるが、GFNsに関する最近の研究は短期的な毒性評価に限られており、GFNsの異なる組織への長期的な蓄積と毒性は依然として不明である。したがって、ヒトの生物医学的応用に利用する前に、材料の生物学的安全性を確保するために、さまざまな細胞や動物を用いてGFNの沈着と排泄に関する長期的な研究を実施する必要がある。

細胞内におけるGFNの取り込みと位置
GFNの細胞内への取り込みと位置もまた、細胞株によって異なる効果を発揮することが観察されている。グラフェンはさまざまな経路で細胞内に取り込まれる [82, 83]。基本的に、GOが細胞膜を通過するには、サイズ、形状、コーティング、電荷、流体力学的直径、等電点、pH勾配などの物理化学的パラメータが重要である[84]。先に述べたように、直径＜100 nmのナノ粒子は細胞内に入ることができ、直径＜40 nmのナノ粒子は核内に入ることができる[85]。例えば、GQDはエネルギー依存的な経路ではなく、細胞膜に直接侵入する可能性がある[86, 87]。より大きなタンパク質でコーティングされた酸化グラフェンナノ粒子（PCGO）（～1 μm）は主に貪食を通して細胞に侵入し、より小さなPCGOナノ粒子（～500 nm）は主にクラスリンを介したエンドサイトーシスを通して細胞に侵入する [88]。GOシートは、細胞膜に接着して巻きついたり、脂質二重層に挿入されたり、あるいは細胞との相互作用の結果として細胞内に内在化したりする可能性がある [89]。同様に、PEG化還元型酸化グラフェン（PrGO）やrGOは、疎水性の未修飾グラファイトドメインと細胞膜との相互作用により、脂質二重層の細胞膜に顕著に接着することが示された [90, 91]。その結果、グラフェンへの長期曝露や高濃度のグラフェンは、アクチンフィラメントや細胞骨格の不安定化とともに、細胞膜に物理的または生物学的な損傷を引き起こすことが示唆された [92]。マクロファージ上の3つの主要なレセプターは、Fcgレセプター（FcgR）、マンノースレセプター（MR）、補体レセプター（CR）である。さらにFcgRは、媒介される貪食経路における重要な受容体である［90、93、94］。GOのタンパク質コロナは、マクロファージ受容体、特にタンパク質コロナ内に含まれるIgGによる認識を促進する。マクロファージは、GOと接触することで顕著な形態変化を起こすことが観察された[34]。内在化後、グラフェンは細胞質、核周辺腔、および核に蓄積し、ミトコンドリア膜電位の枯渇を通じて細胞内活性酸素を増加させ、ミトコンドリア経路の活性化を通じてアポトーシスを誘発することにより、マウスマクロファージの細胞毒性を誘導した [83]。可能性のあるGFNの相互作用と蓄積部位を図1にまとめた。

臓器におけるGFNの毒性
GFNの毒性および生体適合性は、理論的および動物モデル研究を通じて観察・評価されてきた。現在のところ、GFNが動物のさまざまな臓器やシステムにおいて毒性を示すデータは大量にあり、この総説ですべてのデータを列挙することは困難である。そこで、一定の数の文献を要約し、表1に示すGFNのin vivo毒性学的研究をいくつか選んだ。

内臓における毒性
GO は、重要な臓器の正常な生理学的機能を阻害することで、急性 の炎症反応や慢性の傷害を引き起こす可能性がある [32, 81]。経口経口投与実験では、消化管からのGOの検出可能な吸収は示さ れなかった[95]。興味深いことに、高用量のGOよりも低用量のGOの方が、母マウスにGO懸濁液を飲ませた後に消化管に深刻な損傷を与えた。GFNは炎症を引き起こし、1回の気管内投与で90日目も肺に残存し、鼻のみの吸入で肺リンパ節にまで転移していた[96, 97]。凝集塊を形成するGOを高用量投与すると、肺血管が閉塞し、呼吸困難が生じることがあり [50, 98]、静脈注射による1および2mg/kg体重の高濃度投与で血小板血栓が観察された [89] 。GOは肺胞-毛細血管バリアーを破壊し、炎症細胞が肺に浸潤し、炎症性サイトカインの放出を刺激すると報告されている。線維化と炎症は、肺のコラーゲン1、Gr1、CD68、CD11bという蛋白マーカーのレベル上昇によって確認された。FLGを分散させるためにTween 80を使用したり、グラフェンを分散させるためにプルロニック界面活性剤を使用したりすると、細胞やマウスで肺線維症が形成される可能性が低くなることが示唆されたが、グラフェンをウシ血清アルブミン（BSA）で懸濁した場合には肺線維症が観察された [100]。さらに、放射性同位元素は肺に送達され、肺における125I-NGOの深度分布を伴い、同位元素が肺に沈着して突然変異や癌を引き起こす可能性がある [30]。しかし、最近の論文では、低用量のGOおよび機能化グラフェンを静脈内注射したマウスでは、明らかな病理学的変化は見られなかったと主張されている（アミノ化GO（GO-NH2）、ポリ（アクリルアミド）官能基化GO（GO-PAM）、ポリ（アクリル酸）官能基化GO（GO-PAA）およびGO-PEG）。つまり、GFNの官能基と作用濃度または凝集状態が、GFNの毒性に大きく影響する。近年、GFNの毒性を低下させるために、GFNの官能基を修飾したり、作用濃度を低下させたり、凝集状態を変化させたりする方法が通常用いられている。

中枢神経系における毒性
グラフェンは、脳腫瘍治療のための薬物／遺伝子デリバリー、頭蓋内および脊髄の生体適合デバイス、バイオセンシングおよびバイオイメージング技術への応用により、脳神経外科手術に大きく貢献している。脳におけるグラフェンの可能性やリスクに関する研究も出てきている。ニワトリ胚モデルでは、グラフェン薄片がリボ核酸レベルとデオキシリボ核酸合成速度を低下させ、脳組織の発達に有害な影響を及ぼした。中枢神経系におけるGFNの最近の研究は、毒性よりもむしろ応用に関わるものがほとんどである。GFNに関する毒性研究のデータは現在進行中である。

生殖発生系における毒性
原始的なグラフェンは、ニワトリの受精卵に注入した後19日間培養すると、心臓の脈管形成と分岐血管の密度を低下させた [101]．GOおよびrGOは、濃度依存的に胚の孵化率および体長に影響を及ぼすことにより、ゼブラフィッシュ胚に損傷を与える。暴露されたゼブラフィッシュ胚では、明らかな奇形や死亡 は観察されなかったが [102]、GOはゼブラフィッシュ胚の絨毛に付着し、包まれ、顕著 な低酸素状態と孵化遅延を引き起こした。GO凝集体は、胚の眼、心臓、卵黄嚢、尾などの多くの小器官に保持され、これらの領域でアポトーシスと活性酸素種（ROS）の発生が観察された[103]。さらに、rgoは非妊娠雌マウスの血清エストロゲン濃度を変化させ なかった。雌マウスでは条件が異なり、交配前または妊娠初期にrGOを注射 したマウスのダムは健康な子孫を出産でき、rGOを注射したダムの産仔の中 に異常な産仔はわずかしか存在しなかった。しかし、妊娠マウスはどの用量でも流産し、妊娠後期に高用量のrGOを注射すると、ほとんどの妊娠マウスが死亡した［44］。特筆すべきは、高用量投与群では泌乳期間中に子の発育が遅れたことである。GOの高用量は、経口暴露により母マウスの水分消費 量を減少させ、乳汁分泌を減少させたため、子孫の成長を遅らせた [53]。これらの知見は、GFNsが発生に有害である可能性を示しているが、生殖および発生毒性に関するデータはまだ不十分である。根本的な毒性メカニズムを解明するためには、GFNが雌雄の生殖および発育に及ぼす影響に関する研究がまだ必要である。

血液適合性の影響
GOの血液中への放出は避けられない。GOの血液適合性は、機能性コーティングと暴露条件に依存することがわかった。サブミクロンサイズのGOが最大の溶血活性を示し、凝集グラフェンが最も低い溶血反応を誘導した。また、プリスティン・グラフェンおよびGOは、75μg/mLまで溶血効果を示した[104]。GO-ポリエチレンイミン（GO-PEI）は、1.6 μg/mLでもHSAに結合して顕著な毒性を示した[105]。カルボキシル化グラフェン酸化物（GO-COOH）は、50μg/mLを超える濃度でTリンパ球に対する顕著な細胞毒性を示し、25μg/mL以下では良好な生体適合性を示したが、GO-キトサンは溶血活性をほぼ抑制した［106］。これまで、血液適合性の対応するリスクはほとんど不明であった。
結論として、GFNによって誘発される肺障害はいくつかの研究で研究されており、その結果、肺における炎症細胞浸潤、肺水腫および肉芽腫形成が示されている。しかし、肝臓、脾臓、腎臓などの他の臓器における評価については、数少ない具体的な研究しか行われておらず、これらの内臓に対する傷害症状、傷害指数、傷害レベルについては十分に検討されていない。さらに、GFNsの神経毒性に関する研究は非常にまれであり、どの神経や脳部位に障害が起こるかを明らかにしたデータはなく、関連する行動症状も研究されていない。GFNsの発達毒性は、構造異常、成長遅延、行動・機能異常、さらには死亡を引き起こす可能性がある。GFNsの生殖および発達毒性に関する研究は非常に重要であり、今後広く注目されることになるだろう。ほとんどすべてのGFNs毒性研究は短期間の実験であり、長期的な慢性毒性傷害を調査した研究はない。しかし、他のナノ材料の毒性研究に基づくと、GFNsの長期暴露は健康を害する重要な要因である可能性がある[107-109]。したがって、GFNsの長期的な研究が必要である。

細胞モデルにおけるGFNの毒性
in vitroにおけるGFNの細胞毒性は、様々な細胞で確認されており、細胞の生存率や形態を変化させ、膜の完全性を破壊し、DNA損傷を誘導する[110-112]。GOまたはrGOは、細胞接着を低下させ、細胞のアポトーシスを誘導し、リソソーム、ミトコンドリア、細胞核、および小胞体へ侵入する[113]。GQDは細胞内に侵入し、NIH-3 T3細胞においてp53、Rad 51、OGG1タンパク質の発現を増加させることでDNA損傷を誘導した[87]。しかしながら、GQDはヒト乳がん細胞株（50μg/mLの用量）またはヒト神経幹細胞（250μg/mLの用量）に対して有意な毒性を示さなかった[114, 115]。GO誘導体は、アクチン細胞骨格、フォーカルアドヒージョン、エンドサイトーシスの制御など、細胞膜の構造と機能に関与する遺伝子の発現を劇的に減少させた [89]。ラット褐色細胞腫細胞（PC12細胞）では、グラフェンとrGOが、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出、カスパーゼ-3の活性化の増加、活性酸素の発生などの細胞毒性作用とミトコンドリア傷害を引き起こした [82, 116]。

グラフェンは、細胞株、グラフェン材料の種類、および投与量に応じて、細胞生存率 [117]を増加させたり、細胞死 [118]を引き起こしたりする可能性がある。GOの細胞毒性は、ヒト線維芽細胞および肺上皮細胞では20 μg/mL以上の濃度で24時間後に観察されたが、A549細胞では50 μg/mL以上の濃度で最小限の毒性しか認められなかった[119]。HeLa細胞では、活性酸素、マロンジアルデヒド （MDA）、LDHなどのGOによって誘導される生物学的応答 が増加したのに対し、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD） は用量依存的に減少した [120]。しかしながら、GO-分子ビーコン（GO-MB） は、HeLa細胞において20μg/mLでも低い細胞毒性を示した [121]。GOは、A549細胞の生存率を低下させたが、同じ濃度と暴露時間で、CaCo2大腸がん細胞の細胞生存率を上昇させた [122]。別の研究では、GOがSH-SY5Yの分化を劇的に促進し、低濃度では神経突起の長さと神経細胞マーカーMAP2の発現を増加させたが、高濃度（≧80 mg/mL）ではSH-SY5Y細胞の生存率を抑制したことが報告されている[123]。GO-PEG[124]やGO-キトサン[125]などのGO上の機能化コーティングは、細胞間の相互作用を阻害することにより、粒子の細胞毒性を大幅に減衰させることができる。

試験管内でのGFNの毒性を表2にまとめた。グラフェンナノ材料の細胞毒性に関するデータは対照的であり、さまざまな特性が結果に影響を及ぼしている。毒性のメカニズムや影響因子については、詳細な解明が必要である。

GFNの毒性の起源
報告されているように、グラフェンの濃度、横方向寸法、表面構造、官能基、純度、タンパク質コロナなどの特性は、生体系における毒性に強く影響する [2, 7, 104, 126-129]。

濃度
多くの結果から、グラフェン材料は動物および細胞において用量依存的な毒性を引き起こすことが示されている。例えば、肝臓および腎臓障害、肺肉芽腫形成、細胞生存率低下、細胞アポトーシスなどである [130-134]。In vivo研究では、低用量（0.1 mg）および中用量（0.25 mg）に曝露したマウスにGOの明らかな毒性は認められなかったが、高用量（0.4 mg）では慢性毒性が誘発された。GOの高含有量は主に肺、肝臓、脾臓、腎臓に沈着し、1回の尾静脈注射では腎臓で浄化されにくかった[135]。興味深いことに、投与量を増やすと、静脈注射によるs-GOの肝吸収は劇的に減少したが、肺への取り込みは増加した［31］。さらに、in vitro研究では、20 μg/mLのGOナノシートは、2時間のインキュベーションで A549に細胞毒性を示さなかったが、高濃度（85 μg/mL）では、24時間以内に細胞生存率が50%まで低下したことが報告された[136, 137]。Lüらもまた、ヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞株において、 GOは低濃度では96時間明らかな細胞毒性を示さなかったが、 100 mg/mLのGOで96時間培養すると、細胞の生存率が20% まで急激に低下したことを示した[123]。

HeLa細胞、NIH-3 T3細胞、および乳がん細胞（SKBR3、MCF7）をグラフェンナノリボンで処理した結果でも、用量依存的（10～400 mg/ml）かつ時間依存的（12～48時間）に細胞生存率が低下した［138］。GO の濃度が高くなると、リソソーム、ミトコンドリア、小胞体、および細胞核に侵入した [119]。rGOは、低用量および初期時点ではアポトーシスを介した細胞 死を引き起こすが、時間/用量の増加に伴い壊死が優勢になることを示 したデータがいくつかある [110, 135]。

横方向寸法
100 nm未満のナノ粒子は細胞内に入ることができ、40 nm未満は核内に入ることができ、35 nm未満は血液脳関門を通過することができる[85]。ある研究では、GO（588、556、148 nm）はA549細胞に侵入せず、明らかな細胞毒性を示さなかった[112]。グラフェンの直径が100～500 nmの場合、最も小さなサイズが最も深刻な毒性を引き起こす可能性があり、直径が40 nm以下の場合、最も小さなサイズが最も安全である可能性がある。例えば、直径11 ± 4 nmのrGOは、1時間で0.1および1.0 mg/mLという非常に低い濃度でhMSCsの核内に侵入し、染色体異常とDNA断片化を引き起こす可能性がある。しかし、直径3.8 ± 0.4 nmのrGOシートは、24時間後に100 mg/mLという高用量であっても、hMSCsにおいて顕著な遺伝毒性を示さなかった[118]。

in vivoの研究では、s-GO (100-500 nm)は肝臓に優先的に蓄積したのに対し、l-GO (1-5 μm)は主に肺に分布した。これは、l-GOがより大きなGO-タンパク質複合 体を形成し、静脈注射後に肺毛細血管でろ過されたためである [31]。同じ濃度における3つのGOナノシートの相対的な横方向 の大きさ（205.8 nm、146.8 nm、33.78 nm）を考えると、小さいGOの方が大きい GOよりもHela細胞への取り込みがはるかに大きい[139]。s-GOの高い取り込みは、細胞の微小環境を変化させ、その結果、3つのサイズのGOサンプルの中で最も大きな生存率低下と最も深刻な酸化ストレスを誘発した[119]。その結果、ある研究では、GOのサイズ依存的にマクロファージのM1分極化と炎症反応がin vitroおよびin vivoで誘導されることが明らかになった。より大きな GOは、細胞により取り込まれやすい小さなGOシートに 比べて、貪食が少なく細胞膜への強い吸着を示し、TLR との強固な相互作用を誘発し、NF-κB経路を活性化した [94]。こうした効果の根底にある詳細なメカニズムをさらに解明するには、グラフェン材料の横方向サイズの重要なメカニズムを説明するためのさらなる研究が必要である。

表面構造
GFNは、表面化学的性質が大きく異なる。例えば、純粋なグラフェン表面は疎水性であり、GO表面はカルボキシレート基を伴って部分的に疎水性であり[140-142]、rGOは中間の親水性を有する[143]。GFNは、おそらく細胞との極めて強い分子間相互作用によって、細胞膜やタンパク質の機能や構造を破壊することが観察された[2, 91]。例えば、rGOは細胞膜に結合し、受容体を刺激し、ミトコンドリア経路を活性化してアポトーシスを誘導した[110, 111, 144]。GO は rGO よりも小さく、毒性も低いという限定的なエビデンスが 示されたが、これは前者の種が酸素含有量が高く、エッジが滑らかで、親 水性であるためである [104, 145, 146]。GOとrGOでは表面の酸化状態が異なるため、親水性が明 確なGOはHepG2細胞に容易に取り込まれる可能性がある。逆に、疎水性が明らかなrGOは、細胞表面に吸着・凝集し、取り込まれることなく（あるいは取り込まれにくく）なる可能性がある[110]。強いπ-πスタッキング相互作用により、グラフェンはタンパク質の多くの残基、特にビリンヘッドピース（HP）、F10、W23、F35などの芳香族残基を切断する能力が高い。タンパク質の二次構造および三次構造は、大部分がグラフェン表面に横たわっており、タンパク質の構造と機能を破壊する[41]（図2）。さらに、GOは二本鎖 DNA の塩基対の間に挿入し、分子レベルでの遺伝情報の流れを乱す可能性があり、これが GO の変異原性効果の主な原因の一つである可能性がある [7, 112, 146, 147]。

電荷
GOの表面電荷は、細胞の内在化および取り込みメカニ ズムに影響を与えるため、多くの研究がその重要性を強調し てきた [148-150]。貪食細胞以外の細胞では、GOの細胞内への取り込みは ごくわずかであったが、これはマイナスに帯電したGOと細胞 表面との間の強い静電反発によるものと思われる[34]。しかしながら、負に帯電したナノ粒子は、細胞表面上の利用可能なカチオン性部位に結合し、スカベンジャー受容体によって取り込まれることにより、非貪食細胞に内在化される可能性があることが、他の研究者によって示唆されている [110, 146, 150]。GO/GS粒子は、赤血球（RBC）の形態変化と著しい溶血を引き起こし、高度の溶血を引き起こすと報告されている。赤血球膜の破壊は、おそらくGO/GS表面の負に帯電した酸素基と、赤血球外膜の正に帯電したホスファチジルコリン脂質との間の強い静電相互作用に起因している [106]。

官能基化
PEG [52]、PEG化ポリ-L-リジン（PLL） [151]、ポリ（ε-カプロラクトン） [152]、ポリビニルアルコール [3]、プルロニック [153]、アミン [98]、カルボキシル基、およびデキストラン [79] 基による官能基化は、グラフェンの毒性を大きく低下させ、生体適合性を向上させることが研究により確認されている。In vivoの結果から、GO-Pluronicハイドロゲルの皮下注射後には軽度の慢性炎症が現れただけであり、GO-DEXの静脈注射後には目立った短期毒性は試験されなかった [79, 154]。PEG化GSは、血液生化学と組織学的検査で評価されたように、20 mg/kgを3ヶ月間投与されたマウスに顕著な毒性を引き起こさず、RESへの滞留も比較的低かった [52, 155]。GOをキトサンでコーティングすると、血液中の溶血活性がほとんどなくなった [39]。さらに、PEGコーティングはGOが誘発した急性組織傷害を効果的に緩和し、肝臓、肺、脾臓におけるGOの凝集と滞留を減少させ、GO [81]、GO-DEX [79]、およびフッ素化酸化グラフェン（FGO） [156]のクリアランスを促進した。

In vitroでは、いくつかの細胞機能アッセイにより、強い毒性効果を低減させるためには原始的なグラフェンやGOの表面官能基化が重要であるという明確な証拠が示された [91]。PEG-GO、PEI-GO、LA-PEG-GOは、GOよりもヒト肺線維芽細胞へのダメージが少なかった[148]。PEG-GOは、グリオブラストーマ細胞（U87MG）、乳がん細胞（MCF-7）、ヒト卵巣がん細胞（OVCAR-3）、結腸がん細胞（HCT-116）、リンパ芽球細胞（RAJI）などのいくつかの細胞培養に対して、100μg/mLまでの濃度で細胞毒性を示さなかった［119、157、158］。GQDs-PEGは、非常に高濃度（200μg/mL）であっても、肺がん細胞や子宮頸がん細胞に対する毒性が非常に低いか、全くないことを示した［159］。しかし、非生分解性材料であり、細胞内への取り込みの可能性が大きいため、機能化グラフェンの長期的な悪影響の可能性を評価するためには、さらなる調査が必要である。

凝集と沈殿
報告されているように、ナノ材料は、特に生理的条件下では、個々の単位よりもむしろ凝集体を形成する傾向がある。GS表面はGOに比べて赤血球の付着が少なく、水中凝集体形成が多い割には溶血活性が低かった。対照的に、GSの速い沈降と凝集体形成は、ウェルの底で増殖させたヒト皮膚線維芽細胞の栄養供給を大きく阻害した[106]。したがって、グラフェン粒子の凝集と沈降は、細胞によってさまざまな影響を及ぼす。

不純物
ナノ材料の純度は重要な検討事項である。というのも、ナノ材料そのものではなく、残留する汚染金属が観察された毒性の原因である可能性があり、その結果、GFNの細胞毒性に関して相反するデータが得られているからである[35, 160]。従来から調製されているGOには、細胞に対して変異原性の高いMn2+やFe2+が多く含まれている。従来から調製されているGOからこれらのイオンが非特異的に放出されることで、異常に高いレベルの細胞毒性とDNA破壊が生じる可能性がある[39]。特に、Pengら[161]は、わずか0.025ppmのMn2+と0.13ppmのFe2+を含む高純度GOを製造し、Haneneら[162]は、良好な水分散性とコロイド安定性を有する高純度単層GOシートを調製する新しい方法を発明した。これらの新しい方法によって作製されたGOは、in vitroでは有意な細胞毒性反応（暴露量100μg/mLまで）を誘導せず、in vivoでは明らかな炎症反応や肉芽腫形成（暴露量50μg/動物まで）は観察されなかった。したがって、GFNの純度は注目に値するものであり、生物学的応用に関与するGFNの決定に向けた重要なステップである。

タンパク質コロナ効果
自由表面電荷が高いため、ナノ材料は生体系内のタンパク質と容易に「コロナ」を形成することができる [163, 164]。タンパク質のコロナは、ナノ粒子の循環、分布、クリアランス、毒性に影響することが示唆されている。GO が血清中の吸着血漿タンパク質と GO-タンパク質コロナを形成し、これらの GO-タンパク質コロナが生体内での GO の生物動態学的挙動の運命を決定する上で重要な役割を果たすことを報告した論文がいくつかある。このようなGO-タンパク質コロナ は、特異的および非特異的相互作用を通じて、GOの内皮 細胞や免疫細胞への接着を制御することができる [165]。基本的に、タンパク質コロナに含まれる免疫グロブリンGと補体タンパク質は、免疫細胞内でナノ粒子を再編成するのに役立ち、粒子がRESに飲み込まれる原因となり、IgGでコーティングされたGOは、細胞膜レセプターとの特異的または非特異的相互作用のいずれかによって取り込まれた [31, 165]。しかし、別の研究では、フィラ ルマウスにGO水溶液を飲ませた後、GOが腸管内の粘膜上 皮細胞に直接接着できなかった。タンパク質コロナは、GOと細胞膜との物理的相互作用を制限し、HeLa、THP-1およびA549細胞における細胞形態学的損傷を軽減することにより、GOの細胞毒性を緩和した [166-168]。GOをFBSでプレコートし、細胞とともにインキュベートすると、細胞毒性効果は大きく減少した。100μg/mL FBSコートGOではほぼ90%の生存率、20μg/mL FBSコートGOでは100%の生存率が観察された。同様の傾向は、BSAで覆われたGOでも観察された [166, 169]。一貫して、追加血清は、J774.A1細胞において4 μg/mLの用量で原生GOの毒性を中和することができ、未処置細胞と比較して細胞数が52.5 %減少した [89]。

多くの研究を検討した結果、グラフェンの毒性は複数の要因に影響されるという結論に達した。それらの要因が組み合わさることで、多くの場合、GFNの毒性が大きく変化する。科学的研究ではしばしば、原因と結果を明確に特定することが必要であり、そのためには一度に1つの要因のみを変化させ、その1つの要因の影響を特定する必要がある。しかし、いくつかの論文では、GFNsの毒性に影響を与えるいくつかの要因が同時に研究され、その結果混乱が生じた。

FNの毒性メカニズムの可能性
GFNsの物理化学的特性や毒性については多くの研究者によってよく研究されているが、GFNsの毒性の根底にある正確なメカニズムは依然として不明である。GFNsの細胞毒性の主なメカニズムの概略図を図3に示す。

物理的破壊
グラフェンは、他の球状ナノ粒子や一次元ナノ粒子と比較して、sp2 炭素を含む二次元構造を持つユニークなナノ材料である。グラフェンナノ粒子と細胞膜との物理的相互作用は、グラフェンの細胞毒性の主な原因のひとつである [7, 170, 171]。グラフェンは表面の曲率が良好なため、ペプチドのαヘリカル構造と結合する能力が高い [172]。75μg/mLを超える濃度では、純粋なグラフェンはRAW 264.7細胞の表面に大きく接着し、細胞膜の異常な伸展をもたらした [104]。GFNと細胞膜との強い疎水性相互作用により、F-アクチンのフィロポーダルと細胞骨格の機能不全が形態学的に拡大した。さらに、GNSの研ぎ澄まされたエッジは「刃」として働き、細菌の細胞膜を挿入し、切断する可能性がある[173]。さらに、GOは大腸菌の外膜を直接損傷し、細胞内成分の放出をもたらした [173]。しかし、TEMイメージングにより、GOをFBSでプレコートすると細胞膜の破壊がなくなることが明らかになった[166]。

酸化ストレスにつながる活性酸素産生
酸化ストレスは、活性酸素レベルの上昇により、カタラーゼ、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-PX）などの抗酸化酵素の活性が圧倒されることで生じる [174]。活性酸素は、多くの細胞内シグナル伝達カスケードにおいてセカンドメッセンジャーとして働き、膜脂質の破壊、DNAの断片化、タンパク質の変性、ミトコンドリアの機能不全などの細胞高分子の損傷を引き起こし、細胞の代謝やシグナル伝達に大きな影響を与える [175-177]。GOと細胞との相互作用は、過剰な活性酸素の発生につながる可能性があり、これは発がん、老化、突然変異誘発のメカニズムにおける最初のステップである [83, 122]。酸化ストレスは、GOによって誘発された急性肺損傷において重要な役割を果たし [30]、酸化ストレスによって引き起こされる炎症反応は、GFNへの曝露によってしばしば出現した [133, 177, 178]。SODおよびGSH-PXの活性は、GO曝露後、時間および投与量依存的に低下した [82, 106, 119]。同様に、HLF細胞がGOに暴露されると、酸化ストレスがアポトーシスとDNA損傷の主要な原因となった［148］。プリスティン・グラフェンで処理した細胞では、活性酸素の発生によってマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）（JNK、ERK、p38）とTGF-β関連のシグナル伝達経路の両方がトリガーされ、Bcl-2タンパク質ファミリーの2つのプロアポトーシスメンバーであるBimとBaxの活性化を伴っていた。その結果、カスパーゼ-3とその下流のPARPなどのエフェクタータンパク質が活性化され、アポトーシスが開始された [83, 179]。炎症、アポトーシス、壊死を誘導するMAPK、TGF-β、TNF-α関連のシグナル伝達経路に関する詳細情報を図4にまとめた。

ミトコンドリア損傷
ミトコンドリアは、細胞内の様々なシグナル伝達経路に関与するエネルギー産生センターであり、アポトーシス制御のキーポイントでもある [83]。GOおよびカルボキシルグラフェン（GXYG）への曝露後、HepG2細胞ではミトコンドリア膜が脱分極し、ミトコンドリアの量が減少した [180]。GFNに曝露すると、ミトコンドリアの酸素消費量が結合型および非結合型ともに有意に増加し、ミトコンドリア膜電位が散逸し、最終的にはミトコンドリア経路を活性化することでアポトーシスが誘発された [181]。例えば、GOは、ミトコンドリアの電子輸送複合体I/IIIの活性と、電子輸送鎖の部位I/IIへの電子の供給を増加させ、MHS細胞のミトコンドリア呼吸中の活性酸素の発生を加速した [99]。GOとチトクロム-c/H2O2電子伝達系を介した-OHの形成は、酸化ストレスと熱ストレスを増強してミトコンドリア呼吸系を障害し、最終的に劇的な毒性をもたらす可能性がある [151]。さらに、GO上の酸素部位は、細胞の酸化還元タンパク質から電子を受容し、シトクロムcと電子輸送タンパク質の酸化還元サイクルを支えている可能性があり、シトクロムMtrA、MtrB、MtrC/OmcAは、GOへの電子伝達に関与している可能性がある[182]。したがって、細胞膜の損傷と酸化ストレスの誘導を除けば、GFNは細胞のミトコンドリア活性に直接影響を与えることによって、アポトーシスや細胞壊死を引き起こす可能性がある [183, 184]。

DNA損傷
GO はサイズが小さく、表面積が大きく、表面電荷が 高いため、重大な遺伝毒性を有し、染色体断片化、DNA 鎖切断、点突然変異、酸化的 DNA 付加体および変質など、深刻な DNA 損傷を引き起こす可能 性がある [87, 122, 185, 186]。マウスにGOを20 mg/kgの用量で静脈注射したところ、古典的な突然変異原であるシクロホスファミド（50 mg/kg）と比較して、突然変異誘発が観察された [112]。GOが細胞核内に侵入できなくても、核膜が破壊される有糸分裂中にDNAと相互作用する可能性があり、DNA異常の機会が増加する [87, 147, 187, 188]。グラフェン炭素環と疎水性DNA塩基対との間のπスタッキング相互作用は、DNAセグメントをグラフェン表面に「立たせる」ことも「寝かせる」ことも可能であり、それぞれらせん軸が垂直または平行になる。分子間力はDNAの末端塩基対を大きく変形させ、遺伝毒性を高める可能性がある[189]。GOはまた、MAPK、TGF-β、NF-κBなどの細胞内シグナル伝達経路の活性化を通じて酸化ストレスを促進したり炎症を誘発したりすることで、染色体断片化、DNA付加体、点突然変異を誘発する可能性もある [110, 112, 146]。グラフェンおよびrGOはまた、染色体損傷を反映するp53、Rad51、およびMOGG1-1の発現を上昇させ、さまざまな細胞株において細胞周期のG1期からS期への移行を阻止することによってCDK2およびCDK4の発現を低下させることができる [112]。DNA損傷は、癌の発生を引き起こすだけでなく、GOの変異原性が生殖細胞で生じた場合、次世代の健康を脅かす可能性もあり、生殖能力と子孫の健康に影響を与える[112, 190]。

炎症反応
GFNは、気管内投与または静脈内投与により、高用量で炎症細胞浸潤、肺水腫および肉芽腫形成を含む重大な炎症反応を引き起こす可能性がある [30, 49]。血小板は、炎症反応中に病原体や粒子状物質を攻撃する血栓形成の重要な構成要素であり、GOは静脈内注射後、肺血管を閉塞させる血小板に富む血栓形成を直接活性化する可能性がある [98, 191]。GOを21日間皮下注射すると、IL-6、IL-12、TNF-α、MCP-1、IFN-gなどの主要なサイトカインの分泌とともに、強い炎症反応が誘導された。GFNは、サイトカインやケモカインを放出することで炎症反応や組織傷害を引き起こし、循環単球の動員やTh1/Th2サイトカインおよびケモカインの分泌を促進する [124, 193]。さらに、純粋なグラフェン[193]やrGO[110]は、トール様受容体（TLR）に結合して細胞内のNF-κBシグナル伝達経路を活性化することにより、炎症反応を引き起こす。NF-κBシグナル伝達カスケードは、TLRとIL-1やTNF-αなどの炎症性サイトカインによって引き起こされる。活性化されると、NF-κBは細胞質から核へと移行し、分解IκBとの結合を促進し、転写因子として作用して、多くの炎症性サイトカインを合成する [194] 。GFNによって活性化されるTLR4とTLR9のシグナル伝達経路の概略図を図5に示す。

アポトーシス
アポトーシスは、複雑なプログラムを通じて遺伝子によって制御される細胞の自己破壊と定義されている［83, 195］。goとrgoは、マウスの肺に吸入するとアポトーシスと炎症を引き起こし［99］、gfnsも細胞内でアポトーシス促進作用を示した［111, 113, 124, 196］。さらに、グラフェンとgoは細胞膜を物理的に損傷し [166]、ミトコンドリア外膜の透過性を高め、ミトコンドリア膜電位を変化させた。増加したrosはmapkとtgf-βのシグナル伝達経路を引き起こし、ミトコンドリア依存性のアポトーシスカスケードを介してカスパーゼ-3を活性化し、アポトーシスの実行を促した [83, 99]。同様に、rgoは低用量かつ早い時点でアポトーシスを引き起こし、デスレセプターと正統的なミトコンドリア経路によって引き起こされた：GO-COOHは、タンパク質レセプターに結合し、ROS非依存性経路を活性化することにより、核DNAに受動的アポトーシスシグナルを伝達した。しかし、GO-PEIは、Tリンパ球の膜を著しく損傷し、アポトーシスを誘発した。

オートファジー
オートファジーは、細胞成分の自己分解プロセスであり、最近では非アポトーシス性細胞死として認識されている [198-200]。オートファジーの活性化には、ベクリン1、複数のオートファジー関連タンパク質（ATG）、微小管関連タンパク質軽鎖3（LC3）、p62を含むオートファゴソームの形成が必要である[201]。オートファゴソームの蓄積は、様々なナノ粒子への曝露と関連しており [202-205]、オートファジーは細胞外生物を除去し、細胞質内の生物を破壊することができる [206]。GOとGQDは、オートファゴソームの蓄積とLC3-IからLC3-IIへの転換を誘導し、オートファジー基質であるp62タンパク質の分解を阻害することが示された[207, 208]。さらにGOは、マクロファージ[34, 192]や大腸がん細胞CT26[206]において、TLR4とTLR9の反応を同時に引き起こすことができる。オートファジー経路は、マクロファージにおけるTLRシグナルによる貪食と関連している [206, 209]。

ネクローシス
壊死は、炎症反応や細胞傷害によって誘導される細胞死の代替形態である。高濃度（50 mg/mL）のグラフェンを細胞に暴露すると、アポトーシスとネクローシスが起こる [83]。報告されているように、細胞質 Ca2+ レベルの上昇によって誘発される LDH の漏出とミトコンドリア透過性移行孔の開口は、アポトーシス／ネクローシスにつながる [210]。GO投与は、TLR4シグナルを活性化し、その後にオートクリンTNF-α産生を部分的に誘発することにより、マクロファージ性壊死を誘導することが明らかにされた [93]。GOとCDDPの併用（GO/CDDP）は、RIP1を減少させ、RIP3タンパク質を増加させ、高移動度グループB1（HMGB1）の核から細胞質への放出とCT26細胞外への放出を伴って、壊死を誘発した［205、211、212］。

エピジェネティクスの変化
エピジェネティクスには、dnaメチル化、ゲノム・インプリンティング、母性効果、遺伝子サイレンシング、rna編集が含まれる［213-215］。dnaメチル化は、最もよく研究されているエピジェネティック修飾の一つであり、リン酸化、ユビキチン化、atp-リボシル化を含み、クロマチンリモデリングにつながる可能性がある［197、216、217］。最近発表された論文では、sl-go/fl-goにさらされると、dnmt3bとmbd1遺伝子がアップレギュレートされ、グローバルなdnaハイパーメチル化が起こることが報告され、gnpを投与すると、dnmt3bとmbd1遺伝子の発現が減少し、ハイパーメチル化が起こることが報告された［216］。gnp投与は、dnmt3bとmbd1遺伝子の発現を低下させることで、低メチル化を引き起こした。gnp投与は、cep-1の構成要素に影響を与えることで、dna損傷-アポトーシスシグナル伝達カスケードを抑制するmirna-360制御経路を活性化する可能性がある。

結論として、多くの研究が、4つのシグナル伝達経路が関与するgfns毒性の代表的なメカニズムについて論じている：TLR、TGF-β、TNF-α、MAPKである。これら4つのシグナル伝達経路は相関的かつ相互調節的であるため、炎症反応、オートファジー、アポトーシス、その他のメカニズムは独立したものでありながら、互いに関連している。さらに、酸化ストレスはこれらのシグナル伝達経路を活性化する上で最も重要な役割を果たしているようだ。他のナノ材料の毒性研究では、アポトーシス、オートファジー、ネクローシスが交差し、ある条件下では相互に阻害したり促進したりすることが報告されている。しかし、これまでの論文で調べられてきたGFNs毒性のシグナル伝達経路は、複雑な網の目のほんの一部に過ぎず、シグナル伝達経路のネットワークについては、今後詳細に調べる必要がある。

データギャップと今後の研究
現在のところ、GFNの潜在的危険性について結論を出すには文献が不十分である。ある研究者は、生物医学的応用に焦点を当てた多くの研究 [119、154、162、219] においてグラフェン材料が生体適合性であることを示唆し、他の研究者は有害な生物学的反応や細胞毒性を報告している [32、118、135、138、192]。これらの一貫性のない結果は、研究グループの違い、様々な細胞モデルや動物モデル、GFNの物理化学的特性の違いなど、いくつかの要因に起因している可能性がある。GFNを人体やその他の生物医学的用途にin vivoで応用する場合には、生体適合性を考慮する必要があり、GFNの毒性についてのより詳細で正確な研究が必要である。
第一に、GFNの毒性に関する今後のすべての研究において、詳細な物理化学的特性評価が必須である。実験では、GFNsの特徴として、そのサイズ、形態、表面積、電荷、表面修飾、純度、および凝集を含める必要がある[88, 141, 148, 162]。これらの物理化学的因子はGFNの毒性および生体適合性に大きく影響するため、単一因子の実験計画および他の干渉因子の除外を考慮すべきである。また、形成された酸化残渣が、機能化の過程でグラフェンや GO の表面構造を大きく変化させる可能性があるため、作製プロセスの詳細についても説明する必要がある [151]。重要なことは、グラフェン技術において単一の普遍的手法を確立することであり、これによって異なる研究や異なる研究室からのデータをより適切に比較できるようになる。
第二に、観察基準やパラメータ、実験方法の選択が異なると、実験室間で大きなばらつきが生じる可能性がある [220, 221]。例えばMTTアッセイでは、自然還元により偽陽性が生じるため、グラフェンの毒性を正確に予測することはできない。したがって、水溶性テトラゾリウム塩試薬（WST-8）、活性酸素アッセイ、トリパンブルー排除試験など、適切な代替評価を利用すべきである［106, 222］。さらに、コメットアッセイは小核アッセイよりも高い DNA損傷を示すことが多いが、これは前者が修復可能な傷害を測定 し、後者が細胞分裂後に残る遺伝子損傷を測定するためである [159, 223]。したがって、グラフェン材料の毒性を評価する際には、偽陽性を避けるために最も適切なアッセイ法を選択する必要がある。
第三に、がん細胞株はその遺伝的背景によって感受性や耐性が異なる傾向があるため、細胞株の選択は極めて重要である。同じグラフェンナノ粒子でも、様々な細胞の起源によって異なる反応を引き起こす可能性がある。偽陽性や偽陰性の結果を避けるためには、安定性に優れた適切な細胞株を使用しなければならない。ヒトや動物由来の初代細胞は、ヒトの健康状態をよりよくシミュレートできる。他のナノ材料の毒性試験には大量の初代細胞が利用されてきた[224-228]が、これまでのGFNを用いた実験では初代細胞の培養は極めてまれである[210, 229]。GFNsの物理化学的特性と毒性を総合的に評価するためには、初代細胞と組み合わせたさまざまな細胞実験を行う必要がある。
第四に、GFNの投与経路は毒性試験において非常に重要な役割を果たし、投与方法が異なれば毒性学的反応も異なる[32, 53]。したがって、曝露経路と曝露期間は、研究の目的に応じて慎重に選択されるべきである。経鼻薬物送達は、ナノ材料の神経毒性の研究にしばしば用いられるが [230, 231]、この投与法はGFNsの毒性試験にほとんど適用されていない。神経系におけるGFNの毒性学的研究はまれであり、そのメカニズムは不明であるため、今後さらに研究する必要がある。さまざまな曝露経路を通じたGFNの吸収、分布、代謝、蓄積、および排泄を含む最近のトキシコキネティクス研究では、ある程度の結果が得られているが、内部の複雑なメカニズムを解明するにはまだ不十分である。例えば、生理的障壁を通過するGFNの具体的な分子メカニズムや、組織におけるGFNの蓄積量や排泄期間を理解するためには、さらなる研究が必要である。また、ヒトがGFNにさらされる機会が増加していることから、ヒトの体内における全身毒性の評価は今後の研究において不可欠である。
第五に、注意を要するもう一つの重要な問題は、体内に入った後、あるいは細胞に取り込まれた後のGFNの長期的な運命である。最近の研究のほとんどは短期的な毒性評価であり[89, 232]、2008年にGFNが広く応用されて以来、長期的な毒性傷害はあまり注目されてこなかった。さらに、官能基化されたグラフェン表面は生体適合性を向上させるが、表面コーティングの長期安定性についても考慮する必要がある [233]。表面コーティングが最終的に分解された場合、その毒性は短期暴露の結果とは大きく異なる可能性がある。より長い処理時間がGFNのナノ毒性ポテンシャルに影響するかどうかを判断するためには、長期的な研究が必要である。
第6に、GFNsの毒性メカニズムにおいて、より特異的なシグナル伝達経路を発見し、解明する必要がある。現在、酸化ストレス、アポトーシス、オートファジーなど、いくつかの典型的なGFNsの毒性メカニズムが説明され、広く受け入れられている。しかしながら、これらのメカニズムは一般的な用語で説明されているに過ぎず、これらのメカニズムにおける特定のシグナル伝達経路を詳細に調べる必要がある。他のナノ材料の毒性に関与するシグナル伝達経路も、GFNの研究に関連している可能性がある。したがって、今後の研究では、より多くのシグナル伝達経路を検出する必要がある。例えば、ナノエピジェネティクスは、ナノ材料の数多くの研究において考慮されており、GFNsの限られた毒性と副作用を評価する上でも有用である。最近の研究では、GFNがエピジェネティックな変化やゲノム変化を引き起こし、物理的毒性や発がん性を刺激する可能性があることが示されている[234]。GFNは高い表面積、滑らかな連続表面、生物学的持続性を有しており、腫瘍形成性の固体インプラントの特性と類似している。GFNが異物肉腫を誘発する可能性があるかどうかは不明であり、グラフェンの腫瘍の可能性やリスクに関する確定的な研究は早急に実施されるべきである。

結論
ここ数年、GFNは幅広い技術および生物医学分野で広く利用されている。現在のところ、ほとんどの実験では肺と肝臓におけるGFNの毒性に焦点が当てられている。したがって、脳障害や神経毒性に関する研究は、今後さらに注目されるべきものである。多くの実験から、GFNは多くの生物学的応用において毒性の副作用を持つことが示されているが、毒性のメカニズムに関する詳細な研究が早急に必要である。さらに、GFNsの毒性に関する対照的な結果は、効果的な実験方法と体系的な研究によって対処する必要がある。本総説は、トキシコキネティクス、毒性メカニズム、および影響因子を要約することにより、GFNの毒性について概説し、将来的にGFNのin vitroおよびin vivoの血液適合性および生体適合性に関する徹底的な研究を促進するための情報を提供することを目的とした。この総説は、GFNの臨床応用および治療応用の前に安全性に関する懸念に対処するのに役立ち、生物学的応用におけるGFNのさらなる開発にとって重要であろう。