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論文|オンライン公開中
小分子RNAがクオラムセンシングファージとその宿主の攻撃・防御機構を制御する
https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00090-8


マルセル・シュプレンガー
マルテ・シーメルス
セバスチャン・クラウトヴルスト
カイ・パペンフォート3

脚注を表示するオープンアクセス掲載:2024年04月04日DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.03.010
PlumXメトリクス

ハイライト

ファージVP882の活性化がコレラ菌の複雑な転写変化を引き起こす

Hfq RNAシャペロンは宿主とファージがコードする転写産物の相互作用をサポートする

ファージにコードされたVpdS sRNAはファージの複製を促進する。

宿主にコードされたsRNAは塩基対相互作用を通してファージの複製を阻害する。
まとめ
全てではないにせよ、多くの細菌は集団行動を制御するためにクオラムセンシング（QS）を利用しており、最近ではバクテリオファージ（ファージ）でもQSが発見されている。ファージは、自ら情報伝達分子を産生したり、宿主の情報伝達プロセスを「盗聴」したりして、溶菌感染と溶原性感染とを切り替えることができる。ここでは、QS分子DPOによって活性化される溶菌性ファージVP882とビブリオコレラの相互作用を研究する。VP882の誘導により、ファージの転写産物が主要なRNAシャペロンであるHfqと結合し、その結果、宿主にコードされた低分子RNA（sRNA）と競合してダウンレギュレーションすることを発見した。VP882自身もHfqに結合するsRNAをコードしており、VpdSと名付けられたこれらのsRNAの1つが、宿主とファージのmRNAレベルを制御することによってファージの複製を促進することを示した。さらに、宿主にコードされたsRNAは、ファージmRNAの発現をダウンレギュレートすることによってファージの複製に拮抗することができ、したがって宿主のファージ防御手段の一部である可能性を示した。
図抄録
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キーワード
ファージVP882
低分子RNA
クォーラムセンシング
Hfq
コレラ菌
はじめに
バクテリオファージ（略してファージ）は細菌を捕食するウイルスであり、生物圏で最も豊富な生物学的存在と考えられている1。ファージと宿主との相互作用は非常に多様であり、細菌の進化の主要な原動力のひとつである可能性が高い2。最近では、宿主とファージの相互作用に関する研究により、真核生物の免疫システムの古代のホモログを構成する細菌防御戦略の数々が発見されている3,4。同様に、ファージは細菌の免疫を標的とする高度な防御戦略を開発し、ファージと宿主の間で進行中の軍拡競争が明らかになった5。
ウイルスとファージは長い間、孤立した存在と考えられてきた。例えば、枯草菌に感染する溶菌性ファージΦ3Tは、ペプチドを介したコミュニケーション戦略（アービトリウムシステムと呼ばれる）を用いて、周辺環境におけるファージ濃度を測定し、溶菌と溶菌の生活様式の切り替えを調整している7。同様に、溶菌性バイブリオファージVP882は、宿主のVqmA QSレセプタータンパク質と相同性のある、ファージにコードされた転写因子を利用している8,9。両タンパク質とも自己誘導分子である3,5-ジメチルピラジン-2-オール（DPO）に反応するが、VP882の溶菌プログラムを活性化するのは、ファージにコードされたVqmAタンパク質だけである。ここでファージVqmAは、VP882のCIリプレッサー・タンパク質を封じ込めるQtipと呼ばれる小さなタンパク質の産生を誘導し、それによってファージの溶菌プログラムを活性化する8（図1A）。注目すべきことに、類似のコミュニケーションシステムが数百のファージゲノムで発見されており、QSを感知するファージが自然界に広く存在していることを示している10,11,12,13。
図サムネイルgr1
図1DPOによるVP882活性化における宿主とファージの転写反応
キャプション
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上記のシステムはどちらもQSを用いて溶菌感染様式と溶原性感染様式を「決定」しているが、QSシグナルの生成方法が異なっている。具体的には、アービトリウム系のシグナル伝達ペプチドがファージゲノム上にコードされているのに対し、DPOはスレオニンデヒドロゲナーゼ（Tdh）を介したL-スレオニンの分解により宿主細胞で産生される14。DPOが宿主にコードされたVqmAタンパク質に結合すると、VqmR small RNA（sRNA）の転写が活性化され、コレラのバイオフィルム形成と病原性遺伝子制御が阻害される14,15,16。
VqmRは、細菌に広く存在し、複数の標的転写産物と塩基対を形成することで遺伝子発現を制御するHfq結合型sRNAの一群に属する17。Hfqは当初、Qβ RNAファージの複製を促進する宿主因子として大腸菌で同定され18、現在では他の多くの生物でも研究されている。例えば、hfqが欠損するとコレラ菌による腸内コロニー形成が阻害され、QSシグナル伝達が阻害されることから、Hfq結合型sRNAがこれら2つのプロセスを制御している可能性が示唆される20,21。特にVqmRは、バイオフィルム形成の主要な転写活性化因子をコードするvpsTや、病原性を含む様々な集団行動に関与するaphAなど、複数の標的転写産物とRNA二重鎖を形成することが示されている15,16。
V.コレラ菌の病原性遺伝子発現に関与することが報告されている他のHfq結合型sRNAには、VcdRP、24 VrrA、25,26 TarA、27,28 TarAとTarBがある。TarAとTarBはビブリオ病原性アイランド（VPI）にコードされており、両者の発現は病原性関連転写因子ToxTによって制御されている27,29。興味深いことに、VPIにコードされるTarA sRNAは、V. コレラのコアゲノムにコードされるptsGの発現を阻害することが報告されている。実際、同様の観察は他の腸内病原体でもなされている31,32。しかし、温帯性ファージの溶菌活性化におけるRNA-RNA相互作用の役割については、現在のところ不明である。
この疑問を解決するため、我々はDPOによるファージ溶菌プログラムの活性化後に、V. コレラとVP882のトランスクリプトームを記録した。その結果、両方のゲノムにおいて、数百の転写産物が調節されていることを発見し、転写開始イベントをマッピングした。VP882の活性化により、ファージ由来の転写産物がHfqに結合し、その結果、宿主にコードされたHfq結合sRNAがダウンレギュレーションされた。我々は、ファージ誘導後、ファージにコードされたVP882ファージ由来sRNA（VpdS）sRNAがHfqの主要な相互作用パートナーであることを発見し、それがRNase Eを介したプロセシングによってgp29遺伝子の3′非翻訳領域（UTR）から産生されることを示した。VP882の活性化に伴うHfqを介したRNA-RNA相互作用のグローバルな同定により、VpdSと複数の宿主およびファージ転写産物との塩基対形成を含む、ファージと宿主転写産物との間の広範なRNA二重鎖形成が明らかになった。従って、vpdSの変異はVP882の複製とファージによる細胞溶解を遅らせる。逆に、宿主にコードされたTarB sRNAは、ファージ溶解遺伝子の発現を阻害し、その結果ファージの複製を阻害することを発見した。以上の結果から、宿主とファージの転写産物間のHfqを介した塩基対形成は、VP882の活性化において普遍的であり、ファージと宿主の両方がHfq結合sRNAを利用してファージの複製を操作し、自分たちの利益につなげていることが明らかになった。
研究結果
VP882誘導のトランスクリプトーム解析
温帯性ファージは、宿主のゲノムの一部として、あるいはファージプラスミドとして宿主細菌と共存している33。ファージの複製誘導とファージ粒子の集合は、DNA損傷によって引き起こされることがよく知られているが、最近のいくつかの研究によって、QS分子もこのプロセスに関与していることが明らかになった34。注目すべきは、VP882はV. コレラ C6706宿主に再感染しないため、QSを介したファージ誘導の根底にある制御原理を研究する理想的なモデル系となっていることである8,9,35。
VP882とコレラ菌の相互作用をより深く理解するために、VP882とコレラ菌のトランスクリプトームを、DPOによるファージ誘導前（溶菌状態）と誘導後のいくつかの時点（15分、60分、120分）で記録した。これらの実験では、内因性のDPO産生を除外するため、tdh欠損V.コレラ株を用いた14。非処理の対照サンプルと比較すると、DPOの添加は、処理後最初の60分間は細胞増殖に有意な影響を与えなかったが、それ以降は増殖を強く阻害した（図1B）。この表現型はコロニー形成単位（CFU）の減少とも相関しており、全細胞の約1％～2％がファージ活性化時に細胞溶解に関与しなかった（図S1A）。逆に、VP882の誘導によって、細胞外のファージDNAレベルが強く上昇し、トランスクリプトームデータセット中のファージ特異的リードの相対的割合が上昇した（図1CとS1A）。具体的には、DPO添加前と添加15分後では、リードの約3-5%がVP882ゲノムにマップされたのに対し、60分と120分の時点では、リードの約20-25%がファージ特異的であった。ファージ遺伝子の詳細な検査から、これらの時点ではほぼ全ての遺伝子がDPO処理によって活性化されたことが明らかになったが、DPO添加15分後にはわずかな変化しか観察されなかった（図1D）。注目すべき例外はqtip遺伝子で、誘導前と比較して約2.4倍の誘導を示した。DPOによるVqmAphageレセプターの活性化がQtip合成の引き金となり、それがCIリプレッサータンパク質を封鎖して不活性化し、ファージの活性化につながるからである（図1A）9。VP882で観察されたパターンと同様に、DPO処理15分後にはわずかな遺伝子（19個）しか差次的発現を示さなかったが、60分と120分の時点ではそれぞれ1,384個と1,949個が変化した（図1EとS1B）。発現調節された宿主遺伝子のうち、VP882の誘導によってV. cholerae C6706ゲノムの2番染色体上のスーパーインテグロンに位置する遺伝子が活性化される一方、この条件下では多くのノンコーディングRNAのレベルが低下することがわかった（図1E、S1C、S1D）。
VP882の活性化に伴う非コードRNAの発現の差異を追跡するために、細胞内で文書化された役割に従って、発現低下したRNAを分類した（図S1E）。その結果、抑制された非コードRNAの大部分（約50%）が、コレラ菌や他の細菌で遺伝子発現を調節することがよく知られているHfq結合型sRNAのグループに属していることがわかった17,36,37。これらの結果を確認するため、以前に報告されたHfq依存性sRNAであるVqmR、FarS、CarZ、Vcr017の発現をノーザンブロットで調べた。トランスクリプトームデータと一致して、VP882が活性化されると、FarS、CarZ、Vcr017の発現がすべてダウンレギュレートされることがわかった（図1F）。VqmRの発現はDPO14,15の存在により初期に誘導されたが、ファージ誘導の後期にはsRNAのレベルは低下した。対照的に、Hfq非依存性のVcr068 sRNA15の発現は、実験を通して安定したままであった。興味深いことに、VP882活性化中にプラスミドを介したHfqを過剰発現させると、コントロールプラスミドと比較して、VqmR、FarS、CarZ、およびVcr017レベルが上昇した（図S1F）。以上をまとめると、DPOによるVP882の活性化は、Hfq依存性sRNAのダウンレギュレーションを含め、コレラのトランスクリプトーム出力に強く影響するという結論に達した。
RIP-seq解析により、宿主およびファージにコードされたHfq結合sRNAが検出された。
HfqはRNAシャペロンであり、2つの塩基がペアになった転写産物間の相互作用を促進することが最もよく知られている38。Hfqへの結合はまた、sRNAをリボ核酸分解による崩壊から保護する。この仮説を検証するため、DPOによるVP882誘導の前後でHfqタンパク質のレベルを測定し、野生型とhfq欠損型のコレラ菌におけるVP882活性化をモニターした。その結果、HfqレベルはVP882誘導30分後に軽度上昇し、120分後には誘導前のレベルに戻っていた（図2AおよびS2A）。同系統の野生型細胞と比較すると、hfqの欠損はVP882による細胞溶解の促進をもたらし（図S2B）、HfqおよびHfq結合転写産物がVP882の活性化に関与しているという考えを支持した。
図サムネイルgr2
図2RIP-seq解析により、宿主およびファージにコードされたHfq結合sRNAが検出された。
キャプション
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VP882誘導におけるHfqの役割をより深く理解するために、次にファージ活性化前後（60分時点）のHfqのRNAリガンドを決定し定量した。この目的のために、染色体hfq遺伝子のC末端に3XFLAGエピトープを持つV.コレラ細胞を用いて、Hfqと結合した転写産物のRNA共免疫沈降を行い、陰性対照として3XFLAGエピトープを欠くV.コレラ株を用いた22。DPO処理前後の個々のHfq結合sRNA（図1に類似、すなわちCarZ、FarS、Vcr017）の存在量を比較したところ、Hfq共免疫沈降後はsRNAレベルが減少したが、VqmRレベルはDPO処理後に増加した（図2B）。これらのデータに従い、vqmR転写レポーターの活性はファージ活性化により上昇した；しかしながら、vcr017およびvcr068遺伝子の類似転写レポーターは活性に有意な変化を示さなかった（図S2C）。
他のHfq結合sRNAもファージ活性化によってHfq占有率が低下するかどうかを調べ、Hfqと相互作用するファージ由来の転写産物を同定するために、RNA配列決定を用いてHfq関連転写産物をグローバルスケールで決定した。Hfqに結合した転写産物をゲノム由来に従って定量化した結果、溶菌状態では全シーケンスリードの約2%しかVP882ゲノムにマップされなかったが、ファージを誘導するとこの数は約15%に増加した（図2C）。重要なことは、Hfqに結合する宿主のmRNA、rRNA、tRNAの割合はDPO処理の前後で一定であったが、宿主のsRNAの相対的な割合はVP882が誘導されると減少したことである。これらのデータは、VP882由来の転写産物がファージ誘導後にHfqのかなりの割合を占め、宿主にコードされたsRNAを凌駕していることを示唆している。
VP882ゲノムには71の推定オープンリーディングフレーム（ORF）42が含まれており、dRNA-seqを用いてファージゲノム上の59の転写開始点（TSS）をアノテーションした（表S1）。ファージ転写産物のHfqへの結合を調べるため、VP882誘導の前後でHfq結合シークエンスリードの相対量を比較し、Hfq結合sRNAを構成する可能性のある未注釈転写産物を検索した（図S2D）。実際、gp29遺伝子（推定尾管タンパク質をコードする）の3′UTRに潜在的なsRNAを発見し、これはHfq共免疫沈降サンプルに濃縮されていた（図2D）。この転写産物をVpdSと命名し、Hfqとの相互作用を確認した（図2B、上から5番目のパネル）。他のHfq結合sRNAと比較すると、VpdSは全てのsRNAの中でHfq占有率の最も強い増加を示し（図2E）、Hfq結合sRNAにマッピングされた全リードの約1.4%を構成していた（図S2E）。
我々のトランスクリプトームデータとノーザンブロット解析から、VpdSは約50ヌクレオチド長の転写産物として蓄積し、ファージ活性化後30分で初めて検出可能になることが明らかになった（図1Dと2F）。しかしながら、我々のdRNA-seq解析ではvpdSに関連するTSSは報告されておらず（表S1）、このsRNAはプロセシングされている可能性が示唆された。我々は、主要なエンドリボヌクレアーゼであるRNase Eが、mRNAの3′UTRからsRNAを切断することが以前に報告されていることから、VpdSのプロセシングに関与しているのではないかと推測した43。この仮説を検証するため、誘導性pBADプロモーターから3′ UTRを含むgp29 ORFをプラスミド上に発現させ、野生型と温度感受性RNアーゼE変異体（rneTS）でVpdSの発現を試験した44。ノーザンブロット解析の結果、rneTS変異体は非許容温度（44℃）下で成熟VdpS sRNAを産生できなかったが、野生型細胞ではVpdSの成熟はそのままであった（図S2F）。要約すると、我々のデータは、HfqとRNase Eの両方がファージ転写産物の結合とプロセシングに関与し、VpdSはVP882の活性化中に産生されるHfq関連ファージsRNAであることを示唆している。
ファージの溶菌と溶解におけるRNA-RNA相互作用のグローバルな同定
ここ数年、ゲノムワイドなスケールでRNA二重鎖形成を検出する新しい技術がいくつか開発されている45,46。これらの技術のひとつが、ライゲーションとシークエンシングによるRNA相互作用（RIL-seq）であり、Hfq上での2つのRNAの架橋に続いて、RNAライゲーション、cDNAの生成、キメラリードのシークエンシングが行われる47。そこで、宿主とVP882がコードする転写産物間のRNA二重鎖形成をグローバルに調べるために、RIL-seqを用いた。上記の実験セットアップに従い、VP882を保有するV. cholerae細胞から、溶菌状態およびDPOによるファージ誘導後（60分時点）のRIL-seqサンプルを得た。その結果、溶菌状態と溶解状態からそれぞれ1,297個と1,975個の相互作用が検出され、溶解状態ではファージ由来の転写産物が関与するRNA二重鎖に強くシフトしていることがわかった（図3Aと3B）。これらの相互作用を3つの主要なカテゴリーに分類した、 (1)2つの宿主転写産物を含む相互作用、(2)1つの宿主転写産物と1つのファージ転写産物を含む相互作用、(3)2つのファージ転写産物間の相互作用。溶解状態では、少なくとも1つのファージ転写産物を含むRNA二重鎖はわずか（約3%）であった（図3C；カテゴリー2と3）。
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図3VP882の溶原性生活様式と溶菌生活様式における宿主とファージのインタラクトーム
キャプション
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我々のデータはまた、いくつかの宿主にコードされたsRNAの相互作用ターゲットの数のシフトと、VpdSを含む相互作用の数の増加を明らかにした（図3A、3B、S3A）。具体的には、溶菌状態ではVpdSを含む3つの相互作用が発見され、ファージ誘導後には46の相互作用が発見された。注目すべきは、これらの潜在的相互作用パートナーは宿主の転写産物（図3C、カテゴリー2）だけでなく、ファージの転写産物（例えばgp02とgp38；カテゴリー3）にも関与していたことである。VpdSによる標的mRNAの転写後制御を確認するため、VpdSとのRNA二重鎖形成を予測できた11の推定標的（それぞれ9つの宿主遺伝子と2つのファージ遺伝子）に注目した（図S3B-S3L）。これらのターゲットの5′UTRを最初のコード配列とともにGFPベースのレポーター系にクローニングし、大腸菌でVpdSの効果を試験した。全てのターゲットはVpdSの存在下でGFP発現を変化させたが、その範囲はvca0808のようなわずかなアップレギュレーションからfrhCのような約6倍のダウンレギュレーションまでであった（図3D）。対照的に、VpdSはhfq非存在下ではこれらの標的（kefBを除く）を制御できなかった（図S3M）。これらの結果は、VP882がコードする転写産物はファージの活性化によってHfqを介した遺伝子制御に関与するようになり、VpdSはこの条件下で豊富なsRNAとして宿主とファージの複数の標的mRNAを制御していることを示唆している。
VpdSと標的mRNAとの相互作用
Hfqと協働する塩基対を持つsRNAは、標的転写産物を同定するために一本鎖配列要素を用いることが多い48。標的認識を可能にするVpdSの塩基対配列を決定するために、レポーターアッセイで制御された4つの標的転写産物（rpoS、cyaA、petA、gp02）に注目した（図3D）。rpoS、cyaA、petA遺伝子は宿主ゲノム上にあり、以前から宿主とファージの相互作用に関与している49,50,51。一方、gp02はDNAパッケージングに必要な小ターミナーゼサブユニットをコードするVP882遺伝子である42。これらの予測を検証するため、3つのVpdS変異体（M1-M3；図4A-4DおよびS4A）を作製し、ノーザンブロット法で発現を調べた（図S4B）。すべてのVpdS変異体は等しく発現していたが、それぞれの標的の発現を阻害することはできなかった（図4E-4H）。GFPレポーターの対応する塩基対を変異させると、野生型VpdSによる抑制が消失したが、それぞれのVpdS変異体と組み合わせると、制御が回復した。VpdSによるこれらのレポーターの制御をコレラ菌のタンパク質産生と関連付けるため、染色体上のrpoSとcyaA遺伝子に3XFLAGエピトープを付加し、ウェスタンブロットでVpdSによる制御を調べた。GFPレポーターから得られたデータと同様に、RpoS::3XFLAGとCyaA::3XFLAGの産生はVpdSによって減少したが、VpdS M1を発現させた場合には制御は検出されなかった（図S4C）。これらのデータを総合すると、VpdSは標的mRNAとの塩基対形成によって遺伝子発現を制御する、正真正銘のHfq結合型sRNAであることが示唆される。
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図4VpdSは転写後に作用し、宿主とファージの遺伝子発現を調節する。
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VpdSはVP882の複製と宿主細胞の溶解を促進する
Hfqに結合するsRNAは、微生物の生理学や病原性の多くの側面において重要な制御的役割を担っている53。VpdS sRNAの発見により、DPOによるVP882の活性化という観点からこの疑問に取り組むことができた。この目的のために、VP882の染色体上で、Rho非依存性ターミネーターはそのままに、sRNAの塩基対配列（vpdS遺伝子のbp 1-20を欠失）を除去して、vpdS欠失変異体を作製した（図S4A）。VP882野生型ファージとΔvpdSファージによるDPOを介した細胞溶解をモニターしたところ、どちらのファージも細胞溶解を誘導することができたが、このプロセスはvpdS非存在下で著しく遅延した（図5A）。一方、プラスミドを介したVpdSの過剰発現では、VP882の活性化によって細胞増殖が抑制され、細胞溶解が促進された（図S5A）。
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図5VpdSによるVP882の複製と宿主細胞の溶解の促進
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次に、野生型VP882とvpdS変異体の間の細胞密度の違いが、ファージ誘導前後のCFUをカウントすることによって、細胞の生存率の変化にもつながるかどうかを調べた。実際、vpdSを変異させると、野生型ファージと比較してコレラの生存率が約75％高くなった（図4B）。一方、VpdS M1変異体（rpoSとgp02を制御できない；図4Eと4H）を過剰発現させると、ΔvpdSの表現型を補完できなかった。注目すべきは、4株とも溶菌条件下でCFU数が非常に類似していたことである（図S5B）。
VP882のvpdS欠損に関連する分子基盤をよりよく理解するために、定量的リアルタイムPCRを用いて、野生型およびΔvpdS VP882ファージ、ならびに相補株におけるgp02 mRNAレベルをモニターした。vpdSの変異はgp02レベルの増加をもたらしたが、プラスミドボアVpdS発現は逆の効果を示した（図S5C）。CFU数（図5B）と同様に、VpdS M1の過剰発現はΔvpdS変異体のgp02レベルに影響を与えなかった。
これらの結果から、野生型またはΔvpdS VP882ファージを保有するコレラ菌細胞のトランスクリプトームも記録することにした。宿主のトランスクリプトームを比較したところ、DPO添加30分後と60分後に、それぞれ100個と175個の調節低下宿主遺伝子が同定された（図S5D）。ファージのトランスクリプトームを調べると、vpdS変異体では30分後に全ファージ遺伝子の60%以上（44/71）がダウンレギュレーションを起こしたが、ファージ誘導から60分後に発現が変化した遺伝子はわずかであった（図5C）。このパターンは、vpdS変異体で検出された細胞溶解の初期遅延を反映しており（図5A）、VpdSがVP882の複製と集合の調整に関与していることが示唆された。
この仮説を検証するために、ファージアセンブリの代用として、DPOを介した活性化後の細胞外VP882 DNA量を定量した。予想通り、DPO処理によりファージDNA量の強い増加が検出された（図5D）。vpdSを欠くVP882は、30分の時点で、同種の野生型ファージよりも約10倍少ないファージDNAを産生したが、DNAレベルはファージ誘導の後の段階ではほぼ同等であった。VpdSの過剰発現は外部ファージDNAの増加をもたらしたが、VpdS M1変異体はこの効果をもたらさなかった（30分時点）。まとめると、VpdSの発現は標的mRNAとの塩基対形成を通じて、ファージの複製と溶解プロセスを促進すると結論づけられる。
TarBはVP882の複製を阻害する宿主sRNAである
以上のデータから、V. choleraeとVP882の転写産物はHfq上で数百のRNA二重鎖を形成し、VpdSはファージの複製を促進するファージ由来のsRNAであることが示された。逆に、宿主にコードされたsRNAはファージ転写産物と塩基対を形成し、ファージの複製に拮抗する可能性があると考えた。この考えを探るため、VP882コードmRNAと相互作用する宿主sRNAをRIL-seqデータセットから検索したところ、3つの候補sRNA（VrrA、Vcr227、TarB）が多数の相互作用を示すことがわかった（図S6A）。これらのうち、TarB sRNAに注目したのは、VP882誘導時にいくつかの新しいRNA二重鎖で見つかったからである（図6A）。
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図6VP882の複製と宿主細胞の溶解を阻害する宿主sRNA TarB
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これらの相互作用の1つは、ファージ細胞溶解オペロン42の最初の遺伝子をコードするgp69のmRNAに関与しており（図S6B）、TarBがVP882を介した細胞溶解を制御している可能性が示唆された。ノーザンブロット解析から、TarBはVP882の複製過程を通して検出可能であることが明らかになった（図S6C）。注目すべきは、TarBの2つのアイソフォームが検出されたことで、短い方のアイソフォームはTarBの注釈長（78ヌクレオチド；Bradley et al.27）と一致した。より長い方のTarBアイソフォーム（240ヌクレオチド）は、同じRho非依存性ターミネーターを用いているが、TSSはさらに162bp上流に位置している。実際、TarBはgp69::gfpレポーターを効率的に阻害し、TarB（TarB M1）またはhfqの変異はこの効果を消失させた（図6B、6C、S6F）。
その結果、VP882活性化中の野生型およびΔtarB V. コレラ菌細胞におけるgp69 mRNA発現をモニターした。tarBの変異は溶菌状態でのgp69レベルには影響しなかったが（図S6G）、ΔtarB細胞ではDPOを介したVP882の活性化により、同系の野生株と比較してgp69レベルが約2.8倍増加した（図6D）。対照的に、TarBの過剰生産はgp69の発現を阻害し、この効果は変異TarB変異体では減少した。
さらに、ファージ活性化前後の野生型とΔtarB細胞の増殖曲線とCFU数を比較することで、これらの結果を裏付けた。実際、tarB変異体では細胞溶解が促進された（図6E）。VpdS（図S5A）と同様に、tarBはDPO非存在下では細胞の生存に影響を与えなかったが（図S6H）、VP882が誘導されると、ΔtarB細胞は野生型細胞と比較してCFUが約50％減少した（図6F）。プラスミドを介したTarBの発現はこの表現型を補完したが、TarB M1は細胞生存に有意な影響を与えなかった。これらのデータを総合すると、TarBは溶解遺伝子オペロンの発現を阻害することにより、ファージの複製に対抗していることが示唆される。
考察
CRISPR-Casやその他の抗ファージ防御システムの発見は、ここ数年のファージ生物学におけるルネッサンスの火付け役となった54,55。CRISPR-Casシステムがアンチセンス誘導crRNA（CRISPR RNA）を用いて外来核酸を認識・破壊するのに対し、他の防御システムはタンパク質を中心としたメカニズムでファージの複製に対抗する4、 特に、ファージ由来のsRNAの大部分は、宿主ゲノムに組み込まれた不活性なプロファージに由来しているため、検出された制御パターンが真性のファージの機能なのか、それとも宿主とファージの間の適応的な共進化効果なのかを判断するのは困難である31。
VP882とコレラ菌の相互作用は、他の溶原性ファージや宿主のストレス応答系を誘発しないQS分子（DPO）によってファージを活性化できるという意味でユニークであり、このことが結果の解釈を混乱させる可能性がある。興味深いことに、VP882を保有する天然分離株はQS関連遺伝子に変異を持つことが報告されており、VP882のライフサイクルにおいてQSが中心的な役割を果たしていることが明らかになっている61。 9 VP882 が V. cholerae C6706 に感染できない理由は現在のところ不明である。しかし、VP882 は他の様々な Vibrio 株42（V. cholerae を含む）に感染できることが報告されており、今回の結果が自然条件下でも妥当であることが示唆された。
VP882は、腸内細菌で頻繁に見られるプラスミドファージの一種であり、最近では抗生物質耐性遺伝子の拡散に関与していると考えられている。vpdSの蓄積には、mRNAの3′UTRに存在するいくつかの宿主にコードされたsRNAに類似したRNase Eによるgp29-vpdS転写物のプロセシングが必要である。RNaseEはしばしばHfqと協調して作用することから63、Hfqを介したRNA二重鎖形成と、宿主にコードされたリボヌクレアーゼによるファージ転写産物の切断の両方が、VP882と宿主との相互作用に関係しているという考えが支持される。
同様に、真核生物ウイルスは、感染を成立させたり、免疫反応を圧倒したりするために、宿主の転写後機構に依存することが多い64。コレラ菌のHfq結合パートナーのプールに対するVP882の活性化の強い影響（図2C、2E、3A、3B）と同様に、ウイルス感染は、宿主のマイクロRNAシグネチャーのシフトと頻繁に関連している65。例えば、エプスタイン・バーウイルスは、宿主のダイサー依存性成熟経路を必要とし、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）のような主要な免疫経路の発現を阻害する44のマイクロRNAをコードしている66。我々のデータは、細菌もまたウイルス複製に対抗するために塩基対形成制御因子を用いており、逆にファージは遺伝子発現を調節するために宿主の転写後機構を利用していることを示している。
VpdSとTarBの標的スペクトルから、両sRNAはファージ遺伝子だけでなく宿主遺伝子も制御できることが示唆された（図3Bと6A）。TarBの転写はToxTによって制御されており、このsRNAはV. コレラ菌において、抗ウイルス活性を促進する遺伝子を含むいくつかの標的を制御することが報告されている27,28。VP882に関して、TarBはファージ溶解オペロンのmRNAを抑制することによって、抗ファージ活性を提供するようである（図6）。68。TarBに加え、宿主にコードされた他のいくつかのsRNAは、ファージ遺伝子の直接的な制御、あるいはファージ誘導や細胞溶解に対抗するのに役立つストレス遺伝子の発現調節によって、ファージ防御に関与している可能性がある。この見解は、V. コレラ菌hfq変異体がVP882誘導時に細胞溶解を促進するという観察結果から支持される（図S2B）。
同様に、VP882の活性化におけるVpdSの役割は、宿主とファージの複数の標的mRNAの制御にも関与している可能性がある（図4）。具体的には、gp02ファージのmRNAはDNAパッキングタンパク質をコードしており、VpdSによる阻害は、ファージの組み立てを調整するのに役立つ、ファージ固有の制御プロセスとして機能する可能性がある。一方、VpdSによるrpoSの制御（図4E）は、VP882の複製を間接的に促進する可能性が高い。rpoS遺伝子はσSをコードしている69。σSはいくつかの飢餓遺伝子を活性化する代替シグマ因子であり、ファージから細胞資源を引き離す可能性がある。加えて、σSに結合したRNAポリメラーゼはVP882のプロモーターを認識する可能性が低く、ファージの複製を遅らせる可能性がある。実際、vpdSを欠損したVP882変異体は、細胞溶解の遅延とファージ遺伝子の発現の減少を示した（図5A-5C）。興味深いことに、大腸菌に感染したT7ファージもσS活性を阻害することが証明されている49；しかしながら、この機能は制御RNAではなくタンパク質（Gp5.7と呼ばれる）によって媒介される。注目すべきは、VP882ゲノムは、宿主の転写後制御を阻害することに加えて、TraRタンパク質のホモログ（Orf61）をコードしており、宿主のリボソームプロモーターでの転写を阻害することが報告されている70。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
モノクローナル ANTI-FLAG M2 抗体 Sigma-Aldrich Cat#F1804; RRID: AB_262044
大腸菌 RNA ポリメラーゼ α モノクローナル抗体 4RA2 BioLegend Cat#663104; RRID: AB_2687386
ヤギ抗ウサギ IgG、HRP 標識 Thermo Fisher Scientific Cat#A16104; RRID: AB_2534776
ヤギ抗マウス IgG、HRP 標識 Thermo Fisher Scientific Cat#31430; RRID: AB_228307
細菌およびウイルス株
大腸菌株 表 S2 該当なし
ビブリオコレラ株 表 S2 該当なし
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
TURBO DNAフリーキット Invitrogen Cat#AM1907
ブロッティングナイロンメンブレン、タイプB、ポジティブ Sigma-Aldrich Cat#15356
プロテイン G セファロース Sigma-Aldrich Cat#P6649
Pierce Protein A/G Magnetic Beads Thermo Fisher Scientific Cat# 88803
SUPERase In サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat#AM2694
T4 ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK） NEB Cat#M0201L
T4 RNA ligase 1, high conc NEB Cat#M0437M
ストレプトアビジン磁気ビーズ NEB Cat#S1420S
リコンビナント RNase インヒビター Takara Cat#2313B
Proteinase K（RIL-seq 用） Thermo Fisher Scientific Cat#EO0491
ターミネーター 5'リン酸依存性エクソヌクレアーゼ Lucigen/Biozym Cat#162370
RNA 5' ポリホスファターゼ Lucigen/Biozym Cat#136120
ポリ A ポリメラーゼ酵素 Lucigen/Biozym Cat#280500
GlycoBlue™ 共沈剤 Thermo Fisher Scientific Cat#AM9516
Superscript III ファーストストランドキット Thermo Fisher Scientific Cat#18080051
プロテアーゼ阻害剤カクテルセット III、EDTA フリー Merck - Millipore Cat#539134-1ML
RNase A/T1 ミックス Thermo Fisher Scientific Cat#EN0551
AMPure XP ビーズ Beckman Coulter Life Sciences Cat#A63881
SPRISelect ベックマン・コールター・ライフサイエンシズ Cat#B23317
DNase I（RNaseフリー） NEB Cat#M0303L
Monarch® RNase A NEB Cat#T3018L
プロテイナーゼ K、分子生物学グレード NEB Cat#P8107S
NEBNext Ultra II Q5 マスターミックス NEB Cat#M0544S
ギブソンアセンブリー® マスターミックス NEB Cat#E2611L
プロテイン G セファロース、ファーストフロー Sigma-Aldrich Cat#P3296
NEBNext® Magnesium RNA フラグメンテーションモジュール NEB Cat#E6150S
重要な市販アッセイ
NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® NEB Cat#E7300L
Luna® ユニバーサルワンステップ RT-qPCR キット NEB Cat#E3005X
Monarch® プラスミドミニプレップキット NEB Cat#T1010L
組織用 Monarch® HMW DNA 抽出キット NEB Cat#T3060L
RNA Clean & Concentrator™ 5 Zymo Research Cat#R1013
Monarch® RNA クリーンアップキット（10 μg） NEB Cat#T2030L
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Cat#5067-1511
Agilent RNA 6000 Pico キット Agilent Cat#5067-1513
Agilent 高感度 DNA キット Agilent Cat#5067-4626
NextSeq 1000/2000 P2 試薬（100 サイクル）v2 イルミナ Cat#20046811
NextSeq 1000/2000 P2 試薬（200 サイクル）v2 イルミナ Cat#20046812
寄託データ
生データと解析データ： RNAseq VP882 本論文 GEO： GSE247770
生データおよび解析済みデータ RIPseq 本論文 GEO GSE247768
生データおよび解析済みデータ： RILseq 本論文 GEO GSE247767
生データおよび解析済みデータ： RNAseq VP882 野生型 vs ΔvpdS 本論文 GEO： GSE247769
オリゴヌクレオチド
本研究で使用したDNAオリゴヌクレオチド 表S4 該当なし
組み換えDNA
本研究で作製したプラスミド Table S3 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
CLC Genomics Workbench Qiagen https://qiagenbioinformatics.com RRID:SCR_011853
BaseSpace Sequence hub イルミナ https://euc1.sh.basespace.illumina.com RRID:SCR_011881
RNAfold UniVie http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi RRID:SCR_024427
IntaRNA Freiburg RNA Tools http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp
Prism 9 グラフパッド https://www.graphpad.com/
RNAhybrid ビーレフェルト大学 BibiServ http://bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de RRID:SCR_003252
ChimericFragments Huber et al.23 https://github.com/maltesie/ChimericFragments
新しいタブで表を開く
利用可能なリソース
連絡先
リソースや試薬に関するさらなる情報やリクエストは、リードコンタクトであるKai Papenfort (kai.papenfort@uni-jena.de)までお願いします。
材料の入手可能性
本研究では、独自の試薬の使用や生成は行っていない。
データおよびコードの利用可能性

すべてのシーケンスデータはGene Expression Omnibus (GEO)にアクセッションコードGSE247770（VP882のRNA-seqおよびdRNA-seq）、GSE247768（RIP-seq）、GSE247767（RIL-seq）およびGSE247769（VP882およびVP882 ΔvpdSファージ活性化のRNA-seq）で寄託されており、発表日現在一般に入手可能である。

本論文はオリジナルコードを報告していない。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報、およびオリジナルのノーザンブロットとウェスタンブロット画像は、要請があれば主担当者から入手可能である。
実験モデルと被験者の詳細
細菌株
本研究を通して、V. cholerae C6706を野生型株として使用した。本研究で使用した全菌株を表S2に示す。V.コレラ菌および大腸菌は、LBブロス（Lennox）またはM9培地（0.4 %グルコース）を用い、37℃、200 rpmの条件下で好気的に増殖させた（温度感受性株を除く）。特に断りのない限り、抗生物質は以下の濃度で使用した： 100 μg mL-1アンピシリン、50 μg mL-1カナマイシン（M9培地中：25 μg mL-1）、20 μg mL-1クロラムフェニコール（M9培地中：10 μg mL-1）、50 μg mL-1ハイグロマイシンB、6.25 μg mL-1ポリミキシンB、および5,000 μg mL-1ストレプトマイシン。VqmAphageの発現を誘導するため、0.035%アラビノースを添加したM9培地中、OD600 0.4で1:10の逆希釈を行い、温帯ファージ誘導前の同調を行った。ファージの活性化は25μM DPOで刺激した。経時的な成長をモニターするため、200μLの培養液を96ウェルプレートにテクニカルトリプリケートで分注し、Spark 10Mプレートリーダー（Tecan社製）を用いて37℃で15分ごとに600nmの吸光度を測定した。相対生存率を算出するため、細菌培養物の連続希釈液を寒天プレートにスポットし、コロニー形成単位を測定した（野生型の生存率を100%とした）。RNase E の一過性不活性化には、V. コレラ野生型および rne-3071 変異を保有する温度感受性株（rneTS）を 30℃で指示された細胞密度まで増殖させた。培養液を半分に分け、30℃で連続培養するか、44℃で30分間培養した。RNAサンプルは、プラスミドを介したgp29-vpdS誘導後の指示された時点で、両方の温度から集めた。プラスミドは、大腸菌S17λpirプラスミドドナー株からRK2/RP4ベースのコンジュゲートトランスファーによりレシピエントV. コレラ細胞に導入した。大腸菌Top10からのプラスミド導入には、S17λpirヘルパー株を三親交配で用いた。VP882ファージをV. choleraeに導入した9。ドナー、ヘルパー、レシピエントの混合物をLB寒天培地プレート上で37℃、4時間以上インキュベートした（pKAS32とVP882は16時間、その他のプラスミドは8時間まで）。大腸菌の増殖を特異的に阻害するために、適切な抗生物質とポリミキシンBを用いてトランスコンジュガントを選択した。簡単に説明すると、pKAS32プラスミド導入株はアンピシリンを含む寒天プレート上で選択した。単一コロニーをストレプトマイシンプレートにストリークして対選択し、PCRまたは塩基配列決定によって所望の変異について検査した。
方法の詳細
プラスミド構築
本研究で使用したプラスミドを表S3に、DNAオリゴヌクレオチドを表S4に示す。pMS-100、pMH-001およびpMS-257については、cmRカセットをpEVS143-CからKPO-1518／1519で増幅し、ギブソンアセンブリーによってそれぞれKPO-1520／1521直線化pCMW-2K、pMD-004およびpKP-361にクローニングした。pMS-137は、VP882染色体DNAからgp29-vpdSをKPO-843/8434で増幅し、KPO-0196/1397で線状化したpMD004とギブソンアセンブリーして作製した。pMS-141およびpMS-142は、VP882染色体DNAからvpdSをKPO-8438/8434で増幅し、KPO-0092/1397で線状化したpEVS143-KおよびpEVS143-Cとそれぞれギブソンアセンブリーして作製した。KPO-8626/8627、KPO-8585/8586およびKPO-9087/9088を用いた部位特異的変異導入により、pMS-141にM1、M2およびM3点変異を導入し、それぞれpMS-156、pMS-155およびpMS-203を得た。pMS-228のM1変異は、KPO-8626/8627を用いたpMS-142の部位特異的変異導入によって得られた。pMS-177は、KPS-0014染色体DNAからKPO-8773/8774を用いて全長tarBを増幅し、KPO-0092/1397で線状化したpEVS143-Kとギブソンアセンブリーすることによって構築された。pMS-198は、cmRカセットをpEVS143-CからKPO-1518/1519で増幅し、KPO-1520/1521で直鎖化したpMS-177にギブソンアセンブリーでクローニングした。pMS-189とpMS-226は、それぞれpMS-177とpMS-198をKPO-8939/8940で部位特異的変異導入して得た。プラスミドpMS-260については、hfqをKPS-0014染色体DNAからKPO-9809/9810を用いて増幅し、ギブソンアセンブリーによってKPO-4051/pBAD-ATGrev-linearized pMD373にクローニングした。cmRカセットは、KPO-1520/1521で線形化したpMS-260と、pEVS143-CからKPO-1518/1519で増幅したcmRカセットをギブソンアセンブリーしてpMS-261にクローニングした。転写レポーターのために、pMS-258およびpMS-259は、それぞれKPO-9802/9803およびKPO-9807/9808を用いてKPS-0014染色体DNAからvcr017およびvcr068プロモーター領域を増幅し、KPO-1953/9804で線状化したpMS-257とギブソンアセンブリーすることにより作製した。翻訳GFPレポーター融合には、モノシストロン遺伝子にはpXG10、オペロンにはpXG30ベクターを用いた。細菌およびウイルスのターゲットインサートは、それぞれKPS-0014染色体DNAおよびVP882ゲノムDNAから、以下に示す対応するオリゴヌクレオチドの組み合わせで増幅し、ギブソンアセンブリーによりKPO-1702/1703で直鎖化したpXG10にクローニングした： pMS-148（petA、KPO-8566/8567）、pMS-149（frhC、KPO-8568/8569）、pMS-151（gp02、KPO-8572/8573）、pMS-164（vexA、 KPO-8701/8702）、pMS-166（vca0808、KPO-8707/8708）、pMS-232（glyA、KPO-9274/9275）、pMS-195（gp69、KPO-8916/8722）。pKP-464(KPO-1062/1063)とpKP-479(KPO-1046/1047)については、pXG10とそれぞれのインサートをNsiIとNheIで消化し、ライゲーションした。なお、各レポーターの DNA インサートの長さは、図 S3B～S3L に示した RNA 二重鎖の予測に基づいている。gp69の5'UTRのターミネーター構造を除去するために、9 pMS-195をKPO-9058/9059で増幅し、pMS-202を得た。pMS-234とpMS-237については、それぞれhemH（KPO-9278/9279）とgp38（KPO-9343/9344）を増幅し、ギブソンアセンブリーでKPO-4646/1703で直鎖化したpXG30にクローニングした。rpoS（pKP-479）、gp02（pMS-151）、cyaA（pJR-26）およびpetA（pMS-148）の翻訳レポーターの点変異を、KPO-9199/9200、KPO-9341/9342、KPO-8589/8590およびKPO-9093/9094を用いたPCRにより導入し、それぞれpMS-220、pMS-235、pMS-154およびpMS-201を得た。プラスミドpMS-186、pKAS32-rpoS::3XFLAGおよびpMS-160は、KPO-0267/0268で直鎖化したpKAS32を用いてギブソンアセンブリーにより構築した。pMS-186はKPS-0014の染色体DNAからインサート断片を増幅した： KPO-8827/8828およびKPO-8829/8830、pKAS32-rpoS::3XFLAG: KPO-1566/1567およびKPO-1568/1569、pMS-160： KPO-6033/6034およびKPO-6037/6038。pMS-160のFLAG配列はKPO-6035/6036を用いてKPS-0995から増幅した。
RNA単離、ノーザンブロット分析、定量的リアルタイムPCR
培養アリコート（4 OD600単位）を指示された時点または細胞密度で採取し、0.2 volの停止液（95％エタノール、5％フェノール）と混合した。ナイロン膜（シグマ社製）をROTI®Hybri-Quick中で[32P]末端標識DNAオリゴヌクレオチドと42℃でハイブリダイズさせた。膜はSSC（5x、1x、0.5x）/0.1%SDS洗浄バッファーで3回洗浄した。シグナルはTyphoon Phosphorimager（GE Healthcare）を用いて可視化した。ノーザンブロット解析用のオリゴヌクレオチドは表S4に示す。複数の標的sRNAをプローブする場合、膜は30mLのROTI®Hybri-Quickで72℃、少なくとも2時間かけて剥離した。qRT-PCR は Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (New England BioLabs) と CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad) を用いて行った。5S rRNA と recA を参照遺伝子として用いた。qRT-PCRに用いたオリゴヌクレオチドは表S4に示す。
ウェスタンブロット分析および蛍光アッセイ
シグナルは Fusion FX EDGE イメージャー（Vilber）を用いて可視化し、バンド強度は GelQuant ソフトウェア（biochemlabsolutions）を用いて定量した。染色体上に3XFLAGタグのついたHfq、CyaAおよびRpoSは、抗FLAG抗体（Sigma）を用いて検出した。RnaPαはローディングコントロールとして、抗RNAPα抗体（BioLegend）を用いて検出した。転写GFPレポーターまたは翻訳GFP融合体を発現するV. コレラ菌および大腸菌Top10細胞の蛍光測定は、前述の方法で行った。大腸菌はLB培地と各抗生物質で一晩培養した。全ての細胞をPBSで洗浄し、再懸濁した。Spark 10Mプレートリーダー（Tecan）を用いて、相対蛍光強度を測定した。非蛍光細胞を自家蛍光コントロールとして用いた。
ファージ変異株の作製
ΔvpdS∷FRTのVP882ファージは、pKD-3のFRT-cmR-FRTカセットをKPO-8630/8131とKPO-8631/8132を用いてPCR増幅した後、ラムダレッドで組換えることにより作製した73。両PCR産物は、KPO-8632/8633を用いてオーバーラップPCRにより結合させ、ゲル抽出により精製した。欠失カセットをファージJSP-1269とpKD-46を共形質転換したエレクトロコンピテントTop10細胞に形質転換し、相同組換えによりファージ遺伝子vpdSを置換した。カナマイシンとクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で陽性クローンを選択し、コロニーPCRで確認した。pKD-46の消失は、37℃で一晩培養することで達成された。ファージDNAからクロラムフェニコール耐性カセットを除去するために、陽性クローンをpFLP-hyg（FLPの構成的発現）と共形質転換し、カナマイシンとハイグロマイシンを含むLB寒天培地で30℃で選択した。pFLP-hygプラスミドの消失は液体培地中44℃で一晩増殖させることにより達成され、クロラムフェニコールカセットの切除はPCRとカナマイシン、カナマイシンとクロラムフェニコール、またはカナマイシンとハイグロマイシンを含むLB寒天上での選択的増殖により確認された。
ファージDNAの調製と定量PCR
VP882で溶菌したV. choleraeの同期培養をOD600nm 0.2まで増殖させ、50mLを採取した（サンプル0分）。培養液を25μMのDPOで刺激し、増殖に戻した。誘導後 30 分、60 分、120 分後に 50 mL の培養液を採取し、4,700 rpm、4℃で 10 分間遠心分離した後、0.2 μm のフィルターでろ過することで、溶解していない細胞や残渣を除去した。濾液を100 U DNase I（NEB）と1 mg Monarch RNase A（NEB）と共に37℃で30分間インキュベートし、宿主核酸を消化した。ファージ粒子を、16.7mLの5M NaClと16.7mLの50％ PEG-8000を加えて4℃で一晩沈殿させた。ウイルス粒子を遠心分離（20,000 x g、4℃、20分間）で回収し、ファージペレットを300 μL 5 mM MgSO4に氷上で少なくとも30分間浸した。ファージDNAは、Monarch® HMW DNA Extraction Kit for Tissueを用いて、ファージDNA単離のための製造業者のプロトコールに従って単離した。各サンプルに500 ngのpUC19プラスミドDNAをスパイクし、相対定量を行った。簡単に説明すると、ファージをProteinase Kで消化し、遊離したDNAをイソプロパノールで大型ガラスビーズ表面に沈殿させた。2回の洗浄工程の後、DNAを50μLの溶出バッファーに回収した。定量的PCR（qPCR）には、1μLのDNAをGoTaq qPCR Master Mix（Promega、#A6002）とCFX96 Real-Time PCR System（Bio-Rad）を用いた。pUC19のampR遺伝子を参照遺伝子として用いた。qPCRに使用したオリゴヌクレオチドを表S4に示す。
RNAseq および dRNAseq VP882 活性化
VP882（JSP-1269）で溶菌したV. cholerae Δtdh株をM9培地で3連培養した。OD600 0.2の同期培養を25μM DPOで処理し、指示された時点で0.2容量のストップミックス（95％エタノール、5％[vol/vol]フェノール）を添加して転写を停止した。全RNAを単離し、Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific）で処理し、Bioanalyzer（Agilent）を用いてRNAの完全性を確認した。cDNAライブラリーはvertis Biotechnology AGにより3'末端特異的プロトコルで調製した。rRNAを除去したRNAサンプルは、超音波を用いて断片化した（4℃で30秒×4パルス）。オリゴヌクレオチドアダプターをRNA分子の3'OH末端にライゲーションした。M-MLV逆転写酵素と3'アダプターをプライマーとして、第一鎖cDNA合成を行った。第一鎖cDNAを精製し、5'イルミナTruSeqシーケンスアダプターをアンチセンスcDNAの3'末端にライゲーションした。最後に、3'cDNA断片を増幅し、Agencourt AMPure XP kit（Beckman Coulter Genomics）を用いて精製した。dRNA-seqアプローチでは、異なる時点の同じ複製からのRNAサンプルを等量（各2.5μg）でプールした。プールされたRNAサンプルは、超音波（4℃で30秒×4パルス）を用いて断片化した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）処理を行った。サンプルを2つに分割し、一方をターミネーターエキソヌクレアーゼ処理（+TEX; Lucigen）、もう一方を未処理（-TEX）とした。RNAサンプルはポリ(A)ポリメラーゼを用いてポリ(A)テール化し、RNA 5'ポリホスファターゼ(Lucigen)を用いて5'PPP構造を除去した。RNAアダプターをRNAの5'-一リン酸にライゲーションし、オリゴ(dT)-アダプタープライマーとM-MLV逆転写酵素を用いて第一鎖cDNA合成を行った。cDNA断片をPCR増幅し、Agencourt AMPure XP kit（Beckman Coulter Genomics）を用いて精製した。すべてのcDNAライブラリーは、NextSeq1000システムを用いて100-ntのリード長でシングルリードモードでシーケンスした。デマルチプレックスされた生リードは、品質と3'アダプターのためにトリミングされ、CLC Genomics Workbench（Qiagen）の "RNA-Seq Analysis "ツールを用いて、標準的なパラメータ設定でV. choleraeおよびVP882参照ゲノム（NCBIアクセッション番号NC_002505.1、NC_002506.1、NC_009016.1）にマッピングされた。さらに、CLC Genomics Workbenchを使用して、アノテーションされた遺伝子にマッピングされたリードをカウントし、遺伝子発現の差を計算した。CLC Genomics WorkbenchはTMM正規化を利用し、edgeRアルゴリズムを用いて条件間の遺伝子発現を比較する。74 フォルドチェンジ≧±1.5、FDR調整p値≦0.05の遺伝子を差次的発現と定義した。VP882ファージの転写開始点(TSS)アノテーションでは、プラスとマイナスのTEX条件におけるカバレッジと、それに基づく隣接ヌクレオチド間の差を計算した。差の局所的な最大値をTSSと呼び、推定TSSのセットを手作業でキュレーションした。
Hfq共免疫沈降とRIP-seq解析
VP882（JSP-1269）で溶菌したV. コレラ菌Δtdh株とΔtdh hfq::3XFLAG株をM9培地で3連培養した。OD600 0.2 で同期化した培養物を分割し、25 μM DPO または水で処理し、37℃、200 rpm で 60 分間インキュベートした。50OD600ユニット相当の細胞を、以前に記述されたように免疫沈降に供した23。手短に言えば、モノクローナル抗FLAG抗体（Sigma, #F1804 ）とプロテインGセファロース（Sigma, #P3296 ）を用いて、Hfq結合RNAを濃縮した。溶解バッファーで5回ストリンジェントな洗浄を行った後、フェノール-クロロホルム-イソプロパノール抽出によってRNAとタンパク質の画分を分離した。RNAをDNase I（Thermo Fisher Scientific）で処理し、RNAの完全性をAgilent 2100 Bioanalyzerでテストした。cDNAライブラリーは、NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina（NEB; E7300L）を用いて、メーカーの指示に従って調製した。デマルチプレックスされた生リードを品質とアダプターのためにトリミングし、CLC Genomics Workbench（Qiagen）を用いてV. choleraeおよびVP882参照ゲノム（NCBIアクセッション番号NC_002505.1、NC_002506.1、NC_009016.1）にマッピングした。CLCの "Differential Expression for RNA-Seq "ツールを用いて、hfq::3XFLAGタグ付きサンプルのフォールドエンリッチメントをタグなしコントロールサンプル（Δtdh）と比較した。所定のカテゴリー（ファージ転写産物、宿主sRNA、宿主RNA、宿主tRNAおよびrRNA）に一致するリードカウント（TPM値）を、同じcDNAライブラリーのTPMの総数と比較した。
Hfq RIL-seqおよび計算機解析
サンプルはRIP-seqアプローチと同様に収集し、オリジナルのRIL-seqプロトコールに従って処理した75。簡単に言うと、50 OD600単位に相当する細胞をタンパク質とRNAのUV架橋に供した後、細胞溶解を行い、モノクローナル抗FLAG抗体（Sigma; F1804）を用いて共免疫沈降を行った。回収されたRNAはRNase A/T1処理によりトリミングされ、近位RNAはT4 RNAリガーゼを用いてライゲーションされた。プロテイナーゼKを用いたタンパク質消化後、RNAを抽出し、断片化し、TurboDNase消化した。共沈殿した RNA を 1X SSC、1mM EDTA、オリゴヌクレオチドミックス（16S と 23S オリゴは 5.8nM、5S オリゴは 11.6nM）と混合した。この混合物を変性させ、冷却した後、ストレプトアビジンビーズ（ThermoFisher; 65001）と室温および50℃でインキュベートした。ライブラリー増幅にはNEBNext Ultra II Q5ポリメラーゼを用いた。DNAライブラリーはNextSeq1000システムで200-ntリード長、ペアエンドモードで配列決定した。Demultiplexedされた生シーケンスリードの品質をチェックし、低品質なテールや複雑な領域を除去した。残りのリードはV. choleraeおよびVP882参照ゲノム（NCBIアクセッション番号NC_002505.1、NC_002506.1、NC_009016.1）にマッピングされた。アラインメントは、新たに同定されたsRNA VpdSのアノテーションを含め、宿主（sRNA、CDC_UTR、遺伝子間領域）およびVP882（ファージ転写産物）参照ゲノムのアノテーションを参照した。その後、相互作用（キメラリード）を、相互作用あたり5リード、FDR調整p値≦0.05というカットオフ値を用いて、その数と統計的有意性によってフィルターした。
VP882野生型およびVP882 ΔvpdSのRNA-seq解析
VP882野生型およびVP882 ΔvpdSで溶菌したV. cholerae Δtdh株をM9培地で3連培養した。OD600 0.2で同期化した培養を25μM DPOで処理し、指示された時点で0.2容量のストップミックス（95％エタノール、5％[vol/vol]フェノール）を添加して転写を停止した。全RNAを単離し、Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific）で処理し、Bioanalyzer（Agilent）を用いてRNAの完全性を確認した。rRNA 除去 RNA は Agencourt AMPure XP kit (Beckman Coulter Genomics) を用いて精製し、NEBNext® Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB) を用いて75℃で5分間断片化した。cDNAライブラリーは、NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB; E7300L)を用いて、メーカーの指示に従って調製した。cDNAライブラリーの品質はAgilent 2100 Bioanalyzerで確認し、プールしたcDNAライブラリーはNextSeq1000システムで100-ntリード長、シングルリードモードでシーケンスした。デマルチプレックスされた生リードを品質とアダプターのためにトリミングし、CLC Genomics Workbench（Qiagen）の "RNA-Seq Analysis "ツールを用いてV. choleraeおよびVP882参照ゲノム（NCBIアクセッション番号NC_002505.1、NC_002506.1、NC_009016.1）にマッピングした。フォールド変化≧±1.3かつp値≦0.05の遺伝子を差次的発現と定義した。
定量と統計解析
統計解析はGraph Pad Prism 9 (GraphPad Software Inc.)を用いて行った。データは平均値±SDで示した。各実験の技術的および独立した生物学的複製数は、図の説明または方法に示されている。これらの実験では盲検化や無作為化は行わなかった。実験の統計的詳細は図中の凡例に記載されている。ブロット画像のバンド強度はGelQuantNet（biochemlabsolutions）で定量し、Graph Pad Prism 9で解析した。
謝辞
Andreas StarickとYvonne Greiserの優れた技術サポートに感謝する。Jörg VogelとKathrin Fröhlichには原稿に対するコメントを、Papenfort研究室のメンバー全員には洞察に満ちた議論と示唆をいただいた。本研究は、ドイツ研究財団（SPP2330、プロジェクトID 464459808およびEXC2051、プロジェクトID 390713860）、ヴァレ財団（K.P.へ）、欧州研究評議会（ArtRNA、CoG-101088027）の支援を受けた。
著者貢献
概念化、M. SprengerおよびK.P.、方法論、M. Sprenger、調査、M. SprengerおよびM. Siemers、形式分析、M. SprengerおよびM. Siemers、データキュレーション、M. Sprenger、M. SiemersおよびS.K. Siemers、S.K.、執筆-原案、M. Sprenger、K.P.、執筆-校閲・編集、M. Sprenger、K.P.、可視化、M. Sprenger、M. Siemers、S.K.、資金獲得、K.P.。
利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
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ドキュメントS1。図S1-S6、表S2-S4、補足参考文献
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表S1. 図2に関連する、DPOを介した溶解誘導下でのファージVP882におけるTSSの検出
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スコープス (27)
PubMed
概要
全文
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パブコメ
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全文
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グーグル奨学生
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スコパス (3)
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グーグル奨学生
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筑波大学
パブコメ
概要
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全文PDF
グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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スコープス (113)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ムーン・K.
ゴッテスマン S.
大腸菌におけるHfq結合低分子RNA間の競合。
Mol. Microbiol. 2011; 82: 1545-1562
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07907.x
論文で見る
スコープス (129)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
フセイン R．
リム H.N.
Hfqの競合による低分子RNAシグナル伝達の阻害。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108: 1110-1115
https://doi.org/10.1073/pnas.1010082108
論文で見る
スコープス (112)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
パペンフォートK.
サイードN.
ウェルシンクT.
ルッキーニ S.
ヒントンJ.C.D.
Vogel J.
保存されたHfq依存性低分子RNA、ArcZによるmRNA制御の特異的かつ多面的パターン。
Mol. Microbiol. 2009; 74: 139-158
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06857.x
論文で見る
スコープス (185)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラン S.F.
ホアンC.H.
チャン C.H.
Liao W.C.
Lin I.H.
Jian W.N.
Wu Y.G.
チェン・S.Y.
ウォン H.C.
パンデミック腸炎ビブリオO3:K6株における新規プラスミド様プロファージの特性解析。
Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75: 2659-2667
https://doi.org/10.1128/AEM.02483-08
論文で見る
スコープス (51)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ポナスF.
ヘルJ.
Vogel J.
mRNA 3′末端由来の低分子RNAによる細菌の遺伝子制御の概要。
FEMS Microbiol. Rev. 2022; 46: fuac017
https://doi.org/10.1093/femsre/fuac017
論文で見る
スコパス(25)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ホヨス M.
フーバー M.
フェルストナー K.U.
Papenfort K.
3′UTR由来の細菌性低分子RNAによる遺伝子自動制御。
eLife. 2020; 9e58836
https://doi.org/10.7554/eLife.58836
論文で見る
パブコメ
クロスフィルム
グーグル奨学生
エステバン-セルナS.
マコーハンH.
グラネマン S.
微生物におけるタンパク質-RNAインタラクトームのUV架橋解析の利点と限界。
Mol. Microbiol. 2023; 120: 477-489
https://doi.org/10.1111/mmi.15073
論文で見る
スコープス (0)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Melamed S.
複数のRNA結合タンパク質とそのRNAとの相互作用を明らかにする新しい配列決定法。
Curr. Genet. 2020; 66: 713-717
https://doi.org/10.1007/s00294-020-01066-y
論文で見る
スコープス (10)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
メラメド S．
ピアA.
ファイゲンバウム-ロムR.
ガット Y.E.
ライズN.
バー A．
アルトゥビア Y．
アルガマンL.
マルガリット・H.
細菌における小分子RNA-標的相互作用のグローバルマッピング。
Mol. Cell. 2016; 63: 884-897
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.07.026
論文で見る
スコープス (252)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル・スカラー
アップデグローブ T.B.
シャバリーナ S.A.
シュトルツG.
塩基対を持つ低分子RNAはどのように進化するのか？
FEMS Microbiol. Rev. 2015; 39: 379-391
https://doi.org/10.1093/femsre/fuv014
論文で見る
スコープス (67)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
タビブ-サラザールA.
リューB.
バーカーD.
バーシェル L.
キムロンU.
マシューズ S.J.
ウィグネシュワラージ S.
大腸菌のRpoS管理に必要なT7ファージ因子。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018; 115: e5353-e5362
https://doi.org/10.1073/pnas.1800429115
論文で見る
スコープス (28)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ザヒド M.S.
ワイズT.M.
カムルザマンM.
ゴーシュ A.N.
ネール G.B.
メカラノスJ.J.
ファルケ S.M.
環状AMP（cAMP）-cAMP受容体タンパク質シグナル伝達系は、複数の環境バクテリオファージに対するコレラ菌O1株の抵抗性を媒介する。
Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76: 4233-4240
https://doi.org/10.1128/AEM.00008-10
論文で見る
スコープス (13)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Zhang S.
Zhao B.
李J.
Song X.
Tong Y.
An W.
新規溶菌シアノファージYongMによる宿主シアノバクテリアの死滅：タンパク質プロファイリング解析。
Microorganisms. 2022; 10: 257
https://doi.org/10.3390/microorganisms10020257
論文で見る
スコープス (5)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ファイファー V.
パペンフォートK.
ルッキーニ S.
ヒントンJ.C.
Vogel J.
MicC RNAによるコード配列ターゲティングにより、細菌のmRNAサイレンシングが翻訳開始下流で明らかになった。
Nat. Struct. Mol. Biol. 2009; 16: 840-846
https://doi.org/10.1038/nsmb.1631
論文で見る
スコープス (246)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
バーキストL.
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Vogel J.
感染関連small non-coding RNAの分子表現型解析。
Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 2016; 37120160081
https://doi.org/10.1098/rstb.2016.0081
論文で見る
スコープス (13)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
オフィールG.
ソレック R.
現代のファージ生物学： 古典的モデルから新たな洞察へ。
Cell. 2018; 172: 1260-1270
https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.10.045
記事で見る
スコープス (148)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ヒレF.
リヒター H.
ウォン S.P.
ブラトビッチ M.
レッセル S.
シャルパンティエ E.
CRISPR-Casの生物学： 前進と後退。
Cell. 2018; 172: 1239-1259
https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.032
論文で見る
スコープス (603)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ダンハム D.T.
アンガーマイヤーA.
シード K.D.
ファージとそのサテライトウイルスの間のRNA-RNA相互作用ゲノムから、両ゲノムにわたって遺伝子発現を制御する低分子RNAが明らかになった。
Mol. Microbiol. 2023; 119: 515-533
https://doi.org/10.1111/mmi.15046
論文で見る
スコパス(2)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
タビブ-サラザールA.
ウィグネシュワラージ S.
T7感染時のRNA管理。
Phage (New Rochelle). 2022; 3: 136-140
https://doi.org/10.1089/phage.2022.0029
記事で見る
スコープス (0)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ツリー J.J.
グラネマンS.
マカティア S.P.
トラーヴェイ D.
ガリー D.L.
病原性大腸菌におけるバクテリオファージコード化抗sRNAの同定。
Mol. Cell. 2014; 55: 199-213
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.05.006
論文で見る
スコープス (178)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ラグナタン P.T.
ン・クワン・リムE.
マー X.
マッセ E.
ヴァンダープール C.K.
大腸菌におけるプロファージ暗号化遺伝子産物の制御機構（Escherichia coli.
J. Bacteriol. 2023; 205e0012923
https://doi.org/10.1128/jb.00129-23
論文で見る
スコープス (0)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ハーシュコ・シャレフ T.
オデンハイマー・バーグマンA.
エルグラブリ-ワイスM.
ベン・ツヴィT.
ゴビンダラジャン S.
セリ・H.
パペンフォート K.
フォーゲル J.
アルトゥビア S.
小分子RNAとメッセンジャーRNAの2つの機能を持つGifsy-1プロファージIsrKは、細菌の重要な仕組みを調節する。
PLoS Genet. 2016; 12e1005975
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005975
論文で見る
スコパス (30)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ダディ O.P.
シルペJ.E.
フェイ C.
バスラー B.L.
クオラムセンシング活性の自然なサイレンシングにより、腸炎ビブリオは自己誘導体検出ファージによる溶菌から守られる。
PLoS Genet. 2023; 19e1010809
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010809
論文で見る
スコパス(1)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ファイファー E.
ボニンR.A.
ロシャ E.P.C.
ファージプラスミドは感染と溶原性転換により抗生物質耐性遺伝子を拡散する。
mBio. 2022; 13e0185122
https://doi.org/10.1128/mbio.01851-22
記事で見る
スコープス (34)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
バンディラ K.J.
ブービエ M.
カルプシスA.J.
ルイジ B.F.
RNA分解酵素の社会的構造。
Biochim. Biophys. Acta. 2013; 1829: 514-522
https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2013.02.011
論文で見る
スコープス (62)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スカルスキー R.L.
カレン B.R.
ウイルス、マイクロRNA、宿主の相互作用。
Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 123-141
https://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134243
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
グズアシスV.
タストグルーS.
ジャンナカキスA.
ハツィゲオルギウ A.G.
健康と疾患におけるウイルス由来小RNAとマイクロRNA。
Annu. Rev. Biomed. 2023; 6: 275-298
https://doi.org/10.1146/annurev-biodatasci-122220-111429
論文で見る
スコープス(1)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Wang M.
Gu B.
チェン X.
Wang Y.
Li P.
Wang K.
がんにおけるエプスタイン・バーウイルスにコードされたマイクロRNAの機能と治療の可能性。
Mol. Ther. Nucleic Acids. 2019; 17: 657-668
https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.07.002
論文で見る
スコープス (35)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ジラルディ E.
ロペス P.
Pfeffer S.
ウイルス感染における宿主マイクロRNAの重要性について。
Front. Genet. 2018; 9: 439
https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00439
論文で見る
スコープス (125)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ドロンS.
メラメドS.
オフィールG.
リービットA.
ロパティナA.
ケレン M.
アミタイ G.
ソレックR.
微生物パンゲノムにおける抗ファージ防御システムの系統的発見。
Science. 2018; 359eaar4120
https://doi.org/10.1126/science.aar4120
論文で見る
スコープス (551)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ゴッテスマン S.
トラブル発生： 細菌の一般的ストレス応答を制御するシグナル伝達経路。
J. Biol. Chem. 2019; 294: 11685-11700
https://doi.org/10.1074/jbc.REV119.005593
論文で見る
スコープス (138)
パブコメ
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ゴパルクリシュナン S.
ロスW.
アクバリ M.S.
リーX.
ヘイコックス J.R.J.
グレインジャーD.C.
コート D.L.
Gourse R.L.
ファージラムダOrf73を含む大腸菌Fエレメントタンパク質TraRのホモログが宿主の転写を直接リプログラミングする。
mBio. 2022; 13e0095222
https://doi.org/10.1128/mbio.00952-22
論文で見る
スコープス (2)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
スコルプスキ K.
テイラー R.K.
対立遺伝子交換のための陽性選択ベクター。
Gene. 1996; 169: 47-52
https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00793-8
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ペシェックN.
ヘルツォークR.
シン P.K.
Sprenger M.
マイヤー F.
フレーリッヒ K.S.
シュレーガー L.
ブラムカンプ M.
ドレッシャー K.
Papenfort K.
RNAを介した細胞形状の制御がコレラ菌の抗生物質耐性を調節する。
Nat. Commun. 2020; 11: 6067
https://doi.org/10.1038/s41467-020-19890-8
論文で見る
スコープス (18)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ダツェンコ K.A.
Wanner B.L.
PCR産物を用いた大腸菌K-12の染色体遺伝子の一段階不活化
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 6640-6645
https://doi.org/10.1073/pnas.120163297
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロビンソン M.D.
マッカーシー D.J.
Smyth G.K.
edgeR：デジタル遺伝子発現データの差分発現解析のためのBioconductorパッケージ。
Bioinformatics. 2010; 26: 139-140
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp616
論文で見る
遺伝子発現解析
PubMed
クロス
グーグル奨学生
メラメド S.
ファイゲンバウム・ロムR.
ピアA.
ライスN.
シェクターO.
バー A.
アルトゥビア Y.
アルガマン L.
Margalit H.
RIL-seqを用いた細菌におけるsmall RNAインタラクトームのマッピング。
Nat. Protoc. 2018; 13: 1-33
https://doi.org/10.1038/nprot.2017.115
論文で見る
スコープス (42)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カルヴィナー P.H.
ゲグラーC.K.
Laub M.T.
RNAシークエンシング研究におけるrRNA欠失のためのシンプルで費用対効果の高い頑健な方法。
mBio. 2020; 11 (10-1128)e00010-20
https://doi.org/10.1128/mBio.00010-20
論文で見る
論文リスト(52)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2024年4月4日
受理 受理：2024年3月13日
改訂版受理 2024年2月2日
受理：2024年2月2日 受理日：2023年11月21日
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.03.010

著作権
© 2024 The Author(s). 発行：エルゼビア社
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