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オリジナル研究論文
フロント Cell. Infect. 微生物学、2023年8月23日
臨床微生物学
第13巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1193113
呼吸器合胞体ウイルス性細気管支炎で入院した乳児の臨床経過における腸、口腔、および鼻咽頭の微生物叢動態

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1193113/full

Daniele Zama2† Federica D'Amico1* Alessandro Rocca2 Marco Fabbrini1 Camilla Totaro3 Luca Pierantoni2 Patrizia Brigidi1 Silvia Turroni4‡ Marcello Lanari2‡ 1.
1ボローニャ大学医学外科学部マイクロバイオミクスユニット、ボローニャ、イタリア
2小児救急ユニット、ボローニャ大学科学研究センター（IRCCS）、ボローニャ、イタリア
3イタリア・ボローニャ・ボローニャ大学小児科専門学校
4イタリア、ボローニャ、ボローニャ大学、薬学・バイオテクノロジー学部、マイクロバイオーム科学・バイオテクノロジーユニット
はじめに 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、世界的に乳幼児における気管支炎と入院の最も一般的な原因である。上咽頭微生物叢はRSV細気管支炎の臨床経過に影響を与える役割を果たすことが示唆されており、口腔および腸内細菌叢に関してもいくつかのエビデンスが示されている。しかし、ほとんどの研究は1つのタイムポイントに焦点を当てたものであり、3つの生態系を同時に調査したものはない。

方法：RSV細気管支炎に罹患した乳児19人の腸内細菌叢、口腔内細菌叢、鼻咽頭細菌叢の動態を、入院期間（5日以上または5日未満）との関連で同時に再構築した。糞便サンプル、口腔スワブ、上咽頭吸引液を3つの時点（救急外来入院、退院、6ヵ月フォローアップ）で採取し、16S rRNAアンプリコンシークエンシングによりプロファイリングした。

結果 興味深いことに、気管支炎の臨床経過に依存して、すべての生態系が時間の経過とともに再配列を起こしたが、その構成は異なっていた。特に、長期入院した乳児では、すべての生態系において、不健康な微生物叢の早期かつ持続的な特徴、すなわち、病原性微生物の発現の増加と、年齢から予測される典型的な常在菌の減少が認められた。

考察 RSV細気管支炎の際に乳児の微生物叢をモニタリングし、異常な微生物叢の特徴を速やかに回復させることは、予後と長期的な健康にとって重要であると考えられる。

1 はじめに
乳児の一般的な下気道感染症である気管支炎は、5歳未満の小児における入院の最も頻繁な原因であり、医療ケアシステムに大きな影響を与えている（Hallら、2009；Shiら、2017）。呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は細気管支炎の最も一般的な原因物質であり、2015年の幼児期における世界の下気道感染症は3,310万件であった（Shi et al.、2017；Mazur et al.、2018）。RSV細気管支炎のさまざまな臨床症状が記録されており、鼻漏、発熱、咳、呼吸困難を特徴とする無症状または軽度の感染経過から、入院、酸素療法、陽圧換気補助、必要であれば小児集中治療室への入院が必要となる可能性のある重篤な経過までさまざまである（Meissner, 2016）。最悪の場合、死に至る可能性もある。2015年には、全世界で6カ月未満の乳児のRSV関連急性下気道感染症による院内死亡が約27,300件あったと推定されている（Shi et al.）

年齢が疾患の程度に影響する主な要因の1つであるようで、6カ月未満の乳児は重症細気管支炎に罹患する頻度が高い（Meissner, 2016）。その他の危険因子としては、出生前のタバコ煙への曝露、屋外の大気汚染、未熟児、低出生体重児、母乳育児の欠如、心肺疾患、免疫不全などが挙げられる（Hall et al., 2009; Lanari et al., 2015a, Lanari et al., 2015b, Figueras-Aloy et al.） 呼吸器に生息する微生物が、細気管支炎発症後の臨床経過に影響を及ぼす役割を担っている可能性を示唆する新たな証拠が得られている（Fujiogi et al.） 例えば、鼻咽頭微生物叢（NM）におけるレンサ球菌、ヘモフィルス菌、モラクセラ菌などの異なる菌株の優勢は、RSV細気管支炎を含む乳幼児のウイルス性気道感染症の文脈で役割を果たすことがすでに立証されている（Rossiら、2021）。ウイルス感染時のNM組成の変化は、RSV感染の重症度を高め、ウイルスクリアランスを遅らせる可能性がある（Gulraizら、2015；Mansbachら、2019）。さらに、Haemophilus、Moraxella、Streptococcusの存在の増加は、乳児におけるRSV感染の最も頻度の高い2つの長期的な結果であることが知られている小児喘息および再発性喘鳴の発症リスクの増加（Rosas-Salazarら、2018；Raitaら、2022）と関連している（Steinら、1999；Blankenら、2013）。一方、RSV細気管支炎の発症における他の宿主関連微生物の生態系の役割は、まだ解明されていない。現在までに、乳児のRSV感染に関連して口腔微生物叢（OM）を調査した研究はわずかである。罹患乳幼児は健常乳幼児と同様にレンサ球菌優位のOMプロファイルを示したが、ヘモフィルス、モラクセラ、クレブシエラの相対量が高いことが、その後の再発性喘鳴の発症に寄与することが示唆されている（Huら、2017；Zhangら、2020）。腸内細菌叢（GM）に関しては、バクテロイデス（Bacteroides）優位のプロファイルを持つ乳児は、エンテロバクター（Enterobacter）/ベヨネラ（Veillonella）優位のプロファイルを持つ乳児とは異なり、細気管支炎の可能性が高いことが観察されている（Hasegawa et al. しかし、利用可能な研究のほとんどは単一のタイムポイントに焦点を当てており、我々の知る限り、3つの生態系を一度に調査したものはない。

上記の知見を確認し、拡張するために、我々は、救急外来に入院し、RSV細気管支炎の診断が確定した時点で登録された1歳未満の小児患者19人を対象に、パイロット研究を実施した。具体的には、3つの異なるタイムポイント（救急外来への入院、退院、6ヵ月後のフォローアップ）において、16S rRNAアンプリコンシークエンシングによるGM、OM、NMのプロファイリングを行った。それぞれの生態系について、気管支炎の臨床経過との関連を検証する目的で、微生物叢動態を再構築した。3つの微生物生態系に対するRSV細気管支炎の影響の評価に加え、本研究では入院期間に関連する潜在的な微生物シグネチャーを同定した。

2 材料と方法
2.1 患者登録とサンプリング
本研究は、イタリアのボローニャにあるIRCCS Azienda Ospedaliero-Universitaria, Unitの小児救急部で実施された前向き単中心縦断観察研究に登録されたRSV陽性患者を評価するパイロット研究である。本研究は、エリア・バスタ・エミリア・セントロ倫理委員会（reference 737/2018/Sper/AOUBo）により倫理的に承認された。2021年9月から2022年4月までに急性細気管支炎の初回臨床診断を受けた入院幼児を対象とした。診断は、胸部聴診での喘鳴および/またはラ音と、上気道感染および下気道感染の徴候を特徴とする呼吸窮迫症候群の所見に基づくものとした。急性細気管支炎に関するイタリアのガイドライン（Baraldi et al. 1歳以上の小児、以前に急性細気管支炎の診断を受けて入院した小児、先天性心肺疾患、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、先天性または後天性免疫不全症、呼吸困難を引き起こす可能性のあるその他の疾患のような重度の慢性疾患を有する小児は除外した。登録された各児童について、以下のデータが収集された： i)個人的および解剖学的データ（性別、生年月日、年齢、民族性、妊娠年齢、分娩様式、出生体重、母乳育児、入院時の体重を含む）、ii)入院データ（入院日、退院日、入院期間、小児集中治療室への入院）； iii）臨床データ（入院前の症状期間、入院時のバイタル（心拍数、呼吸数、体温、酸素飽和度）、呼吸困難の徴候（呼吸数増加、呼気後退）、喘鳴および/またはラ音、経口摂取量減少の有無、合併症）、iv）治療データ（投与された薬剤、呼吸補助期間）。

研究は、図1のスキームに従って3つのフェーズ（入院、短期追跡、長期追跡）に分けられた。研究計画に従って、各患者から血液（宿主の炎症状態を評価するため）、鼻咽頭吸引液（ウイルス量、サイトカインの投与量、炎症性浸潤、NMプロファイリングを評価するため）、口腔スワブ（OMプロファイリング用）、尿（メタボローム解析用）、糞便サンプル（GMプロファイリング用）を採取した。救急治療室への入院から退院までの入院期間中、生物学的サンプルは、登録時（V1）、48時間ごと（V2-V3 a-b）、退院時（V4）という異なる時点で採取された。短期フォローアップのため、乳児は退院後10日、30日、180日目にサンプリングされた（それぞれタイムポイントV5、V6、V7）。その後、患者は病歴聴取と3歳までの検体採取のため、1年ごとに定期的に再診される（V8からV10の時点）。

図1
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図1 研究デザインとサンプル採取計画。試験に登録された各乳幼児について、糞便（茶色の点）、尿（黄色の点）、血液（赤色の点）、口腔スワブ（青色の点）、鼻咽頭吸引液（緑色の点）が採取された。すべての乳児は臨床評価を受けた（灰色の点）。登録された乳児は、救急治療室への入院時（V1）、48時間ごと（V2-V3 a-b）、退院時（V4）、そして短期追跡調査のために退院後10日（V5）、30日（V6）、180日（V7）にサンプリングされた。長期追跡調査は、3歳まで1年ごとのサンプリングからなる研究計画で予期されていた。この研究では、V1、V4、V7の時点のみを調査した。

本研究では、救急外来入院時（V1）、退院時（V4）、6ヵ月追跡調査時（V7）に採取した鼻咽頭吸引液、口腔スワブ、便サンプルのみを分析し、以下に述べるように、それぞれNM、OM、GMの特徴を明らかにした。

2.2 便、口腔スワブ、および鼻咽頭吸引液からの微生物DNA抽出
微生物DNAは、便から、ビーズビート＋カラムの繰り返し法（Yu and Morrison, 2004）を用いて抽出し、以前に記載したように若干の調整を加えた（D'Amico et al.） 約250 mgの便サンプルを1 mLの溶解バッファー（500 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 8、50 mM EDTA、および4%ドデシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、FastPrep装置（MP Biomedicals、Irvine、CA、USA）を用いて、4個の3 mmガラスビーズと0.5 gの0.1 mmジルコニアビーズの存在下、5.5 movements/sで3回の1分間サイクルを行った。95℃で15分間インキュベートし、13,000rpmで5分間遠心分離した後、260μLの10M酢酸アンモニウムを上清に加え、氷上で5分間インキュベートし、13,000rpmで10分間遠心分離した。氷上で1容量のイソプロパノールと30分間インキュベートし、核酸を沈殿させた。こうして得られた核酸ペレットを70％エタノールで洗浄し、100μLのTE（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH8.0）バッファーに再懸濁し、2μLの10mg/mL DNaseフリーRNAseで37℃、15分間処理した。その後、サンプルを15μLのプロテイナーゼKと200μLのALバッファーとともに70℃で10分間インキュベートした。DNA 精製は、DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用い、製造元の説明書に従って行った。DNA の濃度と質は NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) を用いて評価した。

口腔スワブの場合、綿棒を1mLの生理食塩水に懸濁し、2分間ボルテックスした。綿棒を取り出し、溶液を8,000×g、4℃で10分間遠心した。上咽頭吸引液の場合は、試料1 mLを8,000 × g、4℃で15分間遠心した。いずれのサンプルも上清を捨て、ペレットを180μLの酵素溶解バッファー（20mM Tris-HCl pH8.0、2mM EDTAナトリウム、1.2% Triton® X-100、20mg/mL リゾチーム）に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。0.2gの0.1mmジルコニアビーズを加えた後、サンプルを1分間ボルテックスした。25μLのプロテイナーゼKと200μLのバッファーALを各サンプルに加え、56℃で30分間インキュベートした。その後、DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN)の説明書に従って、上記のようにサンプルを処理した。

2.3 16S rRNA遺伝子増幅およびイルミナMiSeqシーケンス
イルミナのプロトコル「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation」（Illumina, San Diego, CA, USA）に記載されているように、すべてのサンプルについてライブラリー調製を行った。16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域は、既報のようにイルミナのアダプターオーバーハング配列を含む341Fおよび785Rプライマーを用いて増幅した（Klindworth et al.） 増幅はKAPA HiFi HotStart ReadyMix（Roche, Basel, Switzerland）を用い、以下のサーモサイクルで行った： 95℃で3分、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを25回行い、最後に72℃で5分間反応させた。抽出陰性コントロールは、研究室の慣行に従って、サンプルとともに処理した。アンプリコンは、磁気ビーズベースのクリーンアップシステム（Agencourt AMPure XP; Beckman Coulter, Brea, CA, USA）で精製した。インデックスライブラリーは、Nexteraテクノロジーを用いたリミテッドサイクルPCRによって調製し、その後、上記のように2回目のクリーンアップステップを行った。4nMの等モル濃度にサンプルをプールして調製した最終ライブラリーを変性させ、20% PhiXコントロールで5pMに希釈した。シーケンシングは、メーカーのガイドラインに従って、2×250bpペアエンドプロトコルを用いてIllumina MiSeqプラットフォームで行った。

2.4 バイオインフォマティクスと統計解析
生配列データは、PANDAseq（Masella et al., 2012）とQIIME 2（Bolyen et al., 2019）を組み合わせたパイプラインを用いて解析した。すべての配列は、長さ（最小/最大＝350/550 bp）と品質（デフォルトパラメータ）についてフィルターされた。次に、DADA2パイプラインを使用して、残りのリードをアンプリコン配列バリアント（ASV）にビニングした。分類学的分類は、Greengenesデータベース（2019年5月リリース）に対してVSEARCHアルゴリズムを用いて行った。得られたASV表は、アルファ多様性とベータ多様性の生態学的指標の計算に使用した。アルファ多様性は、シャノン指数とフェイスの系統的多様性（PD全木）を用いて評価した。β多様性は、加重および非加重UniFrac距離を計算することで推定し、主座標分析（PCoA）グラフの構築に使用した。MaAsLin2（Mallickら、2021）を用い、「LM」解析法、正規化なし、値変換なし、Benjamini-Hochberg法によるp値補正で、微生物プロファイルと臨床メタデータ（タイムポイント間の入院期間および臨床感染スコアを含む）との多変量関連性を評価した。有意な関連（p < 0.05）のみを考慮し、コメントした。さらに、splinectomeR Rパッケージ（Shields-Cutlerら、2018）を用いて、検出された分類群の相対存在量の縦断的シフトと入院期間または臨床感染スコアとの関連をさらに探索した。このパッケージは、データの完全な軌跡を考慮して縦断スプラインを再構築し、バックグラウンドノイズをシミュレートするためにデータのランダムな並べ替えに対するグループ傾向の違いを強調する。詳細には、検出された各分類群の相対量について、入院期間（5日以下対5日以上、特許の層別化については結果の段落「3.1 研究コホートの説明」を参照）および臨床感染スコア（軽度対中等度、カットオフレベルについては表1を参照）に基づく群間比較の傾向の差異を検定した。開発者の指示に従い、経時的な個体間のトレンドがゼロでないことを確認するために、順列検定でデータを検定し、その結果、順列検定されたデータポイントのセットと、各群のトレンド間の全体的な差のp値が得られた。グループ間の差はsliding_spliner関数を用いて縦断的に検定され、より大きな分岐のタイムポイントを特定し、その結果のプロットはsliding_spliner.plot.splines関数を用いて作成された。

表1
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表1 登録されたコホートの人口統計学的データと臨床データ。

統計解析はすべてRソフトウェアを用いて行った。PCoAプロットは "vegan "パッケージ（バージョン2.6-2、https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html）を用いて作成し、データの分離は擬似F比を用いた並べ替え検定（"vegan "の "Adonis "関数）で検定した。Kruskal-Wallis検定とそれに続くpost-hoc Wilcoxon検定を用いて、グループ間、すなわち各微生物の生態系におけるアルファ多様性と門、科、属レベルの相対分類群存在量の経時的な差異を評価した。属レベルのヒートマップは "made4 "パッケージ（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/made4.html）と "gplots "パッケージ（https://cran.r-project.org/web/packages/gplots/index.html）の "heatmap.2 "関数を用いて作成した。全コホートおよび入院期間（5日以上または5日未満）で層別化した患者について解析を行った。抗生物質の使用（すなわち、抗生物質を投与された患者と投与されなかった患者との比較）に焦点を当てた解析もNMについて行われた。P値は、必要に応じてBenjamini-Hochberg法を用いて多重比較の補正を行った。偽発見率（FDR）≦0.05の場合は統計的に有意とみなし、p値が0.05～0.1の場合は傾向とみなした。

人口統計学的変数と臨床的変数を患者群間で比較した。カテゴリー変数は度数で示した。連続変数は、Kolmogorov-Smirnov検定によって各変数について検証されたデータ分布に従って、中央値（四分位範囲、IQR）または平均値±標準偏差（SD）で示した。データは必要に応じてχ2、Mann-Whitney、Student t、またはKruskal-Wallis検定を用いて比較した。解析にはGraphPad Prism 8.0.1バージョンを用い、p値<0.05を統計的に有意とみなした。

3 結果
3.1 研究コホート
19人のRSV細気管支炎の乳児が組み入れ基準を満たした。コホートの人口統計学的データと臨床データを表1にまとめた。男性12人（63％）、女性7人（37％）で、平均年齢は15.2±12.1ヵ月、入院時の平均体重は5.8（IQR：4.6-6.9）kgであった。研究対象者は主に満期産の患者（95％）で、14例（74％）が経腟分娩であった。12例（63％）が入院時に授乳中であり、4例（21％）が家庭で受動喫煙にさらされていた。介入に関しては、患者の79％が酸素療法を必要とし、具体的には93％が鼻カニューレによる低流量酸素療法を受け、残りは高流量鼻カニューレによる治療を受けた。入院中、非侵襲的または侵襲的な人工呼吸補助を必要とした患者はおらず、小児集中治療室への入院も必要なかった。臨床スコアによると、感染症の経過が「重症」であった患者はいなかった。入院期間の中央値は5日であった。

入院期間は5日以下（n=11）と5日以上（n=8）の2群に層別化された。上記の変数について、2群間に統計学的有意差は認められなかった。各患者について、便および鼻咽頭吸引液のサンプリングと口腔スワビングを3つの時点、すなわち救急外来入室時、退院時、6ヵ月後のフォローアップ時に実施し、合計168検体（GM 56検体、OM 56検体、NM 56検体）を得た。全サンプルを16S rRNAアンプリコンシーケンスで解析し、3,682,710の高品質リード（平均±SD；21,791.9±7,455.5）を得た。

3.2 RSV細気管支炎の乳児における入院から6ヵ月フォローアップまでの腸、口腔、および鼻咽頭微生物叢の動態
まず、ベースライン、すなわち救急外来に入院した時点での患者のGM、OMおよびNMに対する潜在的交絡因子の影響を評価した。加重UniFrac PCoA分析（図S1）によると、抗生物質投与（PERMANOVA、p = 0.02）とコルチゾン投与（p = 0.04）に関連するNMプロファイルにのみ分離が認められた。

次に、GM、OM、NMの動態を、救急外来での入院から退院、6ヵ月後までの全コホートにおいて再構築した。α多様性は、シャノン指数とフェイスの系統的多様性（ウィルコクソン検定、p≦0.02）の両方の指標を考慮した結果、すべての生態系で時間の経過とともに徐々に増加した（図S2）。ベータ多様性については（図S3）、重み付けされていないUniFrac距離に基づくPCoAは、追跡調査時の糞便サンプルと以前の時点で採取されたサンプルの間で分離を示した（PERMANOVA、p≦0.05）。同様に、OMおよびNMの構造は、UniFracベースのPCoAによる重み付けなしで、救急外来入院時および退院時に採取されたそれぞれの検体の構造とは異なっていた（p≦0.03）。さらに、加重UniFrac距離に基づくPCoAでは、退院時と追跡時のOMプロファイルの間に分離が検出された（p = 0.01）。図2は、3つの微生物生態系すべてについて、ファミリーレベルの相対存在量プロファイルを示している。GMに関しては、ファーミキューテス（平均相対存在量±平均標準誤差：40.5％±3.9％）、放線菌（37.8％±4.0％）、プロテオバクテリア（17.7％±3.3％）がベースラインのプロフィールを支配していた。主な科はビフィズス菌科（31.3％±3.7％）と腸内細菌科（17.1％±3.3％）であった。追跡調査では、コリオバクテリウム科、クロストリジウム科、ラクノスピラ科、Veillonellaceae科、Ruminococcaceae科、Peptostreptococcaceae科、Erysipelotrichaceae科とともに、ファーミキューテス科の相対的存在量の増加が観察された（Wilcoxon検定、p≦0.04）（図S4）。さらに、時間の経過とともに腸内細菌科の割合が減少する傾向が見られた（p = 0.07）。これらの結果の一部は、特にVeillonellaceae、Peptostreptococcaceae、Lachnospiraceae、Enterobacteriaceaeについて、MaAsLin2検定を適用して確認された（表S1）。

図2
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図2 RSV細気管支炎の乳児の腸内細菌叢、口腔内細菌叢、鼻咽頭細菌叢のファミリーレベルの相対存在量プロファイル。各生態系で最も存在量の多い12のファミリーの経時的な相対存在量を示す棒グラフ。Eは救急外来、Dは退院、FUは6ヵ月後の経過観察。

OMは全体的にファーミキューテス属（82.0％±2.7％）が多く、特に連鎖球菌科（70.5％±3.1％）が多かった。追跡調査では、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、フソバクテリア属の相対量が増加し（p≦0.01）、ファーミキューテス属の相対量が減少した（p＝0.005）ことが観察された（図S5）。科レベルでは、放線菌科、[Paraprevotellaceae]、Gemellaceae、Carnobacteriaceae、Veillonellaceae、Fusobacteriaceae、Leptotrichiaceae、Neisseriaceae、Pasteurellaceae (p ≤ 0.04)が増加し、Streptococcaceae (p = 0.002)が減少した。MaAsLin2を用いて、Carnobacteriaceae、Leptotrichiaceae、Pasteurellaceae、Gemellaceaeの結果を確認することができた（表S1）。

NMに関しては、生態系はファーミキューテス門（50.7%±3.2%）とプロテオバクテリア門（29.5%±3.3%）、連鎖球菌科（38.6%±3.2%）とモラクセラ科（15.7%±3.1%）が支配的であった。FusobacteriaとBacteroidetesの割合が追跡調査時に増加し、[Paraprevotellaceae]、NeisseriaceaeとPasteurellaceae、Aerococcaceae、Carnobacteriaceae、LeptotrichiaceaeとFusobacteriaceaeの割合も増加した（p≦0.04）が、Pseudomonadaceaeの割合は減少した（p≦0.05）（図S6）。MaAsLin2を適用しても、統計的に有意な結果は得られなかった。

3.3 入院期間に関連する腸、口腔、および鼻咽頭微生物叢シグネチャの可能性
各微生物生態系について、入院期間（5日以上と5日以下）に基づいて患者を2群に層別化し、組成動態を評価した。

3.3.1 腸内細菌叢
α多様性はいずれの患者群でも経時的に徐々に増加したが、5日以上入院した患者ではベースラインで高く、追跡調査では低かった（それぞれシャノン指数とフェイスの系統的多様性による）（ウィルコクソン検定、p≦0.05）（図3A）。β多様性に関しては、UniFracに基づくPCoA（重み付けなし）では、入院期間が短い乳児においてのみ、退院時と経過観察時のGMプロファイル間に分離が認められた（PERMANOVA、p = 0.03）（図3B；表S2）。

図3
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図3 入院期間の異なるRSV細気管支炎の乳児における腸内細菌叢動態。(A）5日以下と5日以上の入院患者から救急外来入院時（E）、退院時（D）、6ヵ月フォローアップ時（FU）に採取した糞便サンプルについて、シャノン指数（左）とフェイスの系統的多様性（PD_whole_tree；右）で計算したα多様性の分布を示す箱ひげ図。Wilcoxon検定、* p値≦0.05、** p値≦0.01、*** p値≦0.001、# p値≦0.09。(B）微生物叢プロファイル間の重み付けUniFrac（左）と重み付けなしUniFrac（右）の距離に基づく主座標分析（PCoA）。重み付けなしのUniFracでは、入院期間が短い乳児においてのみ、DサンプルとFUサンプルの間に有意な分離が認められた（PERMANOVA、p = 0.03）。(C)全サンプル（左）および平均値（右）における、最も存在量の多い上位27属の相対的存在量のヒートマップ。

分類学的観点からは、高い系統レベルでも多くの違いが現れた（図3C、S7）。特に、5日以上入院した乳児では、退院時にプロテオバクテリアの減少が観察された（ウィルコクソン検定、p = 0.03）。さらに、この門の相対存在量は、この患者群では5日以下の入院の乳児よりも登録時に高く（p = 0.04）、追跡調査でも高い傾向があった（p = 0.08）。一貫して、これらの乳児は登録時に腸内細菌科細菌の割合が増加し、救急外来入院時に観察された初期値（p≦0.05）よりは減少したものの、追跡調査値は入院期間の短い乳児よりも依然として高かった。逆に、5日以上入院した乳児では、Veillonellaの割合は追跡調査時に増加したが（p≦0.05）、Veillonellaceaeの割合は両群とも追跡調査時に増加した。一方、入院期間が短い乳児では、コリオバクテリウム科（特にエッゲルトヘラ）、クロストリジウム科、ルミノコッカス科（特にフェーカリバクテリウム）、パスツレラ科、ブラウチア科、[Ruminoccus]、[Eubacterium]、およびヘモフィルス科の割合が追跡調査時に増加していた（p≦0.05）。Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae、およびPeptostreptococcaceaeは、両患者群で追跡調査時に増加したが（p≦0.05）、Peptostreptococcaceaeは、入院期間が短い乳児でより多くみられる傾向があった（p＝0.06）。MaAsLin2を用いた多変量線形モデル（図S8；表S1）を用いると、入院期間が5日未満の乳児では、追跡調査時にペプトストレプトコッカス科、パスツレラ科、およびヘモフィルス菌の存在が増加することが確認できた。さらに、5日以上入院した乳児では、登録時にクレブシエラの相対量の増加が検出された。

このデータはsplinectomeR Rパッケージを用いてさらに検討され、5日以上入院した乳児では、退院時および追跡調査時にClostridiaceaeとClostridiumの存在量が増加するという特徴が強調された（p < 0.05）（図S9）。スプライントレンドはまた、この乳児グループの登録時のKlebsiellaの割合の増加（p = 0.02）、および5日未満で入院した乳児の追跡調査時のPeptostreptococcaceaeの割合の増加（p = 0.03）を確認した。5日以上入院した乳児では、退院時にブドウ球菌科とブドウ球菌が増加しているようである（p≦0.05）。臨床的スコアとの関連については、統計的に有意な差が認められたのはBlautiaのみであり、その相対量は登録時および追跡調査時に、感染経過が「中等度」の乳児で高いようであった（p = 0.01）（図S10）。

3.3.2 口腔内細菌叢
α多様性は両患者群で全体的に経時的に増加したが、ベースライン時および追跡調査時のいずれにおいても、入院期間が短い患者群で高かった（ウィルコクソン検定、p≦0.04）（図4A）。加重UniFrac距離に基づくPCoAは、これらの時点において2つの患者群間で分離を示した（PERMANOVA、p < 0.02）（図4B；表S2）。追跡プロファイル間の分離は、重み付けされていないUniFrac測定法でも認められ、退院プロファイル間の分離も強調された（p < 0.05）。さらに、両群の患者において、経時的なOM構造間の有意差が観察された（p≦0.04）。

図4
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図4 入院期間の異なるRSV細気管支炎の乳児における口腔内細菌叢動態。(A）入院期間が5日以下と5日以上の患者から救急外来入院時（E）、退院時（D）、6ヵ月フォローアップ時（FU）に採取した口腔スワブサンプルについて、シャノン指数（左）とフェイスの系統的多様性（PD_whole_tree；右）で計算したα多様性の分布を示す箱ひげ図。Wilcoxon検定、* p値≦0.05、** p値≦0.01、*** p値≦0.001、# p値≦0.09。(B）加重UniFrac（左）および非加重UniFrac（右）の微生物叢プロファイル間の距離に基づく主座標分析（PCoA）。E、D、FUの各サンプルについて、2つの患者グループ間だけでなく、各患者グループ内でも経時的に有意な分離が認められた（PERMANOVA、p≦0.04）。(C）全サンプル（左）および平均値（右）における、最も存在量の多い上位27属の相対的存在量のヒートマップ。

分類学的な観点からは、高い系統レベルでもまた多くの違いが現れた（図4C、S11）。特に、全コホートについて追跡調査時に観察されたプロテオバクテリアの増加は、入院日数が5日以下の乳児に特に特徴的であった（ウィルコクソン検定、p≦0.004）。さらに、この患者群におけるプロテオバクテリアの割合は、ベースライン時および追跡調査時の両方で、他の群よりも高かった（p≦0.05）。また、入院期間が短い乳児では、退院時にファーミキューテス属の割合が増加し（p = 0.01）、追跡調査では減少した（p = 0.001）が、コホート全体で観察されたように、登録時と追跡調査の両方で他の患者群と比較して低かった（p ≤ 0.009）。一方、バクテロイデーテス門は、5日以上入院した乳児においてのみ追跡調査時に増加したが（p < 0.03）、それでも他のグループより低かった（p ≤ 0.04）。フソバクテリア（Fusobacteria）は両群とも追跡調査時に増加していた（p≦0.04）。より低い系統学的レベルでも、一般的な変異とユニークな変異を含む多くの変化が観察された。前者については、放線菌科（およびその属である放線菌）、ゲムラ科、カルノバクテリウム科（およびグラヌリカテラ）、[パラプレボテラ科]（および[プレボテラ]）が両患者群で追跡時に増加または増加傾向にあった（p≦0.07）。一方、パスツレラ科（Pasteurellaceae）とその属であるヘモフィルス属（Haemophilus）、プレボテラ科（Prevotellaceae）（およびプレボテラ属（Prevotella））、フソバクテリウム科（Fusobacteriaceae）（およびフソバクテリウム属（Fusobacterium））、レプトトリキア科（Leptotrichaceae）（およびレプトトリキア属（Leptotrichia））、ナイセリア科（Neisseriaceae）（およびナイセリア属（Neisseria））は、入院期間の短い乳児でのみ追跡調査時に増加した（p＜0.05）。最後に、Streptococcaceae科とStreptococcus属は、5日以上入院した乳児でベースライン時に過剰発現していたが、両患者群で追跡調査時に減少し、入院期間が長い乳児で相対量が有意に高いままであった（p≦0.05）。レプトトリキア科（Leptotrichiaceae）、パスツレラ科（Pasteurellaceae）、ヘモフィルス科（Haemophilus）、ナイセリア科（Neisseriaceae）およびナイセリア科（Neisseria）の相対量の増加は、入院期間が短い乳児では追跡調査時に、また、入院期間が5日以上の乳児では登録時にレンサ球菌科（Streptococcaceae）およびレンサ球菌属（Streptococcus）の存在量の増加が、MaAsLin2を用いて確認された（図S8；表S1）。

splinectomeR解析によると、放線菌科、カルノバクテリウム科、顆粒化菌およびナイセリア菌は、両群とも追跡調査時に増加したが、5日以下の入院期間の乳児の割合が高かった（p≦0.05）（図S9）。一方、Micrococcaceae、PrevotellaceaeおよびRothiaは、入院期間が短い患者でのみ追跡調査時に増加した（p≦0.04）。登録時および退院時、Veillonellaceae（およびVeillonella属）に関しては、5日以下の入院期間の乳児と5日以上の入院期間の乳児の間で統計学的に有意な差が認められ、前者のグループでより高い値が記録されたが、この差は追跡調査では消失した（p≦0.05）。臨床的スコアとの関連については（図S10）、オキサロバクター科およびそのヤンチノバクテリウム属は、登録時に感染経過が「中等度」の乳児で濃厚であった（p≦0.04）。これらの乳幼児はまた、Leptotrichiaceae unassigned、Neisseriaceae、およびNeisseriaの追跡調査時の相対的存在量の増加によって特徴づけられるようであった（p≦0.03）。一方、感染経過が「軽度」であった乳児では、他の乳児グループと比較して、登録時にStreptococcaceaeとStreptococcusの割合が高かった（p≦0.04）。MaAsLin2によると、感染経過が「軽度」の乳児は、「中等度」の患者と比較して、追跡調査時にパスツレラ科とヘモフィルス菌の割合が低いことも特徴であった（p≦0.001）。

3.3.3 上咽頭微生物叢
α多様性は、両患者群で追跡調査時に増加または増加傾向にあった（ウィルコクソン検定、p≦0.09）（図5A）。β多様性に関しては、UniFracベースのPCoA（重み付けなし）は、両群の乳児のNMプロファイルで経時的な分離を示した（PERMANOVA、p≦0.04）。さらに、加重UniFrac測定法では登録時に、非加重UniFrac測定法では退院時に、2つの患者群のNM構造間に分離傾向が認められた（p≦0.07）（図5B；表S2）。

図5
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図5 入院期間の異なるRSV細気管支炎の乳児における上咽頭細菌叢動態。(A）5日以下と5日以上の入院患者から救急外来入院時（E）、退院時（D）、6ヵ月フォローアップ時（FU）に採取した鼻咽頭吸引液サンプルについて、シャノン指数（左）とフェイスの系統的多様性（PD_whole_tree；右）で計算したα多様性の分布を示す箱ひげ図。Wilcoxon検定、* p値≦0.05；# p値≦0.09。(B）加重UniFrac（左）および非加重UniFrac（右）の微生物叢プロファイル間の距離に基づく主座標分析（PCoA）。各患者グループ内およびEとDの2つの患者グループ間で経時的な分離が認められた（PERMANOVA、p≦0.07）。(C）全サンプル（左）および平均値（右）における、最も存在量の多い上位27属の相対的存在量のヒートマップ。

分類学的な観点から（図5C、S12）、コホート全体について観察された[Paraprevotellaceae]（およびその属である[Prevotella]）とNeisseriaceae（およびNeisseria）の追跡調査時の増加は、5日以下の入院期間の乳児に特に特徴的であった（p≦0.02）。さらに、登録時のNeisseriaceaeと追跡調査時の[Paraprevotellaceae]の比率は、5日以上入院した乳児の比率よりも高い傾向があった（p≦0.09）。また、入院期間が短い乳児では、追跡調査時にPrevotellaceae（およびPrevotella）とPasteurellaceae（およびHaemophilus）の相対量が増加した（p≦0.05）。一方、長期入院の乳児では、退院時にオキサロバクター科（特にヤンチノバクテリウム）の増加がみられたが、追跡調査ではその割合は減少した（p≦0.04）。また、ブドウ球菌科、連鎖球菌科、レンサ球菌科は、長期入院児ではベースライン時に過剰発現する傾向があった（p≦0.09）。最後に、Fusobacteriaceae（およびFusobacterium）とLeptotrichiaは、どちらの患者群でも追跡調査時に増加していた（p < 0.05）。MaAsLin2解析では、両患者群でLeptotrichiaとその家族であるLeptotrichiaceaeの相対存在量が追跡調査時に増加していることが確認された（図S8；表S1）。対照的に、臨床スコアとの関連を検索したところ、軽症患者と中等症患者の両方で、追跡調査時にLeptotrichiaceaeとLeptotrichiaの割合が減少していた（p≦0.001）。splinectomeRを用いても有意な結果は得られなかった。

登録時のNMプロファイルの間に抗生物質投与との関連で分離が認められたことから、両群の患者を抗生物質曝露に従ってさらに2つのサブグループに分け、属レベルでの分類学的プロファイルを比較した（図S13）。唯一の有意差はコリネバクテリウム属に認められ、その相対量は抗生物質投与を受けて5日以上入院した乳児の方が、抗生物質投与を受けているが入院期間が短い乳児よりも高かった（p = 0.05）。一方、Staphylococcus（ブドウ球菌）とStreptococcus（連鎖球菌）は、抗生物質を投与されず5日以上入院した乳児の方が、抗生物質を投与されず短期間入院した乳児よりも多い傾向があった（p≦0.09）。Veillonellaもまた、抗生物質を投与されなかった乳児と5日以上入院した乳児では、抗生物質を投与された乳児と比較して濃縮される傾向があった（p = 0.08）。一方、Alloiococcusについては逆の傾向、すなわち抗生物質を投与された乳児と5日以上入院した乳児では、抗生物質を投与されなかった乳児と比較して濃縮される傾向が認められた（p = 0.08）。

4 考察
今回初めて、RSV細気管支炎の乳児において、救急外来入院から退院後6ヵ月までの3つの異なる宿主関連微生物生態系（すなわち、糞便、口腔、鼻咽頭）の時間的動態を同時に調査した。このような動態は、疾患の自然史との関連を検討するために、入院期間の異なる患者において別々に再構築された。さらに、このような動態の違いを評価するためにいくつかの方法が用いられ、全体としてより頑健な結果が得られた。利用可能な文献（Hasegawa et al., 2016a; Hasegawa et al., 2016b; Hu et al., 2017; Stewart et al., 2017; Harding et al., 2020）と一致して、調査したすべての生態系は経時的に再配列を起こしたが、気管支炎の臨床経過によって異なる構成を示した。

GMに関しては、入院期間が短い乳児で最も大きな変動が観察された。特に、これらの乳児は、コリオバクテリウム科（特にエガテラ属）、ルミノコックス科（フェーカリバクテリウム属を含む）、ブラウチア属など、年齢から予測される多くの微生物が徐々に増加し、全体的な優生GMプロファイルの回復を示唆した。実際、これらは典型的な発育中の乳児の微生物叢のメンバーであり、その健康に関連している（Leylabadloら、2020；Liuら、2021；Roswallら、2021；Ouら、2022）。逆に、入院期間が長い乳児では、救急外来に入院してからの日和見病原体、すなわち腸内細菌科、クレブシエラ属、クロストリジウム属の相対量が全体的に高いことが示された（Plata et al. 興味深いことに、一部の患者では、腸内細菌科細菌がGMをほぼ支配し（ベースライン時の相対存在率は96.3％）、その割合は追跡調査でも高いままであった。これらの持続的な過剰発現は、5日以上入院した全患者が受けた長期の酸素療法によって、腸内細菌のような通性嫌気性菌にとってより好都合な腸内環境がもたらされた可能性もあると言わなければならない（Rivera-Chávez et al.）

OMに関しても、調査期間中、入院期間が短い乳児は（年齢と適合する）優生的なプロフィールを獲得する傾向があったが、入院期間が長い乳児の微生物叢は全体的に安定して回復力があり、潜在的に不健康なシグネチャーを退院後6ヵ月まで引き継いでいた。特に、Haemophilus属、Prevotella属、Fusobacterium属、Neisseria属、Leptotrichia属（De Steenhuijsen Pitersら、2015；Obaら、2020；D'Agostinoら、2022）のような、乳児の口腔ニッチに通常存在するいくつかの分類群は、入院期間が短い乳児の方が追跡調査時にはるかに多く発現していた。逆に、5日以上入院した乳幼児では、すべての時点で、病原性のある種を含む連鎖球菌属（Yumoto et al.

NMに関しては、RSV細気管支炎の文脈で現在までに最も特徴付けられた宿主関連微生物生態系（De Steenhuijsen Piters et al、 2017; Stewart et al., 2017; Mansbach et al., 2019）、入院期間が短い乳児では、ナイセリア、［プレボテラ］、ヘモフィルス、プレボテラなどの分類群の相対存在量が経時的に増加していることがわかった。繰り返しになるが、これらは乳児NMの典型的な常在菌であり（De Steenhuijsen Piters et al., 2015; Rocafort et al. 対照的に、5日以上入院した乳児では、退院時にオキサロバクター科とその属であるヤンチノバクテリウム属が増加した以外は、NM組成に経時的な劇的な変化は認められず、この生態系にも非共生的特性が持続していることが示唆された。呼吸器感染症の乳児の鼻咽頭におけるこのヤンチノバクテリウムの増加は、利用可能な文献（Man et al.） さらに、これらの患者ではベースライン時にブドウ球菌とレンサ球菌の割合が高い傾向があり（抗生物質を投与されなかった乳児で多い傾向がある）、OMで認められたものと類似していることに留意すべきである。十分な注意が必要ではあるが、このことは、これらの微生物が、変化した微生物叢だけでなく、難治性の（すなわち、操作がより困難な）微生物叢の初期バイオマーカーとしての関連性を示唆している可能性がある。

われわれの研究には、対照群がないなどいくつかの限界があった。とはいえ、本研究の目的は、入院期間、ひいては気管支炎の臨床経過に関連する微生物叢シグネチャーをさまざまな身体部位から見つけることであり、発病に関連するものではない。さらに、気管支炎に関する32の利用可能な臨床スコアのいずれも、入院患者の重症度を推定するのに十分な信頼性がないことが判明したため、患者を層別化する基準として入院期間を用いた（Rodriguez-Martinez et al.） 特に、本研究で採用された臨床スコアは、臨床的重症度の他のアウトカム（入院期間、酸素療法、酸素療法期間など）と相関がなかったため、このパラメータが患者の分類に使用されず、回復期間が優先された理由が説明される。もう1つの限界は、確かにサンプルサイズが小さいことであるが、3つのエコシステムすべてについてほぼ完全なサンプリング軌跡を持つ患者のみが含まれた。サンプル不足の主な理由は、患者および／または保護者のコンプライアンス、時にはサンプリングの妨げとなる疾患の重症度、そして他のケースでは分析に必要な生物学的材料の収集が不十分であったことである。最後に、乳児のマイクロバイオームは時間の経過とともに変化し、一般的に成人のそれよりも可塑性が高く、安定性が低いという特徴があることを述べておかなければならない。いくつかの微生物学的特徴は、間違いなく不健康または生物学的異常であるが（腸内では腸内細菌科、口腔内では連鎖球菌、鼻咽頭ではブドウ球菌と連鎖球菌の過剰発現など）、他の特徴が単に年齢が進むことと関係している可能性も否定できない。

5 結論
本研究では、乳幼児におけるRSV細気管支炎の臨床経過を識別する可能性のある、3つの異なる宿主関連微生物生態系の構成的特徴を同定した。特に、長期入院した乳幼児は、不健康な微生物叢の早期かつ持続的な特徴、すなわち、病原性微生物の発現の増加と典型的な常在菌の減少を示した。長期的な健康状態に対する乳児の微生物叢の優生的な発達軌跡の関連性（Cox et al. 我々の知見は、より長期間のサンプリングや、高解像度の分類学的プロファイリング（生物種レベルまで）や機能的洞察を目的とした他のオミックスアプローチ（メタゲノミクスやメタボロミクスなど）を含む、より大規模なコホート研究で検証されるべきであり、乳幼児の発達のこの重要な段階における生物学的異常の同定を改善する必要がある。この点に関して、当初の研究計画では、今後流行する季節に被験者を募集してコホートを拡大し、最長3歳までの長期追跡調査におけるサンプルの解析を行うことになっている。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータは、NCBIリポジトリ（アクセッション番号 PRJNA978360）に登録されている。

倫理声明
ヒトを対象とした研究は、Area Vasta Emilia Centro Ethics Committee（参照番号737/2018/Sper/AOUBo）により承認された。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。本研究への参加に関する書面によるインフォームド・コンセントは、参加者の法定後見人/近親者から提供された。

著者貢献
概念化、MLおよびPB；データキュレーション、SR、FD'A、DZ、ARおよびCT；形式分析、SR、FD'A、MF、DZおよびAR；調査、SR、FD'A、DZおよびAR；リソース、PB；監督、PB；視覚化、SRおよびDZ；執筆-初稿、SR；執筆-査読および編集、FD'A、ML、DZおよびST。すべての著者が本原稿を読み、その内容に同意した。

資金提供
著者らは、本論文の研究、執筆、出版のために金銭的支援を受けていないことを表明する。

謝辞
バイオインフォマティクスとデータ可視化のサポートをしてくださったDaniel Scicchitano博士に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1193113/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：呼吸器合胞体ウイルス、腸内細菌叢、口腔内細菌叢、鼻咽頭細菌叢、乳児（0～24ヵ月）

引用 Roggiani S, Zama D, D'Amico F, Rocca A, Fabbrini M, Totaro C, Pierantoni L, Brigidi P, Turroni S and Lanari M (2023) 呼吸器合胞体ウイルス性細気管支炎で入院した乳児の臨床経過における腸、口腔、鼻咽頭の微生物叢動態。Front. Cell. Infect. Microbiol. doi: 10.3389/fcimb.2023.1193113.

受理：2023年3月24日 2023年3月24日；受理された： 2023年08月04日；
発行：2023年08月23日

編集：アレッサンドラ・ピエランジェリ

アレッサンドラ・ピエランジェリ（ローマ・サピエンツァ大学、イタリア
査読者

Meghan Shilts, ヴァンダービルト大学メディカルセンター, 米国
Zhengde Xie, 首都医科大学、中国
Copyright © 2023 Roggiani, Zama, D'Amico, Rocca, Fabbrini, Totaro, Pierantoni, Brigidi, Turroni and Lanari. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Federica D'Amico, federica.damico8@unibo.it

これらの著者は筆頭著者である。

‡これらの著者が最終著者を共有する

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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