厩舎から出る： 野生の雌馬（Equus caballus）の糞便微生物叢における社会的混乱と同時のシフト

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ece3.10079

グレース・J・ヴァジリ、マギー・M・ジョーンズ、ヘイリー・A・カー、カサンドラ・M・V・ヌニェス
初出：2023年5月11日
https://doi.org/10.1002/ece3.10079
Grace J. VaziriとCassandra M. V. Nuñezは、この論文に等しく貢献しました。
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要旨
動物の共生細菌群集（マイクロバイオータ）の崩壊は、食生活の変化、ホルモンレベル、さまざまなストレス要因など、さまざまな要因と関連している。社会性動物では、微生物相が集団の構成員、社会的関係、個体間の微生物移動、競争の激化や地位の維持などの社会的ストレス要因にも影響されるため、健全な細菌群集の維持は特に困難となる可能性があります。我々は、ノースカロライナ州沿岸のバリアアイランドであるShackleford Banksで自由生活する野生の馬（Equus caballus）の微生物相に、雌によるグループ変更の回数で判断される社会的不安定性の増加が及ぼす影響について調査した。群れを離れて新しい群れに加わった雌馬の糞便微生物群集は、群れを変えなかった雌馬のそれと同様に多様であったが、組成的には異なっていた。また、群れを変えることは、いくつかの細菌の属や科の存在量の増加とも関連していた。馬は栄養吸収のために微生物群集に大きく依存しているため、これらの変化は重要であると考えられる。これらの変化を引き起こす特定のメカニズムを特定することはできませんが、私たちの知る限り、本研究は、放し飼いの哺乳類において、急性の社会的擾乱と微生物相の関連を実証した最初の研究です。
1 はじめに
動物の微生物群集（共生細菌群集）の崩壊と、食事、ホルモンレベル、環境要因の変動との関連は、孤独な種と社会的な種の両方でいたるところに見られます（Comizzoli et al., 2021; Zaneveld et al., 2017）。しかし、集団生活する種は、集団構成の変化、集団内の関係、様々な個体間の微生物の移動など、微生物叢に影響を与え得る、社会性特有の追加要因とも戦わなければならない。イエローヒヒ（Papio cynocephalus）の成体では、相互作用率が腸内細菌叢の変動を説明し（食事、親族関係、共有環境を制御した後でも）、腸内細菌種の伝播に社会的パートナー間の直接的な物理的接触が強く関与している（Tung et al.、2015）。同様に、半野生のウェルシュ・ポニー（Equus ferus caballus）において、微生物群集は空間的構造化、さらにはグループ内の特定の社会的相互作用（雄と雌、母親と子供の間のものを含む；Antwis et al.、2018）により変化した。
さらに、病気、環境ストレッサー、身体的外傷を含むさまざまなストレッサー（事実上すべての種が一度は経験する）は、いくつかの分類群における微生物の混乱に関連している（Zaneveld et al.、2017）。劣化した生息地での採食（ホエザル、Alouatta pigra）、病原体の感染（ウシガエル、Lithobates catesbeianus）、温度の上昇（サンゴ、Anthozoa属）など、異質な要因はすべて種の微生物相に影響を及ぼします（Amato et al.、2013；Zaneveld et al.、 2016）。社会性のある種は、集団生活に特有のストレス要因に加えて、（食料/水資源と交尾相手の）競争の激化、集団内および/または集団間の地位の維持、集団「政治」（Ward & Webster, 2016）など、同様のストレス要因を経験し、これらすべてが微生物相に影響を与える可能性があります。社会的ストレス因子と微生物叢の関連性は、実験室で十分に確立されています。長時間の攻撃を受けたマウス（Mus musculus spp.）や母子分離を受けたアカゲザル（Macaca mulatta）は、微生物叢に変化が見られます（Bailey et al.、2010； Bailey & Coe、1999）。畜舎では、輸送や離乳の対象となる家畜馬（Equus spp.）や未分化大腸炎（盲腸と結腸の炎症）の馬はすべて、その微生物叢に変化を示します（Costa et al., 2012; Mach et al.） このような変化は、しばしば微生物の多様性と安定性の低下を含み、動物の感染防御能力を低下させ（Bailey, 2012）、多くの腸内病原体に感染しやすくなる可能性があります（Bailey et al., 2010, Bailey & Coe, 1999）。同様の関係は、野生でも確立されています。捕獲ストレスを受けたエゾリス（Tamiasciurus hudsonicus）や、実験的にコルチコステロン濃度を高めたキイロイトリ（Larus michahellis）では、微生物叢の多様性が低下しています。サンゴは、乱獲、栄養汚染、温度上昇のシミュレーションで無数の変化を示します（Noguera et al., 2018; Stothart et al., 2016; Zaneveld et al.、2016）。同様に、劣化した生息地に住むホエザルは、より多様性の低い微生物コミュニティを示します。これらの変化は、主に食餌の違いに起因していますが、著者らはストレスホルモンの増加が重要な役割を果たした可能性を認めています（Amato et al.、2013）。
ここでは、米国ノースカロライナ州のシャッケルフォードバンクスに生息する自由生活型の野良馬（Equus caballus）の集団において、社会的不安定性の増大が微生物相の変化と関連しているかどうかを調査することにした。野生の馬は、雄馬（スタリオン）、雌馬（メス）、子馬を含むグループ（バンド）を形成する（Feist & McCullough, 1976; Linklater et al. これらの集団は通常長く続き、子孫の散逸を除いて集団構成にほとんど変化はない（Klingel, 1975）。雌馬は、主にバンドの種馬の属性（年齢、階級、在任期間、そしてより少ない程度ではあるが、雄と雄の攻撃性に関与する傾向など）に応じて、その雄やグループを離れて新しいグループに参加するが（Rubenstein, 1994; Rutberg, 1990）、かなり低い割合である（雌の0〜17％; Berger, 1977, Feist & McCullough, 1976, Linklater et al, 2000, Rubenstein, 1981）。このようなグループメンバーの安定性は、すべてのグループメンバーの全体的な幸福にとって重要であり、安定性の低下は、体調や繁殖成功の低下、寄生虫負荷や子孫の死亡率の増加（Kaseda et al., 1995; Linklater et al., 1999）と関連しており、これらはすべて動物の微生物相に影響を与える可能性があります（Comizzoli et al., 2021; Zaneveld et al, 2017）。さらに、グループを変える個体は、新しい生息域を経験し、飼料や水へのアクセスが変わる可能性があり、新しいバンドメイトの微生物コミュニティにさらされ、自分のランクを再評価／再確立することになる；やはり、これらすべてが彼らの微生物相に影響を与えうる（Antwisら、2018; Zaneveldら、2017）。
野良馬に典型的な社会的安定性の低下は、免疫避妊治療と関連している（Madoskyら、2010；Nuñezら、2009、2017；Ransomら、2010）。2000年から2009年まで、ノースカロライナ州シャッケルフォードバンクスの野良馬集団は、免疫避妊ワクチンであるブタゾナペルシーダ（PZP）で管理されていました。このワクチンは、卵の表面にある精子受容体と結合する抗体の産生を刺激する免疫反応を引き起こし、それによって受精を阻止する一方で、排卵とそれに伴う性ホルモンのサイクルを可能にします（Sacco、1977）。通常、抗 PZP 力価は約 10 ヶ月間だけコントロールレベルを上回りますが（Willis, 1994）、1 回の PZP 処理で最大 3 繁殖シーズンまで不妊になることがあります（Turner Jr. et al., 2007）。PZP を投与された雌馬は、バンドを交換する可能性が 10 倍になり、自分の雄を捨てて別の雄のもとへ行くことがある（Nuñez et al.、2009）。この研究の時点（避妊プログラムがほぼ停止してから6～7年後）では、以前にPZPを受けたシャッケルフォードの雌馬は、治療を受けたことのない雌馬と比較して、より頻繁にグループを変え続けている（Jones & Nuñez, 2019; Nuñez et al., 2017）。これらの長期的な効果は、継続的な不妊によるものであり、治療自体の長引く効果ではないことを示唆する証拠がある（Nuñez et al.、2017）。このように集団の変化行動の可変性が高まったことで、野生における社会的混乱と微生物叢の潜在的な関連性をより明確にするユニークな機会が得られました。
社会的な種では、個体または個体のサブグループの行動における大きな変化は、しばしばその近縁者の行動に影響を与えます（Ward & Webster, 2016）。雄馬は雌の群れの変化行動に対して攻撃的に反応し、追いかけ、時には雌を群れに戻そうと蹴ったり噛んだりします（Madosky, 2011）。さらに、この行動をとるメスは、非常にエスカレートしたオスとオスの対立の近くにいることが多い（Jones & Nuñez, 2019）。さらに、群れを変えることに成功した雌は、しばしば居住雌からの攻撃を受ける（C. M. V. Nuñez, unpublished data）。おそらく驚くことではないが、群れの変更行動は内分泌ストレス反応と関連しており（Nuñezら、2014）、これは糞便コルチゾール代謝物（FCM）濃度によって確実に評価できる（Mostl & Palme, 2002; Nuñezら、2014；Wasserら、2000）。グループスイッチングを行う牝馬は、行わない牝馬に比べてFCM濃度が高くなった。さらに、グループチェンジを行う頻度が高い雌馬は、そうでない雌馬よりもFCM濃度が高かった。また、FCM濃度は行動後少なくとも2週間（平均）上昇したままであり、行動（および/またはそれに関連するストレス要因）が雌馬のストレス生理に少なくとも何らかの影響を及ぼすことが示唆された。
私たちは、集団切り替え行動、すなわち社会的不安定性の増大が、雌馬の腸内細菌叢の変化と相関しているかどうかを明らかにすることを目指しました。野外で採取した糞便サンプル（2015年および2016年）を用いて、群れを変えた雌馬と変えなかった雌馬の微生物叢を調べ、関連する社会的行動（および潜在的ストレス要因）と微生物叢の多様性および組成の間の関連性を明らかにしました。群れを変えた雌馬は、群れを変えなかった雌馬と比較して、微生物叢の多様性が低下すると予想しました（Bailey et al.） また、グループを変更した牝馬は、組成的に異なる（シフトした）糞便細菌コミュニティを持ち、そうでない牝馬よりも変動性の高い細菌コミュニティを宿すと予想した（Zaneveld et al.、2017年）。
2 材料および方法
研究エリア
本研究は、米国ノースカロライナ州沿岸の約3km沖に位置するバリアアイランド、シャックルフォード・バンクスで実施した。島の長さは15kmで、幅は0.5～3kmの間で変化する。
島の長さに沿って分布が異なる約14種の支配的な草が存在するが（Rubenstein, 1981）、どの地域も他の地域に特有の種を宿していない（S. Stuska, personal communication, May 2016）. 砂浜は海に接しており、その後に、主にウミアオイ（Uniola paniculata）、ペニーワート（Hydrocotyle bonariensis）、リトルブルーステム（Schizachyrium scoparium）、ブロムスレッジ（Andropogon virginicus）で覆われた砂丘が続く。平坦な沼地には、ソルトメドウ・コードグラス（Spartina patens）、スターラッシュ・ホワイトトップ（Dichromena colorata）、ペニーワート、シーショア・パスパラム（Paspalum vaginatum）、チェアメーカーズ・ブルラッシュ（Scripus americanus）などの草がパッチ状に分布する。海浜林は、ビロードパニック草（Panicum sp.）、マーシュフィンブリー（Fimbrystylis spadicea）、ピンクミューリーグラス（Muhlenbergia capillaris）が主体です。最後に、塩湿地は、スムースコードグラス（Spartina alterniflora）、ソルトグラス（Distichlis spicata）、グラスワート（Salicornia virginica; Rubenstein & Feinstein, 2021）によって支配されている（M. M. Jones & C. M. V. Nuñez, personal observation）。
島は3つの異なる地域からなり、生息地の見え方も異なる（Jones & Nuñez, 2019; Rubenstein, 1981）。島の西側部分には2つの主要な水源があり、高い砂丘と密なブラシによって視界が制限されている；この地域の動物は資源を共有し、重なり合った生息域を示す。東部は平坦で見通しが良く、歴史的にこの地域の馬は縄張り意識が強かったが（Rubenstein, 1981）、最近では利用可能な水の減少により、生息域が大きく重複している（Jones & Nuñez, 2019；Marr, 1996）。中央部の地形は東部と似ており、高い視界を確保しやすいが、水源はより均等に分布しており、馬はより境界のある縄張りを維持できる（Jones & Nuñez, 2019, Rubenstein, 1981）。約29％、32％、38％の動物がそれぞれ島の西部、東部、中央部に位置している。シャックルフォード・バンクスの馬の個体数は、1996年以降、国立公園局（NPS）とシャックルフォード・ホース財団によってコマネチ管理されている。
研究対象
シャックルフォードホースは、典型的な野生のウマ科動物である。1頭または時には2～3頭の牡馬と1～数頭の雌馬とその子孫からなるまとまったバンドを形成する（Rubenstein, 1981）。複数の雄のバンドは野良馬集団の大部分を占めることがあるが（例えば、カイマナワ馬では33％、Linklater & Cameron, 2000）、シャックルフォード・バンクスでは発生頻度が低く、本調査の2年間（それぞれ2015年と2016年）ではバンドの10％と5％を占めるにすぎない。さらに、種馬の縄張り意識の度合いの違いは、島の様々な生態と関連している（Rubenstein, 1981）。本研究の期間中、島の西部に住むバンドは、重なり合うホームレンジ内で自由に移動し、中央および東部のバンドは、テリトリーを守る傾向が強かった（Jones & Nuñez, 2019）。とはいえ、島のすべての地域に住むバンドは互いに空間的に区別されたままであり、バンドのメンバーは容易に決定できた（Feist & McCullough, 1976; Rubenstein, 1981, 1986）。バンド間の相互作用は、通常、若い個体が遊びや探索に参加すること、サブアダルト個体（オスとメスの両方）の分散、オスとメスの競争、バンドから別のバンドへの成体メスの移動などがあった（M. M. Jones & C. M. V. Nuñez, unublished data）。
歴史的に見ると、シャックルフォード・バンクスのバンドは安定しており、グループメンバーシップの変化のほとんどは未熟な個体の分散に伴うものであった（Nuñez, 2000; Rubenstein, 1981）。雌は、主にバンドの種馬の質に反応して、自分の雄やグループを離れて他のグループに参加することがあったが（Rubenstein, 1994; Rutberg, 1990）、その割合は低かった（雌の10.8%; Rubenstein, 1981）。雄は他のグループから雌馬を獲得するために争うこともあったが、他の野良馬集団で典型的なように、種馬はほとんど雌馬を保持した（Rubenstein, 1981） (Feist & McCullough, 1976). 最近では、PZP免疫避妊を施した雌馬の群れが変わることが多くなり、未施行の雌馬の約10倍の群れ替えを行い、5倍の群れに（少なくとも一時的に）加入している（Madosky et al.2010; Nuñez et al.2009）．本研究の時点では、避妊管理停止から6～7年後であるが、以前に治療を受けた雌馬は、治療を受けたことのない雌馬よりも頻繁にグループを変更し続けており（Jones & Nuñez, 2019; Nuñez et al., 2017）、この行動における十分なバリエーションを比較することができる。
PZPによる避妊
NPSは2000年から2009年までPZP免疫避妊を積極的に実施した。避妊プログラム期間中、NPSは毎年2月下旬から4月にかけてPZPを投与しました。PZPの初回投与とブースター投与が行われ、すべての注射に100μgのPZPとアジュバントが含まれていました。初回投与では、フロイントの完全アジュバント、修正、Mycobacterium butyricum（Calbiochem #344 289）を使用し、ブースター投与ではフロイントの不完全アジュバント（Sigma #F5506 ） を使用した。
繁殖牝馬の生理および／または行動に対するPZP処理の残留効果を制御するために（Nuñez et al., 2017）、2000年から2009年の間に少なくとも1回避妊された繁殖牝馬のみを考慮した（S. Stuska, personal communication, May 2016）；これらの繁殖牝馬は平均4.25 ± 0.28 総処理（範囲＝1〜7）を受けた。この研究の時点で、PZP治療は雌馬の約98％について中断されていた：2頭の雌馬（2015年に1頭の雌馬；その雌馬と2016年に追加の1頭の雌馬）だけが積極的にPZP治療を受けていた（表S1参照）。これらの動物は、主に妊娠に耐えられないという懸念から避妊された（S. Stuska, personal communication, May 2016）。
動物の福祉
すべてのサンプリングは、全米研究評議会の基準（全米研究評議会、2011年）に従って実施された。この研究の非侵襲的な性質を考慮し、アイオワ州立大学の、またはNPSの施設内動物ケアおよび使用委員会は、許可は必要ないと判断しました。この作業は、NPSの研究許可証CALO-2015-0013およびCALO-2016-0006の下で実施されました。
行動および人口統計学的サンプリング
行動サンプリングは、主に2人のオブザーバー（H.A.Carr、2015年、M.M.Jones、2016年）によって行われ、さらに4人のオブザーバーによるデータで補足された（M.A.F. Kent and K.E. Monroe, 2015; M. Fatkah and R. Schwartzbeck, 2016）。すべての観察者は、C.M.V.Nuñezによって訓練された。以前の研究（Nuñez et al., 2009, 2017; Ransom et al., 2010）と同様に、データは2015年の8週間（6月下旬～8月中旬）および2016年の8.5週間（6月中旬～8月上旬）にわたって収集し、合計294時間以上の行動観察（192時間、2015； 102.85 h、2016）および雌馬あたり平均 3.39 ± 0.20 h（範囲 = 1.23-10.37 h）とした。馬は、色、性別、身体状態、および傷跡やフリーズブランドを含むその他の識別マークによって個々に識別された。馬の年齢は、長期記録（Nuñez, 2000; Rubenstein & Nuñez, 2009）とNPSのデータ（S. Stuska, unpublished data）から判明している。
2015年と2016年にそれぞれ10日に1回、3.5日に1回（平均）、各研究グループの位置を確認した。各グループのGPS位置と構成を記録し、個々の雌馬の有無に注目した。調査中に存在する繁殖牝馬（4歳以上）のほとんどを観察し、合計61頭の牝馬が、2015年と2016年にそれぞれ潜在的な調査集団の100％と95％を占めました。54頭の牝馬が両シーズンで観察され、残りの牝馬は2015年（n = 4）または2016年（n = 3）のどちらかで観察された。糞便サンプルを提出した避妊済みの雌馬（n = 30）のみをこれらの分析に考慮した。サンプルを提供した30頭の雌馬のうち10頭は、調査中にグループを変更した：2頭の雌馬は2015年と2016年の両方でグループを変更し、3頭の雌馬は2015年のみグループを変更し、5頭の雌馬は2016年のみグループを変更した（表S2、図S1参照）。
牝馬の移動活動はほとんど直接目撃されず（2015年、n = 1; 2016年、n = 1）、したがって、バンドからの牝馬の不在は、グループ間の移動の数を測定する重要な指標となった（Jones & Nuñez, 2019; Nuñez et al, 2009, 2017）。不在と記録された個体が実際には近くにおらず、私たちの視界から外れていることを確認するために、私たちは少なくとも30分間各グループに留まりました。移動行動は、新しいバンドに牝馬が存在することで確認された。2015年では、平均2.50±0.35日以内（範囲＝2～3）に確認され、2016年では、平均13.58±2.49日以内（範囲＝1.5～33）に確認された。
糞便サンプリング
糞便サンプルは、（1）繁殖牝馬の受胎率に対するPZP処理の繰り返しの長期的影響（2015年；Nuñezら、2017年）および（2）種馬の行動とストレス生理学（2016年；Jonesら、2020年；Jones & Nuñez、2019、2023）に取り組む他の二つの調査中に、機会的に（Altmann、1974）集められた。私たちは、雌馬の身元とサンプルの場所が確実な場合にのみサンプルを収集しました；すべてのサンプルは、収集時にまだ暖かかったです。各パイルからいくつかの糞球を集め、手で混ぜた；サブサンプル（約0.4g）を5mLの95％エタノール（Tung et al., 2015）中に保存した。サンプルは80℃で凍結できるまで、0.5～4日間周囲温度で保管した。
すべてのオブザーバーが糞便サンプルを収集した。30頭のPZP処理された牝馬から52個のサンプル（2015年、n＝18；2016年、n＝34）を使用して、その微生物コミュニティを評価した；グループを変更した牝馬から16個のサンプルを、変更しなかった牝馬から36個のサンプルを集めた。11頭の牝馬が2015年と2016年の両方でサンプルを作成し、残りの牝馬は2015年（n = 3）または2016年（n = 16；表S1参照）のどちらかでサンプルを作成しました。牝馬は、2015年と2016年にそれぞれ合計1.32±0.10（範囲＝1～3）および1.31±0.09（範囲＝1～3）のサンプルを提供しました。1日あたり平均1.44サンプル（2015年）および1.21サンプル（2016年）を収集しました。平均して、牝馬群が行動を変えてから私たちがその後の糞便を採取するまでに19.28日（範囲＝1.5-48.5）経過した（表S2参照）。
ボディコンディション
体調が馬の微生物群集と関連していることから、ランプスコアリングにより牝馬の体調を評価した（Garber et al.、2020）。尾てい骨と股関節の間の線の曲率を調べ、個体のランプスコアを決定した。スコアは1から5までの尺度に基づき、1が最も悪いスコアである（Pollock, 1980）。雌は、2015年と2016年にそれぞれ平均1.33±0.14回（範囲＝1～2）、2.08±0.21回（範囲＝1～4）得点された。分析のために、結果の解釈を助けるために、スコアをスケーリングしてゼロでセンタリングした（すなわち、結果のモデル切片は、平均的なランプスコアを持つ牝馬を表すと解釈することができる）。例えば、OTU（operational taxonomic unit）リッチネスモデル（予測変数としてスケーリングなしの平均ランプスコアを使用）の切片のパラメータ推定値は、ランプスコアが低い馬のアルファ多様性を反映しています。逆に、スケーリングされたランプスコアを用いて構築されたモデルの切片は、平均的なランプスコアを持つ馬を代表しており、より生物学的に直感的なアプローチでモデルを解釈することができます。
微生物叢の分析
糞便サンプルは、DNA抽出、ライブラリ作成、配列決定のためにArgonne National Laboratoriesに送られた。DNAはQiagen DNeasy PowerSoil抽出キット（Qiagen Inc.）を使って抽出した。16S rRNA遺伝子のV4領域を515Fおよび806Rプライマー（Caporaso et al., 2012）を用いて増幅し、Illumina MiSeqに適応したプライマーセットを用いてバーコード化した。シーケンスデータは、Illumina MiSeq v2ケミストリーを用いて300サイクルのペアエンドシーケンスを用いて作成しました。MiSeqランで2×150 bpアンプリコンをシーケンスし、両年のサンプルは同じランでシーケンスした。
配列決定後、Quantitative Insights Into Microbial Ecology（Qiime2）パイプライン（バージョン2-2018.8；Bolyenら、2019）を使用して配列データをデマルチプレックス、結合、品質フィルターした。配列を150 bpにトリミングし、Deblur (Amir et al., 2017)を用いてサブオペレーション分類学的ユニットに割り当てた。Silva 138 99% OTUs (515F/806R) classifier (Bokulich et al., 2018)を用いて分類学を割り当てた。各OTUの代表的な配列をmafft (Katoh et al., 2002)で整列し、qiime phylogeny (Price et al., 2010)で系統樹を構築するのに用いた。Qiime2での前処理後、各サンプルのOTU表、系統樹、分類学の割り当て、関連メタデータをRバージョン4.2.2（R Core Team, 2022）に読み込み、データ探索と統計解析のためにphyloseqオブジェクトに変換した（McMurdie & Holmes, 2013）.
統計解析の内容
2.9.1 アルファ多様性
R (v.4.2.2) の線形混合効果モデルを用いて、腸内細菌叢の多様性が集団移動行動によって変化するかどうかを検証した (R Core Team, 2022)。α多様性の解析に先立ち、サンプルを5706リード（最もリード数が少ないサンプルに存在するリード数、図S2参照）にサブサンプリングしました。サブサンプリングされたデータセットを用いて、3つのアルファ多様性指標を計算した：リッチネス（各サンプルで観察されたOTUの数）、シャノンウィーバー均等性（各サンプルにおける各OTUの相対存在度の分布の指標）、フェイスの系統的多様性（個々の微生物コミュニティで表される細菌分類間の分岐長を合計することにより、OTUの数とそれらの系統的関連性の両方を考慮）（Kembel et al.、2010）。最初の最大モデルでは、集団変化行動、調査年、島嶼地域、メスのボディコンディション（平均ランプスコア）、および1つの交互作用（集団変化行動とボディコンディションの交互作用）が、各α多様性指標に及ぼす影響を検証した。この交互作用は、集団変化行動に伴う微生物叢の変化が雌馬の体調に影響される可能性を考慮したものである（Garber et al.、2020）。すべてのモデルには、1頭の馬が複数のサンプルを提供した場合に生じる非依存性を説明するために、馬のIDのランダム効果を含めた。モデルは、説明変数のすべての組み合わせをテストするために構築され、小さなサンプルサイズで調整された赤池の情報基準（AICc; Burnham & Anderson, 2002）と比較された。我々は、∆AICc <2のすべてのモデルで保持された予測変数（表1）と、上位モデル（∆AICc = 0; 表2）のパラメータ推定値を報告する。
表1. ΔAICc < 2を持つアルファ多様性モデルの保持された予測変数とモデル重み。
指標応答変数モデル順位予測変数AICc∆AICcモデル重みα多様性観察された豊かさ1集団変化状況×体調＋島嶼地域＋年519.500.000.94偶数性1切片のみ-216.700.000.95信仰の系統的多様性1集団変化状況＋島嶼地域＋年242.700.000.372 島嶼地域の＋年 242.900.470.34
注：すべてのモデルは牝馬IDのランダム効果を含んでいる。
表2. ∆AICc=0とした上位アルファ多様性モデルのパラメータ推定値。
多様性指標パラメータ値SEdft-Valuep-ValueObserved richness切片716.3439.232819.41.00グループチェンジ状況（あり）23.2926.30140.89.39体の状態11.1213. 97140.80.44島嶼部（中東）19.0737.50140.51.62島嶼部（西）-66.6437.8928-1.76.09年：2016-108.3924.0814-4.50.0005グループの変更の有無（あり）： 体調-20.0822.2614-0.90.38Shannon-Weaver evennessIntercept0.830.0030215.26.00Faith's phylogenetic diversityIntercept41.851.392830.15.00group change status (Yes)1.040.98161.07.30Island region： Mideast0.191.39160.14.89Island region: West−2.241.3628−1.65.11Year: 2016−4.650.8816−5.31.0001
注）α多様性の指標（観察されたリッチネス、シャノン・ウィーバー均等性、フェイスの系統的多様性）は、群変化状態に関して牝馬間で差はなかったが、地域差と時間差が検出された。
2.9.2 ベータ多様性
ベータ分散性
β分散は、群集組成の変動性を示す指標であり、この場合、個々の牝馬の微生物群集組成とそのグループセントロイドの組成との間の非類似度または距離である。β分散値は、サンプルグループ間の分散の均一性を評価するために使用することができます（例えば、グループを変更した牝馬の微生物叢の組成分散が、グループを変更しなかった牝馬の組成分散と等しいかどうかなど）。veganパッケージの「betadisper」関数（Oksanen et al., 2018）を用いて、Bray-Curtis、UniFrac、および重み付けUniFracメトリクスについてベータ分散を計算した。Bray-Curtis非類似度は、サンプル間で共有される微生物分類群の構成（同一性と相対量、ただし系統的関連性ではない）に基づいて、サンプルまたはグループがどれだけ類似（または非類似）であるかを反映します。Bray-Curtis空間のスコアが高いほど、非類似度が高いことを示す（スコアが1に近い2つのコミュニティは、スコアが0に近い2つのコミュニティよりも、その種の共有割合が小さい）。Bray-Curtis非類似度と同様に、UniFrac距離はコミュニティ内の分類群の存在と不在を考慮し、コミュニティメンバー間の系統的な関連性を示す。もし2つの群集がBray-Curtis空間では異なるが、UniFrac空間では異ならない場合、それは群集間で異なる分類群が密接な関係にあり、群集内で共有する枝長が高いためである可能性がある。Weighted UniFrac解析は、細菌分類群の相対的な存在量を考慮しながら、コミュニティの系統的な関連性の指標を提供し、存在/不在に基づく指標よりも希少種の存在に敏感ではない微生物相の包括的な調査を可能にする（Lozupone et al., 2007）。Weighted UniFrac distancesは、コミュニティ間の系統的距離（枝の長さ）と組成の違い（相対的な存在量の違い）を定量的に表したもので、値が高いほどコミュニティ間の距離が大きいことを示す（Lozupone et al.、2007）。
β分散推定値の差は、veganパッケージの "permutest "機能を用いて解析し、同じ雌馬から採取したサンプルの非依存性を考慮した順列構造を含めた。β分散推定値は、グループを変更した牝馬のグループと変更しなかった牝馬のグループの推定値の中央値に関して計算された。
2.9.3 ペルマノーバ
ブレイカーチス非類似度、UniFrac距離、およびphyloseqを使用して計算された重み付けUniFrac距離を使用して、グループを変更した雌馬と変更しなかった雌馬（研究年、島の地域、および雌の体調を制御）の間の微生物コミュニティを比較し、ggplot2（Wickham、2016）で非金属次元尺度（NMDS）順序付けを用いて比較を可視化した。veganパッケージ（Oksanen et al., 2018）の「adonis2」関数（by = "margin"）を用いた順列分散分析（PERMANOVA）を行い、グループの切り替えが牝馬の微生物群集に何らかの影響を与えるかどうかを判断しました。また、PERMANOVAには、研究年、島の地域、雌の体調による微生物群の変動を説明するための変数が含まれており、同じ雌馬から採取したサンプルの非依存性を説明するための順列デザイン構造も含まれていました。
有意に豊富な分類群
最後に、同定されたOTUのうち、どの細菌科または属が、群変化行動、研究年、島嶼地域、雌の体調（適切な場合、下記参照）などのグループ化変数と関連して、馬糞中の存在量に差があるかを分析しました。微生物叢データセットにおける分類群間の差分存在量の推定は、16S rRNAデータの組成的性質のため、非常に困難であり、サンプリング率（1つのサンプルにおける分類群の絶対存在量とサンプル集団における絶対存在量の比）の違いにより、バイアスや偽陽性が生じることがある（Lin & Peddada, 2020）．我々は、差分存在量推定法のそれぞれに固有の限界と我々の研究デザインに対応するため、差分存在量の多い分類群を評価するために2つの方法を使用した。まず、RパッケージANCOMBC（Lin & Peddada, 2020）の「ancombc」関数を用いた、より保守的なANCOM-BC法（Nearing et al, 2022）を用い、サンプル内の組成性とサンプル間のサンプリング比率の違いの両方を考慮した。この方法を用いると、馬の状態に基づいて豊富な微生物分類を評価しなかった。この連続的な指標を生物学的に関連するグループに整理すると、グループごとのサンプルサイズが許容できないほど小さくなってしまうためである。ANCOM-BCで存在量の違いを調べる前に、10%未満のサンプルで観察された分類群を削除し、解析における希少な分類群の過度の影響を回避しました。次に、生の存在量データで存在量の差異を分析しました。次に、他の研究者がANCOM-BCと比較して保守的ではないが、一貫性が高い（Nearing et al.、2022）と指摘しているMaaslin2 RパッケージのMaAsLin2法を使用して、連続予測変数とランダム効果を含めることができるようにしました。この方法を用いることで、繁殖牝馬の体調に基づき、豊富に存在する微生物分類を評価することができました。さらに、同じ雌馬から複数のサンプルが収集された場合を考慮し、ランダム効果を含めることができました。また、10%未満のサンプルにしか存在せず、相対的な存在量が0.01%未満である分類群を除外し、属と科のレベルで有意差のある分類群をテストしました。MaAsLin2での存在量差分析は、生の（非精製）カウントデータに対して行われ、データはデフォルトの対数変換で変換されました。
3 結果
アルファの多様性
集団交換行動は、牝馬の糞便微生物叢の豊かさ、均等性、系統的多様性と有意な関連はなかった（pobs = .333, peven = NA, pPPD = .257; Figure 1）。観察された豊かさは1つのモデルで最もよく説明され、Shannon-Weaver均等性は切片のみのモデルで最もよく説明され、Faithの系統的多様性は∆AICc < 2の2つのモデルで説明された。トップモデル（∆AICc = 0）のパラメータ推定値、標準誤差、p値を表2に報告する。
図1
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ノースカロライナ州シャックルフォード・バンクスの繁殖牝馬の群交代状況は、その豊かさ（a）、均等性（b）、系統的多様性（c）の観点から、微生物叢αの多様性と関連していなかった。各ポイントは糞便サンプル1個を表し、複数のサンプルを採取した牝馬もいる。各指標のα多様性の中央値は実線で、上下の破線はそれぞれ75分位と25分位を示す。
アルファ多様性（リッチネスおよび系統多様性メトリクスを用いて算出）は、2016年は2015年に比べて有意に低かった（pobs < .0001, pPD < .001）。さらに、島の西部地域の馬から採取したサンプルは、島の東部および中央地域の馬から採取したサンプルよりもリッチ度が低い傾向があった（pobs = .09）。また、西部地域のサンプルの系統的多様性は、他の地域のサンプルと比較してやや低下していた（pPD = .03, .11）。群集の均等性については、年、地域、体の状態、集団の変化行動状態による変動は見られなかった。
ベータ分散性
群れを変えた牝馬のβ分散推定値は、UniFracとBray-Curtis空間の両方で高かったが（p = .002）、このパターンは重み付けしたUniFrac距離では繰り返さなかった（表3、図2）。
表3. β分散、すなわちβ多様性のグループ内変動は、Bray-Curtis空間と非加重UniFrac空間で比較した場合、グループを変えた牝馬と変えなかった牝馬の間で差があったが、加重UniFrac空間ではグループ間で差がなかった。
Diversity metricdfSum sqMean sqFN permp-ValueBray–CurtisGroups10.010.016.16499.002Residuals500.110.00–––UniFracGroups10.000.005.43499.0002Residuals500.040.00–––Weighted UniFracGroups10.000.000.29499.65Residuals500.010.00–––
注：すべてのモデルには、同じ雌馬から採取された複数のサンプルを考慮するための順列構造が含まれています。
図2
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Bray-Curtis空間(a)と非加重UniFrac空間(b)では社会集団を変更したNC州Shackleford Banksの雌馬とそうでない雌馬の間でβ分散推定値に差があったが、加重UniFrac空間では差がない(c). 各ポイントは糞便サンプル1個を表し、複数のサンプルを採取した雌馬もいる。各メトリクスのアルファ多様性の中央値を実線で示し、上下の破線はそれぞれ75分位と25分位を示す。
Bray-Curtis空間、UniFrac空間、および重み付けUniFrac空間では、研究年、島の地域、雌の体調、および複数の雌馬の反復測定の影響を制御した後でも、雌馬の糞便微生物群集は集団変化行動に基づき互いに著しく異なっていた（pall < .05; Table 4, Figure 3）。β多様性のすべての指標を用いると、糞便細菌群集も年によって変化した（p < .01；表4）。さらに、雌の体調と重み付けUniFrac空間における群集組成との間には、有意な関連があった（p = .008；表4）。
表4. PERMANOVA分析。
多様性指標TermdfSum sqR 2Fp値Bray-CurtisYear10.570.073.55.004島嶼部20.640.071.97.30体調10.240.031.47.13グループチェンジ状態10. 220.021.35.006Residual136.920.80––Total488.691.00––UniFracYear10.470.063.03.002Island region20.580.071.89.36Body condition10. 180.021.19.74Group change status10.190.021.23.04Residual436.610.82––Total488.081.00––Weighted UniFracYear10.010.149.43.004Island region20.000.051.73.27Body condition10.000.042.46.008Group change status10.000.042.41.01Residual430.040.66––Total480.071.00––
注：すべてのモデル項は限界有意性を評価し、すべてのモデルには同一繁殖牝馬の反復サンプリングを考慮した順列構造が含まれています。
図3
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ノースカロライナ州シャックルフォード・バンクスの繁殖牝馬による集団交代行動は、微生物群集組成の変化と関連しており、ブレイ・カーティス非類似度（a）、重み付けなし（b）および重み付けUniFrac距離（c）で説明できる。各ポイントは1つの糞便サンプルを表し、一部の繁殖牝馬は複数のサンプルを生産した。ストレス値は順序付け解のストレスを表し、印刷されたp値は微生物相の変動に対するグループチェンジステータスの寄与を説明するPERMANOVA分析から得られたものである（表4に報告）。
差異のある豊富な分類群
ANCOM-BCとMaAsLin2を用いて差分存在量分析を行う前に、サンプルの10％以上に存在する科と属のみを保持するようにカウントテーブルをフィルタリングし、69科の科レベルのカウントテーブルと136属の属レベルのカウントテーブルを得ました。また、あるグループ（グループを変更した雌馬、特定の島嶼地域の雌馬）において、FDR補正後のp値（q値）＜.05となる科や属が存在する場合、その科や属は差次的存在であると考えた。
3.3.1 差異的に豊富な細菌ファミリー
ANCOM-BCでは、群れを変える行動と関連する細菌ファミリーは示されなかったが、MaAsLin2では、群れを変えた牝馬の糞に多く含まれる細菌ファミリーとして、Bacteroidales目のEubacteriaceaeファミリーと未分類のファミリー（001）の2つが確認された（Table 5）。
表5. 表5. 群を変えた雌馬とそうでない雌馬の糞便サンプルから検出された、差分存在量分析に用いた方法、分類学的同一性のレベル（科または属）、最も差分のない（偶然に予想されるよりも検出されない）ものから差分の多い（偶然に予想されるよりも多く検出）ものに整理して示した、差を有する細菌科および属。
分類学的レベル方法分類IDログフォールドチェンジBetaSEp-Valueq-ValueFamilyANCOM-BC-------MaAsLin2Eubacteriaceae-0.640.19.0017830.030755Bacteroidales_UCG.001 –1.270.40.0026410.043384GenusANCOM-BCBlautia−0.80–0.249.78e-040.026624Lachnospiraceae NK4A136 group0.45–0.135.24e-040.023789Caldicoprobacter0.78–0.193.12e-050.004241Uncultured genus in Family: Marinifilaceae0.82–0.247.35e-040.025004p-1088-a5 gut group0.95–0.273.74e-040.023789MaAsLin2Blautia–−1.900.54.0012110.032267Eubacterium–0.640.19.0017820.013247Uncultured genus in Family: Erysipelotrichaceae–1.140.29.0003900.013246
3.3.2 差異的存在量のある細菌属
ANCOM-BCを用いた存在量差分解析により、4つの細菌属が同定された： ANCOM-BCを用いた存在量の差分解析により，グループチェンジした馬の糞便において，Marinifilaceae科のCaldicoprobacter（Clostridiales目，Firmicutes門），Lachnospiraceae属のNK4A136グループ，Pirellulaceae科の未名属（P-1088-a5_Gut_Group），が有意により存在し，1属が有意に存在量が少ないとされることがわかった（表5）．MaAsLin2を用いると、グループチェンジした馬の糞便で有意に存在量が多いErysipelotrichaceae科のEubacterium属と未培養の1属の2属と、グループチェンジした馬で存在量が少ない1属（Blautia）が確認されました（Table 5）。また、Blautia属のみ、両手法による存在量差分分析で、グループチェンジの行動によって変化することが確認された（図4）。
図4
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Blautia 属の細菌（門：Firmicutes、クラス：Clostridia）は、ノースカロライナ州Shackleford Banksの牝馬から採取した糞便サンプル52個中24個に存在した。この細菌は、グループを変更した牝馬の糞便では、変更しなかった牝馬の糞便よりも有意に少なかった（FDR補正後p < .05）。
3.3.3 体質、年、地域との関連性
いずれの解析方法でも、科や属レベルの分類群について、雌馬の体調との差異が確認されなかった。一方、両手法とも、いくつかの分類群（科・属レベル）について、調査年や地域との差分存在量を同定した。調査年との関連で差分存在量の多い9科と7属、調査地域との関連で差分存在量の多い3科と2属を検出した（表S3およびS4）。
4 考察
我々は、野生の雌馬において、糞便微生物叢の組成が集団変化行動（社会的不安定性の代理）と関連していることを明らかにした。予想に反して、リッチネス、イーブンネス、系統的多様性を含むアルファ多様性の指標は、グループを変更した雌馬とそうでない雌馬とで差がなかった。しかし、Bray-Curtis空間、UniFrac空間、および重み付けUniFrac空間において、群れを変えた雌馬の腸内細菌叢の組成は、そうでない雌馬の組成と異なることがわかった。これらの結果から、グループを変更した牝馬と変更しなかった牝馬の糞便微生物群集の組成には、小さい（R2 = .025, .038）ながらも有意な（p < .05）差があることがわかった。
PERMANOVAは、グループ間のばらつきを示すグループセントロイドの有意な移動を検出することを目的としており、コミュニティ間の差異を観察しました。しかし、この種の分析は、グループ内変動の大きな差によって混乱する可能性がある。この可能性に対処するため、我々はまた、牝馬のグループ間でベータ分散推定値を比較し、グループの変化行動に関連するBray-Curtis空間とUniFrac空間の違いを発見した。Bray-Curtis空間とUniFrac空間における組成の違いは、コミュニティ内の分散の不均一性、コミュニティメンバーの違い、あるいはレベルの異なる系統的な関連性によって引き起こされる可能性がある。もし、バンドを変更した牝馬の集団内変動が大きく、PERMANOVAで検出されたコミュニティレベルの差異を引き起こすとすれば、社会的不安定性が微生物叢の不安定性を誘発する可能性を示唆することになる。しかし、加重UniFrac空間における結果は、グループチェンジをした雌馬としなかった雌馬の細菌群集が組成的に異なるという、より決定的な証拠となる。具体的には、UniFrac空間では、群間セントロイドの差は、群内変動の差とは無関係であることが明らかになった。むしろ、重み付けUniFrac空間での解析は、糞便微生物群集の構成がより方向性をもって変化していることを示す証拠となった。これらの結果から、社会的擾乱（集団の変更行動など）は、細菌の多様性を豊かさや関連性（α多様性）で測定した場合、全体的なシフトを引き起こさない可能性があることが示唆された。むしろ、社会的擾乱は、群集構造のより微妙な変化を引き起こす可能性がある。これらの変化は、（群集を比較するために使用される指標によって）異なるレベルのグループ内変動や、細菌分類群の相対的存在量、群集内の分類群の同一性、および群集内の関連性（β多様性）の変化の組み合わせによって引き起こされる。本研究では、このようなシフトの結果については触れていないが、このようなシフトを検出し、そのメカニズム的な起源を考えることで、集団生活を営む動物における社会的摂理の連鎖的影響について明らかにすることができるかもしれないと主張している。
このような変化を引き起こすメカニズムは無数に存在する可能性がある。例えば、微生物群集組成の変化は、しばしば食餌の変化と関連している（Amato et al., 2013; Ley et al., 2006, 2008; Turnbaugh et al., 2009; Wu et al., 2011; Yildirim et al., 2010）。本研究では、食餌の変化（飼料と水源の両方の変化を含む）、および／または新たに出会った個体間の微生物移動の増加（集団切り替え行動の成功後に発生する生息域および／または地域の変化に伴う）が、雌馬の糞便微生物群集の変化に重要な役割を果たしたと考えられる（Stothartら、2021年）。野生の馬のホームレンジとグループ構成は一般的に安定しており（Berger, 1977; Feist & McCullough, 1976; Klingel, 1975; Linklater et al., 2000; Rubenstein, 1981）、より一貫した食事と環境微生物相をもたらし、それによってグループメンバー間の微生物相の類似性を促進します（Antwis et al., 2018; Stothart et al., 2021）．コミュニティ間の分散の増加は、個体群を安定させると考えられています（Crowley, 1981）。しかし、繰り返しグループを変える雌馬は、1つの場所（地域またはホームレンジ）を代表する微生物コミュニティを開発するほど長くグループにとどまらないかもしれません。代わりに、新しい環境と新しいグループメンバーからの細菌コミュニティへの暴露が増加します。半野生のウェールズポニーを用いた研究では、微生物群集は空間的な構造化、さらにはバンド内の特定の社会的相互作用によって変化しうることが実証されています（Antwis et al., 2018）。同様に、グループを変更した雌馬は、各バンドに留まる期間に応じて、1つのバンドから他のバンドへの糞便微生物群集の移行を経験する可能性が高いが、再び、これらのコミュニティは任意の1つの場所を代表するものではない場合がある。このような「移行期」の微生物群集は、離散するヒヒのオスで実証されている：現在の社会集団での生活期間が短い移民のオスは、集団での生活期間が長いオスに比べて、他の長期集団居住者との類似性が低い微生物群集を有していた（Grieneisen et al.、2017）。このような「移行期」の微生物群集は、集団を変える雌馬（特にこの行動をより頻繁に行う雌馬）を、環境の変化（それが周囲の環境の変化（干ばつ、ハリケーン、気温の上昇／低下などによる）であれ、宿主自身の生理的変化（生殖状態、集団への参加、体調などによる）であれ）のより感受性が高い状態に置くかもしれません（McKenzie et al.、2017. 本研究では、そのような効果を検証するのに十分なサンプルサイズがなかった。今後の研究では、これらの遷移を利用し、その潜在的な効果をモニターすべきである。
年度と繁殖牝馬の糞便微生物群集の間に強い関連があることは、生態学的な違い、食餌のシフト、および/または社会的ダイナミクスの変化など、研究期間中のいくつかの変化を示していると考えられる。調査期間中の平均気温と最高気温は、各年でほぼ同じであった（表6）。平均降水量は2015年にわずかに多かったが（表6）、この比較的小さな差だけで雌馬の微生物群集の年による著しい違いを説明できたとは考えにくい。これらの条件は、年度をまたいで同じような飼料を入手できることを示す可能性があるが、食餌のシフトを否定することはできない。とはいえ、社会性の微妙な違いも野良馬の微生物群集組成に影響を与えることが示されている。先に述べたように、半野生のウェールズポニーを用いた研究では、バンド間、さらにはバンド内のより密接に関連する個体間で、より類似した糞便微生物群集が示され、密接な仲間間での細菌分散の重要性が示されました（Antwis et al., 2018）。ノバスコシア州セーブル島の野良馬を用いた研究では、同様の効果が示され、野良馬の微生物群集に対する親の状態（雌馬の間）と生態学的ドリフトの重要性が明らかになった（Stothart et al.、2021）。これらの互いに排他的でない効果のいずれか1つまたはいくつかが、年によって異なる形で牝馬の微生物叢に影響を与えた可能性がある。
表6. 試験期間中の平均気温、最高気温、平均降水量（±標準誤差）（National Climate Data Center、2022年）。
年平均気温平均最高気温平均降水量2015年26.26℃ ± 0.0229.49℃ ± 0.025.19 cm ± 0.14201626.90℃ ± 0.0230.15℃ ± 0.013.65 cm ± 0.01
しかし、年、島嶼地域、繁殖牝馬の体調を考慮しても、群れを変えるという共通の行為が微生物群集の変化と関連しており、社会的動揺そのものが繁殖牝馬の微生物群集の変化の少なくとも一部と関連していることを示しています。群れを変える行動は、シャックルフォードの雌馬にストレス反応を引き起こす可能性があります（Nuñez et al.、2014）。群れを変える雌馬は、常駐する種馬が群れに戻そうとする際に、しばしば追いかけられ、時には蹴られたり噛まれたりする（Madosky et al.、2010）；常駐種馬と新種馬の両方による繁殖行動のレベルが上がる（Nuñez et al.、2009）；そしてしばしば、非常にエスカレートした雄雄の衝突の近くに身を置く（Jones & Nuñez、2019）。さらに、新しいバンドへの変更を成功させた雌馬は、常駐する雌馬からの攻撃を受けることが多い（C. M. V. Nuñez, unpublished data）。今回示された違いが雌馬のストレス生理学によるものであることを確認することはできませんが、慢性的または長期的なストレス要因は、実験室と野生の両方で多様な分類群の微生物群集に影響を与えます。マウス、アカゲザル、アカリス、イエローレッグカモメ、サンゴはすべて、ストレスの増加に伴い微生物相に変化を示します（Bailey et al., 2010, 2011; Bailey & Coe, 1999; Noguera et al., 2018; Stothart et al., 2016; Zaneveld et al.、2016）。本研究に最も関連するのは、輸送、離乳、および大腸炎感染が家畜馬の微生物叢に及ぼす影響です（Costaら、2012；Machら、2017；Schosterら、2016）。無数の変化が記録されていますが、Clostridiales目の細菌の相対的存在量の減少とBacteroides属の細菌の存在量の増加が顕著です（Costa et al., 2012, Mach et al., 2017, Schoster et al., 2016）。
興味深いことに、グループを変えた牝馬の間で、Blautia属の細菌が一貫して枯渇するパターンを発見しました。Blautia属には、以前はClostridium属とRuminococcus属に分類されていたいくつかの細菌が含まれています（Liu et al.、2021）。この属の細菌は厳密に嫌気性であり、この属のいくつかの株は、プロバイオティクス活性および抗炎症活性と関連している（Liu et al.、2021）。飼育馬では、Blautia菌の存在量の増加が肥満表現型と関連しており（Biddle et al., 2018）、日本でヒトを研究している研究者は、Blautia相対存在量と内臓脂肪蓄積の間に強い負の関係があると指摘しています（Ozato et al., 2019）。私たちの研究は、食事や代謝の測定を含まず、Blautiaの存在量と雌馬の健康や体の状態の指標との間の関連は描かれていません。にもかかわらず、Blautia属の細菌と宿主の食事や代謝との間に強い関連があること、および集団変化行動が食事のシフトを伴う可能性があることを以前に議論したことを考えると、Blautia存在量の一貫したシフトの観察は、社会的摂動（集団変化）が腸内細菌相に変化をもたらす可能性のあるメカニズムについて興味深い一瞥を提供するものです。
全体として、今回の発見は、雌馬の群れ替え行動は糞便微生物群集に存在する細菌分類群の数とは関連しないが、細菌分類群の相対的な存在量、分類学的同一性、関連性の違いを説明する可能性があり、群れ替えを行う雌馬は、典型的（非群れ替え）微生物群集からの移行を示すことが示唆された。その正確な原因（社会的混乱とそれに伴う行動・生理的影響、食事の変化、新しい個体による微生物移行の増加など）にかかわらず、これらの変化は、栄養吸収を微生物相に大きく依存している草食動物にとって重要であることが判明しました。しかし、集団行動の変化に伴う雌馬の糞便微生物群集の変化が有益、有害、中立のいずれであるかは、直接操作してみなければ明確に判断できない。また、群れを変えた牝馬が、その行動によって微生物群集に変化をもたらすのか、それとも最初から群れに属している牝馬とは異なる群集を保有するのか、判断することはできません。群れを変える行動の前後で雌馬を採取することでしか、このダイナミズムをよりよく理解することはできません。しかし、フィールドワークのロジスティックスと糞便採取のセレンディピティにより、この分析を行うための十分なサンプルサイズが得られなかった（前サンプルn=8、後サンプルn=7）。さらに、蠕虫レベル（Koch & Schmid-Hempel, 2011; Zaiss & Harris, 2016）や免疫反応（Macpherson et al., 2018）などの他の要因が、雌馬の微生物叢の変化と相関する可能性がある方法を調べることは、そのような変化の潜在的なメカニズムをよりよく理解するために重要である。
まとめると、私たちの結果は、高度に社会的で微生物相に依存する哺乳類である野良馬の細菌コミュニティに、社会的混乱とコミュニティレベルのシフトを結びつけています。社会的相互作用と微生物叢の相関は野生でも実証されていますが（Antwis et al., 2018; Stothart et al., 2021）、今回の研究は特定の社会的擾乱と微生物叢の関連を示唆しており、動物の行動と生理の間の無数の関連性をさらに解明しています。さらに、私たちの結果は、重要な管理上の意味を持つ可能性があります。避妊した雌馬が示した行動と生理の変化は、管理戦略が野生動物にとって予期せぬ、そして広範囲に及ぶ影響を与える可能性を浮き彫りにしています。PZPで治療したシャックルフォードの雌馬は、未治療の雌馬よりもグループを変える頻度が高く、より多くのグループに参加する（Madosky et al., 2010; Nuñez et al., 2009）；これらの行動効果は、治療終了後も長期に渡って持続しうる（Nuñez et al., 2017）。PZPは、オジロジカ（Odocoileus virginianus; McShea et al., 1997）、エルク（Cervus canadensis; Heilmann et al., 1998）、絶滅危惧種のアフリカゾウ（Loxodonta africana; Bertschinger et al., 2018）、プシェバルスキー馬（Equus ferus przewalskii; Kerekes et al, 2021）などの世界中の動物集団の制御に使われています。シャックルフォードに関する私たちの以前の研究は、より少ない避妊処置を長期間にわたって行うことで、より自然な行動と生殖生理を維持し（Nuñez et al., 2017）、ストレスを軽減できることを示しています（Nuñez et al., 2014）。今回のデータを考えると、こうした管理方法は、処置した雌馬における重要な共生関係も維持できる可能性があります。このような関係が他の管理された野生動物でも維持されるかどうかは、今後の研究の焦点として価値があるように思われる。
著者貢献
グレース・J・ヴァジリ： データキュレーション（同等）、正式解析（リード）、可視化（リード）、執筆-原案（同等）、執筆-レビューおよび編集（同等）。マギー・M・ジョーンズ 調査（同等）、方法論（同等）。ヘイリー・A・カー（Haley A. Carr 調査(均等)．カサンドラ M. V. ヌニェス．概念化（リード）、データキュレーション（同等）、形式分析（サポート）、資金獲得（リード）、調査（サポート）、方法論（同等）、プロジェクト管理（リード）、リソース（リード）、監督（リード）、可視化（サポート）、執筆-原案（同等）、執筆-レビューおよび編集（同等）。
謝辞
ケープ・ルックアウト国立海浜公園の国立公園局のSue Stuska博士には、フィールドでの支援と馬の歴史的データの提供に感謝する。また、Maggie Kent、Kaylee Monroe、Micah Fatkah、Rachel Schwartzbeckには、現地での協力に感謝する。James Adelman博士には、統計のアドバイスと、本論文の初期バージョンに対する丁寧なコメントをいただき、特別に感謝します。また、本論文の改善にご協力いただいた3名の匿名査読者に感謝する。本研究は、(1)アイオワ州立大学（農学生命科学部、自然資源生態管理学部）よりC.M.V.N.に助成を受けた。 (2) USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Multistate Funding (project IOW05509) to C.M.V.N.; (3) National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1744592 to M.M.J.; and (4) Iowa State University's Science With Practice program (H.A.C.). 本資料で表明された意見、発見、結論または勧告は、著者らのものであり、必ずしも全米科学財団の見解を反映するものではありません。サンプル収集と分析は、国立公園局の研究収集許可証CALO-2015-0013およびCALO-2016-SCI-0006の下で実施された。私たちの非侵襲的な方法を考慮し、アイオワ州立大学および国立公園局の施設管理・使用委員会は、許可は必要ないと判断しました。
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