記事｜41巻8号111709号2022年11月22日発行
線維芽細胞はTIMP2を介して血液脳関門損傷と出血性脳損傷を修復する
徐 玲玲　
Abhijit Nirwane
徐廷
Minkyung Kang
Karan Devasani
ヤオ・ヤオ3

脚注を表示するオープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111709

ハイライト

Col1α1+線維芽細胞の消失は出血性脳損傷を悪化させる

Col1α1+線維芽細胞の切除は、ICH後のBBB損傷を悪化させる

Col1α1+線維芽細胞はICHによるBBB損傷を傍系細胞機構を介して修復する

Col1α1+線維芽細胞は、TIMP2依存的にICHによるBBB障害を修復する。
まとめ
脳出血における線維芽細胞の機能はいまだ不明である．線維芽細胞特異的マーカーであるCol1α1を標的とし、Col1α1+線維芽細胞を欠損させたマウスを作製した。これらの変異体は、血液脳関門（BBB）障害の悪化、傷害体積の拡大、神経機能の悪化を示し、ICHにおけるCol1α1+線維芽細胞の有益な役割を明らかにした。これらの知見を裏付けるように、線維芽細胞はin vitroのICHモデルにおいて内皮の透過性を有意に低下させる。次に、線維芽細胞は、トランスサイトーシス関連タンパク質に影響を与えることなく、主にタイトジャンクションタンパク質のアップレギュレーションを介して、ICHにおけるBBBの完全性を促進することを証明し、トランスセルラーではなくパラセルラーのメカニズムを示す。その結果、線維芽細胞のBBB保護作用の一部は、TIMPメタロペプチダーゼインヒビター2（TIMP2）が介在していることが明らかにされた。さらに、外因性TIMP2がICH後のこれらの変異体におけるBBB破壊を減弱させることも見いだした。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞がTIMP2依存的に傍細胞経路を介してICHのBBB損傷を修復することを示唆し、ICH治療においてCol1α1+線維芽細胞とTIMP2が標的となり得ることを示唆している。
グラフィカルな要旨
図1.サムネイルfx1
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キーワード
血液脳関門
脳内出血
線維芽細胞
TIMP2
研究テーマ
CP:分子生物学
CP：発生生物学
はじめに
線維芽細胞は、異種細胞集団であり、創傷治癒など多くの重要な機能に関与している1,2,3。CNSでは、線維芽細胞は主に髄膜と血管周囲に存在する4。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）、脊髄損傷（SCI）、虚血性脳卒中、散発性筋萎縮性側索硬化症などの様々な神経疾患において、線維芽細胞が活性化し、線維性瘢痕の形成に寄与しているという証拠が増えつつあります4、5、6、7、8、9 しかしながら、線維芽細胞の活性化の機能的意義と線維性瘢痕の役割については議論があるところです。一方では、線維芽細胞が有害な機能を発揮していることが報告されている。例えば、瘢痕組織中の線維芽細胞由来の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質は、CNS損傷後の神経細胞の再生を阻害する。10,11,12 これらの知見と一致して、増殖するCol1α2発現線維芽細胞を切除すると、EAE慢性期においてオリゴデンドロサイト系細胞の増加や運動機能の改善が認められる7 一方、線維芽細胞の有益な役割を示す証拠も存在している。例えば、血小板由来成長因子受容体α（PDGFRα）+線維芽細胞は、虚血性脳卒中の亜急性期において血液脳関門（BBB）の完全性を保護し、出血性変化を抑制する13。さらに、線維芽細胞を含むと思われる「タイプA」周皮細胞の生成を阻害して瘢痕形成を抑制すると、SCIモデルで組織封鎖ができなくなる14。
これらの論争の的となる知見は、線維芽細胞特異的マー カーの欠如により説明されるかもしれない。PDGFRα、PDGFRβ、Col1α2を含むいくつかのマーカーが線維芽細胞の同定に用いられてきたが、7,8,13 これらのマーカーはいずれも線維芽細胞には特異的でない。例えば、PDGFRαは線維芽細胞とオリゴデンドロサイト前駆細胞の両方を標識し、15 PDGFRβとCol1α2は線維芽細胞と壁細胞の両方を標識する4、16 これまでの研究における「線維芽細胞」集団には、CNS損傷にも高い反応を示す壁細胞などの汚染された細胞も含まれていると思われます。最近のシングルセルRNAシークエンス（RNA-seq）解析により、Col1α1が脳の他の細胞ではなく、線維芽細胞に選択的に発現していることが明らかになった16ことから、Col1α1を用いて線維芽細胞を特異的に標識することができる可能性がある。
脳内出血は脳卒中全体の10-30％を占め、最も死亡率・罹患率の高い病態です17, 18, 19。残念ながら、脳内出血の病態解明が不十分であるため、有効な治療法はありません。虚血性脳卒中では線維芽細胞が活性化し、BBBの健全性を促進しますが、ICHにおける線維芽細胞の機能は依然として不明です13,20。
本研究では、Col1α1+線維芽細胞がICHにおいて有益な役割を果たすことを報告した。さらに、Col1α1+線維芽細胞は、TIMP metallopeptidase inhibitor 2 (TIMP2) 依存的に、傍細胞経路を介してICH後のBBB修復を促進することを示した。これらの知見は、Col1α1+線維芽細胞とTIMP2が、ICHの治療において標的となり得ることを示唆している。
研究結果
Col1α1+線維芽細胞は、FKOマウスでは恒常性条件下では減少していない。
最近のシングルセルRNA-seq解析により、Col1α1がCNSの線維芽細胞に特異的に発現していることが示された16。この線維芽細胞を選択的に標的とするために、本研究ではCol1α1-Creマウスを使用した。まず、Ai14+/-:Col1α1-Cre+ (Col1α1-tdTomato)マウスを用いて系統樹の研究を行った。シングルセルRNA-seqデータと一致して、tdTomato+細胞は、恒常性条件下で主に髄膜と大血管に見られた（図1A ）。しかし、すべてのCol1+血管がtdTomatoを発現しているわけではないことに注意が必要である（図1A）。定量的には、Col1+血管面積の34.9%、Col1+血管長の34.7%がtdTomatoを発現しており（図1B）、Col1α1プロモーターが通常状態では弱い可能性が示唆された。また、tdTomatoは脳実質ではなく血管でPDGFRαと合流し（図1C）、線維芽細胞マーカーRALDH2と部分的に共焦点化した（図1C）。これらの結果は、Col1α1-Creが線維芽細胞のサブ集団を特異的に標識していることを示唆している。
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図1Col1α1+線維芽細胞の系譜トレース
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Col1α1+線維芽細胞の機能を調べるために、Col1α1+線維芽細胞にジフテリア毒素受容体（DTR）を発現させたマウス（DTR+/-：Col1α1-Cre+、FKOと呼ぶ）を用いて機能喪失試験を行った。このCol1α1+線維芽細胞を破壊するために、FKOマウスとコントロールにジフテリア毒素（DT、500 ng）を5日間連続で毎日腹腔内注射し、最後の注射の24時間後に分析を行った（図S1A）。生理食塩水を注射したFKOマウスとDTを注射したDTR+/-同腹子の両方をコントロールとして使用した。興味深いことに、FKOマウスとコントロールは、恒常性条件下で脳内に同程度のCol1発現を示した（図S1BおよびS1C）。安定したECMタンパク質であるCol1は、線維芽細胞数を正確に反映することができない可能性がある。そこで、PDGFRα+Olig2-細胞の定量による線維芽細胞数の検討も行ったが、コントロールとFKOの脳で差は見られなかった（図S1DおよびS1E）。さらに、in situ hybridization解析を行ったところ、Col1α1（mRNA）陽性細胞の数は、コントロールとFKOマウスで同程度であった（図S1FおよびS1G）。これらの知見は、FKOマウスではCol1α1+線維芽細胞が恒常的な条件下では効率的に切除されないことを示唆している。
1つの可能性として、腹腔内投与されたDTはBBBを通過してCNSの線維芽細胞を切除することができないことが考えられる。この可能性を探るため、我々は浸透圧ポンプを用いてFKOマウスの側脳室にDTを直接投与した。興味深いことに、コントロールとFKOマウスは、同等のCol1レベル（図S2AおよびS2B）、PDGFRα+Olig2-細胞（図S2CおよびS2D）およびCol1α1+細胞（図S2EおよびS2F）を呈した。これらの結果は、恒常性条件下での線維芽細胞切除の失敗は、腹腔内注射されたDTのCNSへの浸潤の欠如によるものではないことを強く示唆している。むしろ、恒常性条件下でのCol1α1プロモーターの活性が弱いためであろう。
線維芽細胞切除の欠如と一致して、FKOマウスは恒常性条件下で肉眼的に正常であった。機能的研究により、恒常性条件下でのFKO脳ではビオチン（図S3A）およびヘモグロビン（図S3B）のレベルがごくわずかであり、BBBの完全性が損なわれていないことが示された。これらの結果と同様に、ゾナ・オクルーデンス1（ZO-1；図S3CおよびS3D）およびオクルディン（図S3EおよびS3F）を含むタイトジャンクションタンパク質（TJP）および周皮細胞カバー（図S3GおよびS3H）は対照およびFKO脳で同レベルであることがわかった。これらの結果から、FKOマウスではCol1α1+線維芽細胞は恒常性条件下では壊滅していないことが改めて示唆された。
FKOマウスでは、ICH後にCol1α1+線維芽細胞が破壊される
線維芽細胞はさまざまなタイプの傷害の後に活性化されるため4、FKOマウスの表現型はICHモデルでさらに特徴づけられた。同様に、まずICH後のCol1α1-tdTomatoマウスを用いて系統追跡調査を行った。損傷後2日目にはtdTomato+細胞はほとんど検出されなかったが、これらのtdTomato+細胞はICH後5日目に損傷部位で実質的に増加した（図S4A）。ICH後7日目には、tdTomato+細胞は血腫周囲に集積し、瘢痕様構造を形成していた（図S4A）。この結果と一致して、Col1はICH後に同様の発現パターンを示した（図S4BおよびS4C）。免疫組織化学的解析の結果、血腫周辺部ではtdTomatoがCol1、PDGFRα、PDGFRβ、RALDH2などの複数の線維芽細胞マーカーと共局在しており（図1Dおよび1E）、これらの細胞が線維芽細胞であることが示された。しかし、瘢痕のすぐ外側の領域では、tdTomatoはPDGFRβと共局在化したが、Col1ではなかった（図1F）。さらに、tdTomatoシグナルはこの瘢痕周囲の領域で小血管と関連していた（図1F）。さらに解析すると、ICH後7日目にtdTomato+線維芽細胞が毛細血管に集積したが、偽のコントロールでは認められなかった（図1G-1I）。興味深いことに、これらのtdTomato+細胞は、NG2やDesminを含む典型的な壁細胞マーカーを発現していなかった（図1J）。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞がICH後に毛細血管に移動し、血管の健全性の修復に関与している可能性があることを示唆している。
次に、ICH後のFKOマウスにおける線維芽細胞の切除効率について検討した。DTはICH後-2、-1、0、1、2、3、5日目に投与された（図2A ）。時間経過研究により、ICH後2日目ではなく5日目と7日目に、FKO脳では対照と比較して損傷部位のCol1レベルが有意に減少していることが明らかになった（図2B、2C、S4B、およびS4C）。脳内の線維芽細胞数をより正確に定量するために、PDGFRαとOlig2に対する共染色を行った。コントロールと比較して、FKOマウスはICH後7日目の損傷部位でPDGFRα+Olig2-線維芽細胞の約69%の減少を示した（図2Dおよび図2E）。さらに、in situ hybridizationで傷害部位のCol1α1発現を検出したところ、FKOマウスではCol1α1+細胞の数が劇的に減少していた（図2F、2G）。これらの知見は、ICH後のFKOマウスではCol1α1+線維芽細胞が実質的に消失していることを示唆している。
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図2ICH後のFKOマウスではCol1α1+線維芽細胞が破壊されている。
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Col1α1+線維芽細胞の切除はICHの転帰を悪化させる
21 対照マウスとFKOマウスは、ICH後2日目には同程度の血腫サイズを示し（図3Aおよび3B）、初期損傷が同程度であることが示された。しかし，受傷後5日目と7日目には，FKOマウスは有意に大きな傷害体積を示した（Figure 3A and 3B）．血腫の大きさと同様に、FKOマウスは生存率が著しく低下し（図3C）、受傷後7日目にはfluor jade C陽性（FJC+）の変性ニューロンが多く、神経細胞死の悪化が示唆された（図3Dおよび3E）。対照マウスは受傷後6日目には動き回ることができたが（動画S1）、FKOマウスは動き回ることができなかった（動画S2）。この観察と同様に、FKOマウスはICH後の亜急性期において、コントロールと比較して有意に高い神経学的欠損スコアを示し（図3F）、神経機能の悪化を示唆した。これらの結果は、ICHにおけるCol1α1+線維芽細胞の有益な役割を強調するものである。
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図3Col1α1+線維芽細胞のアブレーションはICHの転帰を悪化させる
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動画S1. 図3に関連する、ICH後6日目のコントロールマウスの代表的な動画

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動画S2. FKOマウスのICH後6日目の代表的な映像（図3関連
Col1α1+線維芽細胞の切除は、ICHの亜急性期におけるBBB障害を悪化させる。
免疫組織化学的データと一致して、ICH後7日目のFKOではなくコントロールの脳では、毛細血管を包むように突起を伸ばした線維芽細胞が透過型電子顕微鏡で頻繁に観察された（図4A ）ことから、ICH後のBBB修復におけるCol1α1+線維芽細胞の役割の可能性が再び示唆された。BBB の崩壊は二次的な脳損傷の原因となり、ICH の転帰と相関している22 。次に、内因性マーカーを用いて ICH 後の FKO マウスとコントロールマウスの BBB インテグリティを調べた。ICH後2日目のFKOとコントロールの脳では、IgG（図4Bと4C）とヘモグロビン（図4Dと4E）が同レベルであり、やはりこれらのマウスでは初期損傷が同程度であることが示された。しかし、ICH後7日目には、FKO脳でIgG（図4Bおよび4C）とヘモグロビン（図4Dおよび4E）が劇的に増加し、BBB破壊がより深刻であることが示唆された。これらの知見と一致して、FKOマウスはICH後7日目に、対照群と比較して、外因性トレーサーであるビオチンの漏出が促進されていた（図4Fおよび4G）。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞がICH後のBBB修復に重要な役割を担っていることを示唆している。
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図4Col1α1+線維芽細胞のアブレーションはBBB障害を増悪させる
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Col1α1+線維芽細胞の切除は傍細胞リークを増加させる
BBBのバリア機能には、副細胞的なメカニズムと超細胞的なメカニズムの両方が寄与している。23,24 ICH後のFKOマウスにおけるBBB崩壊の亢進が傍細胞漏出の悪化に起因しているかどうかを調べるために、2つのTJP（ZO-1とオクルディン）の発現を免疫組織化学的に検討した。FKOマウスと対照マウスは、偽薬投与群とICH後2日目ではZO-1とオクルディンが同レベルであったが、FKOマウスではICH後7日目に両TJPが劇的に減少した（図5A〜5D ）。これらの生化学的変化と同様に、ICH後7日目のFKOマウスでは、タイトジャンクションの超微細構造の変化が観察された。具体的には、タイトジャンクションは、コントロールの脳では電子密度が高く、よく形成されていたが、FKOの脳では電子が軽くなり、破壊された（図5E）。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞がTJPの発現とタイトジャンクション構造を制御することによって、ICH後のBBBの完全性を修復していることを示唆している。
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図5Col1α1+線維芽細胞のアブレーションはタイトジャンクションの破壊を増加させる
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Col1α1+線維芽細胞の切除は細胞外漏出に影響を与えない
トランスサイトーシスの増加が、ICH後のFKOマウスにおけるBBBリークの悪化に関与しているかどうかを調べるために、免疫組織化学的にmeca32とカベオリン-1の発現を評価した。コントロールとFKOマウスは、ICH後7日目には同等のmeca32の発現を示した（図S5AおよびS5B）。さらに、内皮カベオリン-1は、ICH後7日目にコントロールとFKOマウスで同程度に観察された（図S5Cと図S5D）。これらの結果と同様に、透過型電子顕微鏡により、ICH後7日目のコントロールとFKOマウスにおいて、内皮のピノサイトーシス小胞の数は同程度であった（図S5Eと図S5F）。これらの結果は、ICH後の亜急性期におけるCol1α1+線維芽細胞を介したBBB修復において、トランスセルラー経路は最小限の役割しか果たしていないことを示唆している。
Col1α1+線維芽細胞の切除は、アストロサイトの極性ではなく、周皮細胞の被覆に影響を与える
蓄積された証拠は、周皮細胞被覆率27,28とアストロサイト極性29の両方がBBBの完全性に積極的に寄与していることを示唆している。我々はまず、ICH後のコントロールとFKOマウスで、周皮細胞被覆率を調べた。偽薬群およびICH後2日目には影響がなかったが、ICH後7日目のFKOマウスでは、PDGFRβ強度（図S6AおよびS6B）およびCD31+毛細血管上のPDGFRβ被覆率（図S6AおよびS6C）は対照と比較して劇的に減少した。同様の結果は、CD13とポドカリキシンをそれぞれ周皮細胞マーカーと血管マーカーとして用いた場合にも観察された（図S6D-S6F）。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞がICH後の周皮細胞被覆を増強することを示唆している。次に、線維芽細胞の切除がアストロサイトの極性に影響を与えるかどうかを、アクアポリン4（AQP4）とCD31の共染色を行うことで検討した。AQP4の発現と被覆率は、ICH後2日目と7日目にコントロールとFKOの両方の脳で血腫周辺領域で大幅に減少したが、遺伝子型間の有意差は観察されなかった（図S6G-S6I）ので、ICH後のアストロサイト極性におけるCol1α1+繊維芽細胞の役割は小さいことが示唆された。
線維芽細胞はin vitroのICHモデルで内皮バリアー統合を促進する
具体的には、ヘモグロビン活性化マイクログリア調整培地を、初代脳微小血管内皮細胞（BMEC）を上側チャンバーに、線維芽細胞を下側チャンバーに、または線維芽細胞を含まないトランスウェルシステムに添加しました（図6A ）。共培養システム（BMECs と線維芽細胞）は、単培養システム（BMECs 単独）と比較して、ICH 導入後 48 時間に有意に高い経内皮電気抵抗（TEER；図 6B）と 4kDa フルオレセインイソチオシアナート（FITC）-デキストラン（図 6C）の漏出を減少させた。bEnd3細胞（マウス脳内皮細胞株）を用いた場合にも同様の結果が得られた（図S7Aおよび図S7B）。これらの結果は、このin vitro ICHモデルにおいて、線維芽細胞がBBBの完全性を高める機能を有していることを示唆している。
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図6線維芽細胞由来のTIMP2がin vitro ICHモデルでBBBインテグリティを促進する様子
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in vivoのデータと同様に、in vitroのICHモデルでは、線維芽細胞がTJPの再分布と発現に優位な影響を及ぼしました。傷害を受けていないBMECでは、ZO-1とclaudin5が細胞境界に多く見られた（図6D）。しかし、in vitro ICHの後では、TJPのこの細胞境界の分布パターンは失われた（図6D）。興味深いことに、線維芽細胞は、ICH後の細胞境界での両TJPの発現を大幅に増加させ（図6D）、TJP再分配における線維芽細胞の重要な役割を浮き彫りにした。さらに、線維芽細胞は、in vitro ICH後のbEnd3細胞において、ZO-1（図S7C）、オクルディン（図S7D）、およびクローディン5（図S7E）の総発現レベルも劇的に増加させた。TJPとは異なり、カベオリン-1やメカ32を含むトランスサイトーシス関連タンパク質の発現は、BMEC（図6E）またはbEnd3細胞（図S7F）の線維芽細胞によって影響を受けなかった。これらの結果は、線維芽細胞がICH後に内皮バリアの完全性を修復する分子を、主に経細胞的ではなく傍細胞的なメカニズムで分泌していることを示唆している。
質量分析による線維芽細胞分泌分子のスクリーニングと同定
線維芽細胞から分泌される分子をスクリーニングするために、濃縮調整培地を用いて液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を実施した。その結果、合計66個の線維芽細胞由来タンパク質が同定された（表S1）。これらのタンパク質のうち、2（3.03％）が核タンパク質、16（24.24％）が細胞質タンパク質、2（3.03％）が細胞膜タンパク質、25（37.88％）がECMタンパク質、そして21（31.82％）が分泌タンパク質であった（図6F）。線維芽細胞は内皮細胞と直接接触することなくバリア機能を修復できることから（図6A〜6E）、主に分泌型タンパク質に着目した。TIMP2とPAI1（plasminogen activator inhibitor 1）という2つのタンパク質は、（1）線維芽細胞で高発現していること（表S1）、（2）両タンパク質が脳卒中時にBBB保護活性を示したこと、という理由からさらなる研究に選ばれた32,33,34,35。
線維芽細胞由来TIMP2はin vitroでICHによるBBB損傷を修復する
TIMP2とPAI1のICH後のBBBインテグリティにおける機能を調べるために、in vitro ICHモデルで機能ブロック抗体を用いた機能喪失試験を行った。IgGコントロールと比較して、TIMP2機能ブロック抗体は内皮-線維芽細胞共培養系でTEER（図6G）を有意に減少させ、4kDa FITC-デキストラン漏出（図6H）を増加させた。興味深いことに、PAI1機能ブロック抗体はTEER（図6G）および4-kDa FITC-デキストラン漏出（図6H）に影響を与えなかった。これらの結果は、PAI1ではなくTIMP2がin vitroのICHモデルにおける内皮バリアの完全性に寄与していることを示唆している。線維芽細胞由来のTIMP2のBBBインテグリティにおける機能をさらに検証するために、レンチウイルスを介したRNAi技術を用いて線維芽細胞におけるTIMP2発現をノックダウンした（図6I）。薬理学的アプローチと同様に、線維芽細胞におけるTIMP2のノックダウンは、コントロールと比較してTEERを大幅に低下させ（図6J）、4kDa FITC-デキストラン漏出を促進した（図6K）。これらの結果は、線維芽細胞がICH後のBBB損傷を少なくとも部分的にTIMP2を介して修復することを示唆している。
TIMP2によるICH誘発BBB損傷の修復
TIMP2がICHによるBBB損傷を回復できるかどうかを調べるために、まず、初代BMECを用いたin vitroのレスキュー実験を行った（図6L）。組換えTIMP2は、in vitro ICHモデルにおいてTEERを大幅に向上させ（図6M）、4kDa FITC-デキストランの漏出を減少させた（図6N）。さらに、TIMP2は、BMECの細胞境界におけるZO-1とclaudin5の発現を増加させたが（図6O）、カベオリン-1とmeca32の発現には影響を及ぼさなかった（図6P）。これらの知見は、TIMP2がin vitroのICHによる血管漏出を主に傍細胞機構を介して減弱させることを示唆する。
次に、TIMP2が生体内のBBBの健全性とICHの転帰に及ぼす影響についてさらに検討した。FKOマウスの脳に、組み換えTIMP2または生理食塩水（コントロール）を、浸透圧ポンプを用いて4日間（ICH後3-7日目）注入した。免疫組織化学の結果、この方法はICH脳内のTIMP2レベルを大幅に上昇させた（図7Aおよび図7B ）。TIMP2処理は、ICH後7日目のFKOマウスの血腫体積を大幅に減少させた（図7Cおよび図7D）。さらに、TIMP2投与後のFKOマウスでは、脳実質におけるヘモグロビン（図7Eおよび7F）およびビオチン（図7Gおよび7H）の蓄積が対照群と比較して有意に減少しており、BBBの健全性が改善されていることが示された。我々の機構的データと一致して、ZO-1（図7Iおよび7J）およびオクルディン（図7Kおよび7L）のレベルは、TIMP2処置したFKOマウスにおいて劇的に上昇した。これらの結果は、TIMP2がICHによって引き起こされたBBBの損傷をin vivoで修復することを示唆している。興味深いことに、PDGFRβの被覆は、FKOマウスにおけるTIMP2処理によって救済されなかった（図7M及び7N）。これは、このモデルにおける周皮細胞の被覆におけるTIMP2の最小限の役割を示している。これらの知見は、Col1α1+線維芽細胞がBBB損傷および出血性脳損傷を部分的にTIMP2を介して修復することを示唆している。
図 サムネイル gr7
図7TIMP2投与によるFKOマウスin vivoでのBBBインテグリティの向上
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考察
Col1α1+細胞は、恒常性維持下において主に脳の髄膜と大血管に存在し、Col1、PDGFRα、RALDH2を含むすべての線維芽細胞マーカーを発現することが示された（ただし、一部共局在化が認められるのみであった）。これらの解剖学的、生化学的特徴は、Col1α1-CreがCNSの線維芽細胞の亜集団を特異的に標識していることを示唆している。Col1α1プロモーターの活性は、Col1+細胞の約35%しかtdTomatoを発現しないため、恒常的な条件下では弱いということは注目に値する。線維芽細胞の傷害に対する高い反応性と一致して、Col1α1+細胞はICH後に劇的に増加し、亜急性期には血腫周囲に優位に集積した。これは、Col1α1+線維芽細胞が増殖してICHにおける線維性瘢痕形成に寄与している可能性を示している。興味深いことに、線維芽細胞と思われる大血管由来PDGFRβ+CD105+間質細胞の増殖も、マウスとヒトの両方で虚血性脳卒中後の亜急性期に観察されている36。この観察と一致して、線維芽細胞は虚血性脳卒中後の線維性瘢痕形成に寄与することが示されている8。さらに、SCIやEAEなどの他の神経疾患においても、線維芽細胞が活性化し、線維性瘢痕形成に寄与することを支持する証拠がある4。これらの結果は、線維芽細胞の増殖・活性化および線維性瘢痕形成がCNS損傷後の共通の変化である可能性を示唆している。
ICH後の亜急性期には、Col1α1+細胞は線維性瘢痕とそのすぐ外側の領域に優位に見られた。線維性瘢痕では、Col1α1+細胞は様々な線維芽細胞マーカーを発現し、線維芽細胞であることを強調するように集まっていた。しかし、瘢痕のすぐ外側の領域では、Col1α1+細胞は線維芽細胞マーカーCol1を失い、壁細胞マーカーPDGFRβと共局在し、小血管に関連していたことから、これらの細胞は周皮細胞様の性質を持つ可能性が示唆された。この推測を裏付けるように、Col1α1+線維芽細胞を切除したマウスは、ICH後に周皮細胞の被覆率が低下していた。さらに、CNSの血管関連細胞として、線維芽細胞は発生過程で血管の安定化を促進する37。これらの結果は、Col1α1+線維芽細胞が毛細血管に移動してBBBの完全性とICHの結果を調節する可能性を示唆するものである。
Col1α1+線維芽細胞を欠損させたマウスを用いて、Col1α1+線維芽細胞がBBBの修復を促進することにより、ICHにおいて有益な役割を果たすことを明らかにした。PDGFRα/Col1発現線維芽細胞は，虚血性脳卒中の亜急性期におけるBBB機能障害を予防し，出血性変化も抑制することが報告されている13）．これらの結果は，線維芽細胞が脳卒中後のBBB修復に不可欠な役割を果たしていることを示唆している．線維芽細胞の有益な役割と同様に、線維芽細胞を含むと思われるGLASTおよびPDGFRβを発現する「タイプA」周皮細胞の減少により、SCIモデルにおいて非閉鎖性障害が引き起こされる14。同様に、増殖しているCol1α2発現細胞の切除は、 EAEの慢性期においてオリゴデンドロサイト系細胞の増加 と運動機能の改善をもたらす7 。この相違は、これらの 研究で用いられた線維芽細胞マーカーの違いによって説明 できるかもしれない。Col1α1、Col1α2、GLAST、PDGFRα、PDGFRβは、それぞれ異なる機能を持つ線維芽細胞の異なるサブポピュレーションを標識している可能性があります1,2。個々の線維芽細胞集団の機能を理解することは、線維芽細胞生物学における我々の知識を著しく豊かにする。単細胞RNA-seq解析のような技術は、異なる線維芽細胞亜集団のマーカーや特性を同定するために使用されるかもしれない。Col1α1を除き、上記のマーカーはいずれも線維芽細胞特異的でないことに留意すべきである。これらのマーカーは、疾患の予後に影響を及ぼす可能性のある他の細胞タイプも標識する。加えて、疾患や病期の違いも、この相違の一因かもしれない。線維芽細胞は、異なる傷害モデルや傷害後の異なるステージで、異なる機能を発揮している可能性がある。例えば、線維芽細胞は、亜急性期にはBBBの完全性を積極的に制御し、一方、再形成期には、緻密な線維性瘢痕が神経細胞や他の細胞の損傷組織への侵入を妨げる可能性がある。したがって、線維芽細胞の機能を複数の段階で研究することが重要である。
BBBの破壊は、ICHの重要な病態であり、脳卒中の転帰と相関する。22,39 本研究では、Col1α1+線維芽細胞がTIMP2依存的にBBBの修復を促進することを見いだした。このことは、TIMP2が虚血性および出血性脳卒中におけるBBBの破壊を防ぐことを示したこれまでの研究結果と一致している32, 33, 40, 41 TIMP2は、生理的および病的状態においてECMターンオーバー/リモデリングとBBBの完全性を活発に制御するMMPであるマトリックスメタロプロテイナーゼ2（MMP-2）の内因性阻害剤である41, 42。MMP-2は脳卒中で大幅に発現が増加し43,44、MMP-2の増加はBBBの破壊を引き起こすことから、TIMP2はMMP-2を阻害することにより脳卒中の神経保護作用を発揮すると考えられている。しかし、TIMP2は、MMPに依存しない働きもする可能性があることに留意すべきである。TIMP2がMMP-2阻害を介して、あるいはMMP非依存的に、脳梗塞の血管透過性を低下させるかどうかについては、さらなる研究が必要である。
TIMP2投与により、Col1α1+線維芽細胞切除マウスにおけるBBB破壊は減弱し、TJPは上昇したが、周皮細胞被覆には影響しなかったことから、ICH後の周皮細胞被覆におけるTIMP2の役割は小さいことが示唆された。この部分的な救済は、他の要因もICH後のCol1α1+線維芽細胞切除マウスの表現型に寄与していることを示唆している。線維芽細胞はECMタンパク質，成長因子，炎症性サイトカインの主要な細胞供給源として，これらの機序を介してBBBの完全性と脳卒中の転帰を制御している可能性がある．線維芽細胞の発現プロファイルを明らかにすることは、線維芽細胞を介した脳梗塞回復の分子機構に関する洞察をもたらすであろう。
組織型プラスミノーゲン活性化因子の内因性阻害剤であるPAI1もまた、LC-MS/MS研究においてBBBの完全性を制御する可能性のある線維芽細胞分泌因子として同定された。しかし、機能喪失研究は、PAI1がTIMP2とは異なり、我々のin vitro ICHモデルでBBB透過性に影響を与えないことを示した。このことは，PAI1が虚血性脳卒中のBBBを保護し，出血性変化を抑制するというこれまでの知見と対照的である34, 46．この相違は，実験モデルや条件の違いにより説明できるかもしれない．組織型プラスミノーゲン活性化因子の発現量は，PAI1が欠損した場合に機能的変化を引き起こすほど高くない可能性がある．したがって、今後の研究では、組織型プラスミノーゲンアクチベーターの発現とICHにおけるPAI1の機能的意義をin vivoで評価する必要がある。
本研究では、Col1α1+線維芽細胞がTIMP2を介してICH後のBBB損傷を部分的に修復することを報告した。他の神経疾患においても、Col1α1+線維芽細胞がBBBの回復に関与している可能性がある。最近のシングルセルRNA-seq研究では、アルツハイマー病患者の大脳皮質において、血管周囲線維芽細胞が著しく少ないことが示されました47。線維芽細胞の減少は、BBBの完全性とアルツハイマー病の病態を制御することが示されているTIMP2やMMP-2のレベルや活性に影響を与えるかもしれません48。さらに、Col1α1+線維芽細胞は多発性硬化症と外傷性脳損傷におけるBBBの損傷を同様のメカニズムで修復する可能性もあります。これらの疾患は、多くのECM遺伝子やECMの調節因子（例えば、細胞外プロテアーゼやプロテアーゼ阻害剤）を含むコアBBB機能障害モジュールとして知られる共通の内皮遺伝子発現変化を共有していることが報告されている49。
研究の限界
Col1α1-Cre株は線維芽細胞を特異的に標識しているが、そのプロモーター活性は恒常性条件下では低すぎる。我々は、恒常性のある成体動物で線維芽細胞の枯渇を誘導することができなかった。しかし、ICH損傷後、Col1α1プロモーター活性は大幅に上昇し、線維芽細胞の枯渇を誘導することに成功した。このように、Col1α1-Cre株は、恒常的な条件下では線維芽細胞の枯渇には不十分であるが、ICHやおそらく線維芽細胞を活性化する他の損傷後には、Col1α1+線維芽細胞を特異的に標的とするために用いることが可能である。
さらに、Col1α1-Cre株は線維芽細胞の部分集団（Col1α1+線維芽細胞）のみを標識し、髄膜線維芽細胞と血管周囲線維芽細胞を区別しないことに注意する必要がある。そのため、ICHにおいてどの集団が神経保護機能を発揮しているのかは不明なままである。線条体では、血管周囲線維芽細胞が髄膜線維芽細胞よりも血腫に近い位置にあることから、我々は、髄膜線維芽細胞ではなく血管周囲線維芽細胞がTIMP2を介してBBB損傷や出血性脳損傷を修復しているという仮説を立てている。しかし、この仮説は、今後、血管周囲の線維芽細胞を特異的にマークするツールを用いて検証する必要がある。
STAR★Methods
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ラット抗CD31 BD Biosciences Cat#553370; RRID:AB_394816
ヤギ抗ポドカリキシン R&D Cat#AF1556; RRID:AB_354858
ウサギ抗RALDH2 シグマ社 Cat#HPA010022; RRID:AB_1844723
マウス抗NG2 BD Biosciences Cat#554275; RRID:AB_395339
マウス抗デスミン剤 Millipore Cat#IF02L; RRID:AB_2261688
ウサギ 抗 Olig2 Novus Cat#NBP1-28667; RRID:AB_1914109
ウサギ抗 ZO-1 Innovative Research Cat#61-7300; RRID:AB_138452
ウサギ抗AQP4 ミリポア Cat#AB3594; RRID:AB_91530
ウサギ抗 Col1 ミリポア Cat#AB765P; RRID:AB_92259
ウサギの抗オクルーディン Invitrogen Cat#71-1500; RRID:AB_2533977
マウス抗 Claudin5 Invitrogen Cat#35-2500; RRID:AB_2533200
ラット抗Meca32 Novus Cat#NB100-77668; RRID:AB_2276108
ウサギ抗カベオリン-1 Cell Signaling Cat#3238; RRID:AB_2072166
ウサギ抗 PDGFRβ Cell Signaling Cat#3169; RRID:AB_2162497
ヤギ抗PDGFRα R&D社 Cat#AF1062; RRID:AB_2236897
ヤギ抗 TIMP2 R&D、Cat#AF971; RRID:AB_355752
マウス抗 PAI1 R&D、Cat#MAB1786; RRID:AB_2186903
マウス IgG R&D Cat#MAB002; RRID:AB_357344
ラット抗CD13-FITC BD Biosciences Cat#558744; RRID:AB_397101
ウサギ抗ヘモグロビン クラウド-クローン Cat#PAB409Mu01
マウス抗アクチン シグマ社 Cat#A5441; RRID:AB_476744
Alexa Fluor-405 コンジュゲート ロバ抗ラット Invitrogen Cat#A48268; RRID:AB_2890549
Alexa Fluor-488 コンジュゲート ロバ抗ウサギ Invitrogen Cat#A21206; RRID:AB_2535792
Alexa Fluor-594 コンジュゲート ロバ抗ウサギ Invitrogen Cat#A21207; RRID:AB_141637
Alexa Fluor-594 コンジュゲート ロバ抗マウス Invitrogen Cat#A21203; RRID:AB_141633
Alexa Fluor-594 コンジュゲート ロバ抗ラット Invitrogen Cat#A21209; RRID:AB_2535795
Alexa Fluor-647 コンジュゲート ヤギ抗ラット Invitrogen Cat#A21247; RRID:AB_141778
FITC 標識ヤギ抗マウス BD Pharmingen Cat#554001; RRID:AB_395197
FITCコンジュゲートヤギ抗ラット BD Pharmingen Cat#554016; RRID:AB_395210
細菌・ウイルス株
Lentivirus-siRNA-TIMP2 Santa Cruz Cat#SC-29506
Lentivirus-siRNA-Control Santa Cruz Cat#SC-108080
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
ジフテリア毒素 Sigma-Aldrich Cat#D0564
Sulfo-NHS-Biotin ThermoFisher Cat#21217
アビジン-FITC BD Biosciences Cat#554057
リコンビナントヒト TIMP-2 タンパク質 R&D Cat#971-TM-010
重要な市販アッセイ
RNAScope in situ ハイブリダイゼーション Advanced Cell Diagnostics Cat#323100
寄託データ
生データおよび処理済みMSデータ ProteomeXchange Consortium Database: PXD037247
実験モデル 細胞株
マウス脳内皮細胞(bEnd.3) ATCC Cat#CRL-2299; RRID:CVCL_0170
マウス骨髄細胞(LADMAC) ATCC Cat#CRL-2420; RRID:CVCL_2550
マウス脳ミクログリア（EOC 13.31） ATCC Cat#CRL-2468; RRID:CVCL_5743
ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC） ScienCell Cat#1000
ヒト脳血管外膜線維芽細胞（HBVAF）ScienCell Cat#1110
実験モデル 生物／系統
マウス B6.FVB-Tg(Col1a1-cre)1Kry 理研BRC BRC:RBRC05603; RRID:IMSR_RBRC05603
マウス B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory JAX:007914; RRID:IMSR_JAX:007914
マウス C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J The Jackson Laboratory JAX:007900; RRID:IMSR_JAX:007900
ソフトウェアとアルゴリズム
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
Prism 8 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Photoshop Adobe N/A
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リソースの有無
主担当者
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるYao Yao ( yao7@usf.edu ) に直接ご連絡ください。
材料の入手方法
材料は、それぞれの材料提供契約の範囲内で、要求に応じて共有されます。
実験モデルおよび被験者の詳細
マウスの作製
線維芽細胞切除実験のために、Col1α1-Cre+マウスとCre誘導型ジフテリア毒素受容体（DTR）マウス50を交配し、DTR+/-:Col1α1-Cre+（FKOと呼ぶ）マウスを作製した。FKO マウスのコントロールとして、ジフテリア毒素 (DT, sigma-Aldrich) を等量注入した同腹の DTR+/- マウスを使用した。系統追跡実験では、Ai14レポーター株をCol1α1-Cre+マウスと交配し、Col1α1+細胞とその子孫をtdTomatoで永久標識したAi14+/-:Col1α1-Cre+ (Col1α1-tdTomato) マウスを作製した。これらの実験では、約2ヶ月齢の雌雄のマウスを用いた。
マウスの維持
すべてのマウスは、南フロリダ大学の動物施設で維持された。彼らは、特定の病原体を含まない条件下で、12時間/12時間の明暗サイクルで、水と餌に自由にアクセスできる換気ケージで飼育された。すべての手順はNIHガイドに準拠し、Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認された。
方法の詳細
ジフテリア毒素の注射
恒常性研究のために、ジフテリア毒素（DT, sigma-Aldrich）をコントロールおよびFKOマウスに腹腔内または脳室内に投与した。前者では、500ng DTを毎日5日間連続投与し、最後の投与から24時間後にマウスを分析した。後者では、Alzet Osmotic Pumps (model #1002 ) とBrain Infusion Kitを使用して、1500ng DTを5日間かけて側脳室に直接投与した。ICH研究では、FKOマウスに毎日500ngのDTを6日間連続投与し、その後犠牲になるまで1日おきに投与した。ICHは、DT注入の3日目に誘発され、マウスはICH後の様々な日に分析された。DT注入戦略は、Figure 2AおよびS1Aに示した。
ICHモデル
51,52 簡単に言えば、マウスはアベルチンの腹腔内注射（体重の500 mg/kg）によって麻酔され、脳定位固定装置（Stoelting Co.、IL、USA）上に固定された。以下の座標で頭蓋骨にバーホールを開けた。ブレグマの0.2 mm後方，正中線から2.4 mm外側，深さ3.7 mmの位置に穴を開けた．コラゲナーゼ（タイプVIIS；Sigma, St.Louis, USA；0.15U in 0.5μL saline）を30ゲージシリンジ（Hamilton）を用いて固定装置で操作しながら右線条体に注射した。注入後の逆流を防ぐため、針は5分間そのままにした。
In vivo BBB透過性アッセイ
5mg/mlのSulfo-NHS-Biotin（ThermoFisher、21217）を滅菌生理食塩水に溶解したものを50ul、コントロールおよびFKOマウスに静脈内投与した。6時間循環させた後、マウスを4％PFAで経心的に灌流させた。脳切片では，Avidin-FITC (1:200, BD, 554057)でビオチンを検出し，可視化した．マウスIgGおよびヘモグロビンは、血管マーカーCD31と共染色した。ビオチン、IgG、ヘモグロビンの平均蛍光強度は、1切片あたり少なくとも3枚の画像、血腫に沿って均等に分布した4〜8切片、少なくとも4匹のマウスを用いてImageJソフトウェアを用いて決定された。
インビボTIMP2処理
Alzet浸透圧ポンプ（モデル#1002）および脳注入キットを、製造業者の説明書に従って、ICH誘導後3日目にFKOマウスに移植した。簡単に言えば、マウスをアベルチン（体重500 mg/kg）で麻酔し、カルプロフェン（体重5 mg/kg）を皮下投与した。カニューレを脳梗塞部位に植え込んだ。各マウスに0.8μgの組換えヒトTIMP2（R&D、971-TM-010）を滅菌生理食塩水で4日間に渡って投与した。対照として、滅菌生理食塩水を満たした浸透圧ポンプを使用した。脳サンプルはICH後7日目に採取した。
神経学的欠損
54,55 このシステムでは、体の対称性、歩行、登攀、旋回行動、前肢の対称性、強制旋回を含む6つの特性を0から4で評価し、最高点は24であった。スコアが高いほど重度の神経学的障害を示す。マウスの遺伝子型は、この試験を実施した研究者には伏せられた。
免疫組織化学
56 簡単に言えば、脳切片を冷たい3%グリオキザールで30分間、または4%PFAで20分間固定した。PBS で十分に洗浄した後、切片をブロッキングバッファー（1%BSA、PBS に 0.3% 正常ロバ血清と 0.3% Triton X-100 を含む）中で室温で 1 時間インキュベートした。次に、切片を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。PBSで十分に洗浄した後、切片を適切な二次抗体と室温で1時間インキュベートした。その後、切片をPBSで3回洗浄し、Fluoromount-G with DAPIでマウントした。Nikon Eclipse TiE 顕微鏡および LSM710 共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影し、ImageJ および/または Adobe Photoshop で処理した。ICH脳については、血腫周辺領域から画像を撮影した。
透過型電子顕微鏡
マウスを麻酔し、PBSで灌流した後、2％PFAと2％グルタルアルデヒドを含む0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で灌流した。血球周囲帯から脳組織を切り出し、一晩固定し、1%四酸化オスミウムと1%フェロシアン化カリウムで後固定した。次に，採取した脳組織を2％酢酸ウラニルで一括染色し，樹脂に包埋した．RMC MT-X ミクロトーム（Boeckeler Instruments）を用いて超薄切片を切り出し，2%酢酸ウラニルと1%クエン酸鉛で後染色を行った．切片はJEOL JEM1011 (JEOL)を用いて80 kVで検査し、写真撮影した。
細胞培養
マウス脳内皮細胞（bEnd.3、CRL-2299）、マウス骨髄細胞（LADMAC、CRL-2420）、およびマウス脳ミクログリア（EOC 13.31、CRL-2468）はATCCから購入した。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC、1000）およびヒト脳血管外膜線維芽細胞（HBVAF、1110）はScienCell社から購入した。 bEnd.3およびLADMAC細胞は標準培地［10％牛胎児血清（FBS）、100単位／mlペニシリンおよび100μg／mLストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）］で培養した。EOC 13.31細胞は、20%LADMAC調整培地を添加した標準培地にて培養した。HBMEC細胞はEndothelial Cell Medium (ECM, Cat. #1001 , ScienCell)で、HBVAF細胞はFibroblast Medium (FM, Cat. #2301 , ScienCell)で培養された。すべての細胞は、37℃、5% CO2雰囲気で培養された。
In vitro ICHモデル
EOC 13.31 ミクログリア細胞を 10μM ヘモグロビン（Sigma, H7379） で 48 時間処理し、その上清をミクログリア調整培地として回収した。次に、トランスウェルインサート（Corning Costar, 3472）に2×104個のHBMECまたはbEnd3細胞を播種した。細胞がコンフルエントに達した時点で、線維芽細胞を下部のチャンバーに播種した。翌日、上段および下段のチャンバーにミクログリア調整培地を加え、in vitroでのICHを模倣した。
In vitro BBB透過性アッセイ
前者については、TEERはEpithelial-volt-ohm-meter（EVOM、World Precision Instruments Inc.）を使用して測定した。後者については、100μg/ml 4kD-FITC dextran (sigma, 46,944) を上部チャンバーに添加し、下部チャンバーへの漏出を蛍光プレートリーダーで測定した。
TIMP2およびPAI1の遮断
線維芽細胞から分泌されるTIMP2およびPAI1を機能的にブロックするために、5μg/ml TIMP2ブロッキング抗体（R&D、AF971）および2.5μg/ml PAI1ブロッキング抗体（R&D、MAB1786）をそれぞれin vitro ICH システムの下部チャンバーに添加した。コントロールとして5μg/mlのマウスIgG（R&D, MAB002）を使用した。
In vitro TIMP2処理
In vitroレスキュー実験は、初代HBMEC細胞を用いて行った。簡単に言えば、HBMEC細胞をTranswellインサート（Corning Costar、3472）中で培養し、10nM組換えヒトTIMP2タンパク質（R＆D、971-TM-010）または生理食塩水の存在下でin vitro ICHモデルを上記のように誘発させた。HBMECのバリア機能は、in vitro BBB透過性アッセイを用いて決定した。
TIMP2ノックダウン
線維芽細胞におけるTIMP2発現をノックダウンするために、RNAi技術を使用した。簡単に言えば、TIMP2を標的とするshRNA（sc-29506-V）またはスクランブル配列（コントロール、sc-108080）を発現するレンチウイルスを、製造者の指示に従って、線維芽細胞を形質導入するのに使用した。手短に言えば、線維芽細胞を12ウェルプレートにプレーティングした。それらが50％コンフルエンスに達したとき、5μg／mlポリブレンおよびレンチウイルス（MOI＝1）を含む完全培地を添加した。培地は、形質導入の12時間後に交換した。2μg/ml puromycin (Gibco, A1113803) を添加した完全培地を用いて、導入48時間後にshRNAを発現するクローンを選択した。
LC-MS/MS分析
LC-MS/MS分析には、FBSフリー培地を用いた。具体的には、マウスマイクログリアを5μMヘモグロビンを含むFBSフリーDMEMで24時間培養し、得られたマイクログリア調整培地を用いて、ヒト線維芽細胞を24時間処理し、線維芽細胞調整培地を採取した。ミクログリアおよび線維芽細胞調整培地をAmicon Ultra遠心分離フィルター（MWCO 10 kDa, Millipore, Z677108）を用いて濃縮し、gradient SDS-PADEでタンパク質の分離を行った。ヘモグロビンのバンドはゲルから切り離し、残りのゲル片はプールしてプロテオミクス・質量分析施設に提出し、LC-MS/MS分析に供した。簡単に言うと、タンパク質はゲル内トリプシン消化プロトコルを用いて消化された。質量分析は、Thermo-Fisher LTQ Orbitrap Elite 質量分析計と Proxeon Easy NanoLC システム (Waltham, MA) を結合して行った。データは Xcalibur ソフトウェア (バージョン 2.2, Thermo Fisher Scientific) を用いて取得した。タンパク質の同定と修飾の特性評価は、Thermo Proteome Discoverer (version 1.4) と Mascot (Matrix Science 2.7) および UniProt データベースを用いて実施された。修飾の可能性があるペプチドのスペクトルは、割り当ての正確さを検証するためにさらに検査された。
RNAScope in situ ハイブリダイゼーション
RNAscope multiplex fluorescent reagent kit V2 (Advanced Cell Diagnostics, 323,100) を用いて、メーカーの説明書に従ってin situハイブリダイゼーションを実施した。Col1α1特異的オリゴプローブ（319,371-C3）およびOpal™色素を使用してCol1α1 mRNAの発現を可視化した。切片はOlympus BX53蛍光顕微鏡で撮影し、NIH ImageJソフトウェアで解析した。
ウェスタンブロッティング
細胞をRIPAバッファ（50-mM Tris pH 7.4、1% NP-40、0.5% Na-deoxycholate、1% SDS、150-mM NaCl、2-mM EDTA、1 x protease inhibitor cocktail、および1 x phosphatase inhibitor cocktail）を用いて溶解させた。Bio-Rad protein assay kitを用いて総タンパク質量を測定し、等量のタンパク質をSDS-PAGEにロードして分離した。PVDF膜（Millipore社製）に転写後、標準的な免疫ブロッティング法を用いて目的のタンパク質を検出した。以下の一次抗体を使用した：マウス抗クラウディン-5（1：500、Invitrogen、35-2500）、ウサギ抗ZO-1（1：500、Thermofisher、61-7300）、ウサギ抗カボリン-1（1: 1000、Cell Signaling、3238S）、ラット抗メカ32（1：200、Novus、NB100-77668）、ヤギ抗TIMP2（1：200、R＆D、AF971）、およびマウス抗アクチン（1：2000、Sigma、A5441）。SuperSignal West Pico Plus Chemiluminescent Substrate (Thermo scientific)を用いてタンパク質バンドを検出した。NIH ImageJ ソフトウェアを使用して、ターゲットタンパクバンドの密度を定量した。標的タンパク質の発現は、β-アクチンの発現に対して正規化した。
定量と統計解析
画像解析
脳損傷はクレジルバイオレット染色で明らかにし、傷害体積は以前に記載したように NIS-Elements D3.0 ソフトウェアを使用して連続切片で定量化した52,54 。FJC+細胞は、1切片あたり血腫に隣接する3フィールド、血腫に沿って均等に分布する4～8切片、および少なくとも4匹のマウスを用いて定量化された。変性細胞の数は、フィールドあたりの細胞数として示した。すべてのデータ解析は、盲検化された治験責任医師によって行われた。
Col1α1-Cre標識効率は、恒常性条件下でのCol1α1-tdTomato脳におけるCol1蛍光面積（または長さ）に対するtdTomato蛍光面積（または長さ）の割合として定量化された。PDGFRβカバー率、CD13カバー率、AQP4カバー率は、それぞれCD31またはポドカリキシン陽性毛細血管領域を覆うPDGFRβ、CD13、AQP4蛍光領域のパーセンテージとして定義した（前出）61。ZO-1/occludin強度、PDGFRβ/CD13強度、AQP4強度は、CD31+またはポドカリキシン+毛細血管面積で正規化した統合蛍光強度と定義し、以前に記述した通りである52。PDGFRα+Olig2-線維芽細胞は、PDGFRα+Olig2-領域内のDAPI+核を数えることによって決定された。内皮カベオリン-1レベルは、血管内のカベオリン-1シグナルの平均グレー値として定量化した。簡単に言えば、ポドカリキシン+血管を輪郭抽出し、ROIとして設定し、対応するカベオリン-1画像に重ねた。そして、設定したROI内のカベオリン-1シグナルの平均グレー値を、ImageJ（NIH）を用いて測定した。in situハイブリダイゼーションでは、Col1α1（mRNA）発現細胞は、Col1α1シグナルに囲まれたDAPI+核の数を数えることによって決定された。定量化には、各切片から無作為に選んだ少なくとも3フィールド、血腫または脳の吻側-尾側軸に沿って均等に分布した4-8切片、および少なくとも4匹のマウスを使用した。すべてのデータ解析は、盲検化された治験責任医師によって行われた。
62 手短に言えば、ICH 後 7 日目のコントロールおよび FKO マウスの内皮ピノサイトーシス小胞を手動で数え、内皮面積で正規化した。3匹のマウスから25～27本の毛細血管を定量化に使用し、データ解析は盲検化された研究者によって行われた。
統計解析
統計解析はPrism 8 (GraphPad Software)を用いて行った。スチューデントのt検定および/またはマン・ホイットニーのU検定は、独立した2群間の差異を調べるために使用された。2群以上を比較する場合は、一元配置分散分析とノイマンキールズポストホック分析を適用した。結果は平均値±SDで示した。
データおよびコードの入手方法

質量分析プロテオミクスデータはPRIDEパートナーリポジトリ経由でProteomeXchange Consortiumに寄託されており、データセットIDはDatabase: PXD037247 は、PRIDE パートナーリポジトリに寄託されており、公開日現在、入手可能である。

本論文では、オリジナルコードは報告していません。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じてリード・コンタクトから入手可能です。
謝辞
この研究は、National Institutes of Healthの助成金（R01HL146574 , RF1AG065345 , R21AG073862 , R21AG064422 to Y.Y.）とアメリカ心臓協会のプレドクトラルフェローシップ（20PRE35210605 to L.X.）により支援されています。
著者の貢献
L.X.とY.Y.は研究をデザインし、L.X.、A.N.、M.K.、K.D.、T.X.は実験とデータ分析を行い、L.X.とY.Y.はすべての共著者から情報を得て原稿を執筆した。
利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
補足情報
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pdfファイルに関するヘルプ
ドキュメントS1. 図S1〜S7、データS1
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xlsx ファイルに関するヘルプ
表S1. 質量分析により同定された線維芽細胞由来タンパク質のリスト、図6関連
zip ファイルをダウンロード (.17 MB)
zip ファイルに関するヘルプ
データS2. 定量データの統計解析、図1～7およびS1～S7に対応
参考文献
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記事情報
出版年譜
掲載されました。2022年11月22日
受理されました。2022年11月1日
改訂版受理 2022年9月11日
2022年9月11日 2022年1月6日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111709