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公開日：2021年12月17日
SARS-CoV-2トリガーによる肥満細胞の急速な脱顆粒が肺胞上皮の炎症と肺傷害を誘発する

https://www.nature.com/articles/s41392-021-00849-0

メン・リ・ウー
劉鳳亮（リュウ・フェンリャン
...
王 建華（ワン・ジェンホア
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シグナル伝達と標的治療 6巻 記事番号：428 (2021) この記事を引用する
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指標詳細
概要
SARS-CoV-2感染による高炎症は、急性肺障害およびCOVID-19の重症化に関連している。制御不能な高サイトカイン血症を引き起こす主要なメディエーターを特定することは、治療にとって不可欠である。マスト細胞（MC）は粘膜に戦略的に配置され、免疫の炎症を有益または有害に制御しています。本研究では、SARS-CoV-2をトリガーとするマスト細胞の脱顆粒が肺胞上皮の炎症と肺傷害を引き起こすことを明らかにした。SARS-CoV-2チャレンジは、ACE-2ヒト化マウスおよびアカゲザルのMC脱顆粒を誘発し、細胞内のACE2へのSpike-RBD結合により急速なMC脱顆粒を再現することができた。MC脱顆粒は肺胞上皮細胞の様々なシグナル経路、特に炎症因子の誘導とそれに伴うタイトジャンクションの崩壊に変化を与えた。重要なことは、脱顆粒を阻害する臨床用MC安定化剤を投与すると、SARS-CoV-2による炎症性因子の産生が抑制され、肺障害が予防されることであった。これらの知見は、SARS-CoV-2が肺の炎症を引き起こす新しいメカニズムを明らかにし、COVID-19治療における免疫調節剤としてのMC安定剤の適応外使用を示唆している。
はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019（COVID-19）が世界的なパンデミックとなっています。高齢者における重症化と死亡の発生率が高いことが確認されています1。この疾患を抑制するために、ヌクレオチドアナログであるRemdesivir（Veklury）は、成人および12歳以上の小児におけるCOVID-19の治療薬として米国食品医薬品局（FDA）から承認されています2。また、メルク社とリッジバック社が開発したリボ核酸アナログのmolnupiravir（EIDD-2801、MK-4482）が、COVID-19に対する内服治療として英国から認可されました。 3,4 また、米国FDAは、2つのmRNAワクチン（Pfizer-BioNTech、Moderna）と1つの組み換えアデノウイルス-26ワクチン（Janssen、Ad26.COV2.S）を集団使用として承認・認可し5、世界では100以上のSARS-CoV-2ワクチン候補が開発中です6。
COVID-19の主要な病理学的特徴は、COVID-19の重症化に伴う炎症反応（高サイトカイン血症または「サイトカインストーム」とも呼ばれる）であり、生体内で生成されるこれらの炎症性サイトカインおよびケモカインによって肺胞上皮細胞および毛細血管内皮細胞が損傷する7、8、9、10、11、12、13、14、15。重症COVID-19患者で過剰に産生される既知の炎症性サイトカインおよびケモカインには、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MIP1αおよび1β、CCL2、CCL5、CCL20、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL10およびCXCL17がある。 9,13,14,15,16,17,18,19,20 その中でも、IL-6、TNF-α、C反応タンパク質（CRP）レベルの上昇は、COVID-19疾患の重症度の独立した危険因子であることが示されています13、17、20、21、22。
したがって、炎症亢進ループを標的とした免疫調節薬の開発は、COVID-19重症例に対する治療法開発のための魅力的な戦略である7,23,24。炎症亢進を緩和して臨床結果を改善するために、いくつかの薬剤候補が試されてきた。その中には、ヒト化抗IL-6受容体抗体トシリズマブ25、抗IFN-γモノクローナル抗体エマパルマブ、IL-1受容体拮抗薬アナキンラ（NCT04324021）、JAK1およびJAK2阻害薬バリサイトおよびリツコリチニブ26（NCT04338958）、デキサメタゾンなどの副腎皮質ホルモン剤27、28、29などがある。しかし、トシリズマブは中等症入院患者における挿管や死亡の予防には効果がなかった。30,31 別のIL-6受容体モノクローナル抗体サリルマブは、臨床転帰の改善や死亡率の減少につながらないばかりか、深刻な合併症を引き起こしている32。実際、コルチコステロイド治療は免疫反応全体を抑制し、抗ウイルスI型インターフェロン反応の誘導も阻害する。34,35 したがって、宿主の免疫保護を損なうことなく、炎症を抑制する有効な免疫調節薬の開発が必要である。
肺は、コロナウイルスの主要な標的である。肺の肺胞は、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）を発現する上皮細胞で覆われている。SARS-CoV-2感染時に肺胞上皮細胞と毛細血管内皮細胞の両方がダメージを受けるには、肺胞上皮の炎症が前提条件であると考えるのが妥当である36,37,38。この間に感染上皮細胞が単球とマクロファージを勧誘・活性化して炎症性サイトカインを分泌し、さらに好中球を勧誘しT細胞を活性化して炎症を増悪する12。死後の肺生検で示されたように、肺胞内膜細胞の壊死、肺胞2型過形成、線状の肺胞内フィブリン沈着を伴うびまん性の肺胞損傷、微小血管症を伴う広範囲の血管血栓症、肺胞毛細血管の閉塞が見られた39、40。したがって、SARS-CoV-2の上皮炎症のメカニズムを明らかにすることが最も重要である。
MCは、呼吸器官や鼻腔など、宿主と環境の接点に戦略的に配置される組織常在細胞である。アレルギーの主要なエフェクター細胞としてだけでなく、MCは可溶性因子の放出や直接的な接触を通じて様々な免疫細胞と相互作用し、免疫炎症を有益または有害に制御することができる。DNA/RNAウイルス、真菌、細菌またはそれらの生成物を含む様々な病原体は、MCを活性化して、脱顆粒依存または脱顆粒独立経路を通じてサイトカインおよびケモカインの分泌を誘導することができる43。放出されたメディエーターは、病原体の除去のために免疫エフェクター細胞のリクルートを促進することができる。あるいは、これらの炎症メディエーターは、病原体の侵入を促進するために上皮内皮の障壁を破壊する不適切な炎症反応を引き起こすかもしれない43。SARS-CoV-2感染では、COVID-19患者の死後の肺生検で、血管周囲および中隔のMCの密度が大幅に増加しており、MCが肺胞中隔に動員されて特定の未知の機能を果たしていることを示唆している44、45 SARS-CoV-2感染により、アフリカングリーンモンキーの肺実質へのMC浸潤が引き起こされた46 これらの証拠は、SARS-CoV-2の病原におけるMCの役割を示していると考えられる。
そこで、本研究では、SARS-CoV-2感染におけるMCの役割を調べ、SARS-CoV-2がMCの脱顆粒を誘発するかどうか、そしてウイルスが誘発する肺胞上皮の炎症と肺損傷におけるその連続的役割を検討し、COVID-19治療に有効な免疫調節剤を見つけることを期待しています。
研究成果
SARS-CoV-2はACE2ヒト化マウスの肺でMC脱顆粒を誘導する
SARS-CoV-2がin vivoでMC脱顆粒を誘発するかどうかを調べるために、ACE2-ヒト化近交系マウス47（C57BL/6N-Ace2em2（hACE2-WPRE，pgk-puro）／CCLAと称される、 SARS-CoV-2（107株）を2×106 TCID50（50％組織培養感染量）の用量で経鼻感染させ、感染後異なる日数（dpi）に安楽死させて組織学的解析のために肺組織を採取した。模擬感染として、同量のPBSを接種した。その結果、1-dpiおよび3-dpiにおけるSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の免疫染色によって示されるように、SARS-CoV-2ビリオンは主に気管支周囲および気管支肺胞-管接合部に分布するという以前の観察結果を確認した（補足図1）。MCとその脱顆粒はトルイジンブルー（T.blue）によるメタクロマティックラベルで示した50。模擬感染（図1a）と比較して、1dpiでは気管支周囲にMCの集積が見られ、肺胞空間では顆粒が放出されていることが確認された（図1c）。SARS-CoV-2感染後のMCの脱顆粒は、肺胞空間に広く分布する放出顆粒の多さで確認された（図1c、e、g）。MCの蓄積と脱顆粒の領域周辺の肺病変をヘマトキシリンとエオシン（H.E.）で染色して検討した。模擬感染コントロール（図1b）と比較して、MC集積・脱顆粒部周辺に炎症細胞（リンパ球、単球）の浸潤、出血、肺胞隔壁肥厚、粘膜脱落などの肺病変が認められた（図1d、f、h）。肺組織病変の程度に応じて病理スコアを評価し、肺切片中のMC数を算出した（図1i）。
図1：SARS-CoV-2は、hACE2-ヒト化マウスにおいて、肥満細胞の脱顆粒および肺障害を誘発する。
5匹のC57BL/6N-Ace2em2(hACE2-WPRE,pgk-puro)/CCLAマウスに、2×106 TCID50の用量でSARS-CoV-2（107株）を経鼻的に感染し、2匹のマウスは模擬感染として使用した。マウスは1dpi、3dpi、5dpiで安楽死させ、組織学的解析のために肺組織を採取した。トルイジンブルー染色によりMCとその脱顆粒を観察し（a、c、eおよびg）、H.E.染色により肺損傷を観察した（b、d、fおよびh）、スケールバーを示した： 100 μm。(i）肺組織病変の程度に応じて病理学的スコアを評価し、肺切片のMC数を算出した。*p < 0.05および**p < 0.01は、有意差とみなす。
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上記の観察がSARS-CoV-2感染の1つの実験モデルに限定されないことを確認するために、別のマウスモデル、すなわちAd5-hACE2導入BALB/cマウス51を使用した。マウスに7×104 TCID50 SARS-CoV-2を鼻腔内投与し、異なる時期に犠牲にして組織学的染色のために肺を採取した。同様の結果が得られた。模擬感染（補足図2a）と比較して、SARS-CoV-2チャレンジは、気管支周囲および気管支肺胞-管路接合部においてMC脱顆粒を誘発した（補足図2c、e、g）。隣接する肺切片の同時H.E.染色では、これらの部位周辺に肺病変が認められたが（補足図2d、f、h）、模擬感染マウスでは認められなかった（補足図2b）。肺組織病変の程度に応じて病理学的スコアを評価し、肺切片のMC数を算出した（補足図2i）。これらのデータから、SARS-CoV-2感染により、ACE2ヒト化マウスの肺病変部周辺にMCの集積と脱顆粒が誘導されることが説得力を持って証明された。
SARS-CoV-2感染によるアカゲザルの肺でのMC脱顆粒の誘導
マウスでの病態モデルを確立した後は、ヒトへの応用が期待される霊長類での発症の有無を検討した。SARS-CoV-2は、ヒトCOVID-19の免疫学的病態の特徴の多くを再現できる中国アカゲザル（chRM）（Macaca mulatta）に感染します。特に、高齢のchRMは、若いchRMと比較して、遅れてより激しいサイトカインストームと高い免疫細胞浸潤を示しました52。したがって、このモデルはMC活性化に関連した炎症反応を詳細に調べるのに最も適している。
我々は、SARS-CoV-2感染により、chRMの肺でMCが脱顆粒することを確認した。若齢chRM（3〜6歳）（図2）または高齢chRM（17〜19歳）（図3）に麻酔をかけ、SARS-CoV-2（1 × 107 TCID50）（107株）を気管内に感染させた。7dpiまたは15dpiで動物を犠牲にし、肺を採取して切片にし、T.blue染色でMCの変化を検討した。模擬感染（図2a、3a）と比較して、SARS-CoV-2チャレンジでは、7dpiと15dpiの両方で、気管支周囲と気管支肺胞-小管接合部にMCが集積し、MCの脱顆粒が認められた（図2b-f、図3b-d）。予想通り、若いCRM（図2b-f）と比較して、老化したCRMはSARS-CoV-2によるMCの蓄積と脱顆粒をより広範囲に示した（図3b-d）。以上のことから、SARS-CoV-2はアカゲザルの肺においてMCの脱顆粒を誘導することが示された。
図2：SARS-CoV-2は、若齢のCRMにおいてマスト細胞の脱顆粒を誘導する。
若齢のCRM（3〜6歳）をZoletil 50で麻酔し、気管支鏡で2mL容量のSARS-CoV-2（1 × 107 TCID50）を気管内接種した。 a 模擬感染。動物を7dpi（b、c、d）または15dpi（e、f）で安楽死させ、組織学的解析のために肺葉を採取した。トルイジンブルー染色により、MCとその脱顆粒を観察した。赤矢印はMCを示す
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図3：SARS-CoV-2は、老化したchRMsにおいてマスト細胞の脱顆粒を誘導する。
高齢のchRM（17〜19歳）をZoletil 50で麻酔し、気管支鏡で2mL容量のSARS-CoV-2（1 × 107 TCID50）を気管内接種した。 a 模擬感染．動物を7dpi（b）または15dpi（c、d）で安楽死させ、組織学的解析のために肺葉を採取した。トルイジンブルー染色により、MCとその脱顆粒を観察した。赤矢印はMCを示す
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Spike-RBDとACE2との結合により、MCの急激な脱顆粒が引き起こされる。
SARS-CoV-2が引き起こすMCの脱顆粒の分子メカニズムをさらに調べるため、ヒトMC細胞株LAD2細胞を用い、まずSARS-CoV-2がLAD2細胞の脱顆粒を誘発するかどうかを検討しました。MCの脱顆粒は、先に述べたように、細胞質アビジン顆粒の免疫染色の強度低下によって評価することができる50,53。SARS-CoV-2 (M.O.I. = 1) (2019-nCoV WIV04 株)で細胞を処理した結果、SARS-CoV-2は、ウイルス感染後5分以内に細胞質のアビジン顆粒の免疫染色が急速に減少することからわかるように、直ちにLAD2細胞の脱顆粒を誘発し、2時間のウイルス感染の間に細胞脱顆粒の誘発が進行することがわかった（図4a）。
図4：Spike-RBDとACE2との結合により、急速なMCの脱顆粒が誘発される。
a SARS-CoV-2 (M.O.I. = 1)誘発LAD2脱顆粒、細胞内アビジンを免疫染色したフローサイトメトリーで検出。 b, c LAD2細胞におけるACE2発現、ウェスタンブロッティングおよび特異抗体による免疫染色で検出。 d 抗ACE2抗体による事前ブロッキングによりRBD結合を低減。LAD2細胞を抗ACE2抗体（5μg/ml）と37℃で1時間インキュベートした後、Spike-RBD（5μg/ml）を添加して4℃で1時間結合させ、LAD2細胞へのSpike-RBDの結合をフローサイトメトリーで検出した。 e、f、g Spike-RBDはLAD2脱顆粒を誘発する。LAD2細胞をSpike-RBD（5μg/ml）と37℃で指示時間インキュベートした後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、4℃で1時間、抗アビジン-FITCで免疫染色し、フローサイトメトリーで解析し（e、g）、独立した7回のリピートによる結果を要約して示した（e）。脱顆粒成分TryptaseとChymaseはELISAで検出した（f）。LAD2細胞は、Spike-RBD刺激の前に、37℃で1時間、抗ACE2抗体（5μg／ml）で前処理した（g）。 h HCoV-NL63およびHCoV-229EによるLAD2脱顆粒の誘導。LAD2細胞をHCoV-NL63またはHCoV-229E（M.O.I＝1）と共に指示時間インキュベートし、細胞脱顆粒を上記のように検出した。3回（a、b、f、h）または4回（c、d、g）の独立した繰り返しからの1つの代表データを示す。データは、平均値±SDで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, *p < 0.0001 は有意差とみなす。MFI 平均蛍光強度
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SARS-CoV-2-トリガーによる迅速なMC脱顆粒の観察（5分と短い）は、ウイルス結合がこのイベントに関与している可能性を示しています。LAD2細胞は、ウェスタンブロッティング（図4b）およびフローサイトメトリー（図4c）によりACE2受容体を発現し、SARS-CoV-2およびスパイク偽型レンチウイルス（NL4-3/S）に対して感受性があった（補足図3）。SARS-CoV-2 Spike糖タンパク質の組換え受容体結合ドメイン（RBD）は4℃でLAD2細胞に結合でき、抗ACE2特異抗体で事前にブロッキングするとSpike-RBD結合は阻止された（図4d）。特に、ACE2へのSpike-RBDの結合は、Spike-RBD処理後5分以内に細胞内アビジン強度が著しく低下することで示されるように、即時の脱顆粒を伴い（図4e、補足図4a）、2時間の培養期間の間に脱顆粒は徐々に増加した（図4e）。Spike-RBDによるLAD2の脱顆粒は、細胞内のTryptaseおよびChymaseの放出によっても定量化された。Spike-RBDまたはSpike-pseudotyped lentivirus (Pseudo. Virus)のいずれかでLAD2細胞を2時間処理すると、TryptaseとChymaseの放出が著しく増加し、化合物48/80 (C48/80) を、MC脱顆粒の刺激に関する正の実験対照として使用した（Fig 4f）。
Spike-RBDとACE2の特異的な相互作用がMC脱顆粒を誘発する鍵であることを確認するため、抗ACE2抗体で事前に処理することで相互作用をブロックしたところ（図4d）、LAD2細胞へのSpike-RBD処理はもはや細胞脱顆粒を誘発することができないことが判明した（図4g）。また、ヌクレオカプシドタンパク質処理では、LAD2の脱顆粒を誘導することはできなかった（補足図4b）。Spike-RBD刺激による2時間の短い刺激では、LAD2細胞におけるサイトカインのde novo合成の明らかな上昇は見られなかったが、8時間以上の刺激では炎症性サイトカインの産生を誘導した（補足図5）。
さらに、他のタイプのコロナウイルスでもMCの脱顆粒を誘導できるかどうかを検討した。HCoV-NL63とHCoV-229Eのコロナウイルスを用いてLAD2細胞を処理したところ（M.O.I = 1）、ウイルス刺激後5分以内に細胞質アビジン顆粒の免疫染色が急速に減少することからわかるように、急速なMC脱顆粒が認められ、2時間のウイルス感染経過とともに細胞脱顆粒誘導は進行した（図4H）。
これらのデータから、SARS-CoV-2のSpike-RBDとACE2の結合は、迅速かつ特異的なMCの脱顆粒を即座に誘発することが示された。
トランスクリプトーム解析により、ヒト肺胞上皮細胞におけるMC脱顆粒が誘発する細胞内シグナル伝達のリモデリングを明らかにした。
SARS-CoV-2感染症は、肺胞上皮の炎症とバリア機能障害を引き起こす。55,56 SARS-CoV-2トリガーによるMC脱顆粒が関与しているかどうかを調べるため、Spike-RBD誘発MC脱顆粒モデルでトランスクリプトーム解析を行った。Spike-RBDで処理したLAD2細胞の培養上清を採取し、A549細胞（腺癌ヒト肺胞底上皮細胞株）を24時間処理した後、標準プロトコルでA549細胞内のトランスクリプトームを解析した。3回の独立した繰り返しによるデータをまとめた。ボルケーノプロットでは、Spike-RBDで処理したLAD2細胞の上清でA549細胞を処理した後、合計1667個のアップレギュレート遺伝子と907個のダウンレギュレート遺伝子を表示しました（図5a）。異なる発現遺伝子（DEG）のジーンオントロジー（GO）機能濃縮分析では、サイトカインのシグナル伝達と産生、骨髄球と白血球の活性化、細胞接着、自然免疫と炎症反応、細胞アポトーシスシグナルを制御する遺伝子セットが明らかにアップレギュレーションし、一方、細胞周期、細胞分裂、アクチン線維ベースの細胞運動過程を制御する遺伝子セットがダウンレギュレーションした（図 5b）。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）により、アップレギュレートされた遺伝子は炎症反応や自然免疫反応の制御に、ダウンレギュレートされた遺伝子は細胞周期や細胞間結合の制御に関連付けられた（図5c）。
図5：LAD2/RBD上清で処理したA549細胞のトランスクリプトーム解析。
a LAD2/RBD上清と培地を比較したDEGのVolcano plot。上位10個のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション遺伝子のシンボルを示す。 b DEGsのGO機能濃縮解析。c 炎症反応、自然免疫反応、細胞間結合組織、細胞周期に関連する遺伝子セットの分布と、DEGsに基づく濃縮スコアをGSEAで示した。 d DEGsの転写因子濃縮解析。e-i ISGs（e）、サイトカイン・ケモカイン関連遺伝子（f）、メタロペプチダーゼ（g）、細胞接合関連遺伝子（h）、細胞周期・分裂関連遺伝子（i）のセットについて、相対発現量（左図）、フォールドチェンジ（中図）、調整p値（右図）を示したヒートマップ。M medium; S, LAD2/RBD supernatant. j コア DEGs の Protein-Protein interaction network analysis. カラーバーはトランスクリプトームレベルでのタンパク質コード遺伝子の変化倍率を表す
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DEGの転写因子濃縮解析から、上昇した転写因子は主に免疫・炎症反応を司るもので、RELA、STAT3、STAT1、JUN、CEBP-α/β、IRF1、ATF4など、低下した転写因子は主に細胞増殖や代謝の制御に関わるもので、E2F1、E2F4、TP53、ZBTB16などでした（図5d）。
高発現差のあるコアDEGをカタログ化した。LAD2/RBD上清による刺激により、A549細胞では抗ウイルス免疫遺伝子の発現上昇が誘導され、ISGやIFN-I応答に関する遺伝子（IFI27、OAS2、IFI6、IFITM1、ISG15、MX1、RSAD2、IRF7、OASL、MX2、IFIT1、IFIT3など）の著しいアップレギュレーション（図5e）も観察されました。その他、炎症性サイトカイン/ケモカイン、特にCCL20、IL-6、IL1α、TNF、CCL5、IL1β、CXCL8（IL-8）遺伝子のアップレギュレーション（図5f）、メタロペプチダーゼコード遺伝子（ADAMTS2やMMPなど）のアップレギュレーション（図5g）が顕著である。LAD2/RBD上清は、細胞接合と細胞周期/分裂の制御因子をコードする多数の遺伝子のダウンレギュレーションを誘導した。細胞接合に関連するダウンレギュレーションされたコアDEGには、タイトジャンクションタンパク質（CLDN2、CLDN5、TJP1、JAM2など）をコードするもの、カドヘリン（e.g.．CDH6、CDH19、CDH17、CDH11、FAT1、DSC2、EPCAMなど）、細胞骨格/微小管関連タンパク質（NEB、KRT19、RDX、TPM1、MAP1Aなど）、ミオシン（MYH10、MYO10、MYO5B、MYLK、MYORGなど）（図5H）。細胞周期/分裂に関連するダウンレギュレーションされたコアDEGは、主に分裂期のセリン/スレオニンキナーゼとその制御因子をコードするもの（例：BUB1、NEK2、CDK1；CDKN3、CDKN2C）、セントロメア蛋白（例、 CENPF、CENPI、CENPA）、細胞周期の移行期の制御関連転写因子およびサイクリンファミリーメンバー（例えば、E2F7、E2F8；CCNA2、CCND1、CCNB1、CCNB2）、ゲノム複製制御因子（例えば、CDC45、CDC6、MCM3）、細胞分裂制御因子（例えばCCN2、CDC25a）など（図5i）。コアDEGのPPI（Protein-Protein Interaction Network）解析は、DEG間およびシグナル伝達経路間の関係を可視化するために構築された（図5j）。
以上のことから、SARS-CoV-2をトリガーとするMC脱顆粒は、ヒト肺胞上皮細胞における複数の細胞シグナルを著しく変化させ、特にMC脱顆粒は免疫応答と炎症をアップレギュレートし、細胞接合と細胞分裂に関連する細胞シグナルをダウンレギュレートすることが明らかになった。
SARS-CoV-2をトリガーとするMC脱顆粒を抑制すると、その後の肺胞上皮の炎症が消失する。
そこで、MCの脱顆粒とそれに伴うサイトカイン放出を抑制する薬剤の候補を探すため、MC安定化剤として知られているクロモグリク酸ナトリウム（Sod. crom.）と、ヒトのアレルギー治療に日常的に使用されているヒスタミン受容体1（HR1）拮抗薬のケトチフェンフマル酸塩（Ket.）、エバスチン（Eba.）とロラタジン（Lor.）に関して調査しました。抗ヒスタミン剤であることに加え、Ket.、Eba. (とその主代謝物であるカレバスチン）、Lor. (およびその主代謝物であるデスロラタジン）は、炎症性メディエーターの脱顆粒と放出を防ぐMC安定化剤としても使用できる57, 58, 59, 60, 61, 62, 63。
その結果、LAD2細胞をEba.、Lor.、Sod.crom.、Ket.で前処理することにより、Spike-RBDおよび/またはSpike-偽型レンチウイルスによる細胞脱顆粒が阻害された（図6a）。次に、これらのMC安定化剤を用いて、その後の肺胞上皮細胞からの炎症性メディエーターの刺激を抑えることを考えた。LAD2細胞を代表的なMC安定化剤である第二世代抗ヒスタミン剤Lor.とEba.で前処理し、Spike-RBDによる細胞脱顆粒を阻害した後、細胞培養上清を採取して肺上皮細胞A549を処理しました（図6b）。A549細胞をSpike-RBDで直接刺激しても炎症性サイトカインの明らかな発現は誘導されなかったが、LAD2/RBD上清でA549細胞を処理すると、極めて高いレベルのIL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、CCL20およびCCL5の産生が誘導された。Spike-RBD誘発LAD2細胞デグランレーションがLorまたはEbaによってブロックされると、 は、上清の炎症性サイトカイン誘導能を失った（図6c；補足図6）。
図6：MC脱顆粒の阻害は肺胞上皮の炎症を消失させる。
a Lor.、Eba.、Ket.、またはSod. Crom.は、Spike-RBDまたは偽型レンチウイルス誘発LAD2細胞脱顆粒を阻害する。細胞は、事前にLor. (5 μg/mL)、Eba. (3 μg/mL)、Ket. (40 μg/mL)、またはSod. Crom. (10μg/mL）で20時間培養した後、Spike-RBD（5μg/ml）またはSpike-pseudotyped lentivirus（5ng p24Gag）と37℃で2時間インキュベートし、細胞の脱顆粒をフローサイトメトリーで検出した。 b 処理に関する説明図である。LAD2細胞をLorで前処理した、またはLorを用いない。(5μg/mL)またはEba. (3μg/mL)で20時間処理し、次に細胞をSpike-RBD(5μg/ml)で2時間処理し、培養上清を採取してA549細胞をさらに24時間処理するか、A549細胞をSpike-RBDで24時間直接処理し、c IL-6、TNF-α、IL-8、CCL20、CCL5およびIL-1βのmRNAレベルはリアルタイムq（RT-）PCRで定量した、 およびgapdh mRNAに対して正規化した、d ZO-1、Jam-2、Claudin-5およびOccludinの発現は、特定の抗体による免疫染色によって検出し、フローサイトメトリーで分析した、および（e、f）、A549細胞のMMP9およびMMP19の発現は、ウェスタンブロッティングまたはリアルタイムq（RT-）PCRによって測定し、ゲルのグレー強度はImage Jによって計算し正規化した（e）。3回（c、d、e、g）または5回（a、f）の独立した繰り返しによる1つの代表的なデータを示す。データは平均値±SDで表示されている。*p < 0.0001 および ****p < 0.0001 は有意差とみなす (c, f)。MFI 平均蛍光強度 (a, d)
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観察されたLAD2/RBD上清による炎症性サイトカイン産生が単一細胞株でのアーティファクトではないことを確認するため、ヒト非小細胞肺がん細胞H1299をLAD2/RBD上清での刺激に使用しました。その結果、LAD2/RBD上清はH1299細胞においてIL-6, IL-8, IL-1β, TNF-αの発現を有意に誘導した（補足図7）。
肺胞上皮バリアーの崩壊は、タイトジャンクションタンパク質の欠陥と関連している。上記のトランスクリプトーム解析データ（図5h）と同様に、LAD2/RBD上清でA549細胞を刺激すると、タイトジャンクションタンパク質ZO-1, Jam-2, Claudin-5, Occludinが減少するが、RBDタンパク質で直接刺激しても効果は見られなかった。LAD2をあらかじめLor.やEbaで処理し脱顆粒を阻害すると、収穫したLAD2/RBD培養上清は、タイトジャンクションタンパク質に障害を及ぼすことはなかった（図6d）。これらのことから、LAD2/RBD上清中に放出された特定の因子またはファクターがタイトジャンクションタンパク質に作用していることが示唆された。
MMP-9は、細胞外マトリックスを分解することで肺胞上皮・内皮毛細血管バリアを損ない、好中球や白血球の移動を刺激し、炎症を促進する可能性がある66）。上記のトランスクリプトーム解析データ（図5g）と一致するように、LAD2/RBD上清処理したA549細胞はMMP9の発現レベルが高く、Lor.やEba.でLAD2の脱顆粒を阻害すると、LAD2/RBD上清はMMP9遺伝子発現誘導能を失った（図6e、f）。MMP19は、上記のRNA-Seqデータにおいて、もう一つ有意に発現が上昇した遺伝子である（Fig.5g）。MMP19は単球、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞で発現している67。また、LAD2/RBD上清処理したA549細胞ではMMP19の発現量が高く、Lor.またはEba.でLAD2の脱顆粒を阻害するとMMP19遺伝子の発現誘導が失われることを確認した（図6G）。これらのデータを総合すると、Spike-RBDをトリガーとするMCの脱顆粒は、A549肺胞上皮細胞からの炎症性サイトカインおよびMMPの産生をさらに誘導することができることが示されます。このメカニズムに基づき、MCの脱顆粒を抑制する薬剤は、肺胞上皮の炎症を抑制し、タイトジャンクションタンパク質の完全性を保護することが可能であると考えられる。
MC安定化剤は、SARS-CoV-2誘発肺炎を軽減し、マウスの肺損傷を防止する。
in vitroの研究から得られた上記の観察が、実際のin vivoでの感染に適用できるかどうかを検証するために、hACE-2ヒト化マウスのSARS-CoV-2感染モデルに立ち返りました。C57BL/6N-Ace2em2（hACE2-WPRE,pgk-puro）/CCLAに、Lor. (10 mg/kg)またはEba. (5 mg/kg)を、5×106 TCID50の用量でSARS-CoV-2（107株）を鼻腔内感染させる1日前にi.p.を通じて投与し、その後、マウスが5 dpiで安楽死するまで5日間毎日Lor.かEba.を投与し続けた（図7a）。
図7】MC安定化剤は、マウスの肺傷害を予防する。
a マウスの処置の説明図である。C57BL／6N-Ace2em2（hACE2-WPRE，pgk-puro）／CCLAマウスに、事前-投与として、Eba．(5mg/kg)またはLor. (10mg/kg）を2×106TCID50のSARS-CoV-2（107株）に鼻腔内感染させる1日前にi.p.で投与し、感染期間中は毎日Eba.とLor.の投与を継続した。各処理群に5匹ずつ、感染および薬物処理を行わないマウス2匹をモックコントロールとして使用した。マウスを安楽死させ、病理学的解析のために肺葉を摘出した： トルイジンブルー染色でMCの脱顆粒を観察し、H.E.染色で肺の傷害を観察した。スケールバー 100 μm. h H.E.スコアおよび(i) 肺切片のMC数（5dpi）. *p < 0.05およびp < 0.01は有意差とみなす。
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未治療のコントロールでは、SARS-CoV-2チャレンジにより気管支周囲にMCが蓄積し、気管支周囲の豊富な放出顆粒と肺胞腔の散乱により、強固なMC脱顆粒が証明された（図7b）。隣接する肺切片のH.E.染色では、肺胞隔壁の肥厚、炎症細胞浸潤、線維性滲出液、ヒアリン膜形成、粘膜落屑、出血などの肺病変が認められた（図7c）。Lor.とEba.の投与は、MCの脱顆粒をブロックし（図7d、f）、肺病変を大幅に軽減した（図7e、g、h、i）。さらに、これら2つのMC安定剤の投与は、IL-6、TNF-α、CCL20、CCL5、IL-8、IL-1β、IFN-γおよびCRPの産生の大幅な減少によって明らかなように、SARS-CoV-2誘導炎症を著しく減衰させた（図8a）。ウイルスの複製もモニターした。各マウスの左葉、右葉上、右葉中、右葉下、肺奇静脈葉からトータルRNAを調製し、ヌクレオカプシド遺伝子の発現を定量化することによりウイルス複製を測定した。Lor.またはEba.の単剤投与では、ウイルス複製は有意に減少しなかった（Fig. 8b）。これらの薬剤は、ウイルス量を減らすことによって間接的にではなく、MCの脱顆粒とその後の炎症を防ぐことによって、SARS-CoV-2が誘発する肺の炎症と傷害を直接的に減らすという考えと一致する。まとめると、これらのデータは、MC安定剤の投与が、SARS-CoV-2誘発の肺の炎症を軽減し、マウスの肺損傷を防止することを実証している。
図8：MCスタビライザーはSARS-CoV-2誘発の炎症を抑える。
C57BL／6N-Ace2em2（hACE2-WPRE，pgk-puro）／CCLAマウスに、事前-投与でEba．(5mg/kg)またはLor. (10mg/kg）を2×106TCID50のSARS-CoV-2（107株）に鼻腔内感染させる1日前にi.p.で投与し、感染期間中は毎日Eba.とLor.の投与を継続した。各処理群に5匹ずつ、感染および薬物処理を行わないマウス2匹をモックコントロールとして使用した。a IL-6、TNF-α、CCL20、CCL5、IL-8、IL-1β、IFN-γおよびCRPのmRNAレベルはq(RT-)PCRで定量化し、gapdh mRNAで正規化した。 b ウイルス複製はヌクレオカプシド遺伝子の発現を定量化することでモニターされた。データは、平均値±SDで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001は有意差とみなす。
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考察
本研究では、SARS-CoV-2による上皮の炎症と肺損傷において、MCが重要な役割を果たすことをin vivoで実証し、in vitroでその可能なメカニズムを明らかにした。SARS-CoV-2以外にも、HCoV-NL63やHCoV-229EのようなコロナウイルスもMCの脱顆粒を誘導する可能性がある。コロナウイルスが誘導するMCの脱顆粒が、上皮の過炎症につながる共通のメカニズムである可能性がある。この点については、さらに調査する価値がある。
MC安定化剤Eba.とLor.がSARS-CoV-2誘発の炎症亢進と肺損傷を抑制することができるという検証は、COVID-19の重症例を治療するための免疫調節剤としてのMC安定化剤の適応外使用を示唆しており、非常に重要です。細胞株における我々のデータは、他のMC安定剤（例えば、クロモグリク酸ナトリウムやフマル酸ケトチフェン）がSpike-RBD誘発MC脱顆粒を阻害する役割を持つことも示している。SARS-CoV-2感染におけるこれらの有益な役割のさらなる臨床試験は、COVID-19患者の肺損傷の治療において大いに役立つであろう。
MCは粘膜に位置するため、SARS-CoV-2をはじめとする病原体の侵入を察知することができる。SARS-CoV-2 Spike-RBDがMCの急速な脱顆粒を誘導するという我々の知見から、MCの活性化とそれに伴う炎症メディエーターの放出は、COVID-19における肺の炎症と損傷の根本原因の1つだと推測される。
本研究で得られたMC脱顆粒による上皮炎症と肺損傷の表現型は、COVID-19患者や感染動物の免疫学的・病理組織学的所見と一致しており、SARS-CoV-2によるMC脱顆粒が、炎症と肺損傷を引き起こす主要因であることを示しています44, 68, 69。また、MCの脱顆粒は、COVID-19の重症度や死亡の独立した危険因子であることが示されているIL-6を含む炎症性サイトカインやケモカインの極めて高いレベルの産生を誘導することがわかった13, 17, 20, 21, 22
Spike-RBDをトリガーとしたMCの脱顆粒は、様々な種類のメタロペプチダーゼを誘導することにより、肺胞バリアを破壊する重要な経路となる。LAD2/RBD上清は肺胞上皮細胞におけるMMP9の発現を促進し、これはCOVID-19患者における循環MMP9レベルの有意な上昇の観察と類似している64,65。急性肺障害において、放出されたMMP9は、おそらくタイトジャンクションタンパクに対する作用を通して、肺胞-毛細血管障壁の破壊を促進することができる66。
SARS-CoV-2によるMCの脱顆粒の放出成分には、ChymaseとTyptaseが含まれており、ウイルスによる肺胞上皮細胞や毛細血管内皮細胞の永久損傷を説明するのに使用することができる。炎症や病的状態において、活性化したMCから放出されたChymaseは、局所的なアンジオテンシン-2濃度を増幅し、炎症性白血球の動員や内皮機能障害を誘発し、肺血管透過性をさらに高めて肺障害を引き起こす可能性がある70、71。デングウイルスなど他の種類のウイルスも、ChymaseやTyptaseの放出を誘発し、内皮細胞のタイトジャンクションを破壊して血管透過を促進すると報告されてる72。
SARS-CoV-2感染では、細胞周期キナーゼ（CDK1/2/5、AURKAなど）の発現を抑制し、細胞周期のS期とG2期の間で細胞周期を停止させることが知られている 68,73 。また、LAD2/RBD上清は、細胞骨格/微小管関連タンパク質およびミオシンをコードする遺伝子の発現を直接抑制することができ、MC脱顆粒が細胞骨格組織の変化を誘導することが示唆された。この実験結果は、SARS-CoV-2感染によって細胞骨格・微小管組織の変化が引き起こされるという臨床的な観察結果と一致するものである68, 73。
Spike-RBDの刺激がMCの脱顆粒を誘発することから、SARS-CoV-2のMCへの感染と複製は、必ずしも脱顆粒の誘発に必要ではないようである。MC細胞はACE2受容体を発現しており、SARS-CoV-2の複製に寛容である。MCにおけるSARS-CoV-2の複製が、二次放出のための炎症性メディエーターのde novo合成につながるかどうかは、さらに調査する価値がある。さらに、SARS-CoV-2が誘発するMCの脱顆粒は、高齢者における疾患の重篤度を説明するために用いられる可能性もある。我々は、SARS-CoV-2が高齢のCRMsにおいてより強固なMC脱顆粒を誘導することを発見し、これは高齢の成人およびRMsにおけるより激しいサイトカインストームと高い免疫細胞浸潤に関連していると考えられる52、69、74、75。
本研究の限界は、Eba.またはLor.の単独投与では、ACE2ヒト化マウスの肺におけるウイルスの複製を直接抑制する効果が低いことである。RNAポリメラーゼ阻害剤であるRemdesivirやFavipiravirなどの抗ウイルス剤とMC安定化剤を併用することで、炎症の抑制とウイルスの除去を同時に行う、より最適な治療戦略を提供できるかもしれません。
以上、SARS-CoV-2が肺MCの脱顆粒を誘発し、ヒト肺胞上皮細胞の様々な細胞シグナルのリモデリングを誘導すること、特にMC脱顆粒が肺胞上皮の炎症を誘発し、結果としてタイトジャンクション蛋白の破壊につながることを明らかにした。また、臨床的に用いられているMC脱顆粒安定化剤のEba.とLor.がウイルスによる炎症性因子の生成を抑制して肺損傷を予防するのに強力な薬剤であることが明らかにされた。今回の発見は、SARS-CoV-2感染が肺胞上皮の炎症を引き起こし、肺傷害を誘発するという、潜在的に新しいメカニズムを明らかにするものである。また、COVID-19の重症例に対する免疫調節薬として、MC安定化剤の適応外使用の可能性を示唆するものである。
材料と方法
倫理規定
すべての動物実験は、中国科学院広州生物医学健康研究所および昆明動物学研究所、広州医科大学第一附属病院の機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得ている。また、SARS-CoV-2動物モデル実験とプロトコルは、バイオセーフティ担当者と施設管理者と明示的かつ広範囲に議論された。すべての動物実験と野生型ウイルスは、動物バイオセーフティレベル3（ABSL-3）施設内で実施された。
細胞およびウイルス
ヒト肥満細胞LAD2およびヒト非小細胞肺がん細胞H1299は、10％脂肪牛血清（FBS）（ギブコ）を含むRPMI1640培地（ギブコ）で、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを加えて培養した。ヒト肝細胞株Huh-7は、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含む10％FBS（Gibco）入りDMEM培地（Gibco）で培養した。脱顆粒のために、LAD2細胞は、100μg/ml幹細胞因子（Novoprotein）、100μg/ml IL-6（Novoprotein）、栄養剤（NS）（Gibco）、100U/mlペニシリン（Invitrogen）、100μg/mlストレプトマイシン（Invitrogen）および2mM L-Glutamine （Gibco）を補うStemPro-34培地で培養した。腺癌ヒト肺胞底上皮細胞（A549）は、10％FBS（Gibco）を含むDMEM／F12培地（Gibco）に100U／mLペニシリンおよび100μg／mLストレプトマイシンを添加して培養した。
SARS-CoV-2の107株は、中国広東省疾病管理予防センターから提供された。コロナウイルスHCoV-NL63（NR-470）およびHCoV-229E（VR-740）は、米国型文化コレクション（ATCC）から購入した。擬似型ウイルスは、Spike発現プラスミドpcDNA3.1-2019-nCoV-S-IRES（2019-nCoV WIV04株）およびpNL4-3でHEK293T細胞をEZ Trans cell transfection reagent（ライフアイラボ、AC04L082）-仲介により共トランスフェクションして生成した。Luc.ΔRΔE.80これら2つのプラスミドは、Lu Lu博士（復旦大学、上海、中国）より提供された。ウイルス粒子を含むトランスフェクト細胞の収穫した上清をアリコートし、-80℃で保存した。
ACE2-ヒト型マウスおよびアカゲザルの実験
3〜4ヶ月齢のC57BL/6N-Ace2em2（hACE2-WPRE,pgk-puro）/CCLAマウスは、中国科学院広州生物医学健康研究所から提供された。47 マウスを各グループにランダムに割り当て、雌雄比は1：1だった。マウス（各群5匹）にSARS-CoV-2（107株）（5×106 TCID50）を指示時間、鼻腔吸入感染させた。モック感染として、同量のPBSを接種した。一部のマウスでは、感染の1日前にエバスチン（5 mg/kg）またはロラタジン（10 mg/kg）（いずれもSigma-Aldrich製）を投与し、感染期間中は毎日投与を続けた。安楽死当日に肺を採取し、病理学的、ウイルス学的、免疫学的解析を行った。
Ad5-hACE2を導入したBALB/cマウスについて51、特定の病原体を持たない6-10週齢の雄雌（比＝1：1）BALB/cマウスをイソフルランで軽く麻酔し、75μL DMEM中のAd5-ACE2 2.5 × 108 fluorescence focus unit（FFU）で経鼻的に導入しました。形質導入後5日目に、総量50μLのDMEM中、7×104 TCID50 SARS-CoV-2でマウスを経鼻感染させた。モック感染として、同量のDMEMを接種した。この実験で使用したSARS-CoV-2株は、広州のCOVID-19患者から分離した（アクセッション番号：MT123290）。指示された時間に、組織学的分析のために、安楽死の日にマウスの肺を収集した。
サル研究については、若齢群（3〜6歳）および高齢群（17〜19歳）を含む8匹の中国アカゲザル（chRM）（Macaca mulatta）（すべて雄）をZoletil 50（Viabac、フランス）により麻酔し、気管支鏡により2mL容量のSARS-CoV-2（ウイルス染色107）（1 × 107 TCID50）で、気道内接種をした。動物は7dpiまたは15dpiで安楽死させ、組織学的解析のために肺葉を採取した52。
組織学的解析
動物の肺を亜鉛ホルマリンで固定した。ルーチン組織学では、組織切片（～4μm）をヘマトキシリン・エオジンまたはトルイジンブルーで染色した。切片はMotic Digital Scanning装置（BA600Mot-4C-VM）を用いて分析した。肺胞隔壁の肥厚、出血、炎症細胞の浸潤、圧密などの肺組織病変の程度に応じて病理学的スコアを評価した。半定量的評価は以下のように行った47。0：肺胞隔壁肥厚がない、1：肺胞隔壁肥厚が非常に軽度で、肺胞隔壁肥厚、出血、炎症細胞浸潤の面積が10%未満、2．肺胞中隔肥厚が軽度の場合、肺胞中隔肥厚、出血、炎症細胞浸潤の面積は10～25％、3：肺胞中隔肥厚が中程度の場合、肺胞中隔肥厚、出血、炎症細胞浸潤、ヒアル膜形成、粘膜脱落、繊維性滲出液の面積は25～50％、4．肺胞中隔肥厚が著明な場合、肺胞中隔肥厚、出血、炎症細胞浸潤、ヒアリン膜形成、粘膜脱落、線維性滲出液の面積は50～75％、5：肺胞中隔肥厚が非常に著しい場合、肺胞中隔肥厚、出血、炎症細胞浸潤、ヒアリン膜形成、粘膜脱落、線維性滲出液の面積は75％を超えています。
Spike-RBDタンパク質のLAD2細胞への結合性
LAD2細胞（3×105）を、付着性緩衝液（1mM CaCl2, 2mM MgCl2, 5% BSA, pH7.4）中でSpike-RBDタンパク質（5 μg/mL, Genscript, Z03483 ）と4℃で1時間インキュベートした。その後、4％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）で室温で30分間固定し、抗His-tag抗体（Abmart, M30111S）で染色を行った。その後、ヤギ抗マウスAlexla Fluor 488標識二次抗体（Invitrogen, A11001）で染色し、フローサイトメトリー（BD Accuri C6）で検出し、FlowJo 7.6.1 ソフトウェアを用いて解析しました。一部の実験では、Spike-RBDタンパク質とのインキュベーションの前に、LAD2細胞を抗ACE2抗体（5 μg/mL, R&D Systems, AF933）で37℃、1時間事前にブロックした。
LAD2細胞のデグランジュレーション
LAD2細胞（3×105）を、Spike-RBDタンパク質（Genscript）（5μg/mL）、ヌクレオカプシドタンパク質（5μg/mL）、SARS-CoV-2 (M.O.I. = 1) (strain 2019-nCoV WIV04) またはHCoV-NL63 (ATCC, NR-470) and HCoV-229E(ATCC, VR-740) (M.O.I. = 1) に示した時間さらした。マスト細胞脱顆粒活性化化合物48/80（C48/80）（4μg/ml）（Sigma, C2313）を対照として用いた。細胞を4％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）で室温で30分間固定し、PBSで3回洗浄した後、細胞を4℃の透過性緩衝液（PBS中1％FBSおよび0.2％Triton X-100）で希釈した抗avidin-FITC（500 ng/mL, Invitrogen, A821）と1時間インキュベートし、洗浄後にBD Accuri C6で細胞を検出、FlowJoで分析した。一部の実験では、ロラタジン（5μg/mL、Selleck）、エバスチン（3μg/mL、Selleck）、フマル酸ケトチフェン（40μg/mL、Yuanye Biology、中国、S46226）、またはクロモグラ酸ナトリウム（10μg/mL、Sigma、15826-37-6）を用いてSpike-RBDタンパク質での刺激前に20時間細胞を前処理した。LAD2細胞培養上清を採取し、ELISAキットでChymaseとTryptaseの放出成分を製造者の指示機器（Lunchangshuo Biotech, Tryptase: SU-B10563; Chymase: SU-B16617）に従って定量化した。
炎症性サイトカインアッセイ
A549細胞（3×105）をLAD2培養上清（250μL）で24時間処理し、細胞を採取した。サイトカインは、mRNAの産生を定量化するか、特異的抗体を用いた細胞内免疫染色により決定した。免疫染色アッセイでは、A549細胞にBD GolgiPlug（BD, 550583）を含む白血球活性化カクテルを加えて6時間培養し、活性化後にFACSバッファーで細胞を洗浄した。BD Cytofix/Cytoperm solution (BD, 554722)を用いて、細胞内サイトカイン染色前に4℃で20分間、細胞の固定と透過を同時に行った。Perm/Washバッファーで希釈した抗体を加え、さらに細胞を4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析（BD LSRFortessa）を行った。サイトカイン抗体は、フローマーカーに対するものを使用した： Alexa Fluor 647-IL-1β (Biolegend, JK1B-1), PE-IL-6 (BD, MQ2-6A3), BV421-IL-8 (BD, G265-8).
リアルタイム（RT-）PCR
TRIzol Reagent（Invitrogen）を用いて細胞からTotal RNAを抽出し、製造者の指示に従い、合成Kit（東洋紡、FSQ-301）を用いてcDNAに逆転写させた。リアルタイムPCRは、SYBR qPCR Mix（Genestar、A33-101）を用い、以下の熱サイクル条件：95℃で2分間の初期変性、95℃で15秒の変性、60℃で15秒のプライマーアニーリング、72℃で30秒の伸長の40サイクルで増幅し、データはSYBR greenベースの半定義により解析し、GAPDHで正規化した。リアルタイムPCRは、Bio-Rad CFX96 Real-Time PCRシステムで実施した。マウス抽出RNAは、THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit（東洋紡）を用いてヌクレオカプシド遺伝子SARS-CoV-2のコピー数を測定するために用いた。標準試料は、中国国家計量研究所から購入した。RT-）PCR のプライマーとプローブは、補足表 1 に記載した。
ウェスタンブロッティング
LAD2細胞またはA549細胞を、溶解バッファー（Beyotime）中で4℃、1時間溶解させた。12,000gで10分間遠心分離した後、上清を還元性SDSサンプルローディングバッファで煮沸し、SDS-PAGEで分析した。ウェスタンブロッティングには、抗ACE2抗体（Abcam、EPR4435）、抗MMP9抗体（シグナル抗体、JA80-73）、抗GAPDH抗体（Abcam、ab82633）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識二次抗体を使用した。
フローサイトメトリー
LAD2におけるACE2の発現は、PE標識ウサギ抗ACE2（Bioss、bs-1004R）で免疫染色し、フローサイトメトリー（BD Accuri C6）で検出することにより決定した。A549細胞におけるタイトジャンクションタンパク質ZO-1、Occludin、Claudin-5およびJAM2の検出のために、細胞をPBS中の5％BSAで室温で1時間ブロックした後、一次抗体と4℃で2時間インキュベートした。ZO-1（Invitrogen、402200）、Occludin（Invitrogen、OC-3F10）、Claudin-5（Invitrogen、4C3C2）およびJAM-2（Abcam、EPR2489）、に対する一次抗体を使用した。ZO-1細胞内染色には透過剤（PBS中1％FBSおよび0.2％Triton X-100）を使用した。細胞をFACSバッファーで洗浄した後、Alexa Flour 488標識ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスIgG（Invitrogen、A11034；Invitrogen、A11001）と4℃で1時間インキュベートし、フローサイトメトリ（BD Accuri C6）で細胞を分析した。
RNA配列決定とデータ解析
A549細胞をLAD2細胞培養上清で24時間処理し、Trizol（Invitrogen）を用いて製造元のプロトコルに従って全RNAを抽出し、QIAseq FastSelect-rRNA HMR Kits（QIAGEN、ドイツ）を用いてリボソームRNAを除去した。断片化したRNA（平均長〜200 bp）を、NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB、米国）の説明書に従って、一本鎖および二本鎖cDNA合成を行い、アダプターライゲーションとローサイクルによる濃縮を実施しました。精製されたライブラリー産物は、Agilent 2200 TapeStationとQubit2.0 (Life Technologies, USA)を用いて評価した。ライブラリーは、Guangzhou RiboBio Co, Ltd.でペアエンドシーケンス（PE150、シーケンスリードは150bp）を行った。(広州、中国）において、Illumina HiSeq 3000プラットフォームを使用してペアエンドシーケンスを行った。
RNAシーケンス（RNA-seq）リードは、Trimomatic v0.36を使用してフィルタリングした。フィルタリングされたリードは、HISAT v2.1を用いてヒト（hg38）参照ゲノムにマッピングし、対応する遺伝子アノテーション（GRCh38.p13）をデフォルト設定で使用しました。SubReadsパッケージv1.5.3のfeatureCounts関数を用いて、デフォルトのパラメータでマップされた遺伝子ごとの総カウントを求めた。次に、Rv4.0のbioconductor package DESeq2 v1.26で、featureCountsで得られたcounts matrixを差分発現遺伝子解析の入力として使用した。単一サンプルで5リード以上、または全サンプルで50リード以上の遺伝子カウントは、さらなる解析のために保持された。フィルタリングされたカウントマトリックスは、DESeq2メソッドを使用して正規化し、ライブラリ固有のアーチファクトを除去した。主成分分析は、Rソフトウェアのビルドイン関数prcompを使用して、グローバルなトランスクリプトームデータに基づいて行われた。log2 fold change >1または< -1、Benjamini-Hochberg法を用いた多重検定で補正した調整p < 0.05を持つ遺伝子を有意とみなした。転写因子濃縮解析と機能濃縮解析は、Metascape server tool81（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）を用いて実施した。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、RパッケージclusterProfiler v3.18.1を用いた。DEGのタンパク質間相互作用（PPI）ネットワークは、STRING v11を用い、信頼スコア閾値を0.7として構築し、Cytoscape v3.8.1を用いて可視化した。
統計解析
統計解析には、Graphpad Prism 8.0を使用した。グループ内直接比較では、Student's unpaired two-tailed t testを実施し、有意差を解析した。複数群の比較には、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を実施した。
データの利用可能性
本研究で使用したすべてのRNA-seq生データは、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA741047 に寄託されています。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
試薬の親切な贈り物をしてくださったLu Lu博士に感謝します。本研究は、NSFC（82172242、81873965）、中国国家重点研究開発計画（2020YFC0842000）、中国広州市呼吸器病国家重点実験室（SKLRD-OP-202207）からの助成金により行われた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
著者情報
著者および所属
河南師範大学生命科学学院（中国、453007、新郷市
Meng-Li Wu、Guo-Ying YuおよびJunbiao Chang
中国科学院動物モデル・人体疾患メカニズム重点実験室、中国科学院昆明動物学研究所、昆明、650223、China
劉鳳亮、何暁燕、鄭宏毅、鄭永棠（Yong-Tang Zheng
呼吸器疾患国家重点実験室、呼吸器疾患国家臨床研究センター、広州医科大学第一附属病院呼吸器衛生研究所、広州、広東省、510182、中国
孫静・趙錦雲
中国科学院広州生物医学健康研究所、広州、510530、中国
Xin Li、Yan-Heng Zhou、Qihong Yan、Ling Chen、Xin-Wen Chen、Jian-Hua Wang
広州再生医療健康広東実験室バイオランド実験室 〒510005 広州市広東町1-1-1
何暁燕、陳欣文、鄭永棠（Yong-Tang Zheng
復旦大学附属上海公衆衛生臨床センター（中国・上海市）201508
Xia Jin
中国科学院大学、北京、100039、中国
王 建華
寄稿文
コンセプトの立案： J.H.W. データキュレーション： M.L.W., F.L.L., X.L., X.Y.H., and H.Y.Z. 形式的解析： 可視化：M.L.W.、J.H.W.： M.L.W., F.L.L., X.Y.H., Y.H.Z. Resources： ソフトウェア：J.H.W., J. Z., J.S., Y.T.Z., X.W.C., F.L.L., L.C., G.Y.Y., and J.C： Q.Y., L.C. Writing-orginal draft： 執筆-原案：M.L.W.、J.H.W. 執筆-査読-編集：X.J., J.H.W： プロジェクト管理：J.H.W.、X.J.、J.H.W： 監督：J.H.W., Y.T.Z., and X.W.C. 資金獲得： J.H.W： J.H.W.とY.T.Z.すべての著者がこの論文を読み、承認した。
対応する著者
Xin-Wen Chen、Yong-Tang Zheng、Jian-Hua Wangに連絡すること。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
補足情報
補足図と表
権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可について
この記事について
この記事を引用する
Wu, ML., Liu, FL., Sun, J. et al. SARS-CoV-2-triggered mast cell rapid degranulation induces alveolar epithelial inflammation and lung injury. Sig Transduct Target Ther 6, 428 (2021). https://doi.org/10.1038/s41392-021-00849-0
引用文献をダウンロードする
2021年8月28日受領
改訂2021年11月15日
2021年12月02日受理
2021年12月17日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41392-021-00849-0
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対象分野
感染症
微生物学
この記事の引用元
三種混合ワクチン接種（ファイザー）患者におけるオミクロンBA.5.1重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2感染後の蕁麻疹：症例報告
カール・シウデリス（Karl Ciuoderis
ラウラ・ペレス
ホルヘ・E・オソリオ（Jorge E. Osorio
メディカルケースレポート誌（2023年）
SARS-CoV-2，SARS-CoV，MERS-CoVの哺乳類間における比較感受性について
李 孟
杜 娟
周旭明
ISMEジャーナル(2023)
COVID-19患者における重篤な肺障害の発症における肥満細胞の役割
アンドレイ・V・ブドネフスキー
セルゲイ・N・アヴデーエフ
インナ M. ペルヴェーエワ
呼吸器研究 (2022)
COVID-19ワクチン開発：マイルストーン、教訓、展望
マオチェン・リー
ハン・ワン
ファン フアハオ
シグナルトランスダクションと標的治療（2022年）
シグナル伝達と標的治療（Sig Transduct Target Ther） ISSN 2059-3635 (オンライン)
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