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オリジナル研究論文
Front. 微生物学、2024年3月26日
Sec.脊椎動物の消化器系における微生物
第15巻 - 2024年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1331130
この論文は次の研究テーマの一部です。
動物モデル、腸内細菌叢と脳疾患
全8記事を見る
微生物叢プロファイリングにより、自閉症関連16p11.2マイクロ重複モデルマウスにおける腸内細菌神経伝達物質の変化が明らかになった

https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2024.1331130/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit

張富&#x;チャン・フー
1
†
Xiuyan Yang&#x;Xiuyan Yang
1
†
Youheng Jiang,&#x;Youheng Jiang
1,2
†
シンリャン・マオ&#x;シンリャン・マオ
3
†
Hualin LiuHualin Liu
3
ヤン・ヤンミンYanming Yang
1
ジア・チェン
1,2
陳珠梅,陳珠梅
1,4
李慧良,李慧良
5,6
張雪松,張雪松
7
毛新軍
マオ・シンジュン
8
*
李寧寧
李寧寧
1,6
*
ディロン・ワン
ディロン・ワン
9
*
ジャン・ジャン
ジャン・ジャン
1
*
1中国広東省深圳市中山大学第七附属病院トーマス・リンダル・ノーベル賞研究室
2広東省中山大学第七附属病院消化器癌研究重点実験室消化器病センター、中国広東省深圳市
3広東省完全生命健康科学技術研究所有限公司、中国広東省中山市
4中山大学第七附属病院麻酔科（中国広東省深圳市
5英国ロンドン大学医学部ウルフソン生物医学研究所医学部門
6中国・英国フロンティアサイエンス研究所（中国・広東省深圳市
7米国ニュージャージー州ピスカタウェイ、ラトガース大学先端生物工学・医学センター
8中国広西チワン族自治区百色市友江民族医科大学附属病院麻酔科
9中国広東省広州市、中山大学中山記念病院小児科
腸脳軸は、自閉症スペクトラム障害（ASD）を含む神経精神疾患の調節に関与していることが明らかになっている。染色体16p11.2マイクロ重複16p11.2dp/+は、ASDに関連する最も一般的な遺伝子コピー数変異（CNV）の一つである。しかし、16p11.2dp/+によって誘発されるASD様障害の発症の根底にある腸内細菌叢の状態の意味するところは、依然として不明である。この問題を解決するため、我々はまず、ASDに特徴的な社会的新奇性障害と反復行動を示す16p11.2dp/+のモデルマウスを調べた。その後、16p11.2dp/+と野生型の腸内微生物群集とメタボロームプロファイルの比較解析を、16S rRNA配列決定と液体クロマトグラフィー質量分析（LC/MS）を用いて行った。その結果、16p11.2dp/+マウスでは、α/βダイバーシティ解析によって示されたように、生物多様性の低下と種の存在量の変化を特徴とする、構造的な微生物叢異常が明らかになった。特に、16p11.2dp/+マウスでは、FaecalibaculumとRomboutsiaの相対量が減少し、TuricibacterとPrevotellaceae UCG_001の増加が観察された。メタボローム解析の結果、19の代謝物が有意に変化し、アミノ酸代謝経路が濃縮されていることが明らかになった。特に、16p11.2dp/+マウスでは、主にヒスタミンを中心とした神経伝達物質ネットワークの崩壊が観察された。これらの知見を総合すると、16p11.2dp/+マウスにおける腸内細菌叢と微生物性神経伝達物質の間に潜在的な変化と相関があることが明らかになり、16p11.2 CNVに関連するASDの病態と治療法に関する新たな知見が得られる。

はじめに
腸内細菌叢は、消化管に生息する微生物の複雑なコミュニティーから構成されている（McCallum and Tropini, 2023）。過去10年の間に、科学的研究は、一般に微生物叢-腸-脳軸として認知されている、消化管系と中枢神経系をつなぐ強固な双方向コミュニケーションネットワークに光を当ててきた（Agirman and Hsiao, 2021）。自閉症スペクトラム障害（ASD）（Wang Q. et al., 2023）、パーキンソン病（Nie and Ge, 2023）、うつ病（Donoso et al., 2023）、アルツハイマー病（Zhu et al.）

ASDは、再発性の定型行動と社会的相互作用の障害に代表される、非常に多様な神経発達状態である（Weissら、2008年）。最近の疫学的知見によると、2018年の米国における小児および青年の有病率は2.3%であった（Li et al.） 注目すべきことに、ASDと診断された人は、障害の中核的特徴と並んで、下痢、便秘、ガス欠などの消化器症状を頻繁に示す（Fulceri et al.） 最近の研究では、ASD患者の消化管症状と神経発達の両側面において、腸内細菌叢が大きく影響していることが明らかにされている。腸内微生物は神経伝達物質を合成する能力を有しており、それによって微生物叢-腸-脳軸に影響を与えている（Srikantha and Mohajeri, 2019）。常在菌であるバクテロイデス・バルガータス（Bacteroides vulgatus）、エガテラ・レンタ（Eggerthella lenta）、クロストリジウム・ボツリヌス（Clostridium botulinum）などの特定の微生物種は、グルタミン酸-グルタミン代謝を変化させ、コルチゾールを減少させ、芳香族アミノ酸の代謝を阻害することによって、ASDの発症と発達に影響を及ぼす可能性がある（Wang et al. 注目すべきことに、先行研究では、ASDの胃腸症状に対する病原性細菌ボツリヌス菌の関係が明らかにされ（Ding et al., 2017）、GTPase RHOファミリーの発現に影響を与える分泌毒素を通じてASDを促進する潜在的な役割について議論されたが（Argou-Cardozo and Zeidan-Chulia, 2018）、致死的疾患とASDをもたらす毒性学の違いは依然として不明である。さらに、胎児ヒスタミン濃度は、ASDコホート内でIFN-γレベルの上昇を示す個体における下痢症状の存在と関連している（Xuら、2023）。さらに、腸内細菌叢の乱れは神経伝達物質の調節を乱し、神経発達障害の発症に寄与する可能性がある。例えば、アントシアニンは乳酸桿菌を増加させ、エンテロクロマフィン（EC）細胞を刺激し、セロトニン合成に必要なトリプトファンの可用性を高めることが実証されている。この効果により、バルプロ酸曝露によりASDを発症したマウスでは、社会的相互作用が改善され、反復行動が減少した（Serra et al.、2022年）。

ASDと診断された人の中で、最も一般的な遺伝的変異の一つは16p11.2コピー数変異（CNV）で、ASD症例の約1％に影響を及ぼしている（Kumar et al., 2008; Marshall et al.） この遺伝子座は約600kbに及び、29のタンパク質コード遺伝子を含んでいる。この領域内の微小重複や微小欠失は、ASD（Fernandez et al., 2010）や統合失調症（Chang et al、 2021年）、代謝異常、血液学的状態、骨格異常、泌尿生殖器異常、睡眠障害などである（Wuら、2015年；Verbitskyら、2018年；Crawfordら、2019年；Giannuzziら、2019年；Kamaraら、2021年；Wangら、2022年；Hanssenら、2023年）。とはいえ、16p11.2 CNVがASD発症に影響を及ぼす正確なメカニズムは、まだ十分に解明されていない（Rein and Yan, 2020）。自閉症は多面的な障害であり、遺伝的、環境的、腸内細菌叢的要因がすべて関与している（Sauerら、2021年）。16p11.2の遺伝子変異が、遺伝的メカニズムだけでなく、非遺伝的要因を通して、自閉症の発症や進行にどのように影響するかを理解することは極めて重要である。16p11.2微小欠失症候群と腸内細菌叢をめぐる研究は行われているが、16p11.2微小重複が腸内細菌叢に及ぼす具体的な影響や、その変化が自閉症症状とどのように関連する可能性があるのかは、まだ明らかになっていない。

7Slx1b-Sept1領域内のマイクロ重複を特徴とする16p11.2dp/+マウスモデルは、16p11.2dp/+の機能的意味を調べるための効果的なツールとなる。ASD様症状の文脈における16p11.2dp/+と腸内細菌叢の複雑で多面的な関連を探るため、まず16p11.2dp/+マウスにおいてASDに関連する中核的行動の存在を確認した。続いて、16p11.2dp/+マウスと野生型（WT）マウスから採取した糞便サンプル中の腸内細菌叢と代謝産物について、16S rRNA配列決定と液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）を用いて解析を行った。16S rRNAのデータから、16p11.2dp/+マウスとWTマウス10匹から合計915個のアンプリコン配列変異（ASV）が得られた。さらに、メタボローム解析を行い、これらのサンプルから合計458の代謝物を同定した。さらに、糞便代謝産物と個々の細菌との相関解析を行い、これらの異なる微生物種と糞便代謝産物との関係を探った。

材料と方法
動物
16p11.2dp/+マウスは、ヒト16p11.2遺伝子座とシンテニックなマウス染色体7F3のヘテロ接合性重複を特徴とし、Jackson Laboratoryから調達した（ストック番号：013129）。これらのマウスをWT C57BL/6バックグラウンドの雌マウスと交配した（Horev et al.） コロニーを維持するため、繁殖にはWT雌と16p11.2dp/+雄の交配を用いた。対照群にはWT雄の子孫を用いた。1群あたり合計10-11匹のマウスが研究に参加した。すべてのマウスに滅菌餌とオートクレーブ滅菌水を自由摂取させ、12時間の光サイクルを与えた。本研究は、南方科技大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって概説された倫理的ガイドラインとプロトコルを厳守して実施された。

行動試験
三室試験
社会行動試験は、以前に記述した実験（Sgritta et al.） 三室装置は、相互に連結された3つの室に分割された長方形の箱（60×40×20cm、L×W×H）から構成された。マウスは空の装置で10分間馴化された。その後、社交性を10分間評価し、その間にマウスは空のケージまたは見知らぬマウス(M)のどちらかと接することができた。その後、もう1匹の見知らぬマウス(Nov)を10分間導入し、社会的新奇性に対する嗜好性をテストした。テストマウスが空のケージ、FamマウスまたはNovマウスと相互作用した時間をEthoVision XT 10ソフトウェアパッケージを用いて記録・測定した。人間の観察者は処置群について盲検であった。

オープンフィールド試験
オープンフィールド試験は、我々が以前に記述した実験（Jiangら、2022）を応用した。マウスを箱（40×40×40 cm3）に入れ、10分間自由に探索させた。内部の20×20cm2の領域を中心領域とした。中心領域での移動距離、移動速度、移動時間は、Noldus EthoVision XT10（Noldus Information Technology; Leesburg, VA, United States）によって記録され、自動的に解析された。

セルフグルーミング試験
マウスをコーンコブの寝具を入れた空のケージに5分間入れ、馴化させた。その後、各マウスは次の10分間でグルーミングに費やした時間を記録した。セルフグルーミングには、顔を拭く、頭や耳を掻く/擦る、体全体をグルーミングするなどが含まれる。

高架式プラス迷路
迷路は、互いに交差する2本の開いたアームと2本の閉じたアームで構成され、床から1mの高さに設置された。高架式プラス迷路はビデオ追跡システムを備え、ビデオはNoldus EthoVision XT10ソフトウェアで解析された。試験マウスはオープンアームに面した中央に置かれ、5分間の活動性を測定した。オープンアーム、センターエリア、クローズアームで過ごした時間の合計が記録された。

糞便サンプルの採取
90日間の摂食期間後、16p11.2dp/+雄マウスとWTマウスから新鮮な糞便を採取した。各マウスにつき、少なくとも2本のチューブからサンプルを採取し、各チューブには約200mgの糞便が含まれていた。

DNA抽出と16S rRNA配列決定
ゲノムDNAは、先の研究（Kang et al., 2019）が実施した研究で概説したように、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）法を利用してマウスの糞便サンプルから単離した。簡単に説明すると、E.Z.N.A Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek, Inc.製、Norcross, GA, United States）を用いて、製造元が提供するガイドラインに従って、優れた品質の全微生物DNAを抽出した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の増幅は、98℃で1分間の初期段階、98℃で10秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の伸長、72℃で5分間の最終伸長段階を30サイクル繰り返すPCR法を用いて行った。この目的のために、ユニバーサル細菌プライマー、341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）および806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）を使用した。シーケンスライブラリーの調製には、NEB Next®Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB、米国）をメーカーのガイドラインに従って使用し、インデックスコードを組み込んだ。ライブラリーの品質は、Qubit@ 2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）とAgilent Bioanalyzer 2,100システムを用いて評価した。最終的に、ライブラリーはHiSeq2500 PE250プラットフォームでシーケンスされ、250塩基対のペアエンドリードが生成された。

糞便メタボローム解析
便サンプル中の代謝物をLC-MSで測定した。簡単に説明すると、800 μLのメタノール-アセトニトリル溶液（1:1、v/v）を80 mgの糞便サンプルに加え、ボルテックスした後、遠心分離した。サンプルを氷上で10分間インキュベートし、4℃で14,000rpm、20分間遠心分離した後、上清を保持し、-80℃で保存した。超高性能液体クロマトグラフィー（UHPLC）-MS/MS 分析には、Agilent 1,290 Infinity LC システム（Agilent、1.7 μm、2.1 mm × 100 mm）を使用して、25℃の一定温度でサンプルのクロマトグラフィー分離を行い、AB Triple TOF 6600 シリーズ質量分析計（AB SCIEX）を使用して溶出代謝物を検出しました。生データファイルを ProteoWizard で .mzXML 形式に変換し、XCMS プログラム1 を使用して各代謝物のピークアライメントと定量を行いました。その後、ピーク強度を全スペクトル強度に対して正規化した。

データ解析と統計検定
2つのグループの行動テストのデータは、分析のためにt検定を受けた。三室試験の結果については、二元配置分散分析を行い、さらにボンフェローニの多重比較検定を行った。

標準的なアンプリコンシークエンスデータ解析は、QIIME 2とそのDADA2プラグインを使用して実施した。これらの解析には、配列の品質管理、特徴表および代表配列の作成、SILVA SSURef NR99 version 138.1データベースに対する代表配列の分類学的割り当て、系統樹の構築が含まれた。 α-多様性およびβ-多様性解析は、Rパッケージveganを用いて行った。16p11.2dp/+マウスとWTマウス間のα多様性の有意差を評価するために、Rパッケージampliconのalpha_boxplot関数に組み込まれたTukey HSD検定を利用した。Rパッケージのveganを用いて、Bray-Curtis距離に基づいて主座標分析（PCoA）を適用し、全サンプルの群集組成を同定した。差分分類群の解析はLEfSeを用いて行った。KEGGパスウェイの予測はPICRUSt2を用いて行った。Wilcoxon順位和検定を用いて、2つのグループ間の門、属、機能モジュールの存在量の差を評価した。p値はBenjamini-Hochberg法で多重検定のために調整し、偽発見率（FDR）をコントロールした。

部分最小二乗判別分析（PLS-DA）および直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）は、各群の代謝物を可視化して比較するために採用し、並べ替え検定アルゴリズムを用いて群間の代謝変動を検出した。有意差のある代謝物は、p値（t検定）<0.05、VIP>1のしきい値を用いて同定し、クラスタリングブロットマップを作成した。微生物と代謝物の相関はスピアマン相関分析を用いて解析し、有意性はp < 0.05とした。

結果
16p11.2dp/+マウスは社会的新規性障害と反復行動を示す
16p11.2dp/+マウスがヒトに見られる臨床的特徴を再現するかどうかを調べるため、8～10週齢の雄性16p11.2dp/+マウスと年齢をマッチさせたWTマウスを用いて行動テストを行った。社会的スキル、反復行動、不安行動などのASD関連行動をテストした。社会性と社会的認知を評価する3室試験では、16p11.2dp/+マウスもWTマウスも、空のケージ（E）よりも見知らぬマウスのいる部屋（M）を好んだ（図1A-C）。興味深いことに、社会的新規性の段階では、16p11.2dp/+マウスはWTマウスに比べて新規マウス（Nov）に対する選好性が有意に低かった。このことは、16p11.2dp/+マウスにおける社会的新奇嗜好性の潜在的欠損を示唆している（図1D-F）。社会性の障害に加えて、反復行動もASDの中核的症状である。16p11.2dp/+マウスの反復行動を評価するために、ホームケージで10分間以内のグルーミングの頻度を観察した。注目すべきことに、16p11.2dp/+マウスは、反復行動を示すセルフグルーミングを有意に多く行った（図1G,H）。ASD患者はしばしば不安様行動を示すことから、16p11.2dp/+マウスが同様の行動を示すかどうかを検討した。オープンフィールド試験（図1I-K）と高架式十字迷路（補足図S1）を通して、マウスの運動行動と不安様行動を測定した。しかし、これらの実験では16p11.2dp/+マウスにおける有意な不安様行動は認められなかった。以上の結果から、16p11.2dp/+マウスは社会的新奇性の認識に障害を示し、ASDを想起させる定型的反復行動をとることが示された。

図1
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図1. 16p11.2dp/+マウスは社会的新奇性の欠損と反復行動を示した。(A,D)三室試験のイラスト（E：空のケージ、M：見知らぬマウス、Fam： Nov：新規見知らぬマウス）。(B)社交性期のヒートマップ。(C)10分間のマウス（社会的）と空のケージ（非社会的）との相互作用に費やされた時間。 (E)社会的新規性段階における表象ヒートマップ。(F)16p11.2dp/+マウスはWTマウスと比較して、新規社会性マウスに対する選好性が低下した。(G) マウスのセルフグルーミング実験の図。(H）16p11.2dp/+マウスのセルフグルーミング時間は有意に増加した。(I) オープンフィールド実験の図。(J,K)16p11.2dp/+マウスとWTマウスの間で、移動距離と中心領域での滞在時間に有意差は認められなかった。統計学的有意性は以下のように示した： データは平均値±SEMで示した。*p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.001, ns: 有意ではない, WT: n = 11; 16p11.2dp/+: n = 10.

WTマウスと比較した16p11.2dp/+マウスの腸内細菌叢の変化
16p11.2dp/+マウスとWTマウスにおける腸内細菌叢の違いを明らかにするために、16S rRNAの塩基配列を決定した。合計919個のアンプリコン配列バリアント（ASV）が同定され、細菌に割り当てられなかった4個を除いた残りは915個であった。図2Aに描かれているように、16p11.2dp/+群ではWT群と比較してChao1指数とShannon指数が有意に低かった。ACE指数（補足図S2A）、リッチネス（補足図S2B）など、他のα多様性推定法においても同様の傾向が見られた。この結果から、16p11.2dp/+マウスはWTマウスに比べて生物多様性と種の豊富さが低いことが示唆された。Bray-Curtis距離測定法を用いて、2群間の微生物群集の類似度を評価するためにPCoAを行った（図2B）。解析の結果、16p11.2dp/+群の微生物叢組成はWT群と有意な違いを示した。複数の分類レベルで細菌組成の包括的解析を行った。16p11.2dp/+マウスとWTマウスは、門レベルでも属レベルでも異なる微生物プロファイルを示した（補足図S2D,E）。特に、WT群と比較して、16p11.2dp/+群はバクテロイデス属のレベルが高く、ファーミキューテス/バクテロイデス比が減少傾向にあることが特徴的であったが、この傾向は統計学的有意差には達しなかった（補足図S2C）。

図2
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図2. 16p11.2dp/+マウスとWTマウスにおける微生物組成と機能的意義の解析。(A）16p11.2dp/+マウスとWTマウスから採取した糞便サンプルを用いて、Chao1指数とShannon指数を含むα多様性指標を算出した。(B）16p11.2dp/+群とWT群を比較する主座標分析（PCoA）プロットにより、β多様性を評価した。PERMANOVAを使用、p < 0.05。(C)16p11.2dp/+群とWT群の間で、属レベルで有意に豊富な細菌分類群の線形判別分析(LDA)スコア(LDA > 2, p < 0.05, FDR < 0.05)。赤色のバーはWT群で濃縮された分類群、緑色のバーは16p11.2dp/+群で濃縮された分類群を示す。(D)16p11.2dp/+マウスとWTマウスでレベル2に濃縮されたKEGGパスウェイの平均値。有意性はt検定、*FDR < 0.05で示した。すべての実験セクションは、1グループ10匹のマウスの解析に基づいている。

次に、LEfSe法を用いて、2群間の腸内細菌叢の属レベルの違いを調べた（LDAスコア＞2.0、p＜0.05）。ロリポッププロットでは、16p11.2dp/+マウスの微生物叢に顕著な変化が見られ、TuricibacterとPrevotellaceae UCG_001のレベルが上昇し、FaecalibaculumとRomboutsiaのレベルが低下していた（図2C）。

16p11.2dp/+グループの腸内微生物群集における機能的変化について予備的な洞察を得るために、我々は16S rRNAシーケンスデータを用いてKEGG解析を行った。我々はまず、16p11.2dp/+群とWT群の間で差のある分類群から、明確なKEGGオーソログマーカーを同定することから始めた。これらのマーカーは機能的細菌遺伝子を表し、2群間の腸内細菌叢の機能的能力の違いを示していた。次に、これらのマーカーをKEGGデータベースの関連代謝経路にマッピングした。その結果、16p11.2dp/+のグループでは、アミノ酸代謝、脂質代謝、エネルギー代謝、糖鎖の生合成と代謝、ゼノバイオティクスの生分解と代謝など、いくつかの経路で障害があることが明らかになった。さらに、omixerRPM r-package（v0.3.2）を用いて、KEGGオルソログを腸脳モジュール（GBM）のアノテーション（Lou et al.） KEGGから得られた知見と一致するように、我々はGBMからアミノ酸代謝、脂質代謝、エネルギー代謝に属する多数の差異パスウェイを同定した（補足図S2F）。

以上の結果を総合すると、16p11.2dp/+マウスの腸内細菌叢には大きな変化があることが明らかになり、16S rRNAデータを用いた代謝経路の乱れの予測可能性が強調された。

WTマウスと比較した16p11.2dp/+マウスの代謝プロファイルの変化
微生物の代謝産物は、様々な経路を介して宿主の生理や行動に影響を与える可能性があり、代謝産物の中には血流に入るものさえある。そこで、16S rRNA分析に用いたサンプルと同じサンプルの代謝プロファイルをLC/MSで調べた。16p11.2dp/+群とWT群の糞便サンプルは、PLS-DAとOPLS-DAの結果に基づいて効果的に区別された（図3A,B）。その後、代謝物プロファイリングにより19の代謝物が有意に変化していることが同定され、中でもヒスタミンが最も大きな変化を示した（図3Cおよび補足表S1）。

16p11.2dp/+マウスの腸内細菌叢における潜在的な機能的変化を推測するために、KEGG解析を行った。同定された代謝物を、代謝反応に関与する酵素を表す対応するKEGGオルソログマーカーにマッピングした。この解析の結果、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理にまたがる13のKEGGパスウェイにおいて、両群間で有意な違いが認められた。特に代謝のカテゴリーでは、有意に変化した代謝物の濃度が最も高かった（図3D）。

さらに、スピアマン相関分析によってこれらの代謝物の相互関係を詳細に調べ、ヒートマップで視覚的に示した（図3E）。要約すると、メタボロミクス解析により、有意に関連性のある19の制御された代謝物が明らかになり、代謝に関連する複数のKEGGパスウェイで濃縮が示されました。

図3
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図3. WTマウスと比較した16p11.2dp/+マウスの腸内細菌代謝プロファイルの変化。(A）部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を用いたクラスタリング分析。(B）直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を用いたクラスタリング分析。(C)16p11.2dp/+群とWT群の間で有意に異なる19代謝産物をバブルチャートで表したもの。1.5倍以上の変化、VIP≧1、p＜0.05（t検定）の代謝物が表示されている。(D）13のKEGGパスウェイが16p11.2dp/+群とWT群で有意差を示した。(赤は正の相関、青は負の相関を示す。色の濃さは相関の強さを表す。統計的有意性は以下のように表される： データは平均値±SEMで示す。p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001、ns：有意ではない、各群n＝10。

16p11.2dp/+マウスにおけるヒスタミン代謝を中心とした神経伝達物質ネットワーク活性の変化
腸内細菌叢と腸内代謝産物には複雑な相互作用があり、両者が疾患発症に寄与することが多いことから、これらの因子の包括的複合解析を行った。まず、16S rRNAとメタボロミクスデータの統合解析をKEGGパスウェイレベル2で行ったところ、5つのパスウェイで交差が見られた（図4A）。その後、これら5つのパスウェイに関連する特徴的な代謝物を分析するうちに、ヒスタミン、5-HT、ドーパミンを含む神経伝達物質ネットワークが明らかになった。ヒスタミンは主にこのネットワークの中心的ハブとして機能し、他の神経伝達物質と代謝的につながっている（図4B）。注目すべきは、ビタミンB6（Ferrante and Mercogliano, 2023）と胆汁酸（Ku, 2014）は、ヒスタミン合成において極めて重要な酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素（HDC）の酵素活性を高める能力を持ち、その代謝プロファイルは注目に値するダイナミズムを示すことである。さらに、ヒスタミンと密接に関連する代謝産物や細菌を同定するために、ヒスタミンと他の有意に変動した代謝産物との相関解析を行ったところ、コプロポルフィリンIIIや1-ステアロイル-rac-グリセロールのような代謝産物との深い関連が明らかになった（図4C）。さらに、特にコリオバクテリウム科UCG_002、デフルビタリウム科UCG_011、オシロスピラ科NK4A214グループなど、様々な細菌属と代謝産物との関係を属レベルで掘り下げ、微生物群集内での役割をマッピングした（図4D）。まとめると、16p11.2dp/+マウスで観察されたヒスタミン代謝の障害は、腸内細菌の代謝活動と複雑に関連している。

図4
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図4. 16p11.2dp/+マウスにおけるヒスタミンを中心とした神経伝達物質ネットワークの濃縮。(A）レベル2で16p11.2dp/+マウスとWTマウスに共通するKEGGパスウェイの変化の数をベン図で示す。(B）16p11.2dp/+群とWT群間の神経伝達物質ネットワークに関連する発現代謝産物の差（Fold change >1.24、VIP≥1、p < 0.1、t検定）。(C)ヒスタミンと有意差のある代謝産物を結んだネットワーク解析。代謝物を結ぶ線は、各微生物属との関連方向を示し、実線（陽性）または点線（陰性）で表される（｜r｜ > 0.4、p < 0.05）。(D)属レベルで異なる量の種と、ヒスタミン代謝に関連する代謝産物との間のスピアマンの相関。相関効果は青（負の相関）から赤（正の相関）へのカラーグラデーションで示されている。統計的有意性は以下のように示す： データは平均値±SEMで示した。p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、t検定で評価。

考察
我々の研究により、ASD形質に関連する腸内細菌叢と微生物神経伝達物質プロファイルの変化が明らかになった。野生型マウスと比較すると、腸内微生物の多様性が減少しており、ASD様行動と相関する微生物集団量の特異的なシフトが観察された。さらに、メタボローム解析の結果、アミノ酸経路に関連する代謝産物における有意な変化が浮き彫りになり、腸内細菌叢とASD様行動との関連性がさらに示唆された。これらの包括的な結果は、ASD発症における腸脳軸の役割を強調するものであり、今後の研究に新たな展望を与えるものである。

われわれの知見に基づき、16p11.2dp/+マウスモデルはさらにASD様症状を示している。この特異的CNVは、de novoで発生する症例の割合が顕著であり（Rein and Yan, 2020）、ASD、統合失調症、知的障害と有意に関連している。行動評価では、社会性障害や反復行動といったASDの中核症状が明らかになり、このモデルに関する先行研究（Reinら、2021年）と一致した。さらに、16p11.2dp/+マウスでは、開腕探索時間や高架式十字迷路の成績に明らかな変化は見られなかった。先行研究では、16p11.2dp/+マウスは高架式十字迷路でテストしたときに開腕時間の短縮を示す可能性が示唆されているが、この影響は性別によって異なる可能性がある（Bristow et al.） 本研究は、16p11.2dp/+マイクロ重複が示す典型的なASD関連特徴を浮き彫りにし、16p11.2dp/+マウスがASD関連研究の貴重なモデルとして役立つ可能性を示唆している。

包括的な脳関連機能障害の下での腸内微生物の意味を掘り下げるために、16p11.2dp/+マウスの腸内細菌叢組成の変化を調べるために16S rRNAシーケンスを採用した。PCoAによるβ多様性解析と並行して、観察された種の豊かさ、Chao1、ACE、およびシャノン指数のようなα多様性指標を利用することで、16p11.2dp/+マウスにおける生物多様性の減少が観察され、先行するASD研究（Gilbertら、2013；Golubevaら、2017；Kangら、2017；Limら、2017；Kangら、2018；Sharonら、2019；Wangら、2019）と一致した。門レベルの組成、特にファーミキューテス（Firmicutes）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の解析では、明確な傾向を特定することなく、他の研究で観察された腸内細菌叢動態の複雑な性質を反映する変動が示された（Tomovaら、2015；Stratiら、2017；Zhangら、2018）。属レベルでは、TuricibacterとPrevotellaceae UCG_001の増加と、FaecalibaculumとRomboutsiaの減少が観察された。これらの観察結果は、自閉症児の糞便マイクロバイオーム解析に関する先行研究と、若干のニュアンスの違いはあるものの、一致している。例えば、ツリシバクターはASDに関連した行動に関与しており、VPAマウスモデルにおいて糞便微生物叢移植後に症状が改善したことで実証されている（Wang J. et al.、2023）。さらに、研究により、Turicibacterの存在量と性ホルモンの間に逆相関があることが示されており、女性におけるASDの有病率に関する知見が得られる可能性がある（Wuら、2022年）。高脂肪食誘発ASDマウスモデルでは、メトホルミンがFaecalibacteriumを増加させ、社交性や5-HT経路の構成要素と正の相関関係があることが判明した（Deng et al.） PrevotellaceaeのUCG_001とFaecalibaculumは、短鎖脂肪酸の存在と関連していることが知られており（Kangら、2023）、ASDの発症に関与している（Mac Fabe、2015）。微生物群集を完全に特徴付ける上で16S rRNAシーケンシングには限界があることから、将来的にはメタゲノム解析を行い、様々な分類学的レベル（種、属、門など）で解析する予定である。この取り組みは、ASD様行動の制御に関与する特定の種を特定することで、ASDに対するマイクロバイオームの影響についての理解を深め、現在の研究成果から得られた洞察をさらに深めることを目的としている。

腸内代謝産物の調節を通じて腸内細菌叢がASDに影響を及ぼす可能性は、興味深い研究分野である。本研究では、LC/MSを用いて糞便中の代謝産物の網羅的解析を行い、特にヒスタミンに顕著な差異が認められた19の代謝産物を同定した。これらの代謝産物は、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理に関連する多様な機能を有している。驚くべきことに、これらの代謝産物の中で最も濃縮された経路は、KEGG解析によって示されたように、アミノ酸代謝であった。我々は、16p11.2dp/+マウスにおける腸内細菌叢と代謝産物との機能的関連を明らかにした。16S rRNAのKEGG解析とメタボロミクスデータの統合により、16p11.2dp/+マウスにおける神経伝達物質ネットワークの変化を明らかにした。この知見は、ASDの子どもはヒスタミン、セロトニン、ドーパミン、ガンマアミノ酪酸（GABA）などの神経伝達物質レベルが不規則であることが多いことを示唆する新たな証拠（Montgomeryら、2018；Strandwitz、2018；De Palmaら、2022；Montanariら、2022）と一致しており、腸内細菌の影響を受けることが知られている（Dinan and Cryan、2017；Chenら、2021；Dicks、2022）。我々の研究では、神経伝達物質ネットワークの崩壊が明らかになり、中でもヒスタミンが最も有意に変化した中核的神経伝達物質であった。

極めて重要な神経伝達物質であるヒスタミンは、ASD（Fernandezら、2012；Wrightら、2017）を含む神経疾患（Nuutinen and Panula、2010；Scamellら、2019）に関与している。先行研究では、ASDと診断された子どもにおける血中ヒスタミン濃度の上昇が強調されている（Rashaid et al.） ヒスタミンの作用は、主に様々なヒスタミン受容体、特にH1R、H2R、H3R、H4Rとの相互作用を介して起こる。ASD患者の脳ではH2Rを、マウスの脳ではH3Rを標的とすることで、ASD症状の緩和が期待できることが、多くの文献から示唆されている（Linday, 1997; Linday et al., 2001; Eissa et al.） さらにヒスタミンは、脳内のセロトニン、ノルエピネフリン、ドーパミンを含む他の神経伝達物質の伝達を促進する役割を担っている（Flik et al.、2015）。腸管内腔に存在するヒスタミンは血流に吸収される可能性があり（Tidmarsh, 1932）、神経障害の制御を含む複数の機能を果たすことができる。さらに、ヒスタミンは過敏性腸症候群（Barbaraら、2004年）や炎症性腸疾患（Dvornikovaら、2023年）など、様々な胃腸障害と関連している。腸管ヒスタミンはH2Rを介して胃酸分泌を刺激し、H4R活性化により腹部不快感を誘発し（De Palmaら、2022）、腸管運動を亢進させ（Mochizuki、1953）、ASDによくみられる臨床症状である下痢（Smolinskaら、2022）を引き起こす。

腸管内のヒスタミン濃度は、ヒスタミンの合成、分解、吸収、分泌過程を含む動的平衡によって維持されている。腸内細菌は、ヒスタミンの分泌を調節したり（Sanchez-Perezら、2022）、HDCを介して合成過程を促進したり（Lucasら、2008）、ヒスタミンN-メチルトランスフェラーゼ（HNMT）やジアミンオキシダーゼ（DAO）を介して分解を促進したり（Shiら、2022）することで、糞便中のヒスタミン濃度に影響を及ぼす可能性がある。ヒスタミンと細菌種との相関を解析したところ、ヒスタミン産生［乳酸桿菌、腸球菌、クレブシエラ（Krellら、2021；De Palmaら、2022）など］、あるいはヒスタミンレベルに影響を及ぼす［緑膿菌、大腸菌（Fioraniら、2023）など］ことによって、ヒスタミンに影響を及ぼすことがこれまでに報告されている細菌とは異なる細菌が多数存在することが明らかになった。したがって、16p11.2dp/+マウスの腸腔におけるヒスタミンレベルの増大は、ヒスタミンに影響を及ぼすことが知られている微生物群の影響を大きく受けている可能性は低く、宿主の合成および/または分泌に起因している可能性が高いと考えられる。さらに、我々のGBMs解析により、両群のサンプル中のヒスタミン分解経路を同定することができた。しかし、16S rRNAの配列決定深度が不十分であったこと、またGBMsがまだ進化途上であったことから、解析の精度は低下した。16p11.2dp/+グループのヒスタミン分解経路の統計値は、WTグループと比較して顕著な減少を示したものの、統計的に有意な差には至らなかった（補足表S2）。このことから、ヒスタミン代謝の変化が、本研究で同定された細菌（すべてではないにしても）の存在量に影響している可能性がある。興味深いことに、これらの細菌のレベルは、自閉症症状（Yeら、2021年；Dengら、2022b）、腸内炎症（Guら、2022年）、腸内神経伝達物質産生（Dengら、2022b；Wang Z. J. ら、2023年）、胆汁酸代謝（Jianら、2022年）など、多数の生物臨床的意義と密接に関連していた。

これらの知見に基づき、16p11.2 CNVは、腸内ヒスタミンレベルの上昇、腸内細菌叢や代謝産物の不均衡として現れ、ASDの発症に寄与する可能性のあるものと密接に関連していることを提案する。16p11.2領域に位置する遺伝子MAPK3とMAZが、腸の肥満細胞における脱顆粒の制御に関与し、ヒスタミン放出につながるという新たな証拠が示されている（Bilottaら、2021；Gouら、2023）。内腔のヒスタミン濃度が上昇すると、肥満細胞の活性化が誘発され（De Palma et al. 今後の研究としては、（1）16p11.2関連遺伝子の欠損に起因する肥満細胞の潜在的な形態学的・分子生物学的変化、（2）これらの変化が特定の腸内細菌叢と代謝に及ぼす影響、（3）ヒスタミンと16p11.2駆動型自閉症行動との関連メカニズム、（4）将来の材料の再解析とアノテーションのためのメタゲノムシーケンスの採用、に関する調査が必要である。

結論
結論として、我々の研究により、16p11.2dp/+マウスにおける腸内細菌叢の異常が、多様な分類学的レベルにわたって明らかになった。特に、これらのマウスでは、微生物の多様性が減少し、糞便微生物叢の構造が乱れている。さらに、腸内細菌叢と代謝産物の統合的解析により、主にヒスタミンを中心とした神経伝達物質ネットワークの異常が明らかになった。これらの知見は、16p11.2 CNVに関連するASDの病態と潜在的な治療法について、特に腸の神経伝達物質代謝を標的とした新たな知見を提供するものである。

データ利用声明
16S rRNAseqの生データはhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1056406。本研究で発表された微生物メタボロミクスデータは補足資料に含まれている。

倫理声明
動物を用いた実験手順はすべて、南方科技大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（SUSTC-2019-174）の承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
ZF：概念化、データキュレーション、形式分析、執筆-原案、執筆-校閲・編集。XY：概念化、データキュレーション、執筆-校閲・編集。YJ：概念化、形式分析、執筆-校閲・編集。XinlM: 方法論、ソフトウェア、監修、検証、視覚化、執筆-校閲・編集。HuaL: 方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆-校閲・編集。YY: 方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆 - レビューと編集。JC: 方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆 - 査読および編集。ZC：方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆-校閲・編集。HuiL: データキュレーション、プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。XZ：データキュレーション、プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。XinjM: 監修、検証、執筆-校閲・編集。NL: 監修、バリデーション、執筆-校閲・編集、資金獲得。DW: 監修、バリデーション、執筆-校閲・編集。JJ: 監修、バリデーション、執筆 - 査読・編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、中国国家自然科学基金会（第81874176号、第82072766号）、深圳市三明医学プロジェクト（SZSM202111005号）、広東省基礎応用基礎研究基金会（2023A1515110843号）、深圳市科技創新委員会（JCYJ20190809154411427号、JCYJ20220530145008018号）からの資金援助を受けている。

利益相反
XinlMとHuaLはGuangdong Perfect Life Health Science and Technology Research Institute Co.

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2024.1331130/full#supplementary-material。

脚注

1. ^ https://xcmsonline.scripps.edu

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キーワード ASD、16p11.2、腸内細菌叢、16S rRNA、メタボローム、ヒスタミン、神経伝達物質

引用 この研究は、ASDの神経伝達物質が、腸内細菌叢の16p11.2重複によって変化していることを明らかにしたものである。Front. Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2024.1331130.

受理された： 2023年11月29日；受理：2024年2月27日；
発行：2024年3月26日

編集者

ジン・ソン、首都医科大学、中国
査読者

Roberta Prete, テラモ大学, イタリア
Xingyin Liu, 南京医科大学, 中国
Copyright © 2024 Fu, Yang, Jiang, Mao, Liu, Yang, Chen, Li, Zhang, Mao, Li, Wang and Jiang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*Correspondence： Xinjun Mao, maobq359@gmail.com; Ningning Li, linn29@mail.sysu.edu.cn; Dilong Wang, wangdlong@mail2.sysu.edu.cn; Jian Jiang, jiangj237@mail.sysu.edu.cn.

これらの著者は本研究に等しく貢献し、筆頭著者である。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品も、またその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

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