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VOL.9へ戻る 9, NO. 45
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微生物学
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ヒト尿路上皮微小組織モデルから、尿路病原体と常在菌の間で共有されるコロニー形成と生存戦略が明らかになる

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adi9834

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CARLOS FLORES HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-9178-6939, JEFFERSON LING HTTPS://ORCID.ORG/0009-0008-5630-5002, [...], AND JENNIFER L. ROHN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-8766-6056 +5著者著者情報・所属機関
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8 11月 2023
9巻 45号
DOI: 10.1126/sciadv.adi9834
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要旨
尿路感染症は世界的に最も一般的な感染症の一つであり、通常、尿路病原株を限定した動物や細胞株で研究されている。ここでは、完全な層別化、分化、生得的上皮反応、尿耐性を示すヒト尿路上皮微小組織モデルを用いて、多様な細菌種を評価した。いくつかの尿路上皮病原体は細胞内に侵入したが、常在性大腸菌も同様であったことから、侵入は単に病原性の特徴ではなく、共有の生存戦略であることが示唆された。大腸菌アドヘシンFimHは細胞内細菌群集形成に必要であったが、侵入には必要ではなかった。その他の共通した生活様式としては、フィラメント形成（グラム陰性菌）、連鎖形成（グラム陽性菌）、剥離細胞の乗っ取りなどがあり、バイオフィルム様凝集体は主にシュードモナスとプロテウスで形成された。尿路上皮細胞は、Rab/LC3によって装飾された構造体の中に侵入した細菌を排出した。一方、常在菌ではなく、細胞毒性の高い/侵入性の尿路病原体は、宿主のバリア機能を破壊し、剥離とサイトカイン産生を強く誘導した。全体として、この研究は、ヒト尿路上皮微小環境における多様な種特異的／株特異的感染戦略とそれに対応する宿主応答を明らかにし、微小組織、細胞、分子レベルでの知見を提供するものである。
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はじめに
尿路感染症（UTI）は、最も一般的なヒトの細菌感染症の一つであり、6ヵ月以内の再発率は〜30％で、抗生物質の性能が最適でないことを浮き彫りにしている(1)。予防を含む治療が繰り返されるため、尿路結石は世界的な抗菌薬耐性の危機を悪化させている(2, 3)。顕著な罹患率、生活の質の低下、死亡率とともに、尿路結石症は世界中の医療制度にとって大きな経済的負担となっている(1)。
マウスモデルやマウス/ヒト膀胱・腎臓細胞株は、宿主と尿路病原体の相互作用、特に最も一般的でよく研究されている原因菌のひとつである尿路病原性大腸菌（UPEC）の場合について、理解を深めるのに役立っている(4)。マウスの膀胱や尿路上皮細胞（T24、5637、SV-HUC-1など）に付着した後、多くの研究により、細菌の侵入と細胞内細菌群集（IBC）の重要な病原性の役割が確立された。IBCは、糸状菌の形態を放出しながら噴出するさやのような形態をとることがあり、それと並行して、上層の細胞層が剥離することで、細菌がより深く侵入し、静止した細胞内細菌リザーバーが形成される（5）。しかし、これらのモデル系以外では、私たちの知る限り、患者の膀胱壁に直接組織内/細胞内細菌が存在することを報告した研究は1件のみであり（6）、他の研究では、患者の尿から排出された尿路上皮細胞に散発的に細菌が同定されている（7-10）。従って、この分野における重要な疑問は、細胞内侵入がヒトにおいてどの程度一般的で、どのようにして達成されるのかということである。これまでにいくつかの病原性因子が同定されており、特に尿路上皮病原性フィンブリアは、広く研究されているタイプ1ピラスやその先端接着剤であるFimHのように、複数の感染ステップに関与している(5, 11-13)。そのため、FimHは過去数十年間、抗生物質の代替品開発のターゲットとしてよく使われてきたが、やはりヒトの高度な細胞環境でのさらなる研究が必要であろう（14, 15）。
一般的に研究されているUTI89株やCFT073株以外のUPECや、感染していない人の膀胱や尿から分離された常在菌、あるいは感染の徴候や症状を引き起こすことなく膀胱内で高レベルまで増殖する大腸菌83972（HM50）のような無症候性細菌尿（ASB）株などの非病原性尿路結核菌については、さらに不確かである。主にHM50を用いたin vitro、二次元（2D）系、マウスモデルでのいくつかの研究により、UTI株と非UTI株との間の遺伝子型や表現型の違いだけでなく、常在菌とASB株との間にも大きな不均一性があることが示されている(16-20)。さらに、大腸菌以外の菌種もまれではなく、特に多菌感染が多い高齢者や、緑膿菌（PA）、プロテウス・ミラビリス（PM）、腸球菌属（Enterococcus sp.）、肺炎桿菌（KP）などが繁殖する病院やカテーテル留置患者ではその傾向が強い。
感染した患者の上皮細胞では、尿路上皮の深部で何が起こっているかを明らかにすることはできないし、感染した患者から尿路上皮の生検を行うことには倫理的な問題があることを考えると、尿路結石症の理解におけるこれらのギャップを埋めるのに役立つ高度なヒト細胞モデルが必要である。尿路上皮の層別化、分化、そして先端尿の存在は、侵入してくる病原体にとってユニークなインターフェースを作り出すが、これはヒト癌細胞株ではエミュレートできない。一方、この分野で使用されている主な動物モデルであるマウスには明らかな利点があるが、マウスとヒトの尿路上皮の間には、細胞層の厚さや数、組織分化バイオマーカー、自然免疫プレイヤー、尿濃度など、重要な超微細構造的・生理学的種差が存在する(21)。このような問題から、最近、補完的なアプローチとして、ヒト細胞ベースの3D尿路上皮モデルやオルガノイドがいくつか開発された(22-25)。
ここでは、完全なヒトの層別化と分化を含む重要なヒト尿路上皮の特徴を再現し、自然上皮免疫応答と並んで、100％ヒト尿環境での実験を可能にする、頑健な3Dマイクロ組織モデル［3D尿耐性ヒト尿路上皮（3D-UHU）］を展開し、複数の種における尿路病原体と宿主の相互作用の広範な側面を研究した。(i)UPECの臨床分離株やFimHアドヘシン変異体がこのモデルに侵入し、IBCを形成するかどうか、(ii)常在性大腸菌がこの環境にどのようにコロニーを形成するか、(iii)グラム陽性尿路病原体とグラム陰性尿路病原体がどのような戦略を用いるか、(iv)ヒトの微小組織が尿路病原体と常在性尿路病原体の両方にどのように反応するか。その結果、病原体と非病原体の間で共有される戦略（例えば、剥離細胞への侵入と乗っ取り）を伴う、時間的、種特異的、株特異的な多様性が明らかになった。さらに、宿主の反応は通常、侵入や組織バリアの破壊、剥離といった特定の細菌の戦略と相関していた。全体として、このモデルは、細胞レベルと尿路上皮組織レベルの両方において、複雑な微小環境におけるヒトの宿主と尿路上皮病原体の相互作用に関する洞察を提供する。
結果
UPECはヒト尿路上皮微小環境において株特異的な形態と浸潤表現型を示す
ヒトの主要な特徴（図S1、A～D）（25）を再現した3D-尿路上皮微小組織モデル（図1、AおよびB）を作製した、 (ii)3つの主要な尿路上皮下層-基底細胞、中間細胞、および先端傘細胞（終末分化マーカーを発現）の分化、(iii)グリコサミノグリカン（GAG層）の先端産生、(iv)強固なバリア機能、および(v)長期間の100％耐尿性（1ヶ月まで試験）。まず、UPECの尿中感染時の挙動を、よく知られている膀胱炎株（UTI89）と腎盂腎炎株（CFT073）（図1C）と、臨床的なUTI分離株（表S1）であるEC10とEC6（パンデミッククローンST131）、およびClinAと並べて調べた。予想通り、尿中では体力がやや低下していたものの、すべての菌株が増殖し、個体数を維持することができた（図S2A）。3D-UHUでは、感染後3時間（hpi）以降、細菌は主に先端尿路上皮表面に散在し、個体数は時間の経過とともに増加した（図S2B）。6時間後からは、CFT073、UTI89、EC10が浸潤を開始し、その後、主に12時間後に感染多重度（MOI）50～100で噴出しうる大集団（IBC）の形成を伴い（図1、DおよびE）、細胞内細菌は抗生物質防御アッセイで評価した106コロニー形成単位（CFU）/ml超に達した（図2A）。対照的に、ClinAとEC6は、侵入することはできたが、ほとんど凝集せず、細菌負荷の低い細胞内分離菌（図S2C）のままであった（106 CFU/ml以下；図2A）。散発的に、3D-UHUアピカル表面に、主にUTI89でバイオフィルム様の凝集体が見られたが（図S2D）、細長い細菌やフィラメントは、試験したすべてのUPECで見られ、時にはIBCの噴出を伴っていた（図1E）。

図1. ヒト尿路上皮モデル3D-UHUにおけるUPEC感染。
(A）3D-UHUの展開と細胞外細菌と細胞内細菌の染色の模式図。Abは抗体。(B）未感染モデルの3Dビュー。(C）UPECのCFT073とUTI89（黄色）による12時間後の3Dビュー。(D）UPECのCFT073（左）、UTI89（中）、EC10（右）による浸潤とIBC形成（破線）。矢印は細胞内の凝集していないUTI89を示す。(E）UPECのIBC噴出（12 hpi、MOI 50）。点線はEC10を露出させたポッド状構造を示し、UTI89については発芽フィラメントが観察される。黄色は細胞外細菌、青色は宿主核（n）および細菌（細胞内および細胞外）のDNA、赤色はF-アクチンまたは細胞膜（CM）。共焦点顕微鏡（(B)～(D)および(E)、左）および走査型電子顕微鏡（SEM）（(E)、右）。

図2. 細菌の侵入とUPEC∆fimHの表現型。
(A）非病原性大腸菌（COM1、COM3、HM50）、UPEC（ClinA、EC10、 CFT073、および各∆fimH変異体）、およびKPをMOI 100［検出限界（LOD）＝0 CFU/ml］で12 hpiにゲンタマイシン保護アッセイで定量した細胞内細菌。データは4つの独立した生物学的複製（N = 4）の平均としてプロットした。(B）EC10およびCFT073バックグラウンドにおける∆fimHによるIBC形成を伴わない浸潤（矢印）。ハサミは隣のパネルの∆fimH EC10の側面図の断面の位置を示す。染色は図1と同様。共焦点画像は、1株につき最低4つの独立した生物学的複製を代表するものである（N≥4）。
UPECによる尿路上皮損傷は、その侵入行動と一致しており、CFT073が最も強い影響を及ぼし、UTI89がこれに僅差で続いた：非感染対照と比較して、バリア透過性が約6倍増加し（図3A）、細胞毒性が約20％増加した（図3B）。対照的に、臨床 UPEC分離株EC6とClinAは、細胞毒性（～8％）と透過性（3～4倍の変化）の両方に弱い影響を与えた。

図3. 3D-UHU組織の完全性に対する細菌の影響。
(A)フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン(4 kDa)透過性アッセイによる感染前後の3D-UHUバリア機能評価。相対蛍光単位（RFU）は基底チャンバーで24時間にわたって測定した。データは生物学的四重反復（N = 4）の平均値±SEとしてプロットした。挿入図は最終時点の比較。****p < 0.0001; ***p < 0.001。(B）乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイで評価した、本研究で使用した尿路病原体および非UPECによる細胞毒性、12 hpi。データは生物学的3反復（N = 3）の平均値±SEとしてプロットした。****p < 0.0001; ***p < 0.001; *p < 0.1。
UPEC FimHはIBC形成に重要であるが、浸潤には必須ではない
UPECのFimHアドヘシンは、細胞株やマウスにおけるさまざまな感染段階に重要であることが示されたので（5, 12）、われわれは、われわれのモデルにおける2つの異なるO抗原UPEC血清型、CFT073（O6）とEC10（O25b）について、その役割を調べた。FimHアドヘシンノックアウト株は、親株と比較して有意に損なわれていたものの、浸潤（〜104 CFU/ml）を示した（図2A）が、いずれの変異株も大きなIBCを形成せず、細胞内ではほとんど孤立したままであった（図2B）。さらに、CFT073 ∆fimH は、親株と同程度の細胞毒性を引き起こしたが、3D-UHU 透過性の障害は少なかった（～3～4 倍の増加；図 3A）。
内在性大腸菌は、侵入、糸状化、剥離細胞の乗っ取りを含む生存戦略をUPECと共有している。
UPECの細胞内侵入は、マウスモデルや細胞株における病原性の特徴であると長い間考えられてきた（5）。私たちは、実験室株MG1655、よく解析されたASB株HM50、および感染していないボランティアのクリーンキャッチ中流尿サンプルから分離された5種類の遺伝的に異なる常在性大腸菌（以下、便宜上「常在菌」と呼ぶ）を用いて、ヒトの微小組織モデルでこの点を検討した： COM1からCOM5である（表S1）。COM1とCOM5は、異なるとはいえ、傘の細胞に侵入することができた： COM1は頻繁に侵入し（〜107 CFU/ml；図2A）、いくつかのUPECに匹敵するIBCを形成した（図4A、上）が、COM5は散発的にしか侵入せず、大きな群集を形成することなく孤立したままであった（図4A、下、および図S2C）。HM50による浸潤もごくまれに検出されたが、そのほとんどは剥離細胞で、その範囲は0～～103 CFU/mlであった（図2A）。HM50は機能的な1型繊毛を産生しないことから(17)、この所見もFimHが浸潤に必須ではないことを裏付けている。他の常在細菌の多くも、まばらに繊毛が生えていた（図S3）。COM2、COM3、COM4、およびMG1655は先端表面にのみ観察され、細胞内のCOM3はゲンタマイシン保護アッセイでは検出されなかった（図2A）。

図4. 3D-UHUにおける非UPECのコロニー形成戦略と形態。
(A）12時間後の常在菌による浸潤、IBC形成を伴うCOM1（破線）、および細胞内に単離されたCOM5（矢印）。B）12時間後の大腸菌のサイズ分布。黒線はロッド（濃い灰色）とフィラメント（薄い灰色）のサイズの平均値、円グラフは1株あたりN = 1000菌における各グループの割合。(C)常在性大腸菌COM2、COM3、COM4、COM5による12 hpiでの菌膜小胞形成（bv）と菌核（*）を伴うフィラメント形成。(D）剥離細胞下面へのCOM2、HM50、COM4による接着。点線はHM50が下にある細胞の端を示す（矢印）。右下： 死にかけた細胞を取り囲むCOM1。共焦点像（(A)、(C)、(D)、右上）とSEM像（(D)、左と下）は、1株につき最低4つの独立した生物学的複製を代表する（N≥4）。
一方、フィラメントの形成は非UPEC株では極めて一般的で、非浸潤株でも3～24 hpiの間に観察された（図4、BおよびC）。平均菌体長（～1～2μmのロッドと～8～10μmのフィラメント）は、UPEC株と非UPEC株で同程度であったが、ロッドに対するフィラメントの割合には株ごとのばらつきがあった（図4B）。COM3では、細菌集団はほぼ完全に糸状菌であり（約85％）、平均サイズが長かった（3μmを超えるロッドと9μmを超えるフィラメント）が、付着力が弱く、容易に洗い流された。FimH接着因子をコードしているにもかかわらず、COM3は、HM50と同様に、fimおよび他のオペロンを配列決定した後に検出された変異により、おそらく機能的なタイプ1繊毛および他の繊毛を欠いており、また血球凝集能の欠如からも支持される（図S4）。さらに、損傷を受けていない傘細胞層の上での非UPECによるフィラメント形成は、多くの場合、細菌ヌクレオイドの肥大化（例えば、房状化）や膜の小胞形成を伴っていた（図4C）。UPECとは異なり、ほとんどの非UPECは3D-UHUにほとんどダメージを与えなかったが、IBCを形成するCOM1は例外で、中程度のバリア透過性の喪失を引き起こしたが（図3A）、有意な細胞毒性は認められなかった（図3B）。しかし、大腸菌に共通する表現型は、剥離および/または死滅する細胞の裏側に付着/コロニー形成することであった（図4D）。
グラム陽性およびグラム陰性尿路病原体は、ヒト尿路上皮微小環境において特異的な挙動を示す
大腸菌の多様性を考慮し、次に3D-尿路上皮微小環境における他の一般的な尿路病原体、すなわちグラム陽性のEnterococcus faecalis（EF）とStreptococcus agalactiae（SA）、およびグラム陰性のKP、PA、PMの挙動を調べた。まず、PMはUPECよりもさらに顕著に尿路上皮のバリア機能を84％低下させ（図5A）、細胞毒性を約35％増加させた（図3B）。PAとKPは細胞毒性が少なく（それぞれ18％と14％）、ほとんどのUPECに匹敵し、次いでEFが続いたが、SAは3D-UHUに対する影響が最も弱く、感染していない対照と同程度であった（図3Bと5A）。さらに、SA（図5B）とKP（図6A）を除き、すべての病原体が尿路上皮表面の広大な領域にコロニーを形成したが、これらは長期間経過してもまばらに分布していた。KPは宿主膜のフチの中か、スパイク状の突起に囲まれていた（図6A）。SAでは、細胞膜が損傷した傘状細胞の上に小さな集合体として、6時間後に離散的な鎖状ニッチが見つかった（図5Bおよび図S5A）。

図5. 3D-UHU透過性とグラム陽性尿路病原体による感染に対する非UPEC尿路病原体の影響。
(A）FITC-デキストラン（4 kDa）透過性アッセイにより評価した、非UPEC尿路病原体感染後の3D-UHUバリア機能。蛍光は基底チャンバーで24時間にわたって測定した。データは生物学的3反復の平均値±SEとしてプロットした（N = 3; ****P < 0.0001; **P < 0.01）。(B）尿路上皮表面の個別の領域におけるSAと、損傷した上部細胞宿主膜との関連（下）。球菌の浸潤（右上の矢印）と上部細胞層の下の鎖（中央、点線）。ハサミは隣接する下パネルの側面図の断面の位置を示す。(')は赤チャンネルを除いた画像。(C)尿路上皮表面に広がったEFと上部細胞層の間を移動する鎖（下、点線）。重度にコロニー形成された傘細胞が剥離され（右上）、小胞様構造と尿路上皮細胞から球菌が噴出している（右下）。図1と同様の染色。図1. 共焦点像（（B）上段および中段、（C）左）およびSEM像（（B）中段および右下、（C）右）。

図6. 3D-UHUにおけるグラム陰性非UPEC性尿路病原体の侵入とバイオフィルム形成。
(A）KP感染。尿路上皮表面に散在する細菌（3時間後と12時間後）；KPを取り囲む膜の隆起とスパイク状の構造。破線はIBCを示す（中央）；矢頭は発疹の可能性を示す（右下）。(')は赤チャンネルを除いた画像。(B）PA感染。バイオフィルム様凝集体の形成、細胞破片の取り込み、沈殿物（下段のSEM像）。感染経過に伴う細菌の長さの減少を示すバイオリンプロット（各時点N = 1100個；***P < 0.0001）。下段の矢印は細胞内細菌を示す。(C）PM感染。3D-UHU表面（上）、中間細胞層断面（IC）内部、傘細胞内部（左下）、および結晶性沈殿物（）を伴う接合部間バイオフィルムを形成しながら炎症性尿路上皮に傍細胞的に浸透するロッド、チェーン、および/または伸長形態（右および下SEM画像）。共焦点画像［（A）左・中；（B）上；および（C）左上・中］およびSEM画像［（A）右；（B）下；および（C）右・下］は、1株につき最低4つの独立した生物学的複製を代表する（N≧4）。
鎖の形成は、時間や種に依存する不均一性はあるものの、尿路病原体に共通する戦略であった。グラム陽性菌は、時間経過とともに分離された球菌の量が増えるにつれて、3～12時間後に長い鎖を形成した（図5、BおよびC）。一方、PA鎖（図6B）とPM鎖（図6C）は12時間後に長くなる傾向があった。さらに、グラム陽性（図5、BおよびC）およびPM（図6C）鎖はともに、主に剥離中の細胞間を細胞間移動することができ、PMの場合はより深い層にアクセスし、中間細胞の間／内側に存在した（図6C、中）。PAについては、長鎖の形成は、より大きなバイオフィルム様凝集塊の形成と一致し、それらは時間とともに合体して厚くなり、しばしば細胞残屑を含み、12 hpiまでに尿路上皮表面の広い部分を覆った（図6Bおよび図S5B）。これに伴って、PAのサイズも〜4μmから〜1μmへと減少した（図6B）。加えて、PAとPMのバイオフィルムは、通常、結晶の様相を呈した沈殿物を含んでおり、PMの場合、これらの沈殿物は特に大きく、より豊富で、接合部に位置していた（図6C、右、および図S5C）。さらに、PAとPMは他の尿路病原体と比較して、尿または至適培地単独でより多くのバイオフィルムを産生し、尿がバイオフィルム産生に及ぼす一般的な悪影響にもかかわらず、PAでは約6倍も多かった（図S5D）。
細胞内侵入は、KPとPMで一般的に観察され、UPECの一部でも6時間経過後に観察された。PMでは傍細胞侵入後に中間細胞で、KPでは傘細胞で大きなIBCを形成した（図6A、中）。残りのすべての尿路病原体も侵入することができたが、これはまれで、12 hpi以降にのみ見られた（例えば、図5、BとC、および6B）。大腸菌と同様に、剥離／発育中の細胞の下面への接着は、すべての非UPEC性尿路病原体に共通してみられた（図5Cと6B、図S5、CとE）。
組織の自然および自律的な尿路上皮応答は、尿路病原体と非尿路病原体とで標的が異なる。
私たちは、感染の際に、宿主の小胞様構造物および／または様々な大きさの細胞断片が傘細胞から押し出されるのを頻繁に観察した（図7Aおよび図S6A）。SAの場合、これらの構造物には通常細菌はいなかったが、長い鎖に大きく囲まれていた（図S6A）。対照的に、より侵襲性の高い株（CFT073、UTI89、COM1など）による感染では、小胞様構造体の内部に細菌が見られ（図S6、AおよびB）、多くの場合、細胞膜が広範囲に荒れている領域に局在していた（図7Aおよび図S6C）。

図7. 尿路病原体と常在菌に対する宿主の反応。
(A）CFT073（左）とUTI89（右）を投与した12時間後の傘細胞による細胞膜の荒れとブリープ／小胞様構造（＊）の形成。(B)LC3（上）とRab27a（下）で装飾されたエクソソーム様構造体中に排出されたCFT073。a～dは、伸長またはケース分解による細菌の放出を示唆する異なる封入パターンを示す（画像上の模式図）。(C）12時間後の、尿路病原体と非病原性細菌による宿主細胞の剥離、および細胞内にCOM1が存在する剥離細胞（下図の矢印）。図1と同様の染色。ハサミは下図の側面図の断面配置を示す。データは生物学的四重反復（N = 4）の平均値±SEとしてプロットした；***P < 0.0001; ***P < 0.001; *P < 0.1。(D）3D-UHUによる12時間後のサイトカイン（IL-1α、IL-1β、G-CSF、RANTES）産生。非感染コントロール（破線）と比較した倍数変化を生物学的三連体（N = 3）の平均値±SEとしてプロットした；***P < 0.0001。共焦点画像［（A）、左、（B）、（C）］およびSEM画像［（A）、右］は、1株につき最低4つの独立した生物学的複製を代表する（N ≥ 4）。
また、ファゴソームマーカーLC3を含む "エクソソーム様 "構造体へのUPECの封入も検出された（図7B）。さらに、Rab27a（エキソサイトーシスと小胞輸送に関連）も細胞外UPEC、常在性大腸菌、KPと共局在化した（図7BのCFT073など）。これらの構造は均一ではなく、完全な「ケージ」から多孔質構造やタンパク質パッチまで様々であった。Rab27b（房状小胞のマーカー）もこれらの構造で観察されたが、傘細胞層全体に高発現していたため、包まれた細菌に対する特異性はそれほど明らかではなく、したがって評価は行わなかった。
恒常性尿路上皮機構（26）である散発的な傘細胞の剥離は、感染していない3D-UHUでも再現できた（図7C）。しかし、侵襲性PM株（～3×105個/ml）、CFT073株、UTI89株、EC10株（～1×105個/ml）、バイオフィルム形成株PA株（～1.5×105個/ml）など、侵襲性の強い菌株に感染すると、より多くの剥離が生じた。IBC形成因子の場合、これらの剥離細胞は頻繁に細菌を内部に封じ込めた（図7C）。一方、非UPEC株では、感染していない対照株と比較して、効率的なインベーダーであるCOM1を用いても、有意な剥離は起こらなかった。
尿路病原体に対する宿主応答の明らかな特異性は、サイトカイン/ケモカインの産生にも及んだ（図7D）。評価した16の分析物の中で、インターロイキン-1β（IL-1β）産生は、特にUTI89、CFT073、PA、PMで圧倒的に強調され（10倍以上）、IL-1α、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、RANTESがそれに続いた。尿路病原体に対するIL-6、IL-8、ペントラキシン3の増加も検出された（図S6D）。この炎症反応は、例えばPMにおける尿路上皮の炎症を示唆する上部細胞層の膨張と一致する（図6Cおよび図S5C、右）。予期せぬことに、PMまたはPAに感染した場合、非病原株または感染していない対照と比較して、いくつかのサイトカインレベルも同程度か、かなり低いレベルに誘導され、IL-6産生は特に影響を受けた（図S6D）。さらに、上記のデータと一致して、CFT073とUTI89はUPECの中で最も顕著な反応を引き起こしたが、ほとんどの非病原性大腸菌は非感染対照と同様の反応を引き起こし、最も弱かったのはHM50とCOM3であった（図7Dおよび図S6D）。ラクトフェリンとリポカリン-2については、研究したすべての細菌間で有意差は認められなかったが、オステオポンチンとインターフェロン-γは検出されなかった。
考察
マウス尿路結石モデルにおける細胞内UPECの画期的な最初の報告（27）から20年が経過したが、ヒト膀胱における宿主と病原体の相互作用については多くの疑問が残っている。先進的なヒト由来モデルの必要性に駆られて（21）、ヒトの重要な尿路上皮の特徴を模倣した頑健なプラットフォームとして3D-UHUを開発した（25）。尿は宿主細胞（28）だけでなく、細菌の増殖、代謝（29）、病原性、例えばバイオフィルム形成（図S5D）（30）、病原因子の発現（31）にも影響を及ぼすため、尿の長期耐性が鍵となる。さらに、マウスでは中間細胞層が1つしかないのに対して（32）、複数の中間細胞層が存在することは、ヒトにおける再発と尿路結石解消のバランスだけでなく、より深い細菌リザーバーの確立と剥離後の再生を評価するためにも重要である。
このヒトに関連した微小環境を用い、原液尿を用いて、常在性大腸菌やASB大腸菌と並んで、様々な尿路病原体を調査したところ、特定の動物モデルやin vitroモデルで記録されているものと比較して、時間的、種的、そして（大腸菌で示されたように）株特異的な行動の多様性が観察された。マウスでは、UPECは定型的なIBCを引き起こし(27)、これは3D-UHUでもいくつかの臨床分離株で再現できた。しかし、他の2つの臨床株はIBCを形成することなく侵入し、分離菌のままであった。また、健常人の尿から分離された常在菌COM1株は頻繁に浸潤し、大きなIBCを形成した。これらの結果から、侵入は必ずしも特定の病原性形質ではなく、この過酷な環境で持続するための共有戦略であることが示唆される。
侵襲には多くの細菌因子が関与していることが示されており、マウスや細胞株における主要なウロビルレンス因子である1型毛状突起先端接着因子FimHもそのひとつである（5, 11-13, 33）。また、FimHに依存しない接着や浸潤のメカニズムが存在する可能性を示唆する意見もあり、著名な因子の増加やそれらの発現の緊密な連携が支持されている(34-37)。ここでは、3次元尿路上皮モデル、マウスや非ヒト霊長類の膀胱で一般的に使用されているものよりも低い細菌接種量でも、機能的FimHの非存在下で傘細胞の浸潤を観察することができた（12, 13, 22, 38-41）。これまでの研究と合わせて、我々のデータは、有望な抗FimH治療薬を補うために、複数の病原性因子を標的とする代替薬の開発の重要性を補強するものである（14, 15）。対照的に、FimH非存在下ではIBCの形成は観察されず、細胞内の細菌-細菌相互作用におけるFimHの重要性が強調され、マウスの膀胱におけるIBCの開始と成熟の両方におけるタイプ1繊毛の重要な役割と一致した（13）。とはいえ、ここで用いたような静的な条件下では、FimHはマンノシル化糖タンパク質に弱い親和性から中程度の親和性で結合し（42）、傘細胞のウロプラキンIa（我々のモデルでも発現）にも結合することが知られている。膀胱内では流動状態が断続的に繰り返されるが、他の付着・侵入コプレーヤーがどのようにこの状態に対処しているのかを理解するためには、さらなる研究が必要である。
ヒト細胞における浸潤メカニズムや、浸潤に続く段階、すなわち、細胞内での増殖と分散、細胞質へのアクセス、IBCの形成または排出、細胞内病原体を防ぐための細胞内経路（オートファジーなど）からの脱出を理解するためには、表現型が異なる浸潤性細菌種の菌株を用いたさらなるメカニズム研究も必要である。様々な経路には、宿主の胞状小胞の破壊（43）、エンドサイトーシス機構や分泌リソソームのハイジャック（44）、ジッパー様機構（33, 34, 45）、および／または上部の細胞の損傷などがあり、その結果、組織内への侵入が容易になる（11, 45-47）。
浸潤はまた、マウスや細胞株において、ほとんどの一般的な非UPEC尿路病原体について報告されている(28, 48-50)。3D-UHUでは、侵入はKPで顕著であり、これはUPECと類似したIBCを形成し、他の種ではほとんど見られなかった。さらに、個々のKPの表面には、サルモネラ菌や赤痢菌で報告されている内在化経路に類似した、宿主膜のスパイク状の突起が取り囲んでいた（51）。PMに関しては、細胞外および細胞内への効率的な浸潤は、細胞株やマウス、膀胱や腎臓でのこれまでの知見を支持するものである(53-55)。我々は、より薄いマウスの尿路上皮では示すことが難しい、より深い中間細胞でこれが起こりうることを示した。しかし、先に示唆されたように(55, 56)、浸潤は支配的なPMの生活様式ではなく、またPAにおいても、ミネラル沈着や細胞破片を伴う広範なバイオフィルムクラスターが形成された。これらの凝集体は、尿素溶解性バイオミネラリゼーションに起因するカテーテル関連尿路結石動物モデル（55、57）で一般的に検出される結晶性バイオフィルムおよび地殻形成の初期段階に類似していたが、留置器具や好中球の動員／細胞外トラップが存在しない場合の、ここでの形成と性質に迫るためには、さらなる調査が必要である。
一方、一部のUPEC、SAおよびPAは、それほど効率的に尿路上皮に侵入（および/または複製/持続）することができなかった。このような場合、単離された細菌は細胞内コンパートメントに捕捉され、エクソソーム様構造におけるエキソサイトーシスによって尿路上皮から排出されやすくなるのかもしれない(58, 59)。先に報告されたLC3とRab27bがこれらの「かご」を飾っていることに加え、Rab27aも排出された細菌と共局在化することが示された。Rab27aは、感染という文脈ではまだ広く研究されておらず、様々な生物種の感染していない尿路上皮では、中程度から全く発現していないことが報告されている（60-62）。ここで、その明確な標識パターン（均一なものから多孔性のものまで）は、細胞内UPECがフシ状小胞に飲み込まれたことを感知し、酵素の発現をトリガーして脱出し、IBCを形成することを示した最近の研究（43）と同様に、伸長、またはケージ分解を介した細菌の脱出メカニズムを示唆している。
より巧妙な宿主の防御に失敗した場合、宿主細胞の断片に含まれる細菌の排出や、細胞の全面的な剥離は、侵襲性の高い(10)、あるいは細胞毒性を持つUPEC株(63)にとって、「最後の手段」としての役割を果たす。このことは、CFT073で観察された特に顕著な反応だけでなく、PMやPAでも、バリア破壊や広範な細胞膜の剥離を伴って観察されたことと一致している。しかし、この戦略は宿主にとっては逆効果になる可能性がある。なぜなら、より深いリザーバーの確立、細胞外への移行、細胞死（PMで一般的に観察されるように）が可能になるからである。我々は、ほとんどの細菌が剥離プロセスを利用して細胞の下に付着し、上層の間に入り込んでいることを観察した。PA菌の場合、この戦略は細胞の残骸を取り込むことにつながり、おそらくは保護的なバイオフィルム凝集体を厚くするためであろう。さらに、「ハイジャック」行動は、宿主の接着分子やマトリックス成分の突然の露出を利用しながら、管腔防御からの一時的なシェルターを提供するのかもしれない。このことは、例えばHM50のような、付着性の低い非病原性菌株が、尿流にもかかわらず尿路上皮内で持続し増殖することの説明に役立つかもしれない(68, 69)。これまで、HM50のようなASB株の持続性については、宿主防御の活性化の欠如と関連したバイオフィルムの形成が重要な仮説とされてきた（17, 69）。さらに我々のデータは、最近報告された「ローリングシェッディング（rolling-shedding）」コロニー形成のメカニズムを支持するもので、UPECは剥離細胞を乗っ取って尿路上皮表面全体に広がり、持続することが示された(70)。さらに、生理的状態の悪い宿主細胞は、毒素やシデロフォアの標的にもなりやすく、尿中では限られた栄養源となる(4)。
連鎖もほとんどの細菌で極めて一般的であったが、伸長／フィラメント化は主にUPEC、非UPEC、KPで観察された。フィラメントは、UPECのIBC疹および免疫回避の文脈で研究されてきたが（71, 72）、我々のデータは、フィラメントが過酷なヒト膀胱微小環境における分散および生存にも重要であり、病原性だけに関連するものではないことを示唆しており、これはPD07i不死化ヒト細胞を用いたごく最近の観察結果（73）からも支持されている。これらの細菌はまた、活性産生または溶解による膜小胞形成やヌクレオイドの肥大化など、ストレスの多い環境での増殖に関連する他の変化も示した（74, 75）。
我々のモデルにおいて、より攻撃的な株は、マウスの膀胱や尿路結石患者における観察を彷彿とさせる、いくつかの炎症性サイトカインの産生を誘導した(76)。非UPECでは逆の結果が観察され、接着性の低いCOM3とHM50が最も低い値を示した。われわれの以前のデータでは、CFT073とUTI89は、10というはるかに低いMOIで、3D-UHUの透過性にも有意な影響を及ぼし、UTI89は、24時間という長いエンドポイントの後、EFと比較してより強いサイトカイン産生を誘導した(25)。ここでは、これらのUPECだけでなく、PAとPMもモデルのバリア透過性に強い影響を与え、特に細胞毒性が強いことが観察された。これらの細胞傷害性の高い株は、IL-1βレベルの上昇を誘導する株でもあった。このことは、UPECがヘモリシン依存的に宿主のインフラムマソームを活性化することにより、このサイトカインの産生を誘導するという先行研究(77-79)と一致している。PA株とCFT073 ΔfimH株は、より浸潤性の高い株と比較して、より高いレベルを誘導したことから、この産生促進は必ずしも浸潤効率とは関連していなかった。PMとPAで観察された反応には、他の毒素が関与している可能性が高い。例えば、UTI以外の状況では、PAの孔形成毒素もインフ ラマソーム活性化経路を誘導した(80)。加えて、ここでは取り上げていないが、IL-1βインフラマソーム非依存的産生経路の累積的影響も起こるかもしれない(77)。対照的に、ここで用いた非溶血性SAは、溶血陽性株と比較してIL-1βの誘導レベルが低く（78, 81）、組織の完全性に対する影響も最も弱かった。以前にも、無症状の健康な女性から採取した別のSA株で、UPECおよびEFと比較して低いMOIの10で、同様の効果が観察された（25）。PMまたはPA感染後の主要サイトカイン（すなわちIL-6）の低下調節は、引き起こされた広範な損傷と細胞毒性を考慮すると、注目に値するものであった。感染のタイミングや宿主免疫の特異性に関連したメカニズムが、このような特殊なプロフィールの根底にあるのかもしれない。加えて、細菌による免疫調節（例えば外膜小胞を介して）も考えられるが(82)、尿路結石に関してはまだほとんど未解明である。
ヒトの尿路上皮微小環境をよく模倣した3D-尿路上皮微小組織モデルから、多種多様な細菌の生活様式と宿主の応答が明らかになったが、このことは、現在の「画一的な」尿路結石治療アプローチに対抗する新規治療法を開発する必要性を浮き彫りにした。フィラメント形成、侵入、宿主の乗っ取りなどの戦略は、尿路病原体や常在菌の持続性を助けるかもしれないが、必ずしも病原性と相関しているとは限らない。例えば、中間的な表現型を持つ分離株（例えば、尿路結石の既往歴のない患者から回収されたCOM1）と他の株/種との尿路上皮における進化的側面と共存を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。UPECで見られたように、菌株特異的な表現型は他の尿路病原体でも見られる特徴であり、ヒトの微小環境における挙動についてもさらなる研究で検討されるべきである。
とはいえ、われわれのモデルには、排尿、生体力学的伸展、腎臓や免疫細胞からの分泌因子など、感染時に重要な役割を果たす要素が欠けている。これらの限界は、このモデルの将来のバージョンで、異なるシステム間のより良い比較を可能にするために対処することができるが、3D-UHUは、個々の変数を単独または組み合わせて試験することができる高度に制御された環境で、重要な界面である先端尿路上皮における宿主と病原体の相互作用を数多く研究するのに有用であることに変わりはない。したがって3D-UHUは、動物実験を補完する扱いやすく頑健なモデルであり、ヒトの尿路結石をよりよく理解するために微調整したり、薬剤開発のための強力なプラットフォームとして利用したりすることができる。このモデルは、他の様々な臓器や組織ニッチにおける感染に対するヒトの微小環境の役割を研究するための、新しい細胞ベースのプラットフォーム開発のためのインスピレーションとしても役立つであろう。
材料と方法
研究デザイン
本研究の最初の目的は、ヒトに類似した尿路上皮微小環境において、UPEC臨床分離株と非病原性細菌（常在菌とASB株の両方）を用いて、尿路病原体形成と宿主応答における重要な事象を明らかにすることであった。私たちは、菌株によって浸潤と細胞内コミュニティが異なる形で起こりうると仮定した。また、治療標的となりうるUPECの主要なアドヘシンであるFimHが、ヒト組織に類似したシナリオにおいて重要な役割を果たすかどうかも知りたいと考えた。バリア機能、層別化・分化、自然免疫反応、尿耐性を長期間にわたって維持することができる革新的なヒト微小組織尿路上皮モデルを用いて、0〜48時間の異なる期間、異なるMOI（10〜100）で細菌を感染させた。菌体1型フィンブリアーの活性は血球凝集アッセイで確認した。一定時間ごとに、共焦点顕微鏡および走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、感染／コロニー形成の進行を観察した。画像は、1株につき最低4つの独立した生物学的複製を代表するものであった。また、細胞内での細菌の侵入効率を測定するために、抗生物質保護アッセイを行った。細菌の形態学的変化を調べ、感染後のロッド対フィラメント比をブラインド自動化法で定量化した。宿主における細菌戦略の効果を評価するため、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン（4 kDa）拡散アッセイを用いて、微小組織からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出による誘導細胞毒性および経時的なバリア透過性を測定した。顕微鏡を用いて、エクソソーム様構造における細菌の排出、宿主の小水疱形成／出血、剥離を調べ、アピカルミリュウを用いて、サイトカイン／ケモカインの産生と剥離細胞を定量化した。言及されたすべての臨床分離細菌は、適切な倫理的承認を得て、以前の研究のために収集されたものである。尿路上皮と大腸菌の相互作用の多様性を考慮し、他の一般的なグラム陽性/陰性尿路病原体による感染戦略とそれぞれの宿主応答を評価するために同様のアプローチを用いた。
膀胱ヒト細胞
自発的に不死化された非形質転換ヒト膀胱上皮細胞（HBLAK；CELLnTEC）は、1バイアルあたり約5×105個の細胞を含んで供給され、さらに使用するまで液体窒素中に保存された。簡単に説明すると、細胞は予め加温したCnT-Prime培地（CELLnTEC）中、37℃、5％CO2の加湿環境で継代前に維持された。継代は、Ca2+とMg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS; Gibco）で洗浄した後、37℃で7分間インキュベートし、80～90%コンフルエントの細胞を剥離するためにアキュターゼ（Sigma-Aldrich）を用いて行った。
細菌株
大腸菌83972株（HM50、ASB）およびCFT073株、PA PAO1株（BAA-47）、SA G19株（13813）、PM 7570株（51286）は、American Type Culture Collectionから入手した。急性膀胱炎患者から回収したKP TOP52およびUPEC UTI89はS. Hultgren（Washington University, St. MLST ST131膀胱炎分離株EC6およびEC10（83）は、ファイザー社（Department of Vaccine Design, Immunology, and Anti-Infectives Pearl River, NY, USA）から入手した。fimHの遺伝子ノックアウト変異体は、CFT073とEC10の親株からファイザー社でλ-redを介した相同組換えシステムを用いて、以前に記載されたように作製した(84)。UPEC株におけるfimHの欠失を確認するために使用したプライマー対は、センスプライマー（catcggcctggcatgatgttgc）とアンチセンスプライマー（ggtactggcgacggctgc）であり、それぞれ近位fimG遺伝子と遠位gntP遺伝子にマップされる。これらのプライマーは、欠失変異体では0.755kbの断片を増幅し、親株では1.658kbの断片を増幅した。これらの断片をサンガー配列決定したところ、0.899kbのfimHオープンリーディングフレームが失われ、FLPリコンビナーゼによるCATカセットの切除に起因する傷跡配列が残存していることが確認された。英国ロイヤルフリー病院からの臨床分離株は、慢性尿路結石症患者からの臨床分離株であるEF（EF36）（既報(28)）、慢性尿路結石症患者から分離されたUPEC ClinA、および健常人のクリーンキャッチ中流尿サンプルから回収された5つの常在性大腸菌分離株（COM1〜COM5）であった（既報(85)）。大腸菌の遺伝子型の詳細は表S1に示す。全菌株はグリセロール中、-80℃で保存した。実験前は通常、最適培地中、37℃で静置保存した： 大腸菌用ルリア・ブロス（LB; Sigma-Aldrich）、PA、SA、PM、EF用トリプトン・ソ イア・ブロス（Oxoid）、KP用栄養ブロス（Oxoid）。
3Dヒト尿路上皮モデルの作製
3D-UHUは既述のように作製した(25)。簡単に説明すると、継代8から12の間に、80から90％のコンフルエント細胞を上記のように剥離し、あらかじめ加温したCnT-Prime中で3×105cells/mlを、12ウェルTranswellプレート（Corning）に立てたプラスチックインサート中の12mm、0.4μm孔のポリカーボネートフィルターメンブレン上に播種し、一方、基底チャンバーは同じ培地1.5mlで満たした。37℃、5％CO2で2日間培養した後、アピカルチャンバーとベーサルチャンバーの両方の培地をカルシウムリッチ（1.2mM）の分化バリア培地（CnT-Prime-3D培地、CELLnTEC）に置き換え、0日目とした。一晩培養した後、頂端チャンバーの培地を、市販のフィルター滅菌したヒト尿（男女10人分、BioIVT社製）に交換し、基底チャンバーは新鮮な培地に交換した。尿/3D培地交換は3日ごとに行い、18日目から20日目まで行った。
細菌増殖曲線
細菌の増殖は、マイクロタイタープレートリーダーTecan Sparkを用いて、LB培地、CnT-Prime-3D培地で希釈した50％尿、または100％ヒト尿（初期接種量OD600nm、0.006±0.003）中、37℃下で24時間にわたり600nmの光学密度（OD）測定によりモニターした。
細菌接種
感染前に、細菌株を凍結ストックから37℃で一晩静置培養し、新鮮な最適培地で再培養した。大腸菌は37℃で48時間静置培養し、他の菌種は一晩培養した。菌数は、QUANTOM Tx Microbial Cell Counter（ロゴス社製）を用い、メーカーの説明書に従って定量した。感染には、実験に応じてMOI10～100の尿を用い、アピカルチャンバーに細菌を接種した。再現性の目的で、MOIは、表面積と細胞サイズから推定される成熟微小組織頂部表面上の約30,000個の傘細胞に基づいて計算した。CnT-Prime-3D培地は基底チャンバーで交換した。
凝集アッセイ
細菌は上記のようにLBブロス中で静置培養し、OD600nmが0.5になるように希釈した。細胞を4000gで5分間遠心分離して回収し、PBSまたは1%マンノース（I型フィンブリアー結合を阻害するため）中に再懸濁した。懸濁液を5％または1％(v/v)のモルモット赤血球（Rockland）と混合した。ライカ倒立顕微鏡DMi1（Leica Microsystems）を用い、マイクロタイターウェル中、4℃で0～4時間インキュベートした後、または室温で30分インキュベートした後、スライドガラス中で画像化し、血球凝集を視覚的にモニターした。
バイオフィルム定量アッセイ
前述のように増殖させた後、すべての細菌培養からのバイオフィルムの形成を、LBおよび25％尿中で評価した。細菌懸濁液を、MOIが15と30になるように調整し、カルガリーバイオフィルムデバイス（Innovotech社製）（各ウェルにペグが伸びている蓋付きマイクロタイター96ウェルプレート）にかけた。37℃、5％CO2で24時間静置培養した後、蓋を外して20分間風乾した。その後、200μlのクリスタルバイオレット染色液を入れた新しいプレートにペグを浸し、室温で30分間インキュベートした。その後、ペグを蒸留水で軽くすすぎ、風乾した後、200μlの33％酢酸（Sigma-Aldrich）に15分間浸した。溶解したバイオフィルムの吸光度を、Tecan Sparkマイクロプレートリーダーを用いてOD550nmで測定した。
FITC-デキストランバリア透過性アッセイ
感染時の3D-UHUバリアーの完全性をモニターするため、CnT-Prime-3Dに溶解した4-kDa FITC-デキストラン（1 mg/ml；Sigma-Aldrich）に細菌をMOI 15で接種した。空のトランスウェルと感染していないモデルが対照となった。0、2、4、6、8、20、22および24時間後に、50μlの基礎培地を96ウェル透明底黒色ポリスチレンマイクロプレート（Corning）に移した。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Tecan Spark）を用い、励起波長490nm、発光波長520nmで測定した。
LDH細胞毒性アッセイ
市販のCyQUANT LDH Cytotoxicity Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いて、3D-UHUで12時間培養後、MOI 100の細菌による細胞毒性を、アピカルミリュウに放出されたLDHの量を定量することにより評価した。
ゲンタマイシン保護アッセイ
100のMOI（106の細菌細胞の初期接種量）で12時間培養した後、頂端チャンバーの培地をゲンタマイシン（500μg/ml；100％尿中）で置換し、最小阻害濃度より150～250倍高くした［Wiegandら（86）に記載されているように実施］。37℃、5％CO2で8時間インキュベートした後、基底チャンバーと頂端チャンバーの培地全量をLBプレートに広げ、37℃で一晩インキュベートした後に増殖がないことを確認するためにコロニー形成単位数をカウントした。インサートをPBSで2回洗浄し、1% Triton X-100とともに37℃、5% CO2で20分間インキュベートした。細胞溶解液を連続希釈し、37℃で一晩培養した後、LB寒天プレートに広げてCFU計数を行った。
剥離細胞の回収と分析
3、6、12 時間後に、アピカルミルー中の剥離宿主細胞を、Acella 20 および 100（それぞれ）のサンプルキャリアと fluidlab R-300 自動セルカウンター（Anvajo Biotech）を用いて、4 μl および 20 μl のサンプルで定量した。残りの容量から100μlを、Cytospin 2遠心機（Shandon社製）を用いて、800rpmで5分間、スライドガラス上で細胞遠心した。疎水性ペンを用いて細胞紡糸細胞の位置を決め、その後のサンプル処理に使用した。スライドをPBSで洗浄し、PBS（Invitrogen）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で4℃で一晩固定した。翌日、PFAを1×PBSで置換し、インサートを染色まで4℃で保存した。
免疫蛍光染色と顕微鏡観察
メンブレン上のすべての3D-UHU培養と細胞紡糸された細胞は、PBS中の4％PFAで固定する前に、PBSで3回洗浄して緩く付着した細菌を除去した。アンブレラ細胞のバイオマーカーを検出するために、固定した感染していない膜を1×Hank's balanced salt solution（Gibco）で2回洗浄し、Hank's balanced salt solution中、Alexa Fluor 555（Invitrogen）に結合させた小麦胚芽アグルチニン（5μg/ml）で暗所、室温で2時間染色した。その後、膜を1×Ca2+およびMg2+を含まないPBSで洗浄した後、1%PBS/ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma-Aldrich）中の5%ノーマルヤギ血清（NGS; Thermo Fisher Scientific）で1時間ブロッキングした。その後、ウサギ抗サイトケラチン-20ポリクローナル抗体（Invitrogen）、マウス抗ウロプラキンIaモノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific）、またはマウス抗ウロプラキンIIIモノクローナル抗体（Invitrogen）を1% BSA/PBS中1% NGSで1:50に希釈した一次抗体とともに、膜を4℃で一晩インキュベートした。膜を1% BSA/PBSで3回洗浄した後、それぞれの二次抗体：Alexa Fluor 488（Invitrogen）に結合したヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギの1:200希釈液と室温で2時間インキュベートした。その後、膜を1% BSA/PBSで3回洗浄し、F-アクチンの標識は、あらかじめ小麦胚芽アグルチニンを使用していない場合は、PBS中0.2% Triton X-100（Sigma-Aldrich）で室温で35分間透過処理した後、Alexa Fluor 488標識Phalloidin（Invitrogen）の1:500希釈液で室温で1時間行った。DNAを4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；1μg/ml；Invitrogen）で室温で15分間染色し、膜をProLong Glass Antifade Mountant（Invitrogen）でイメージング用スライドガラスにマウントした。感染膜および細胞紡出剥離細胞のあるスライドには、以下の一次抗体のいずれかをPBSで1:50に希釈し、4℃で一晩静置して細菌を標識した： マウス抗O6（CFT073用）、ヒト抗O25b（EC10および変異体用）、ニワトリ抗PA（Abcam）、ウサギ抗KP（Invitrogen）およびウサギ抗PM（Invitrogen）、ウサギ抗LC3A/B（Cell Signaling Technology）、ウサギ抗Rab27a（Invitrogen）、またはマウス抗ウロプラキンIIIa（Santa Cruz Biotechnology）； またはFITC標識ポリクローナル抗体（Invitrogen）と室温で3時間反応させた： 抗ストレプトコッカスB群、抗E. 一次抗体のインキュベーションの後、それぞれAlexa Fluor 488（Invitrogen）を結合させたヤギ抗ニワトリ、抗ウサギ、抗マウス、または抗ヒト二次抗体の1% NGSで1:300に希釈したものと室温で2時間インキュベートした。小麦胚芽アグルチニンまたはファロイジン、DAPI染色、サンプルのマウントは前述のように行った。
共焦点顕微鏡で細胞内細菌を調べるために、上記の染色ストラテジーにより、細胞外細菌は抗細菌FITC標識抗体（緑／黄）とDAPI（青）で染色され、細胞内細菌は青でのみ染色され、形態により宿主細胞核と区別できるように、色の違いを検出することができた。IBCまたは細胞内分離細菌は、画像の3Dレンダリングと解析後に同定された。上記の固定手順のコントロールとして、その後の膜透過化の有無にかかわらず、感染／非感染ミクロ組織を4℃で一晩インキュベートしたマウスモノクローナル抗ミトコンドリア抗体Cy3コンジュゲート（Merck）で染色し、透過化なしではミクロ組織への抗体のアクセスがないことを確認した。
染色したオルガノイドの可視化は、ライカSP8顕微鏡を用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡で行い、トップダウンビューとZスタック（サイドビュー）で細胞内細菌を検査した。画像は Leica Application Suite (LASX), Advanced Fluorescence 3.1.0 build 8587 software で処理した。
走査型電子顕微鏡
SEM用サンプルの固定は、0.1Mカコジル酸ナトリウム（CAC; TAAB Laboratories）バッファー中2.5%グルタルアルデヒド/2%PFAで室温30分間行った。その後、固定膜を1%四酸化オスミウム（TAAB Laboratories）/1.5%フェリシアン化カリウム（Sigma-Aldrich）と4℃で1時間インキュベートし、0.1M CACバッファーで3回洗浄した。その後、0.05M CACバッファー中の1%タンニン酸（TAAB Laboratories）で40分間、暗所、室温でインキュベートし、0.05M CACバッファーで2回、蒸留脱イオン水（ddH2O）で1回洗浄した。次いで、膜を段階的エタノール（Sigma-Aldrich）系列で脱水した：50、70、90％エタノールで各2分間、100％エタノールで10分間のインキュベーションを2回。脱水した微小組織をLeica EMD300臨界点乾燥機で完全に乾燥させた。その後、膜をメスでプラスチックインサートから剥がし、カーボン粘着タブを用いてアルミニウムスタブに取り付け、膜を10 nmの金でスパッタコーティングした。SEM画像は、Zeiss Gemini 300（作動距離8mm、加速電圧1.5kV、二次電子（SE2）検出器使用）を用いて取得し、Zeiss Atlas 5ソフトウェアで処理した。画像の偽色付けはGIMP 2.10を用いて行った。
サイトカイン/ケモカインのプロファイリング
12時間後にMOI 100で感染させたアピカルミリューを10,000gで5分間遠心分離し、続いて13,000gで8分間再遠心分離し、細胞／細菌の残骸を除去した。上清は、Luminexビーズベースイムノアッセイ（R&D Systems）のヒト用プレミックス多項目カスタマイズキットを使用し、製造者の指示に従って、感染前後の尿路上皮微小組織で産生されたサイトー/ケモカインの量を定量するために使用した。洗浄バッファー中の最終懸濁液をLuminex 200を用いて分析し、以下の16検体を分析した： CCL5（RANTES）、CXCL1（GRO-α）、CXCL2（GRO-β）、GM-CSF（CSF2）、G-CSF（CSF3）、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子α、IL-1α、IL1-β、IL-6、CXCL8（IL-8）、IL-18、ラクトフェリン、リポカリン-2（NGAL）、ペントラキシン3、オステオポンチン。
統計分析
データは平均値±SDで表され、プロットされ、GraphPad Prismバージョン9.3.1を用いて解析された。レプリケート間の統計的有意性は、分散分析（ANOVA）を用いて決定し、Bonferroniの検定を行った。
PAと大腸菌のロッドおよびフィラメントの長さを定量化するために、共焦点画像を16ビット画像に変換し、MicrobeJプラグイン（87）を用いてImageJソフトウェアで解析した。1株あたり生物学的3連複で合計1000個の細菌をカウントし、1連複あたり3～5個の微小組織領域を使用した。細菌の長さは、桿菌については0～4μm、フィラメントについては4μm超でゲーティングし、除菌は手作業で行った。視野領域より長いフィラメントや、デクラスタリングできないように重なっているフィラメントは定量化から除外した。
謝辞
すべての資金提供者に感謝する。原稿の査読とEC6/10株の提供をしてくれたファイザー社のR. SimonとR. Donald、FimHノックアウト株の構築と確認、およびフローサイトメトリーによる表現型解析をそれぞれ担当してくれたD. KeeneyとJ. Lypowyに感謝する。さらに、UTI89とKPを提供してくれたS. Hultgrenの研究室にも感謝する。また、議論してくれた我々の研究室のメンバーにも感謝したい。
資金提供 この研究は、主に篤志家の寄付（UCL 540045およびUCL 537898）およびファイザー社からの基礎研究助成金（UCL 561022）により行われた。I.J.W.はMedical Research Council Core Funding Grant MC/U12266Bの助成を受け、SEM装置はWellcome Trust Facility Grant 218278/Z/19/Zの助成を受けた。
著者の貢献 概念化： 方法論：C.F.、J.L.R： 調査：C.F.、J.L.、A.L.、R.G.M.、A.A.、I.J.W.、R.F.、J.L.R： C.F.、J.L.、R.G.M.、A.L. 資金獲得： J.L.R.監督： 執筆：C.F.、J.L.R： C.F.およびJ.L.R.。
競合利益： J.L.R.はUCLのスピンアウト企業であり、尿路結石の新規治療法を模索しているAtoCap社の株主である。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
データおよび資料の入手： 本論文の結論を評価するために必要なデータはすべて論文および／または補足資料に記載されている。英国ロイヤルフリー病院およびUCLの臨床分離株のサンプルは、主担当者より提供可能である。ファイザー社（米国）で作製された臨床分離株とノックアウト変異体のサンプルは、科学的審査と材料移転契約（MTA）が完了するまでは、ワクチンデザイン・免疫学・抗感染症学部門から提供可能である。これらのサンプルのリクエストは下記まで： A. Weiss (Andy.Weiss@pfizer.com)。著者全員は、本研究で使用された試料に適用されるMTAはこれのみであることを確認している。
補足資料
このPDFファイルには以下が含まれている：
図S1～S7
表S1
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3.54 MB
参考文献および注釈
1
F. M. E. Wagenlehner、T. E. Bjerklund Johansen、T. Cai、B. Koves、J. Kranz、A. Pilatz、Z. Tandogdu、複雑性尿路感染症の疫学、定義および治療。Nat. Urol. 17, 586-600 (2020).

クロスリファレンス
PUBMED
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2
世界保健機関（WHO）、感染予防と制御に関する世界報告書（WHO、2022年）。
参考文献へ
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3
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クロスリファレンス
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ISI
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4
A. L.フローレス-ミレレス、J.N.ウォーカー、M.カパロン、S.J.ハルトグレン、尿路感染症： 疫学、感染機序、治療オプション。Nat. Rev. Microbiol. 13, 269-284 (2015).

クロスリファレンス
PUBMED
ISI
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