嫌気性菌類によるリグニンの分解

2023年3月13日 10:18

オープンアクセス
発行：2023年3月9日
嫌気性菌類によるリグニンの分解

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01336-8

トーマス・S・ランキエヴィッチ
ヘマント・チョウダリー
...
ミシェル・A・オマリー
作家を表示する
Nature Microbiology (2023)この記事を引用する
1305 アクセス数
53 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
リグノセルロースは植物の細胞壁を形成し、その3つの構成ポリマーであるセルロース、ヘミセルロース、リグニンは、陸上生物圏における最大の再生可能な有機炭素プールである。生物学的なリグノセルロースの分解に関する知見は、地球規模の炭素貯留ダイナミクスに関する理解に役立ち、植物バイオマスから再生可能な化学物質を生産して現在の気候危機に対処しようとするバイオテクノロジーのヒントになります。多様な環境に生息する生物はリグノセルロースを分解し、炭水化物分解プロセスはよく定義されているが、生物学的リグニン分解は好気性システムでのみ説明されている。嫌気性リグニンの分解は生化学的な制約から不可能なのか、あるいはまだ測定されていないのか、現在のところ不明である。我々は、全細胞壁核磁気共鳴法、ゲル浸透クロマトグラフィー、トランスクリプトーム配列決定法を用いて、リグノセルロース分解のスペシャリストである嫌気性真菌（Neocallimastigomycetes）がリグニンを修飾できないという明白なパラドックスに疑問を呈した。我々は、Neocallimastigomycetesが嫌気性菌としてイネ科および広葉樹のリグニンの化学結合を切断することを発見し、さらに、発現量が増加した遺伝子産物と観察されたリグノセルロース分解を関連付ける。これらの知見は、嫌気性菌によるリグニン分解に対する認識を変え、リグノセルロースの解重合に依存する脱炭素バイオテクノロジーを発展させる機会を提供するものである。
主な内容
リグニンは不規則なフェニルプロパノイド系生体高分子で、高等植物の二次細胞壁を形成する複合材料であるリグノセルロースの3大成分の1つである。リグニンは植物細胞壁の乾燥質量の3分の1を占めることもあり、地球上の生物圏ではセルロースに次いで2番目に多い生体高分子であり、最も多い芳香族ポリマーである1,2。リグニンの芳香族基は、植物細胞壁に分解抵抗性、構造剛性、疎水性などの必須特性を付与し、流体輸送、病原体に対する防御、バイオマス蓄積を促進する特性を持っています3。植物細胞は、p-クマリル、コニフェリル、シナピルアルコールという3種類の一級p-ヒドロキシシンナミルアルコールからリグニンを合成する。これらのモノマーはフリーラジカルカップリング機構によって重合し、p-ヒドロキシフェニル（H）、グアイアシル（G）、シリンギル（S）サブユニットを生成し、異なるリグニン中に異なる比率で存在している2。確率的な重合過程とS:G:Hの比率の変動が、リグニン構造の不均一性、多様な結合タイプ、さまざまな分岐の度合いに寄与している2。リグニンの高い難分解性は、炭素吸収源としての生物地球化学的役割を規定し、リグノセルロースから汎用化学品を持続的に生産しようとするバイオテクノロジーにとって大きな課題となっている4,5,6,7.
リグニンの生物学的解重合および修飾に関する現在の記述は、好気性システムに焦点を当てており、それらは主にDikaryaの真菌亜界に関連している6,8。Dikaryaのメンバーである子嚢菌酵母などは通性嫌気性であるが、白色腐敗菌などのリグニン分解生物は分子状酸素の存在下で増殖する6, 9. 特徴的なリグニン修飾酵素は多様性に乏しく、宿主の好気的性質を反映している。ほとんどは酸素依存性のメカニズムに依存しており、嫌気的条件下ではおそらく利用できない6,9。これらの機構の多くは、有機フリーラジカルの生成を通じて間接的に（非酵素的に）リグニンを分解するため、リグニン酵素ではなく、リグニン活性酵素と呼ばれている6,9。リグニン活性酵素の酸素依存性から、嫌気性環境では生物学的なリグニンの分解は起こらないとする考え方が広く受け入れられている6。記載されているリグニン活性酵素は、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、汎用ペルオキシダーゼ、色素脱色ペルオキシダーゼ、その他の酸化酵素およびβ-エーテラーゼに分類される6,9。好気性細菌もこれらの酵素のサブセットを生産するが、嫌気性生物は細菌であろうとなかろうと、既知のリグニン活性酵素を保有していない9,10。
草食動物の腸内細菌群のような嫌気性微生物群は、嫌気的条件下でリグノセルロースを迅速に処理し、地球気候に直接影響を与える規模の温室効果ガスを発生させます11,12。しかし、嫌気性環境におけるリグニンの運命は、ほとんど解明されていません1,13。少なくとも、草食動物の腸内コミュニティや、リグノセルロースを嫌気的に分解する他の微生物は、植物細胞壁からリグニンを置換して、マイクロバイオームや動物の代謝の主要な炭素源であるセルロースやヘミセルロースにアクセスしなければなりません。いくつかの先行研究では、嫌気性細菌によるリグニン修飾の間接的な証拠を収集しているが、これらの研究は、天然に存在するリグニンから既に修飾されたリグニン由来の抽出物であるクラフトリグニンの変化を尋ねているため、嫌気性リグニン解体の自然発生を立証できない14、15、16、17、18、19．嫌気性微生物が天然リグニンを除去して炭水化物を獲得するのか、またその場合どのように除去するのかについての知見は、リグノセルロースが嫌気的に分解される多様な環境における炭素の再石灰化プロセスを定義するのに役立ち、地球化学モデルに情報を与えることになる13。
Neocallimastigomycetesの生物は、草食動物の消化管に広く分布する初期分岐型の嫌気性真菌で、リグノセルロースの分解に優れ、草食動物の腸内細菌叢において重要な役割を担っている20、21、22。嫌気性菌は、ユニークな根のような形態と真菌セルロソームと呼ばれる酵素複合体を持ち、リグノセルロース活性酵素を標的ポリマーに局在させるのに役立つ23,24。さらに、これらの菌のゲノムには、AspergillusやTrichodermaなどの工業用酵素生産菌よりも多くの炭水化物活性酵素（CAZymes）がコードされている25、26。配列決定されたすべての新カリマスト菌ゲノムのオープンリーディングフレームのかなりの部分（~60-75%）は、繰り返しの密度、高いアデニン・チミン含有量、最も近い既知の親類との著しい相違のため、機能注釈がない27、28。しかし、新カリマストミセスの未注釈遺伝子は、持続可能なバイオテクノロジーを推進するための新規酵素、特に新規リグノセルロース活性酵素を発見する素晴らしい機会でもある26,29,30。
嫌気性菌とリグニンの相互作用は未解明であり、ネオカリマスチゴミセスが主要な炭素源であるセルロースやヘミセルロースにアクセスするには、少なくともリグニンを回避する必要があるため、大きな知識ギャップとなっている。ルーミナルの微生物とリグニンの相互作用を調べるこれまでの取り組みでは、リグニン分解物の蓄積31,32,33,34や加工植物原料のリグニン化の減少35,36,37,38,39,40が示唆するように、嫌気性菌が直接または間接的にリグニンに影響を与える可能性がある。しかし、リグニン分解の直接的な証拠がない場合、リグノセルロースからのモノアロマの放出は、嫌気性菌が促進するヘミセルロース側鎖の開裂に起因すると考えられている31,41。2次元ヘテロ核単量体コヒーレンス核磁気共鳴法（2D-HSQC-NMR）の進歩により、生物または酵素の作用前および作用後の全細胞壁材料中のネイティブリグニン結合を直接調べることができる42, 43, 44, 45. 最近，2D-HSQC-NMRは白色腐朽菌46および褐色腐朽菌47による脱リグニンの説明，Parascedosporium putredinis NO148が生産する新規リグニナーゼの同定，シロアリ微生物群由来のコンソーシアムの抗リグニン活性の示唆に貢献した49．本稿では、同様のアプローチで、Neocallimastigomycetesのメンバーが植物バイオマスの分解中にリグニンを分解することを明らかにする。
我々は、Neocallimastigomycetesが嫌気性でリグニンを分解することを実証した。2D-HSQC-NMRとゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）分析による分子量測定、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）、リグノセルロースの構成比の変化を明らかにすることにより、説得力のある証拠を提示した。さらに、RNA配列決定（RNA-seq）を用いて、嫌気性真菌の保存遺伝子群を特定し、その生成物がリグノセルロースの構成ポリマーを嫌気的に分解する可能性があることを明らかにしました。同定された遺伝子は、複雑なリグノセルロースを含む培養条件下で高発現しており、バイオインフォマティクス手法と予測モデルを用いてキュレーションし、新規リグノセルロース活性酵素をコードする可能性が高いものを同定しています。
炭素源間で活性を比較する
嫌気性真菌Neocallimastix californiaeを，リグニン組成の異なるイネ科および木材リグノセルロース系基質（ソルガム，スイッチグラス，ポプラ）上で培養を行った。菌の代謝活性、リグノセルロースの可溶化の程度、リグノセルロース組成の変化、菌体増殖培地中のリグノセルロース分解産物の蓄積を測定した（図1）。N. californiaeの培養液は、発酵生成物を生成し（図1a,b）、リグノセルロース系バイオマスを解重合し（図1c,d）、リグノセルロースから多様な芳香族モノマーを遊離しました（図1e）。精製セルロースやセロビオース処理では、モノアロマティクスを測定しなかったことから、この菌は単純な炭水化物から検出可能な芳香族モノマーを生成しないことがわかりました。嫌気性菌の代謝活性は、精製炭水化物（セルロースとセロビオース）および牧草（ソルガムとスイッチグラス）のリグノセルロースで培養した場合は同等だったが、ポプラでは低かった（図1a、b）。セロビオースで培養した培養液は、ラグフェーズが延長した（図1a）。
図1: 嫌気性菌N. californiaeは、様々なリグノセルロースやその他の炭水化物を基質として増殖し、分解・代謝を行う。
a, セロビオース（CB）、精製セルロース（PC）、スイッチグラス（SW）、ソルガム（SO）、ポプラ（P）で培養したときの菌の活性を、菌が蓄積した発酵ガスの圧力としてプロットした。 b, HPLCによる代謝物濃度の変化の合計。c, 固形基質の場合は質量損失、セロビオースの場合はHPLCで測定した、増殖後に分解された原料の割合。 d, 各リグノセルロースタイプの構成比の変化。 e, LC-MSで測定した、菌類培養終了時に菌類増殖培地に存在するモノアロマティック。FA, フェルラ酸; S, シリンジン酸; CA, カフェ酸; SCA, サリチル酸. パネルb-eは、接種から336時間後のaの最終時点までの差を示す。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均値を中心とした生物学的複製の標準偏差を示す（n = 3）。
フルサイズ画像
リグノセルロースの分解を計測する
組成分析により，菌の増殖前後のリグノセルロースのセルロース，ヘミセルロース，リグニン，灰分の相対分率を求め，各種ポリマーの分解の程度を垣間見ることができた（図1d）。セルロースとヘミセルロースの量は調べたすべてのリグノセルロースタイプで減少し、酸可溶性リグニン（ASL）の割合も草本リグノセルロースで減少した（図1d）。逆に、酸不溶性リグニン（AIL）は、成長後のリグノセルロース全体の質量に占める割合が大きくなった。さらに、嫌気性真菌の2番目の分離株であるAnaeromyces robustusでも、セルロース、ヘミセルロース、ASLの損失が同様のパターンで観察され、ASL減少の観察が単一の分離株や属に限られないことが確認された（拡張データ Fig.1）。驚くべきことに、A. robustusはポプラで培養するとASLとAILの両方を減少させ、この作用は他のすべてのリグノセルロースと真菌の組み合わせとは対照的だった（Extended Data Fig.1）。
リグノセルロースからのモノアロマの遊離は、Neocallimastigomycetesの4つの追加分離株の培養でも観察された（図2）。イネ科のリグノセルロースを与えた培養液は、測定されたモノアロマの総量が450 µM以上蓄積し、主要な化学種はp-クマリン酸（pCA）であった。真菌はポプラからより多様な濃度のモノアロマティクスを放出し（200-750μM）、放出された主な化学種はp-ヒドロキシ安息香酸（pB）であった。すべての分離菌がイネ科リグノセルロース由来のpCAまたはポプラ由来のpBを200 µM以上蓄積し，その他のモノアロマの遊離濃度はすべて10 µM未満であった（図2b）。多様な菌がソルガムとスイッチグラスから同じようなモノアロマのランク順のプロファイルを解放し、放出された上位5つの化合物は一貫していた。濃度の高い順に、pCA、フェルラ酸、バニリン酸（VA）、プロトカテク酸（PA、3,4-ジヒドロキシ安息香酸）、シリンジン酸である。ポプラと菌類の組み合わせは、濃度の低い順にpB、pCA、VA、PA、サリチル酸という異なるモノアロマのプロファイルをもたらした。いくつかの分離株、特にA. robustusとPiromyces sp. E1M（補足テキストおよび拡張データ図2）は、Neocallimastix分離株やCaecomyces churrovis（拡張データ表1）よりもポプラから10倍多くのpBを遊離した。
図2：4属の嫌気性腸内細菌がリグノセルロースから多様な芳香族モノマーを可溶化する。
嫌気性腸内細菌5株を3種類のリグノセルロース基質で培養し、培養後にすべての菌株がモノ芳香族化学物質を溶液中に放出した。試験したリグノセルロースの種類はポプラ、スイッチグラス、ソルガム。 a, 真菌の増殖の代用として10日間に蓄積した総圧。 b, 真菌の増殖前後における各種モノアロマの濃度の平均差分。モノ芳香族化合物の略号は、図1と同じである。CAT, カテコール; V, バニリン。凡例の垂直方向の順序は、積み重ねられたバーの順序と一致している。生育培地が未定義であるため，接種していないコントロールの値を実験値から差し引いてbの値を算出した。嫌気性菌の名称は以下の通りである。N. californiae、N. lanatii、A. robustus、Piromyces sp. E1MおよびC. churrovis。両パネルに示した値は生物学的複製の平均値であり、aのエラーバーはこれらの複製（n = 3）の標準偏差を表している。
フルサイズ画像
次に、2D-HSQC-NMRを用いて、ネオカリマスト菌の活動前と活動後のリグノセルロースを分光学的に特性評価し、リグニンに対する修飾を決定した。観察されたリグニン修飾活性が単一の分離株、菌株、属に限定されないことを確認するため、2つの異なる真菌分離株からデータを収集することを選択した。N. californiaeとA. robustusである。その結果、嫌気性真菌の両株は、多様なタイプのリグノセルロースのリグニンの一部を分解することがわかった（図3、拡張データ図3、拡張データ表2）。嫌気性菌で処理したすべての原料のスペクトルには、ヘミセルロースの再モデリングやpCA、フェルラ酸、pBペンダントユニットの除去といった予想されるシグネチャーが明らかになった。ソルガム，スイッチグラスおよびポプラの未接種対照原料のリグニンは，SおよびGサブユニットの含有量が変化し，真菌分離株とのインキュベーション後にシフトした。ソルガム試料のS:G比は、N. californiaeで処理すると対照試料の0.76から0.68に、A. robustusで処理すると0.58に減少した（図3a-c）。同様に、両菌ともスイッチグラスのS:G比を、非接種のコントロールの0.64から、N. californiaeによる培養後は0.46、A. robustusによる培養後は0.34に低下させた（図3d-f）。ソルガムからSサブユニットが選択的に除去されたが，スイッチグラスやポプラのリグニンからは必ずしも除去されず，β-アリールエーテル（β-O-4結合）ユニットやフェニルクマラン（β-5）の消失と一致する。ソルガムでは，これらのβ-O-4とβ-5がほとんど完全に消失していることから，リグニンポリマーに広範な修飾が加えられていることが強く示唆される。スイッチグラスとポプラのリグニンを培養した菌類によるβ-アリールエーテルとフェニルクマランユニットの選択的除去は，ソルガムよりも限定的であるが，これらの結合の分布が変化していることは明らかである。ポプラのリグノセルロースの変化と対照的に、N. californiaeで処理したサンプルのS:G比は、非接種のコントロール（0.99）よりも高く（1.27）、A. robustusではわずかに低い（0.93）（図3g-i）。すべての特徴を明らかにすることはできないが、SおよびGサブユニット（ΣSG）ベースに加えて、メトキシル積分ベースで統合データを正規化することは有益であることがわかった（図3およびExtended Data Table 2）。メトキシル基量はS:Gのシフトに伴って変化するが，SおよびGサブユニットの一部の改変はメトキシル基を保持するようで，この正規化を用いると，イネ科植物におけるS:Gの減少や一部のリグニン結合（β-O-4およびβ-5）の喪失がより明らかになる。
図3：2D-HSQC-NMRデータから，嫌気性菌が様々なリグニン中の芳香族および脂肪族領域を分解し，リグニンペンダント基を除去していることがわかる。
a, ソルガム無接種対照, b, N. californiae生育後のソルガム, c, A. robustus生育後のソルガム。 d, スイッチグラス無接種対照, e, N. californiae生育後のスイッチグラス, f, A. robustus生育後のスイッチグラス。 g, ポプラ無接種対照。 h, N. californiae生育後のポプラ。 i, A. robustus生育後のポプラ。S+G=100%（右図）またはA+B=100%（左図）とした輪郭体積積分から求めたリグニン成分の相対比較を示す。リグニンH単位は検出限界以下であり，レジノールとジベンゾジオキソシン構造も検出限界以下である。pCAとpBのペンダントエステル画分は、「コアリグニン」ベースで計算され、エステルの積分をS+Gで割った値（ペンダントエステル/S+G=%）となる。単量体リグニンサブユニット、ペンデントエステル、および特徴的なユニット間結合を持つユニットの凡例は、スペクトル中のシグナルに合わせて色分けされています。
フルサイズ画像
NMRサンプルの作成に使用した同じリグノセルロース画分由来のリグニンオリゴマーの相補的GPCでは、菌体修飾後に3,500 Da以下のリグニンオリゴマーは減少したが、3,500 Da以上のリグニンオリゴマーは相対的に増加した（拡張データ図4a-f）。また、N. californiaeをアルカリ性リグニン抽出液とインキュベートしたGPC実験では、リグニン由来のオリゴマーの分子量が低下し、処理後のサンプルに低分子量のピークが新たに出現したことが強調されている（Extended Data Fig.）
新規リグノセルロース活性酵素の同定
嫌気性真菌のリグノセルロース分解における未知の側面を促進するタンパク質を特定するため、RNA-seqを用いて、リグノセルロース存在下で発現が上昇した嫌気性真菌遺伝子と、精製セルロースのコントロールとを比較し、分解測定値を照合しました。差分発現実験では、ソルガム、スイッチグラス、ポプラでのN. californiae遺伝子の制御を調べ、精製セルロースで培養した対照培養物と発現を比較しました（図4と5、および拡張データ図5）。ソルガム、スイッチグラス、ポプラでより多く発現している（q < 0.05）50遺伝子を本研究の対象遺伝子とした。機能的に分類された遺伝子の指定条件を満たすKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) カテゴリ51の中で、最も制御が異なるのは、代謝、細胞プロセス、生物系だった（図4）。代謝のKEGGカテゴリーでは、糖質代謝、エネルギー代謝、アミノ酸（AA）代謝が最も影響を受けるサブカテゴリーであった（図4）。
図4: リグノセルロースの有無に応じたKEGGカテゴリのN. californiae遺伝子の制御の違いから、糖質代謝に関連する真菌のトランスクリプトーム動態が明らかになった。
リグノセルロースまたは精製炭水化物の種類。PCを参照条件としてDESeq2を用いて決定した、SO、SW、Pでのアップレギュレーションの差、またはSO、SW、Pでのダウンレギュレーションの差について遺伝子をフィルターにかけた。A列のヒートマップは、統計的調節基準（q < 0.05）を満たすすべての遺伝子長正規化（100万塩基対あたりの転写物）値から計算した、各KEGGカテゴリーの転写物のlog2倍変化量を表す。B列の円グラフは、SO、SW、Pで異なるアップレギュレーション（赤）、ダウンレギュレーション（青）、または差異なく制御された（黒）各KEGGカテゴリーの遺伝子のパーセンテージを描写する。C列のカウントは、N. californiaeゲノムの各KEGGカテゴリーに分類される遺伝子の数を示す。D列の記号は一連のフィッシャーの正確検定の結果を表し、双方向矢印はKEGGカテゴリーが有意にダウンレギュレートおよびアップレギュレートされたことを示し、一方向矢印はカテゴリーがSO、SW、Pの有無によって有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたことを示し、一方、クロス記号はカテゴリーの制御に有意差がないことを示す。フィッシャーの正確な検定によるP値はBenjamini-Hochberg補正を用いて調整し、誤差は生物学的複製（n = 3）から算出した。
フルサイズ画像
図5：分類されていないN. californiae遺伝子を新規リグノセルロース活性酵素とする予測モデル。
a, ここで示された未分類の遺伝子は、精製セルロースのコントロールと比較して、3種類のリグノセルロースすべてでアップレギュレートされている（q < 0.05）。ワークフローで予測されるように、未分類のアップレギュレート遺伝子のいくつかのサブセットは、真菌細胞の外膜にトラフィックされる。円グラフでは、赤、青、黒のスライスは、アップレギュレーション、ダウンレギュレーション、またはレギュレーションされなかったアノテーション遺伝子を表し、サーモン、水色、灰色のスライスは、アップレギュレーション、ダウンレギュレーション、またはレギュレーションされなかった非アノテーション遺伝子を表しています。シグナルペプチドはSignalP5.0、膜貫通ヘリックスはTOPCONSで予測した。 b-d, 最も転写された遺伝子産物のうち、分泌型可溶性タンパク質（b）、単一の膜貫通ヘリックスを持つ膜関連タンパク質（c）、複数の膜貫通ヘリックスを持つ膜包埋タンパク質（d）について注目すべき10のヒートマップを示す。 e, 各種モデルによってCAZymeドメインも持つことが予測される最も発現した10の遺伝子についてのヒートマップを示す。eでは、dbCANとRoseTTAfoldによって予測されたCAZymeドメインがヒートマップの行の右側に記されている。b-eのヒートマップの各行の左側の識別子は、JGIのMycocosm (https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home)のタンパク質IDである。q値は、PCを参照条件としてDESeq2を用いて算出した。
フルサイズ画像
各リグノセルロースで最も発現量が多く、発現量に差のある25種類のCAZymesは、様々なファミリーのグリコシドヒドロラーゼ（GHs）であった。最も発現量が多く、発現量が増加した25種類のCAZymesのうち6種類は、3つのリグノセルロース条件すべてで共通しており、すべて多様なGHとして注釈されている。具体的には、GH9、GH1、GH3、GH27、GH32およびGH5（サブファミリー1）分類のそれぞれから1つの代表が存在した。芳香族-ヘミセルロースエステル結合の切断に関連する酵素である炭水化物エステラーゼ（CE1s）の注釈は、どの条件でも発現量に差はなかった。N.californiaeゲノムに存在する18の推定CE1sのうち、11の転写レベルは3つのリグノセルロース含有条件すべてでわずかに増加していたが、統計的に差のある制御を行うカットオフ値を満たすものはなかった。
ソルガムとスイッチグラスの処理で最も発現し、差次的に制御された25種類のCAZymの共通点から、これらのグラス誘導CAZymeプロファイルは、ポプラで培養した培養物のプロファイルと区別された。2種類のイネ科リグノセルロースで培養した培養液のトランスクリプトームは、上位25個の発現CAZymesのほとんど（25個中19個）を共有していたが、これらの25個のうち13個はポプラ処理で上位25個の発現CAZymesには含まれていなかった。イネ科植物のトランスクリプトームで優先的に発現され、ポプラのトランスクリプトームでは発現されなかった13個の遺伝子はすべて各種GH（GH1s 3個、GH5s 3個、GH9s 2個、GH3s 2個、GH2s 1個、GH6）である。GH2sとGH6sの出現と、いくつかの糖鎖結合モジュール（CBM）、特に真菌のドッケリン・ドメイン（CBM10s）の存在は、これらの草特異的遺伝子の特徴であった。ポプラのトランスクリプトームで最もアップレギュレーションされ発現した遺伝子は、多様性の少ない異なるGHであった。ポプラに特異的に発現する上位25のCAZymesのうち10はGH5sであった：サブファミリー7から5、サブファミリー4から5。他の6つのポプラ特有の関連遺伝子は2つのグリコシド転移酵素（GT8s）、一つの多糖類リアーゼ（PL1）、予測キシロース結合モジュール（CBM35s）と二つのGHs（GH26とGH13）だった。
我々は、セルロース対照に対してリグノセルロース存在下で高い発現レベルを持つ機能分類のない1,578の遺伝子を見つけ、さらにこのリストをバイオインフォマティックモデルでキュレーションした（図5）。KEGG分類を持たない1,578個の同定された遺伝子のうち、3種類のリグノセルロースすべてにおいて、予測されるシグナルペプチドと発現レベルの上昇の両方を持つ未注釈の遺伝子は338個しかなかった（図5a）。このうち、29個は2つ以上の膜貫通ヘリックスを持ち、93個は正確に1つの膜貫通ヘリックスを持ち、216個はシグナルペプチドのみを持ち、細胞外および可溶性タンパク質を表すと仮定された。その結果、338個のうち179個が優先順位の高いターゲットとして同定された（Transcripts per million (TPM) cut-off of 10）。優先順位の高い179のターゲットについて、各サブセットの複数配列アライメントを行ったところ、遺伝子セット内にいくつかのホモログクラスターがあることがわかった（Extended Data Fig. 5）52. さらに、優先順位の高いターゲットの予測されたタンパク質配列のほぼすべてが、配列決定された他の嫌気性菌ゲノムの1つ以上に、50%以上のAA同一性の部分的な相同性を有していた（Supplementary Table 1）。ほとんどの場合、相同性は嫌気性真菌の複数の属にまたがって存在した。他のゲノムから予測されたホモログの多くは、90%以上のAA同一性を持ち、これらの高度に保存されたペプチド配列のほとんどは、利用可能なNeocallimastigomycetesゲノムの多様性全体にわたって存在した。
ドメイン予測は、リグノセルロースの分解に関与する、分類されていない発現量の多い遺伝子産物を示唆することで、優先度の高い注目遺伝子のキュレーションに役立った。本実験で同定された優先度の高い179個の標的のうち、29個がdatabase for automated carbohydrate-active enzyme annotation (dbCAN; Supplementary Table 2)によって予測されたCAZymeドメインを含んでいた53。dbCANで最も同定されたCAZymeドメインは、推定アセチルキシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、多様なキシラナーゼのドメインであった。一次配列を考慮し、折りたたみタンパク質の原子座標も考慮する3トラックのニューラルネットワーク54による予測は、dbCANが予測を提供したすべてのテストケースで同じCAZymeドメインを発見し、dbCANの予測を補完・強化した（補足表2および拡張データ図5）。さらに、ニューラルネットワーク解析により、植物細胞壁の膨潤に関与する可能性のあるいくつかの推定エクスパンシン様タンパク質と、dbCANでは予測されなかったキシラナーゼも同定された。リグニン二量体β-アリールエーテルモデル化合物48を用いた活性測定から、NMRスペクトルで観測された抗β-エーテルユニット活性は、環境の酸化還元電位に敏感で、非酵素的である可能性が示唆された（補足テキストおよび拡張データ図6）。
考察
ここに示した2D-HSQC-NMRのデータは，嫌気性菌の培養によって未処理の天然由来リグニンが分解されることを示す証拠である。すべてのリグノセルロースと菌類の組み合わせにおいて，菌類増殖後のリグニンのS：G比は増殖前と異なっていたが，その差の性質は主にリグニンの種類に依存しているようであった。ソルガムおよびスイッチグラスのリグニンは，S-サブユニットに富むポプラのリグニンよりも初期S:G比が低いことが予想された。イネ科リグニンでは，ソルガムでは真菌の活性によりSサブユニットが優先的に除去され，S:G比が0.08から0.18減少したが，ポプラではN. californiae処理でS:G比が0.28増加したがA. robustus処理ではほぼ同じにとどまった。S:G比の変化の大きさは、シロアリの微生物を濃縮したコンソーシアムを麦わらと3週間培養した場合49、アスペン材で16週間培養した褐色腐朽菌の場合47と同程度であることが報告されている。S:G比の変化は、取得したスペクトルにおけるβ-アリール-エーテルユニット（β-O-4結合）とフェニルクマラン（β-5結合）の再モデリングに関連しています。これらのS:G比のシフトは、しばしばレジノール（β-β）やジベンゾジオキソシン（5-5/4-O-β結合）の破壊とも関連しているが、ここではこれらのユニットは容易に観察できなかった。この多様な結合型に対する活性は、トリシンのペンダントユニットを含むβ-アリールエーテルユニットに限定された最近の知見とは対照的である48,49。様々な結合型に対する非特異的な活性は、観察されたリグニン結合の切断の一部に、低分子を介した間接的な反応が関与している可能性を示唆する。この作用は、高等真菌の酸化的解重合プロセスが芳香族酸ラジカルの形成を通じて非酵素的に作用するのと類似していると仮定する6。
ここで報告された観察は、特にソルガムきびのスペクトルにおいて、いくつかのリグニン解重合を伴うリグニンの再モデリングとして最も正確に要約することができる。この程度のリグニン分解は，嫌気性菌類が炭水化物ポリマーにアクセスするためにリグノセルロースからリグニンを除去することと一致すると考えられる。リグニン-リグニン結合に最も顕著な変化が観察されたのはソルガムである。ソルガムでは，N. californiaeとA. robustusの活性により，フェニルクマランのシグナルが完全に消失し，β-アリールエーテルユニットに対応する共鳴が激減することが確認された。また、ポプラとスイッチグラスの全処理試料でフェニルクマランの減少が観察され、ポプラ試料では特にこれらのシグナルの減少が顕著であった。スイッチグラスの両サンプルとポプラの1サンプルでは、処理後にβ-アリール-エーテルユニットの相対量が減少した。ソルガムではリグニンのコアポリマーまで変化しているが，スイッチグラスとポプラではリグニンの分解はフェノール酸（ヒドロキシシンナメートとヒドロキシベンゾエート）のペンダント基がより支配的である可能性が考えられる。
NMRスペクトルで観察されたβ-O-4およびβ-5ユニットの消失は，GPCトレースで観察されたリグニンの断片化の原因である可能性がある。NMRスペクトルと同じリグノセルロース試料から得られたGPCデータは，小から中サイズのリグニンオリゴマーが失われ，高分子量のリグニンオリゴマーがわずかに蓄積していることを示していた。また，N. californiaeをアルカリ性リグニン抽出物とインキュベートすると，GPCで測定したところ，リグニン由来のオリゴマーが断片化することがわかった。このGPCの結果は，2D-HSQC-NMRのデータと合わせて，リグニンがより小さなオリゴマーに断片化したことと一致するが，その後リグニン断片が再凝縮したことを示す可能性もある。このことは，嫌気性菌によるリグニンの変化は，リグニン-多糖類の結合を切断することによって付随的に引き起こされるとする従来の仮説とは対照的である。
我々が行ったLC-MSと組成分析は、我々の新しいリグニン分解観察結果を公表されている結果と関連付け、モノ芳香族の蓄積とASL損失の測定は、嫌気性菌によるリグノセルロース溶解の過去の観察結果とよく一致しました。我々は，NMRスペクトルで観察された分解の程度から，溶液中で観察されるモノアロマティックはヘミセルロースとリグニンのペンダントエステル加水分解，さらにリグニン分解の複合結果であると仮定する。リグニンに対する活性を調べるためにLC-MSやバイオマス組成の指標を用いた多くの先行研究は、Neocallimastigomycetesによる嫌気性リグニン修飾の観察を説得力を持って主張するには至らなかった31、32、35、36、37、38、39、40 なぜならこれらの方法ではリグニン-リグニン結合の再編成を直接示すことはできないからである。本研究で使用した菌株は、過去に報告された未同定菌株と同様に、リグノセルロースの分解に関与している可能性が示唆された31,35。同様に、真菌の増殖前後に行ったリグノセルロース中の各種ポリマーの割合の組成分析から、本研究の真菌は文献報告と一致する方法で植物細胞壁を脱リグニンすることが示された32, 36, 37, 39, 40.
嫌気性菌はセルロースの解重合を予測的に好み、次いでヘミセルロースを二次的に好むが、ASLの割合も減少させる。嫌気性菌がこれらのポリマーに影響を与える程度は、五炭糖よりも六炭糖を好むこと、および炭水化物にアクセスするためにリグニンを除去することが確立されていることと一致する55。ASLとは対照的に、AILは1つの組み合わせを除くすべての組み合わせで増加した。これは、AIL部位にアクセスできないこと、セルロースとヘミセルロースの除去によるAILの相対的増加、あるいはリグニン分解プロセスでよく知られている再縮合現象56の可能性を示す。消化された細胞壁におけるAILの相対的存在量の増加が観察され、ソルガムNMRスペクトルからβ-O-4シグネチャーが選択的に除去されたことから、我々が観察したリグニンの変化は、ヘミセルロース修飾とその後の周辺のペンダントリグニンフラグメントの可溶化だけから生じるものではないという示唆が得られる。β-O-4結合がほぼ完全に除去されていることから、この結合型は我々が観察したプロセスによって特に影響を受けると考えられる。LC-MSとリグノセルロースの組成変化のデータから得られた主な結論は，我々の観察結果は文献報告と一致しており，我々が観察したリグノセルロースの分解はおそらくNeocallimastigomycetesクラス全体で保存されているということである。これらのデータは，我々が観察したリグニン分解に続く可能性のある現象（溶解と解重合）を物語っているが，NMR観察から独立して嫌気性リグニン分解を立証するものではないのである。
Neocallimastigomycetesが観察した嫌気性リグニン分解は，特にソルガムにおいて，リグニン分解の完全性と速度の両方において，記述された好気性プロセスと対照的である。嫌気性菌によるリグニン分解プロセスは，他の生物学的リグニン分解プロセスよりも速く起こるが，白色腐朽菌が達成した分解の程度には達しない6。好気性菌による抗リグニン過程の特性は通常数ヶ月のオーダーで生じるが47，シロアリ微生物群由来のコンソーシアム49は，N. californiaeとA. robustusが達成したリグニン修飾よりも，より広範囲なリグニン修飾に33%長く要した。嫌気性菌類によるリグニン分解の促進は、草食動物の消化という文脈では論理的である。リグニンを分解するルーメン微生物の報告はこれが初めてであるが、反芻動物のマイクロバイオームは限られた滞留時間で短い時間スケールでリグノセルロースから栄養価を抽出するため、嫌気性菌は炭水化物へのアクセスを得るためにリグニンを迅速に再編成するかもしれない32、38。
嫌気性菌のリグニン分解プロセスは非酵素的であるが、我々が同定したアップレギュレーションされた未注釈の遺伝子産物のいくつかは、嫌気性菌に起因する抗リグニン化学の観測に関与しているかもしれない。機能的に分類されたN. californiae遺伝子の解析から、リグノセルロースの利用可能性に応じて糖質代謝に関連する遺伝子の調節が異なるなど、予想される調節パターンが明らかになった20。さらに、セロビオース条件下でのラグフェーズの延長の観察は、嫌気性菌類における異化抑制の過去の記述と概ね一致している57,58。嫌気性菌のゲノムには、既知のリグニン活性酵素の検出可能なホモログが存在しないことから、N. californiaeゲノムの検出可能なオープンリーディングフレームの72%を占める現在未注釈の遺伝子の産物が、リグニン結合切断を促進する可能性があると仮定している20、26。差分発現実験とその後のバイオインフォマティックフィルタリングにより、216個の可溶性分泌タンパク質と、異種発現と特性解析のための遺伝子ターゲットとなる93個の一回膜貫通ヘリックスタンパク質が同定されました。Neocallimastigomycetesのリグノセルロース活性酵素の一部、特にセルロソーム複合体は、単一の末端膜貫通らせんを介して細胞膜に固定されていると考えられているため、この遺伝子セットに予測膜貫通らせんが1つのタンパク質を含めました23。
差分発現解析で同定された遺伝子のいくつかの特徴は、新規リグノセルロース活性酵素をコードする遺伝子として特徴づける考えを強めるものである。我々が同定した興味ある遺伝子のほとんどは、配列決定されたすべてのNeocallimastigomycetesゲノムに渡って保存されているものである。リグノセルロースの分解に特化した生物群にこれらの遺伝子が偏在していることは、これらの未注釈遺伝子がリグノセルロースの分解に関与しているのではないかという仮説を間接的に支持している。さらに、これらの遺伝子に由来するいくつかのAA配列には、隠れマルコフモデル53やニューラルネットワーク54を用いて同定されたリグノセルロース活性酵素ドメインが予測されている。最も頻繁に同定される酵素ドメインの中には、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、各種キシラナーゼなど、ヘミセルロースおよびヘミセルロース置換基の修飾に関わるいくつかの酵素クラスが含まれる。セルロース以外の部位に作用するドメインに予測が偏るのは、差分発現実験の対照条件に精製セルロースを含み、キシランやリグニンを含まないことから、嫌気性菌によるリグノセルロース解重合における非糖質結合修飾の重要性を示唆しているのかもしれません。この遺伝子セットに未同定のCAZymesが多いことは，我々の実験デザインが未同定のリグノセルロース活性酵素の発現を誘導するのに有効であり，最終的に目的の遺伝子内に新しいリグニン活性酵素が同定される可能性を示している。
好気性リグニン活性酵素の場合と同様に，ネオカリマスチゴミセスが嫌気性リグニン分解を達成する生化学的メカニズムの解明は困難である可能性がある。いくつかの好気性リグニン活性酵素は、数十年にわたる努力の結果、その複雑な酸化還元化学と非酵素的性質が明らかになっただけである6,9,59。2D-HSQC-NMRデータセットで示されたリグニンポリマー内の複数の結合タイプの再変形は、嫌気性菌類酵素系が生成するフリーラジカルやその他の小分子がリグニンの結合切断を非特異的に引き起こすことを示していると思われる。さらに、リグニンを模倣したモデル化合物に対する測定可能な活性は、菌体上清の低分子画分にのみ認められたことから、リグニンの分解にタンパク質以外のメディエーターが関与している可能性がある（Supplementary Text）。現在のところ、嫌気性微生物が酸素のない状態でリグニン分解ラジカルを生成する仕組みを説明する仮説は暫定的にしか存在しない14,15,16,17,18,19。嫌気性リグニン分解の生化学的メカニズムを解明するためには、ネオカリマスチゴミセス培養物と異種発現したネオカリマスチゴミセスのタンパク質でこれらの仮説の検証が必須である。
ある種の嫌気性生物が未処理の天然由来のリグニンを分解する能力を持つというこの発見は、反芻動物の腸内だけでなく、生物圏全体の嫌気性環境において、リグノセルロースの処理方法に関する認識を変えることになると期待している4,7,13。今回報告された変化は、白色腐朽菌などの既知のリグニン分解菌が引き起こす変化と比較するとやや限定的であるが、多様な環境で一般的に見られるリグニン-嫌気性菌相互作用の理解を変えるものとして、広範な意義を持っている。リグニンを除去することで、嫌気性微生物が炭水化物ポリマー中の不安定な炭素にアクセスできるようになり、直接温室効果ガスに再利用したり、動物代謝などの他のプロセスに転用したりすることができる。さらに、リグノセルロース系バイオリファイナリーなどの脱炭素バイオテクノロジーでは、嫌気性条件下で作動する多様な生物学的リグニン分解機構を利用できるようになることで、恩恵を受けることができる5,8.
方法
N. californiaeの栽培条件
嫌気性菌がリグニンを分解する可能性を探るため、我々が以前単離した強健な嫌気性菌 N. californiae を用いて一次実験を行った20。3種類のリグノセルロースと2種類の精製炭水化物について、N. californiae培養物の活性を測定した。スイッチグラス（Panicum virgatum）はカリフォルニア大学デービス校のD. Putnamの研究室から、ソルガム（Sorghum bicolor）とポプラ（Populus）はアイダホ国立研究所のG. L. Greshamの研究室から入手した。3種類のリグノセルロースは、Thomas-Wiley Mini Mill (Model 3383-L10, A. H. Thomas) を用いて粉砕し、振動篩装置 (Endecotts) により2mmのスクリーンを通して断片をサイズ選択した。リグノセルロースの種類を指定したのは、リグニン含有量が多様であり、バイオリファイナリーや家畜の飼料として重要であるためである。コントロールとして、精製セルロース（カタログ番号09-805、Fisher Scientific）およびセロビオース（カタログ番号A1455322、Fisher Scientific）を用いた。精製セルロースは、粉砕の代わりに小さなストリップ（〜3mm）にカットした。
すべての一次実験に使用したN. californiaeの培養は、以前に記述したミニマリストバージョンの培地Cで増殖させた22。培養基（各種リグノセルロース、セルロース、セロビオース）を10 g l-1で、ブチルストッパーとアルミニウム圧着シールで閉じた80 ml血清ビンに供給した。培養容器は100％CO2ヘッドスペースを持ち、培養液の量は40mlであった。ヘム（プロトポルフィリンIX）とビタミン溶液は0.22 µmフィルターでろ過し、前述22,60の濃度で接種前の培養液に添加した。各原料について、接種していないコントロールもN. californiaeの培養と一緒に入れて、増殖培地が無菌であることを確認した。実験培養は6反復で行い、3反復をRNA収集用に、3反復をN. californiaeの液体代謝物の終点分析、経時的な真菌増殖の継続モニタリング、およびリグノセルロースの変化の終点分析用に割り当てた。RNA-seq用のサンプルは、接種から93時間後に、培養液全量を1：1の比率（v/v）でRNA laterと合わせて採取しました。
この実験の最終時点（接種後336時間）で、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）＋LC-MS用の液体サンプルを、培養物を16,000×gで20分間遠心分離することによって固体（供給原料および菌類バイオマス）から分離した。固形物を10 mlのオートクレーブしたMilliQ水に再懸濁し、塩類と真菌を洗い流し、16,000 × gで20分間再ペレット化した。9ミリリットルの水を除去し、固形物と残りの1ミリリットルのMilliQをFreeZone 4.5 Liter Benchtop Freeze Dry System (part number 77500200, Labconco) で24時間凍結乾燥した。これらの洗浄・乾燥したリグノセルロースサンプルは、リグニンおよびリグノセルロース組成の割合の変化を測定するために保持された。
HPLCによるN.californiae代謝活性の測定と全圧積の測定
真菌増殖の代理として、総発酵ガス蓄積量は、以前に記載されたように圧力変換器技術（PTT）を使用して毎日モニターされた61,62。毎日の圧力蓄積を測定した後、ヘッドスペースは6.9 kPaまで排気した。
さらに、真菌活性の二次的な指標として、既述の通りHPLCを用いて真菌の代謝物を定量化した21,22。サンプルは、Aminex HPX-87H分析カラム（パーツ番号1250140、Bio-Rad）を搭載した1260 Infinity HPLC（Agilent Technologies）で実行した。分離条件は、0.6ml min-1、50℃で、5mM硫酸（H2SO4）移動相を使用した。屈折率検出器は35℃、可変波長検出器は210 nmに設定された。ガードカラムは、0.22μmの物理フィルターに続き、Coregel USP L-17ガードカートリッジ（Concise Separations）を使用しました。モニターした化合物は、酢酸、ギ酸、コハク酸、エタノール、乳酸、セロビオース、グルコースです。0.1%、0.05%、0.01% (w/v)のすべてのHPLC標準物質は、滅菌・清澄化したルーメン液22を含む培地バックグラウンドを考慮し、ミニマリスト培地Cで調製した。分析中、ブランクメディアのクロマトグラムは、OpenLab CDS 分析ソフトウェア (バージョン 2.6, Agilent Technologies) を使用して、すべての標準および実験クロマトグラムから差し引かれた。
HPLC用のサンプルと標準品は、5 mM H2SO4の濃度に酸性化して調製し、室温で5分間インキュベートした後、卓上遠心分離機で最高速度で5分間回転させて真菌細胞、タンパク質およびその他の残骸をペレット化した。酸性化したサンプルをペレットの上から取り出し、ポリエーテルスルホン（PES）膜で0.22 µmろ過して、300 µlのポリプロピレンインサートを備えたHPLCバイアルに入れた。
N. californiae生育前後におけるリグノセルロース組成分析
N. californiaeがリグノセルロースから特定のポリマーを優先的に除去するかどうかを調べるため、生育前と生育後のリグノセルロース相対組成を、National Renewable Energy Laboratoryの2段階酸加水分解分析プロトコル63を使用して分析した。すべての組成分析は、技術的に重複して実施された。簡単に言うと、200mgのバイオマスおよび2mlの72％H2SO4を、200rpmで振とうしながら30℃で1時間インキュベートした。得られたスラリーを56mlの脱イオン水で4％H2SO4に希釈し、121℃で1時間二次加水分解を行った。濾液はグルカン、キシラン、ASL組成の測定に使用し、AILと灰分は固体残渣から把握した。
グルコースとキシロースの濃度は、Bio-Rad Aminex HPX-87Hカラムと屈折率検出器を備えたAgilent HPLC 1260 Infinityシステムを使って、35℃で濾液から測定した。移動相として硫酸（4mM）溶液を用い、流速0.6ml min-1、カラム温度60℃とした。セルロース（グルカン）およびヘミセルロース（キシラン）の量は、グルコースおよびキシロースの含有量にそれぞれ162/180および132/150の無水物補正係数を乗じたものから算出した。
ASLは、Nanodrop 2000紫外線可視分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて、酸加水分解上清の240nmにおける紫外線吸収を測定することにより推定した。AILは、サンプルを105℃で一晩加熱してAILと灰の重量を求め、その後、この手順を575℃で少なくとも6時間繰り返して灰のみの重量を求め、残った固形物から重量測定で定量した。
モノアロマの定量用LC-MSサンプル調製と実行条件
LC-MS用サンプルは、N. californiae上清を0.22 µm PES膜でろ過し、次に3,000 Da分子量カットオフ、PES、遠心分離フィルターユニット（12,000 × g、30分、20℃）でろ過して調製した。3,000Da遠心フィルターからの濾液は、1部のHPLCグレードメタノール（v/v）で希釈した。芳香族化合物の分析標準物質、サンプルおよび非接種コントロールは、Agilent Technologies HPLC-ESI-TOF-MS64を使用して分析された。目的の各分析物の絶対定量には、検量線を使用しました。脱プロトン化された分析物の理論質量電荷比は、目的の芳香族を特定するために使用された。対象となる芳香族は、pCA (163.040068)、フェルラ酸 (193.050632)、pB (137.024418)、バニリン (151.040068), VA (167.034982), シリング酸 (197.045547), カフェ酸 (179.034982), PA (153.019332), カテコール (109.029503) and サリチル酸 (137.024418) です。
リグノセルロースサンプルの追加生成のためのA. robustusの培養
第二の真菌の活性を裏付けるリグノセルロースサンプルを採取するため、N. californiaeについて先に述べた一次実験の限定版を、A. robustus20で繰り返した。培養条件は、「N. californiaeの培養条件」の項でN. californiaeについて述べたものと一致させた。培養液は、真菌の増殖が阻害されないように、1日おきに6.9kPaに通気した。14日後、処理したリグノセルロースの固体試料を採取し、「N. californiaeの培養条件」の項に記載したように洗浄した。この洗浄・乾燥したリグノセルロースサンプルは、リグニンの変化を測定するために保持した。また、「N. californiae生育前後のリグノセルロース組成分析」の項で述べたように、真菌の活性によるリグノセルロースの変化を測定するために使用した。
LC-MSによる観察結果を4つのNeocallimastigomycetes単離株に拡張した。
リグノセルロースから放出されるモノアロマティクスの観測を他の嫌気性真菌にも広げるため，4属5種類の嫌気性真菌をソルガム，スイッチグラスおよびポプラで培養した。N. californiae20、A. robustus20、Piromyces sp. E1M (Supplementary Text and Extended Data Fig. 2)、Neocallimastix lanatii28、C. churrovis65,66 を、各リグノセルロース原料（ソルガム、スイッチグラス、ポプラ）を用いて三重に、培地 C20,61 で栽培した。この増殖条件は、「N. californiaeの培養条件」の項に記載した条件の代わりに必要とされたもので、一次実験とその後のA. robustusリグノセルロース試料の生成に使用したC培地の最小バージョンでは、すべての分離株がうまく増殖しないためです。培養は、前述したようにその他の方法で行った。リグノセルロースは1%(w/v)で装填し、培養液は既述のようにヘムおよびビタミンで補正し21,22,60、培養成長はPTTに続いて6.9 kPaに通気してモニターした61。この実験のサンプルは、「モノアロマの定量化のためのLC-MSサンプル調製と実行条件」のセクションで説明したように調製および実行した。
Piromyces sp. E1M 株の単離・分類方法
Piromyces sp. E1Mは、Santa Barbara Zooのアジアゾウの糞便から既述の方法で分離した66,67。簡単に説明すると、糞便を採取し、クロラムフェニコール存在下、嫌気的条件下で培地Cで希釈し、炭素源としてリグノセルロースを供給した。希釈後、リグノセルロースの塊状マットを伴う圧力産生として観察された後、真菌を嫌気性ロールチューブで希釈し、4日間増殖させた。嫌気室でロールチューブの壁からクローン菌を示す単一のコロニーを摘出し、クロラムフェニコール66を含む培地Cに再接種した。このロールチューブ法を3回繰り返して純粋培養を行い、コロニーを摘出するためのロールアウトとクロラムフェニコール存在下での液体培養を交互に繰り返した。
この新規分離株は、内部転写スペーサー領域（ITS1）と大型リボソームサブユニット（LSU）遺伝子の配列に基づいて、Piromyces属に属すると分類された。本菌のゲノムのITS1領域とリボソームRNA遺伝子はプライマーJB206/JB205で、ラージサブユニット28 S rDNAの領域はプライマーNL1/NL468で増幅されました。Ribosomal Database Project (RDP) Classifier69,70による複数配列のアラインメントにより、この新規分離株の暫定的な分類が行われた。ITS1配列の分類にはUNITE Fungal ITSデータベース71が、LSU配列の分類にはRDP Classifier Fungal 28 Sデータベースが使用された。ITSとLSUの配列はGenBankのBioProjectアクセッション番号PRJNA800048で見ることができる。
植物細胞壁全体の2D-HSQC-NMRサンプルの調製とデータ取得
2D-HSQC-NMR用の乾燥・洗浄したリグノセルロースサンプルをN. californiaeおよびA. robustusの両培養施設から採取した。これらのリグノセルロースサンプルは、「N. californiaeの培養条件」および「追加リグノセルロースサンプルの生成のためのA. robustusの培養」のセクションで説明したように、真菌に作用させ、液体媒体から分離して洗浄した。リグノセルロース（～200 mg）をMM300ミキサーミル（Qiagen）で直径2 mmのステンレスボールを用い、攪拌周波数20 s-1で粉砕した。サンプルは、ソルガムやスイッチグラスのサンプルの場合は45分間、ポプラのサンプルの場合は80分間粉砕した。これらの条件は、元の方法で指定された微細なボールミルではありませんが、粉砕時間は、文献42によると、ゲル化に最適な粒子径を持つ材料を生成するように選択されました。42. 粉砕した試料は、既述のように2D-NMR実験用に準備した42,43。5 mm の NMR チューブに、粉砕した植物材料 ~120 mg を、あらかじめ混合した DMSO-d6/pyridine-d5 溶媒 1 ml (4:1, v/v) とともに加え、リグノセルロースを膨潤させてゲルを形成させました。NMRチューブを密閉し、ゲルが見かけ上均一になるまで、1時間ごとに30分の間隔を空けて4時間超音波処理した。
N. californiae または A. robustus によって処理されたリグノセルロースの 2D-HSQC-NMR スペクトルは，Bruker Avance I 800 MHz スペクトロメーターに Bruker Triple Resonance Probe (TXI) を装備して 310 K で収集した．データはBrukerのTopSpinソフトウェア（バージョン4.1.0）を用いて取得した。HSQCスペクトルは、F2（1H）次元で11 ppmから-1 ppmまで、1,024データポイント、53 ms取得時間、スキャン間パルス遅延1 s、F1（13C）次元で165 ppmから-10 ppm、256データポイント、取得時間 3.5 msで収集されました。各進化期間（t1）の増分に対して、256スキャンが記録された。中央のDMSO溶媒ピークを、すべてのサンプルの化学シフト較正の基準として使用した（δC 39.5 ppm, δH 2.5 ppm）。すべてのHSQCスペクトルは、F2およびF1次元の両方で典型的なコサイン2乗アポダイゼーションを用いて処理し、MestreNOVA（バージョン14、Mestrelab Research）を用いて輪郭を統合した。ピークは公表データ42,43,72,73に従って割り当てられた。
このNMR実験では，真菌増殖培地中のリグノセルロースをオートクレーブすることによって，リグニンが不用意に分解される可能性を考慮し，2組のコントロールを用意した。オートクレーブ処理をしていないコントロールは，実験試料と同様にMilliQ水で洗浄した後，凍結乾燥させた。無菌培養コントロールのスペクトルは、無菌培養コントロールと類似していたため、より直接的な比較として、無菌培養コントロールを処理サンプルとの比較に含めています。Extended Data Fig.3は、オートクレーブなしコントロールとイノキュラムなしコントロールの比較を示しています。
アルカリリグニン抽出物を添加したN. californiaeの培養について
嫌気性菌がリグニン由来の抽出物の大きさに影響を与えるかどうかを調べるために，セルロースとアルカリリグニンの両方を含むM2培地で嫌気性菌N. californiaeを培養した。すべての培養物は、既述のように、ビタミンとヘムの0.22 µm、PESフィルターによる補正を受けた21,22。アルカリリグニン（カタログ番号L0082、TCI America）はMilliQ水に溶解し、最終濃度2.5 g l-1になるように添加した。培養液は液量40 mlで、一次炭素源として10 g l-1のセルロース（カタログ番号09-805、Fisher Scientific）を供給した。実験培養は3連で行い、同じ0.22 µm濾過の改良液を用いた非接種コントロールも含まれた。PTT61で測定した成長停止時にボトルを回収し、遠心分離（5,000×g、5分）により上澄み液から固体を分離した。その後、上清をFreeZone 4.5 Liter Benchtop Freeze Dry System (part number 77500200, Labconco)で48時間凍結乾燥した。これらの凍結乾燥試料から取り出したアルカリリグニンを、次にGPC用に処理した。
リグニンオリゴマーサイズのGPC処理
GPC を用いて，N. californiae または A. robustus74 による処理前後のリグノセルロース中のリグニンの相対分子量分布を測定した。これらのリグノセルロースサンプルは、「植物細胞壁全体の2D-HSQC-NMRサンプル調製とデータ取得」のセクションでNMR用に処理したものと同じものである。標準的なプロトコルに従い、10 mgのリグノセルロースを2.5 mlの酢酸と臭化アセチル（92：8）中でインキュベートし、50 ℃で2時間撹拌してリグニンを溶解させた。高真空ポンプとコールドトラップに接続したロータリーエバポレーターで過剰の臭化アセチルと酢酸を除去した。アセチル化リグニンを直ちにテトラヒドロフランに溶解し、0.2μmのポリテトラフルオロエチレンフィルターで濾過した。アルカリ性リグニン抽出物を添加したN. californiaeの培養」の項で詳述した実験から得られたアルカリ性リグニンのサンプルも同様にGPC分析用に調製したが，アシル化反応にはリグノセルロース10 mgの代わりにアルカリ性リグニン10 mgを添加した。
リグノセルロース由来のリグニンフラグメントおよびアルカリリグニンフラグメントのGPC分析は、Agilent Technologies社製PLgel 5μm Mixed-DカラムおよびDiode Array Detectorを備えたEcosec HLC-8320GPC（東ソー社製）で実施しました。ブチル化ヒドロキシトルエンを250ppm添加したテトラヒドロフランを移動相とし、流速1ml min-1、カラム温度40℃とした。オリゴマーサイズのGPC標準は、162g mol-1から29,150g mol-1のポリスチレンオリゴマー（部品番号PL2013、Agilent Technologies）であった。
差分発現解析のためのN. californiaeサンプルからのRNA抽出
差分発現解析を行うために、「N.californiaeの培養条件」の項に記載したように採取したRNA用N.californiaeの試料を溶解し、RNAを抽出した。サンプルは16,000×gで20分間ペレット化し、RNAlaterと培養液を固形物から分離した後、固形物を液体窒素で瞬間冷凍し、抽出まで-80℃で保存した。真菌ペレットを液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて微粉末にし、RNAの精製は、QIAshredderカラム（部品番号79656、Qiagen）によるホモジナイズとオンカラムDNAse消化（部品番号79254、Qiagen）を含むQiagen RNAeasyキット（部品番号74004、Qiagen）のプロトコルに従いました。抽出したRNAの品質は、RNAテープ（部品番号5067-5576および5067-5577、Agilent Technologies）を備えたTapeStationマイクロ流体電気泳動装置を用いて評価し、一方RNA量はQubit蛍光計（Thermo Fisher Scientific）およびRNA broad range assay（部品番号Q10211、Thermo Fisher Scientific）を用いて評価した。
RNAライブラリーの構築、シーケンス、リードの品質管理およびゲノムへのリードのアライメント
シーケンスライブラリーは、Joint Genome Institute (JGI)で作成し、定量した。Stranded complementary DNAライブラリーは、Truseq Stranded mRNA Library Prep（カタログ番号20020595、Illumina）を用いて作成しました。メッセンジャーRNAは、ポリTオリゴを含む磁気ビーズ（カタログ番号20020595、イルミナ）を用いて200 ngのトータルRNAから精製した。精製したmRNAを、二価陽イオン（カタログ番号20020595、Illumina）を用いて断片化し、94℃で2分間インキュベートした。断片化したRNAを、ランダムヘキサマーとSuper Script II酵素（カタログ番号18064-022、Thermo Fisher Scientific）を用いて逆転写し、次いで第2鎖合成を行った。断片化したcDNAをエンドペア、A-テーリング、アダプターライゲーション、10サイクルのPCRで処理した。次に、調製したライブラリーをKAPA Illumina Library Quantification Kit（Roche）を用いて定量し、LightCycler 480リアルタイムPCR装置（Roche）上で実行した。定量したライブラリーを多重化し、ライブラリーのプールを、NextSeq 500 High-Output Sequencing kit v2（Illumina）を用い、2×150インデックスドランプロトコルに従ってIllumina NextSeq 500シーケンサーでシーケンスするために準備した。このシーケンスランでは、品質管理（QC）前に、合計3億9600万2×150リードの15のシーケンスライブラリーが得られました。差分発現データの生リードはNCBIのSequence Read Archiveに寄託されており、NCBI Sequence Read Archiveのアクセッション番号SRP288871-SRP28885で見つけることができます。
JGIが開発したQCパイプラインを使用して、生リードをフィルタリングおよびトリミングしました。生リードをkmerマッチングでアーティファクト配列を評価し、検出されたアーティファクトをBBDuk（バージョン38.90）75を用いてリードの3′末端からトリミングした（kmer = 25, 1 mismatch allowed）。RNAスパイクインに一致するリード、PhiXリード、あいまいなヌクレオチドを含むリードは削除した。Q6に設定されたphred trimming methodを使用して品質トリミングを行った。最後に、25塩基の長さの閾値以下、または元のリード長の3分の1未満でQCを終了したリードを削除した。このQCパイプラインの結果、N. californiae参照ゲノムにアライメントするのに十分な品質のリードが2億3,500万本得られた。
生物学的複製間の相関度を評価するために、生の遺伝子数を使用した。どのレプリカを微分発現解析に使用できるかを決定するために、レプリカ間でピアソンの相関を計算した。5つの処理すべてについて、3つの生物学的三重標本すべてが、これらの複製物が0.89から1.00までの高い相関係数を示したため、差分発現解析に含まれた（Extended Data Fig. 5）。
各ライブラリーのフィルター付きリードは、HISAT2 バージョン 2.1.076,77 を用いて参照ゲノムにアライメントした。Strand-specific coverage bigWigファイルはdeepTools version 3.178を使用して作成した。FeatureCounts (version 2.0.0)79 を用いて、適切なゲノム特徴ファイル (Neosp1_GeneCatalog_genes_20170918.gff) を用いて、生の遺伝子数ファイルを生成した。平均して、各配列ライブラリの品質管理されたリードの92.6%が参照ゲノムにマップされた。生遺伝子数には、逆鎖に割り当てられた一次ヒットのみを含めた。
N. californiaeトランスクリプトームの差分発現解析
DESeq2（version 1.28.1）50を用いて、精製セルロースコントロール条件と他の培養条件との間でどの遺伝子が差次的に発現しているかを決定した。遺伝子をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションとして表示するための統計的カットオフとして、q < 0.05の調整P値を使用しました。精製セルロースと比較して3つのリグノセルロース基質すべてで発現量が増加し、KEGG機能クラスが割り当てられていない遺伝子を特に注目すべき遺伝子とした。
特徴的で注釈のついた遺伝子は、JGI の Mycocosm から取得した KEGG Orthology (KO) 番号に基づき、KEGG カテゴリでラベル付けされた。各KEGGカテゴリーの関連転写物の合計は、対照条件と各処理条件の両方について、与えられたKEGGカテゴリー内のすべての差次的発現遺伝子にアラインされた転写物の合計によって決定した。次に、実験転写物を精製セルロース対照転写物で割って得られた比をlog2変換することにより、各KEGGカテゴリーについてlog2倍変化を計算した。複数のKO番号を持つ遺伝子、または複数のKEGGカテゴリーを参照するKO番号の遺伝子カウントは、それらが分類されたすべてのカテゴリーの計算に含まれたが、遺伝子転写カウントは、複数のKO番号によって複数のKEGGカテゴリーにマッピングされた場合でも、KEGGカテゴリーごとに1回のみ含まれた。差分発現データの解析はすべてPython 3.9.13で行い、Biopython（バージョン1.79）およびNumPy（バージョン1.23.1）のツールを使用した80,81,82.
リグノセルロースとセルロースの比較において、最も急激に発現が上昇したCAZymesを記述するために、処理条件における平均TPM値で決定した上位25遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、各条件で差次的に発現しており、KEGGカテゴリー「糖質代謝」のラベルが貼られていた。次に、これら576個の遺伝子のタンパク質配列を検索し、dbCAN2分類器53にかけ、CAZymeファミリーとサブファミリーを割り当てた。dbCAN2アノテーションを適用した後、TPMの割り当てが最も大きい上位25個の遺伝子を互いに比較し、条件間で最も発現するCAZymesの類似点と相違点を明らかにしました。アノテーションされたCAZymesデータは、BiopythonとNumPy80,81,82のツールを用いてPython 3.0で解析されました。
予測的バイオインフォマティクスツールを用いた注目遺伝子の特徴づけ
N.californiaeゲノムのオープンリーディングフレームのうち、機能的に特徴付けられていないもので、3種類のリグノセルロースすべてで発現が上昇したものを、いくつかの予測モデルを使ってさらに分析した。SignalP5.0を使用して、目的の遺伝子が細胞外部に輸送される可能性が高いかどうかを判断した83。同様に、TOPCONSウェブサーバーを用いて、遺伝子産物が膜に関連する可能性が高いか、代わりに可溶性タンパク質であるかを予測した84。また、dbCANウェブサーバー53を使用して、対象遺伝子のCAZymeドメインを予測した。すべての出力データファイルは、Biopython ツールキットと NumPy80,81,82 の両方を使用して、Python 3.0 で差分発現データとメタデータに照合された。TPM値が10TPM以上、q値が0.05未満で、特性解析の優先度が高いと思われる遺伝子については、さらに解析を行い、現在、これらを注目配列と呼んでいる。
興味のある配列はさらにRosettaサーバーに提出され、RoseTTaFoldを使用してタンパク質構造予測を生成した54,85。この解析はdbCAN53の予測の信頼性を確保するのに役立ち、そのためCAZymeドメインが予測された配列をポジティブコントロールとして解析した。RoseTTaFold予測値がDeepAccNetで計算された0.4以上の信頼度を持つ場合、最も低い平均エラー推定値を持つモデルは、3Di/AAモードでFoldSeek (https://github.com/steineggerlab/foldseek) を使用してPDB100データベースとAlphaFold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk/) に対して局所構造類似性を検索しました。細菌および真菌のタンパク質について、最も低いE値のマッチをコンパイルし、興味のある各配列の推定機能を示唆した。
複数配列のアラインメントを行い、相同ドメインを持ち、類似した機能を持つ可能性のある配列を特定した。3つの遺伝子セット（分泌型、可溶性、膜結合型）の進化史は、neighbor-joining法を用いて推論され86、この解析は100回繰り返された87。Jones、Taylor、Thorntonマトリックスベース法を用いて、部位ごとのAA置換数を単位として進化距離を計算し88、各配列ペアについてすべてのあいまいな位置を削除した（ペアワイズデレイションオプション）。進化解析は、MEGA X52,89で行った。
β-エーテルモデルアッセイ用のタンパク質および低分子フラクションの調製
N. californiaeとA. robustusの真菌培養は、C22培地のミニマム版でソルガム上で培養した。真菌の上清は、培養物全体を16,000×gで3分間嫌気的に遠心分離して真菌の細胞から分離した。上清を嫌気的にデカンテーションし、PESフィルターで0.22 µm濾過した。真菌の細胞ペレットは、滅菌した0.5mmジルコニアシリケートビーズ（部品番号11079105Z、Biospec）と500μlの滅菌リン酸緩衝液（100mM、pH7.0）を入れた滅菌チューブ内で、嫌気的または好気的に20分間ボルテキサで振とうした。好気性および嫌気性溶解液の両方を0.22 µmフィルター（PES）でろ過し、無傷の細胞や大きな細胞残骸を除去しました。10kDa分子量カットオフ遠心濾過装置（部品番号VS0291、Sartorius）を用いて、上清と溶解物の両方のフラクションを嫌気性または好気性のリン酸緩衝液（100mM、pH7.0）で2回緩衝液交換をした。遠心濾過は好気的、嫌気的の両方で行った。初回濾過の濾液、および濃縮バッファー、細胞溶解液と上清の両方から交換されたタンパク質画分を保持した。
嫌気的および好気的なインキュベーションにおける真菌タンパク質調製物の活性を対比するために、上記のように、酸素を含むおよび含まないリン酸緩衝液（100 mM、pH 7.0）を準備した。好気性リン酸緩衝液は、MilliQ水から調製し、ガス透過性のカバーをつけて室温で1週間攪拌した。嫌気性リン酸緩衝液は、MilliQ水を沸騰させた後、その沸騰水を嫌気槽（雰囲気、75％N2、20％CO2、5％H2）に通し、冷却後にリン酸塩を溶解させることにより調製しました。また、嫌気性リン酸緩衝液は、ガス透過性のカバーをつけて1週間連続攪拌した後、その後の培養に使用した。インキュベーションの前に、すべてのリン酸塩バッファーは0.22 µmフィルターでろ過した。低分子（<10 kDa）インキュベーションでは、200 µlの所望のリン酸緩衝液（好気性または嫌気性）を各インキュベーションに添加した。
β-エーテルモデル化合物の活性アッセイ
β-O-4モデルアッセイ用タンパク質および低分子画分の調製」の項で調製した画分とβ-エーテルモデル化合物をインキュベートし、in vitroでの抗リグニン結合活性を再現した48．各反応はインキュベーションの前後に5回サンプリングし、Tecan M200プレートリーダー（Tecan社製）で蛍光を読み取った。すべてのアッセイにおいて、モデル化合物は20 mMで供給し、反応バッファーはリン酸バッファー（100 mM、pH 7.0）を使用した。タイムゼロ測定は、モデル化合物をインキュベーションに加えた直後に行い、タイムファイナル測定は、モデル化合物を反応混合物中で39℃で24時間インキュベートした後に行った。
100μlの反応混合物に50μlのグリシンバッファー（pH10.1、100mM）を加え、蛍光測定を行った。混合物の蛍光は、4-methylumbelliferoneの励起極大と発光極大に相当する372 nmの励起波長と445 nmの発光波長を用いて、黒の96ウェルプレートで読み取られた。
$$\begin{array}{l}{\mathrm{Normalized}};{\mathrm{activity}}\ = \displaystyle\frac{{\begin{array}{l}\left( T_{\mathrm{final}}; {\mathrm{sample}};{\mathrm{fluorescence}};-;T_{\mathrm{0}};{\mathrm{sample}};{\mathrm{fluorescence}} (右)-╱╱左（T_ {mathrm{final}}}; {mathrm{blank}};{mathrm{fluorescence}};-; T_{0}; {mathrm{blank}};{mathrm{fluorescence}} {mathrm{fluence}} {mathm{blank}} {mathm{fluence}} {t_flow \right)\end{array}}}{{{{\upmu}},{\mathrm{g}};{\mathrm{of}};{\mathrm{protein}};{\mathrm{in}};{\mathrm{reaction}}}}\end{array}$$
(1)
各インキュベーションにおける抗プローブ活性は、任意の蛍光単位で、時間最終測定（Tfinalサンプルおよびブランク蛍光）から時間ゼロ蛍光測定（T0サンプルおよびブランク蛍光）を差し引き、蛍光の変化をインキュベーションのタンパク質含有量（反応中のタンパク質のμg）で割ることによって算出した（式（1））。タンパク質を含まないリン酸緩衝液中のモデル化合物からなるブランクインキュベーションの蛍光の変化は、すべての実験アッセイ値から差し引かれた（式(1)）。ポジティブコントロールは、ボタンボウフウ由来のチロシナーゼ（品番T3824、Sigma Aldrich）で、1mlの反応あたり約35μgの精製タンパク質の濃度で供給した。実験処理中のタンパク質量は、Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Reagent (part number 23238, Thermo Fisher Scientific) を用いて決定した。時間ゼロ平均とブランク反応平均に関連する不確実性は、最終的な正規化活性値に関連する誤差に伝播されるが、タンパク質濃度は定数として扱われる。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご確認いただけます。
データの入手方法
すべてのデータは、本文、Extended Data、Supplementary Information、またはJGlのMycocosm（https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/ home）から入手可能です。差分発現データのRaw readはNCBlのSequence Read Archiveデータベースに寄託されており、SRA accession number SRP288871-SRP288885 で見つけることができる。真菌の分類のためのアンプリコン配列は、BioProjectのアクセッション番号PRJNA800048でGenBankに寄託されています。活性部位予測に用いるCAZyデータベース（http://www.cazy.org/）、タンパク質構造予測に用いるAlphaFoldタンパク質データベース（https://alphafold.ebi.ac.uk/）は、いずれも一般に公開されています。菌株および材料は、対応する著者から要請があれば入手可能である。
参考文献
Bomble, Y. J. et al. 生物圏におけるリグノセルロースの脱構築。Curr. Opin. Chem. Biol. 41, 61-70 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
リグニン：4-ヒドロキシフェニル-プロパノイドの酸化的カップリングによる天然高分子．Phytochem. Rev. 3, 29-60 (2004).
記事CAS Google Scholar
リグニン：植物における生合成と生物学的機能. Int. J. Mol. Sci. 19, 335 (2018).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Robinson, J. M. Lignin, Land Plant, and fungi: Biological evolution affecting Phanerozoic oxygen balance. 地質学 18, 607-610 (1990).
記事 Google Scholar
Ragauskas, A. J. et al. Lignin valorization: improving lignin processing in the biorefinery. Science 344, 1246843 (2014).
記事 PubMed Google Scholar
Janusz, G. et al. リグニン分解：微生物、関与する酵素、ゲノムの解析と進化. FEMS Microbiol. Rev. 41, 941-962 (2017).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Floudas, D. et al. 酵素性リグニン分解の古生代起源を31の菌類ゲノムから再構築した。Science 336, 1715-1719 (2012).
記事CAS PubMed Google Scholar
ベッカム、G. T. 、ジョンソン、C. W. 、カープ、E. M. 、サルバチュア、D. & ヴァードン、D. R. 生物学的リグニン価値化における機会と課題（Opportunities and challenges in biological lignin valorization. Curr. Opin. Biotechnol. 42, 40-53 (2016).
記事CAS PubMed Google Scholar
Pollegioni, L., Tonin, F. & Rosini, E. Lignin-degrading enzymes. FEBS J. 282, 1190-1213 (2015).
記事CAS PubMed Google Scholar
Silva, J. P., Ticona, A. R. P., Hamann, P. R. V., Quirino, B. F. & Noronha, E. F. Deconstruction of lignin: From enzymes to microorganisms. Molecules 26, 2299 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Schmitz, O. J. et al. Animals and the zoogeochemistry of the carbon cycle. Science 362, eaar3213 (2018).
記事 PubMed Google Scholar
Godfray, H. C. J. et al. 肉の消費、健康、および環境. Science 361, eaam5324 (2018).
記事 PubMed Google Scholar
Young, L. Y. & Frazer, A. C. 嫌気性環境におけるリグニンおよびリグニン由来化合物の運命. Geomicrobiol. J. 5, 261-293 (1987).
記事CAS Google Scholar
DeAngelis, K. M. et al. Enterobacter lignolyticus SCF1における異化および同化リグニン分解を支持するエビデンス。Front. Microbiol. 4, 280 (2013).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Chaput, G. et al. Lignin induced iron reduction by novel sp., Tolumonas lignolytic BRL6-1. PLoS ONE 15, e0233823 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Billings, A. F. et al. ゲノム配列と嫌気性リグニン分解菌Tolumonas lignolytica sp.novの記述。Stand. Genom. Sci. 10, 106 (2015).
記事 Google Scholar
Duan, J., Liang, J., Wang, Y., Du, W. & Wang, D. パルプ・ペーパー工場のスラッジから分離した新規嫌気性細菌Dysgonomonas sp. WJDL-Y1によるクラフトリグニン生分解。J. Microbiol. Biotechnol. 26, 1765-1773 (2016).
記事CAS PubMed Google Scholar
Woo, H. L. et al. 湿潤熱帯林土壌から分離されたリグニン分解菌Burkholderia sp. LIG30株のゲノム配列（ドラフト）。Genome Announc. 2, e00637-14 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Woo, H. L. et al. リグニン分解菌Klebsiella sp. BRL6-2株の全ゲノム配列. Stand. Genom. Sci. 9, 19 (2014).
記事グーグルスカラ
Solomon, K. V. et al. 初期分岐腸内細菌は、バイオマス分解酵素の大規模で包括的な配列を有する。Science 351, 1192-1195 (2016).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Gilmore, S. P. et al. Top-down enrichment guides in formation of synthetic microbial consortia for biomass degradation. ACS Synth. Biol. 8, 2174-2185 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Peng, X. et al. ヤギ腸内細菌叢におけるリグノセルロース分解を可能にする真菌および細菌コンソーシアムのゲノムおよび機能解析。Nat. Microbiol. 6, 499-511 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Haitjema, C. H. et al. 比較ゲノム解析で明らかになった真菌セルロソームのパーツリスト。Nat. Microbiol. 2, 17087 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
Lillington, S. P. et al. Cellulosome localization patterns vary across life stages of anaerobic fungi. mBio 12, e0083221 (2021).
MycoCosm portal: Gearing up for 1000 fungal genomes. Nucleic Acids Res. 42, 699-704 (2014).
記事 Google Scholar
Seppälä, S., Wilken, S. E., Knop, D., Solomon, K. V. & O'Malley, M. A. The importance of sourcing enzymes from non-conventional fungi for metabolic engineering and biomass breakdown. Metab. Eng. 44, 45-59 (2017).
記事 PubMed Google Scholar
Wilken, S. E. et al. Genomic and proteomic biases inform metabolic engineering strategies for anaerobic fungi. Metab. Eng. Commun. 10, e00107 (2020).
記事 PubMed Google Scholar
Wilken, S. E. et al. 嫌気性ネオカリマスチグミコタ菌のゲノムスケール代謝モデルの実験的に検証された再構築と解析 mSystems 6, e00002-21 (2021).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Podolsky, I. A. et al. Harnessing nature's anaerobes for biotechnology and bioprocessing. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 10, 105-128 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Lankiewicz, T. S., Lillington, S. P. & O'Malley, M. A. 嫌気性菌（Neocallimastigomycetes）の酵素発見がリグノセルロース系バイオリファイナリーの革新を可能にした。Microbiol. Mol. Biol. Rev. 86, e0004122 (2022).
記事 PubMed Google Scholar
Borneman、W. S., Hartley、R. D., Morrison、W. H., Akin、D. E. & Ljungdahl, L. G. 嫌気性菌由来のフェルロイルおよびp-クマロイルエステラーゼと植物細胞壁分解に関する研究。Appl. Microbiol. Biotechnol. 33, 345-351 (1990).
記事CAS Google Scholar
Akin, D. E. & Benner, R. ラムネ菌と真菌による多糖類とリグニンの分解。Appl Environ. Microbiol 54, 1117-1125 (1988).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
梶川博之ほかラムネ科微生物によるリグニンのベンジルエーテル結合の分解。FEMS Microbiol. Lett. 187, 15-20 (2000).
記事CAS PubMed Google Scholar
Joblin, K. & Naylor, G. E. ルーメン嫌気性真菌による木材の発酵。FEMS Microbiol. Lett. 65, 119-122 (1989).
記事CAS Google Scholar
Akin, D. E., Borneman, W. S. & Lyon, C. E. ラムネ菌の単心・多心分離菌による葉身・茎の分解について. Anim. Feed Sci. Technol. 31, 205-221 (1990).
論文 Google Scholar
チモシーリグニンのin vitroルーメン発酵による構造変化について. Ann. Zootech. 44, 153 (1995).
論文 Google Scholar
ルーメン消化による飼料草リグニンの構造変化：チモシー（Phleum pratense L.）からのin vitroルーメン消化による可溶性リグニンの特性. Jpn Agric. Res. Q. 31, 49-53 (1997).
Google Scholar
Susmel、P.、Stefanon、B.、Mills、C. R. & Spanghero、M. 飼料中の有機物、窒素および繊維分画のルーメン分解性. Anim. Prod. 51, 515-526 (1990).
Google Scholar
Susmel, P. & Stefanon, B. ルーメン微生物によるリグニン分解の様相. J. Biotechnol. 30, 141-148 (1993).
記事CAS Google Scholar
Akin, D. E., Lyon, C. E., Windham, W. R. & Rigsby, L. L. ruminal fungiによるlignified stem tissuesの物理分解。Appl. Environ. Microbiol. 55, 611-616 (1989).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Qi, M. et al. ルーメン菌 Anaeromyces mucronatus 由来のフェルラ酸エステラーゼ（Fae1A）の単離と特徴づけ。J. Appl. Microbiol. 110, 1341-1350 (2011).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Kim, H. & Ralph, J. DMSO-d6/pyridine-d5中でボールミル化した植物細胞壁ゲルの溶液状態2D NMR. Org. Biomol. Chem. 8, 576-591 (2010).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. & Ralph, J. 溶液状態2D NMRを用いた植物細胞壁全体の特性評価。Nat. Protoc. 7, 1579-1589 (2012).
論文CAS PubMed Google Scholar
Dinh, C. V. & Prather, K. L. J. Development of autonomous and bifunctional quorum-sensing circuit for metabolic flux control in engineered Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 25562-25568 (2019).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Lu, F. & Ralph, J. Ball-milled plant cell wallの非分解性溶解とアセチル化：高分解能溶液状態NMR. Plant J. 35, 535-544 (2003).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Yelle, D. J. et al. 白色腐朽担子菌Ceriporiopsis subvermisporaによるリグニン分解に寄与する高ジアステレオ選択性酸化剤. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7536-7544 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Yelle, D. J., Wei, D., Ralph, J. & Hammel, K. E. Multidimensional NMR analysis reveals truncated lignin structures in wood decayed by the brown rot basidiomycete Postia placenta. Environ. Microbiol. 13, 1091-1100 (2011).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Oates, N. C. et al. A multi-omics approach to lignocellultic enzyme discovery reveals a new ligninase activity from Parascedosporium putredinis NO1. Proc. Natl Acad. Sci.USA 118, e2008888118 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Dumond, L. et al. 嫌気性バイオリアクターにおける麦わら脱リグニンへのシロアリ腸内細菌の寄与。ACS Sustain. Chem. Eng. 9, 2191-2202 (2021).
記事CAS Googleスカラー
Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
金久正明、古道正明、田辺正明、佐藤由美子、森島和彦 KEGG: ゲノム、パスウェイ、疾患、薬剤に関する新しい視点. Nucleic Acids Res. 45, D353-D361 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) for macOS. Mol. Biol. Evol. 37, 1237-1239 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Zhang, H. et al. DbCAN2: a meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation. Nucleic Acids Res. 46, W95-W101 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Baek, M. et al. 3トラックニューラルネットワークを用いたタンパク質構造と相互作用の正確な予測. Science 373, 871-876 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Henske, J. K. et al. 嫌気性真菌の代謝特性は、粗リグノセルロースのバイオプロセスへの道筋を示す。Biotechnol. バイオエン. 115, 874-884 (2018).
記事CAS PubMed Google Scholar
リグニンの分画から解重合までの望ましくない反応を防止するための最近の取り組み：リグニンからの価値の最大化に向けて. Front. Energy Res. 6, 92 (2018).
記事グーグルスカラ
Solomon, K. V. et al. 初期分岐嫌気性菌における異化抑制は、天然アンチセンス転写物によって部分的に媒介される。Fungal Genet. Biol. 121, 1-9 (2018).
記事CAS PubMed Google Scholar
Henske, J. K., Gilmore, S. P., Haitjema, C. H., Solomon, K. V. & O'Malley, M. A. Biomass-degrading enzymes are catabolite repressed in anaerobic gut fungi. AIChE J. 64, 4263-4270 (2018).
記事CAS Googleスカラー
Hofrichter, M. 総説：マンガンペルオキシダーゼ（MnP）によるリグニン変換. Enzym. Microb. Technol. 30, 454-466 (2002).
記事CAS Google Scholar
Orpin, C. G. & Greenwood, Y. Neocallimastix patriciarumというルーメンのツボカビ菌の栄養と発芽要求量。Trans. Br. Mycol. Soc. 86, 103-109 (1986).
記事CAS Google Scholar
Theodorou, M. K., Davies, D. R., Nielsen, B. B., Lawrence, M. I. G. & Trinci, A. P. J. 圧力変換器を用いた可溶性およびセルロース性基質上での嫌気性真菌の増殖の判定法. Microbiology 141, 671-678 (1995).
記事CAS Google Scholar
Haitjema、C. H., Solomon、K. V., Henske、J. K., Theodorou、M. K. & O'Malley, M. A. Anaerobic gut fungi: advances in isolation, culture, and cellulolytic enzyme discovery for biofuel production. Biotechnol. Bioeng. 111, 1471-1482 (2014).
記事CAS PubMed Google Scholar
Sluiter, A. et al. バイオマス中の構造性炭水化物およびリグニンの定量: Laboratory Analytical Procedure (LAP). Technical Report NREL/TP-510-42618 (National Renewable Energy Laboratory, 2012).
Eudes, A. et al. Production of hydroxycinnamoyl anthranilates from glucose in Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 12, 62 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Brown, J. L. et al. 嫌気性菌 Caecomyces churrovis と Methanobacterium bryantii の共培養は、糖質結合モジュール、ドッケリン、ピルビン酸ギ酸リアーゼの特定基質での転写を促進する。Biotechnol. Biofuels 14, 234 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Henske, J. K. et al. Caecomyces churrovis: a novel, non-rhizoid-forming lignocellulolytic anaerobic fungusのTranscriptomic characterization. Biotechnol. Biofuels 10, 305 (2017).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Peng, X., Gilmore, S. P. & O'Malley, M. A. Microbial communities for bioprocessing: Lessons learned from nature. Curr. Opin. Chem. Eng. 14, 103-109 (2016).
記事 Google Scholar
Tuckwell, D. S., Nicholson, M. J., McSweeney, C. S., Theodorou, M. K. & Brookman, J. L. The rapid assignment of ruminal fungi to presumptive genera using ITS1 and ITS2 RNA secondary structure to produce group-specific fingerprints. Microbiology 151, 1557-1567 (2005).
論文CAS PubMed Google Scholar
Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M. & Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5261-5267 (2007).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Cole, J. R. et al. Ribosomal Database Project: Improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 37, D141-D145 (2009).
論文CAS PubMed Google Scholar
Nilsson, R. H. et al. UNITE database for molecular identification of fungi: handling dark taxa and parallel taxonomic classifications. Nucleic Acids Res. 47, D259-D264 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Lan, W. et al. トリシン-リグニン構造の解明：単子葉植物リグニンのHSQCスペクトルにおける相関の付与. ポリマー 10, 916 (2018).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Del Río, J. C. et al. 分析熱分解法，2D-NMR法，還元開裂法で明らかにした麦わらリグニンの構造的特徴. J. Agric. Food Chem. 60, 5922-5935 (2012).
記事 PubMed Google Scholar
ゲラ、A.、ルシア、L.A.&アルギロプロス、D.S.酵素的弱酸性分解（EMAL）によるEucalyptus grandis Hill ex MaidenとEucalyptus globulus Labill.からのリグニンの分離と特徴づけ。Holzforschung 62, 24-30 (2008).
論文CAS Google Scholar
Bushnell, B. BBMap: A Fast, Accurate, Splice-Aware Aligner Report Number LBNL-7065E (Lawrence Berkeley National Laboratory, 2014).
Kim, D., Langmead, B. & Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat. Methods 12, 357-360 (2015).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
HISAT2およびHISAT-genotypeを用いたグラフベースのゲノムアライメントおよびジェノタイピング。Nat. Biotechnol. 37, 907-915 (2019).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ramírez, F., Dündar, F., Diehl, S., Grüning, B. A. & Manke, T. deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, W187-W191 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Liao, Y., Smyth, G. K. & Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923-930 (2014).
記事CAS PubMed Google Scholar
Van Rossum, G. & Drake, F. L. Jr Python 3 Reference Manual. (CreateSpace、2009).
Cock, P. J. A. et al. Biopython: Computational molecular biology and bioinformatics のための自由に使える Python ツール. バイオインフォマティクス 25, 1422-1423 (2009).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Oliphant, T. E. A Guide to NumPy (Trelgol Publishing, 2006).
Almagro Armenteros, J. J. et al. SignalP 5.0 Improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nat. Biotechnol. 37, 420-423 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Tsirigos, K. D., Peters, C., Shu, N., Käll, L. & Elofsson, A. The TOPCONS web server for consensus prediction of membrane protein topology and signal peptides. Nucleic Acids Res. 43, W401-W407 (2015).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Hiranuma, N. et al. Improved protein structure refinement guided by deep learning based accuracy estimation. Nat. Commun. 12, 1340 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
近傍結合法：系統樹の再構築のための新しい方法. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425 (1987).
CAS PubMed Google Scholar
Felsenstein, J. 系統樹の信頼限界：ブートストラップを用いたアプローチ。Evolution 39, 783-791 (1985).
記事 PubMed Google Scholar
Jones、D. T., Taylor, W. R. & Thornton, J. M. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Comput. Appl. Biosci. 8, 275-282 (1992).
CAS PubMed Google Scholar
クマール、S.、ステッチャー、G.、リー、M.、クニャズ、C.、タムラ、K. MEGA X: コンピューティングプラットフォームを横断する分子進化遺伝学解析。Mol. Biol. Evol. 35, 1547-1549 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
リファレンスのダウンロード
謝辞
M. Castenda-Renteriaには、追加解析の可能性について議論してもらったことを感謝する。カリフォルニア大学サンタバーバラ校とカリフォルニア大学学長室の支援を受け、California NanoSystems Institute 内の Biological Nanostructures Laboratory を使用したことを感謝する。Graphpad Prism v9.3.1は、Fig.1、2、4、5、Extended Data Fig.1、4、6の作成に使用された。Fig.4、5、Extended Data Fig.3の作成にはBioRenderを使用。図3の作成には、Adobe Illustratorを使用した。資金提供者に謝意を表します。米国エネルギー省生物環境研究局助成金DE-SC0020420（MAO）、Institute for Collaborative Biotechnologies助成金W911NF-09-D-0001およびW911NF-19-2-0026（MAO）、US Army Research Office契約番号 W911NF-19-1-0010（MAO), National Science Foundation助成金 MCB-1553721（MAO）, 米国エネルギー省合同バイオエネルギー研究所（JBEI、 http://www. jbei.org）契約番号DE-AC02-05CH11231（ローレンスバークレー国立研究所）、米国エネルギー省五大湖バイオエネルギー研究センター（GLBRC、https://www.glbrc.org/）契約番号DE-SC0018409（ウィスコンシン大学、ミシガン州立大学）の生物・環境研究室。DOE Office of Science User Facilityである米国エネルギー省合同ゲノム研究所（https://ror.org/04xm1d337）が実施した研究（提案：10.46936/10.25585/60000889）は、契約番号DE-AC02-05CH11231で運営される米国エネルギー省科学局から支援を受けています。サンディア国立研究所は、ハネウェル・インターナショナルの完全子会社であるNational Technology and Engineering Solutions of Sandia, LLCが、契約番号DE-NA0003525の下で米国エネルギー省の国家核安全保障局のために管理・運営するマルチミッション研究所である。米国政府および出版社は、本論文の掲載を受理することにより、米国政府が、米国政府の目的のために、本原稿の出版形態を公開または複製する、あるいは他者にそれを許可する非独占的、有償、取消不能の全世界ライセンスを保持することを認める。
著者情報
著者と所属
カリフォルニア大学サンタバーバラ校化学工学部（米国カリフォルニア州サンタバーバラ市
トーマス・S・ランキウィッツ、スティーブン・P・リリントン、パトリック・A・レッジエリ、ジェニファー・L・ブラウン、キャンディス・L・スウィフト＆ミシェル・A・オマリー
カリフォルニア大学サンタバーバラ校生態・進化・海洋生物学部（米国カリフォルニア州サンタバーバラ市
トーマス・S・ランキエヴィッチ
ジョイント・バイオエナジー・インスティテュート（米国カリフォルニア州エメリービル市
Thomas S. Lankiewicz, Hemant Choudhary, Yu Gao, Bashar Amer, Edward E. K. Baidoo, John Gladden, Seema Singh, Jenny C. Mortimer, Blake A. Simmons, Steven W. Singer & Michelle A. O'Malley
サンディア国立研究所バイオマテリアル・バイオマニュファクチャリング部（米国カリフォルニア州リバモア
ヘマント・チョウダリー、ジョン・グラッデン、シーマ・シン
ローレンスバークレー国立研究所環境ゲノミクス・システムバイオロジー部門（米国カリフォルニア州バークレー市
ユー・ガオ、イゴール・V・グリゴリエフ、ジェニー・C・モーティマー
サウスカロライナ大学環境健康科学部（米国サウスカロライナ州コロンビア市
キャンディス・L・スウィフト
エネルギー省共同ゲノム研究所、ローレンスバークレー国立研究所、カリフォルニア州バークレー、米国
Anna Lipzen, Hyunsoo Na, Mojgan Amirebrahimi, Kerrie Barry & Igor V. Grigoriev
ハーパー・アダムス大学農業環境学部（英国・ニューポート
マイケル・K・テオドルー
ローレンスバークレー国立研究所生物システム・工学部門（米国カリフォルニア州バークレー
エドワード・E・K・バイドゥ、ブレイク・A・シモンズ、スティーブン・W・シンガー
カリフォルニア大学バークレー校植物・微生物生物学部（米国カリフォルニア州バークレー市
イゴール・V・グリゴリエフ
グレートレイクス・バイオエネルギー研究センター（米国ウィスコンシン州マディソン市
ヴィタリィ・I・ティモヒン＆ジョン・ラルフ
アデレード大学農業・食品・ワイン学部、ウェイト研究所、南オーストラリア州グレンオズモンド、オーストラリア
ジェニー・C・モーティマー
ウィスコンシン大学マディソン校生化学科（米国ウィスコンシン州マディソン市
ジョン・ラルフ
貢献度
概念化。T.S.L., M.A.O., S.W.S., B.A.S. 方法論。T.S.L.、H.C.、Y.G.、J.R.、B.A.、 E.E.K.B., P.A.L., S.P.L., V.I.T., M.K.T., K.B. and I.V.G. Investigation: T.S.L.、H.C.、Y.G.、B.A.、P.A.L.、S.P.L.、J.L.B、 C.L.S.、A.L、 H.N. 、 M.A.、 M.K.T. ビジュアル化担当．T.S.L., H.C., Y.G. and P.A.L. Funding acquisition: プロジェクト管理：M.A.O., S.W.S., B.A.S: プロジェクト管理：M.A.O.、S.W.S.、B.A.S.。M.A.O.、S.W.S.、J.C.M.、B.A.S.、J.R.、E.E.、K.B.、 I.V.G., S.S. および JG. 執筆-原案執筆-原案：T.S.L. 執筆-校閲-編集：T.S.L: T.S.L.、M.A.O.、S.W.S.、B.A.S.、J.R., P.A.L., S.P.L., H.C., Y.G., B.A. and K.B.
対応する著者
ミッシェル・A・オマリーへの対応
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、この論文の査読に貢献したNeil Bruce、Robert Gruninger、およびその他の匿名査読者に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 成長前後のバイオマス組成から、セルロースとヘミセルロースが選択的に除去され、酸可溶性リグニンも若干除去されていることがわかる。
図中の凡例では、ASLは酸可溶性リグニンを、AILは酸不溶性リグニンを表している。パネルAはソルガム（SO）、スイッチグラス（SW）、ポプラのPの出発組成を、パネルBはNeocallimastix californiae増殖後のSO、SW、Pの組成を、パネルCはAnaeromyces robustus増殖後のSO、SW、Pの組成を表す。パネルDはパネルBとパネルAの差分を、パネルEはパネルCとパネルAの差分を示している。
Extended Data 図2 新規嫌気性真菌分離株Piromyces sp. E1Mは、標準的なNeocallimastigomycetesの形態を持っている。
これらの表現型はPiromyces属とNeocallimastix属に一致し、内部転写スペーサー領域（ITS1）と大型リボソーム亜ユニット（LSU）遺伝子配列からPiromyces属に属すると分類された。パネルAでは、セロビオースなどの可溶性糖の二量体上で培養すると、連動したミクロリゾイドのマットが形成され、パネルBでは、菌のコロニー形成時にリグノセルロースにリゾイドネットワークが介在する。菌類は、パネルCに示すように、運動性のある胞子を生成する。これらは単一の観察結果であり、必ずしも平均的な菌株の形態を代表するものではない。
Extended Data Fig. 3 2次元HSQC-NMRデータで、オートクレーブ処理をしていないコントロールと、オートクレーブ処理をしていないコントロールの比較。
リグニンの特徴は培地を滅菌する過程で変化するが、この変化は菌類が引き起こす変化とは著しく異なる。パネルAはソルガム、パネルBはスイッチグラス、パネルCはポプラで、オートクレーブ処理をしていない対照を示す。ソルガムではパネルDに、スイッチグラスではパネルEに、ポプラではパネルFに、オートクレーブ処理をしていない対照を示した。ソルガムおよびスイッチグラスでは、S:G比はオートクレーブ処理で増加し、菌処理では減少した。ポプラでは、オートクレーブ処理後にS:G比が減少し、嫌気性菌で処理した培養物では増加した。ここで描かれているすべての統合率は、ΣSGベースで計算されている。
Extended Data 図4 リグノセルロースまたはアルカリリグニン由来のリグニンフラグメントのゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）トレース。
リグノセルロース由来の試料はパネルA〜Fに，アルカリリグニン由来の試料はパネルGに示す。トレースは，嫌気性菌の培養による修飾前後のリグニンオリゴマーの分子量分布を示し，リグニンオリゴマーの分子量分布に変化が見られることを示す。すべてのパネルで、適切な基質に対する非接種およびオートクレーブの対照が含まれている（黒色、実線）。パネルA-Fでは、オートクレーブしていないコントロールも含まれている（黒、点線）。パネルA-Fの縦点線は、X軸に3,500Daを示す。パネルAおよびBは、Neocallimastix californiae AおよびAnaeromyces robustus Bによる増殖後のソルガム由来のリグニンオリゴマー、パネルCおよびDは、N. californiae CおよびA. robustus Dによる改質後のスイッチグラス由来のリグニンオリゴマー。パネルEおよびFは、N. californiae EおよびA. robustus Fによる修飾後のポプラ由来のリグニンオリゴマー。パネルGに示すエラーバンドは標準偏差を、中央線はn = 3生物学的複製から計算した平均を表す。
Extended Data Fig. 5 各シーケンスライブラリの品質管理されたリードのピアソン相関から、生物学的三連鎖は非常に類似しており、その後の差分発現解析にすべて含めるべきことが示唆された。
予想通り、リグノセルロース基質は、精製セルロースやセロビオースよりも互いに類似した転写プロファイルを誘導し、イネ科（ソルガムおよびスイッチグラス）のリグノセルロース処理は、ポプラよりも互いに類似していました。ライブラリーは、レプリケートのグループとして順序付けされている。セル内の数値はピアソンの相関係数。レプリケート比較の周りの紫色の枠は、解析を継続するために許容できる相関関係を示しています。各識別子は1つのレプリケートを表す。サンプルは以下の識別子に対応しています。GTHNB = セロビオースレプリカ1、GTHNC = セロビオースレプリカ2、GTHNG = セロビオースレプリカ3、GTHNH = 精製セルロースレプリカ1、GTHNN = 精製セルロースレプリカ2、GTHNO = 精製セルロースレプリカ3、GTHNP = スイッチグラスレプリカ1。GTHNS = スイッチグラス複製2、GTHNT = スイッチグラス複製3、GTHNU = ソルガム複製1、GTHNW = ソルガム複製2、GTHNX = ソルガム複製3、GTHNY = ポプラ複製1、GTHNZ = ポプラ複製2、GTHOA = ポプラ複製3．
Extended Data Fig. 6 興味のある遺伝子産物の複数配列アラインメントでは、相同領域を持つ予測遺伝子産物のクラスターがいくつか見られた。
これらの複数配列アラインメントには、10 TPM以上かつq < 0.05の遺伝子のみが含まれた。各解析は100回行い、関連するアミノ酸配列が一緒にクラスターを形成した複製の割合を枝の横に示した。パネルAでは、シグナルペプチドを持つが膜貫通ヘリックスを持たないタンパク質の予測アミノ酸配列から構築したツリーが示されている。このツリーには113のアミノ酸配列が含まれ、そのアラインメントには3613のアミノ酸位置が使われている。パネルBでは、シグナルペプチドと1つの末端膜貫通部を持つタンパク質の予測アミノ酸配列から構築されたツリーを示しています。このツリーには35個のアミノ酸配列が含まれ、それらのアラインメントには1845個のアミノ酸位置が使用されている。パネルCでは、2つ以上の膜貫通部を持つタンパク質の予測アミノ酸配列から構築したツリーを示しています。このツリーには12個のアミノ酸配列が含まれ、そのアラインメントには1260個のアミノ酸位置が使用されています。CAZymeドメイン予測は、予測されたCAZymが他の遺伝子と90%以上の割合でクラスター化した場合のみ含まれています。相同領域がCAZymeの活性部位と一致するかどうかは調べていないが、多くの遺伝子は予測されたCAZymeの活性部位によってクラスタリングされている。
Extended Data 図7 モデル化合物アッセイにより、Neocallimastigomycetesの培養において、低分子を介した酸化還元反応によりリグニン結合が切断されることが示唆された。
パネルAにはNeocallimastix californiaeの培養データを、パネルBにはAnaeromyces robustusの培養データを示す。ブランク培養（モデル化合物とリン酸緩衝液のみ）による値は、すべての描かれた値から差し引いた。チロシナーゼインキュベーションはポジティブコントロールである。モデル化合物を添加しない細胞溶解液インキュベーションは、真菌の溶解液の自家蛍光を考慮するために含まれている。エラーバーは、n = 5の対にならないテクニカルレプリカの標準偏差を示し、ブランクTimeZero、ブランクTimeFinal、サンプルTimeZero、およびサンプルTimeFinalに関連する不確実性は、代表標準偏差を計算するために伝播されたものである。24時間の蛍光の変化は、さらに各インキュベーションのタンパク質量に対して正規化され、タンパク質濃度は各インキュベーションのX軸の下に示されている。
Extended Data Table 1 嫌気性腸内細菌には、リグノセルロースからモノアロマティクスを容易に可溶化する菌株があり、この効果は基質と菌のペアリングによって異なる。
フルサイズテーブル
Extended Data Table 2 2D-HSQC-NMR contour volume integralsから得られたサブユニット、側鎖、ユニットの相対量。
フルサイズテーブル
補足情報
補足情報
Piromyces sp. E1M株の単離とモデル化合物を用いた活性測定について補足説明する。
報告書の概要
補足表
補足表1：差分発現とリグニン分解観察、予測モデリングを組み合わせて決定した、本研究の高優先度の注目遺伝子の表である。本研究の注目遺伝子は、3種類のリグノセルロースすべてで発現が上昇し、シグナルペプチドを持つという基準を満たした遺伝子である。補足表 2：Neocallimastigomycetes 分類群全体で保存されている、本研究で最も関心の高い、同定されたアップレギュレーション遺伝子の一覧表です。これらの結果から、興味のある多くの遺伝子産物のホモログは、入手可能で配列決定されたすべての嫌気性真菌ゲノムに存在し、これらの予測ペプチドの一部は高度に保存されていることが示された。
権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Lankiewicz, T.S., Choudhary, H., Gao, Y. et al. 嫌気性菌類によるリグニン分解。Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01336-8
引用元：ダウンロード
2022年6月19日受理
2023年1月31日受理
2023年3月09日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41564-023-01336-8
この記事を共有する
以下のリンクを共有した人は、このコンテンツを読むことができるようになります。
共有リンクを取得する
コンテンツ共有イニシアティブ「Springer Nature SharedIt」により提供されます。
対象者
応用微生物学
生体触媒作用
菌類
ネイチャー・マイクロバイオロジー（Nat Microbiol） ISSN 2058-5276（オンライン版）
ネイチャーズドットコムサイトマップ
ネイチャーポートフォリオについて
私たちについて
プレスリリース
報道関係者
お問い合わせ
ディスカバーコンテンツ
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
ナノ
プロトコル交換
ネイチャーインデックス
パブリッシングポリシー
ネイチャー・ポートフォリオ・ポリシー
オープンアクセス
著者・研究者向けサービス
転載・許可
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャーマスタークラス
ネイチャーリサーチアカデミー
リサーチソリューション
図書館・施設
ライブラリアンサービス＆ツール
図書館員用ポータルサイト
オープンリサーチ
図書館に推薦する
広告・パートナーシップ
広告
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランデッドコンテンツ
キャリア開発
ネイチャーキャリア
ネイチャーコンファレンス
ネイチャーイベント
地域別ウェブサイト
ネイチャーアフリカ
ネイチャーチャイナ
ネイチャーインディア
自然イタリア
ネイチャージャパン
ネイチャーコリア
自然中東
個人情報保護方針

クッキー（Cookie）の使用

Cookieを管理する/私のデータを販売しない
法的注意事項

アクセシビリティ宣言

ご利用条件

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？