非小細胞肺がんにおける深い免疫B細胞およびプラズマ細胞のレパートリー

2023年6月16日 11:51

オリジナリティのある研究論文
Front. イムノル、2023年6月15日
Sec. がん免疫と免疫療法
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1198665
この記事は研究トピックの一部です。
免疫・腫瘍学の新規バイオマーカーであるB細胞集団について
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非小細胞肺がんにおける深い免疫B細胞およびプラズマ細胞のレパートリー

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1198665/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FIMMU_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Akshay J. Patel1、Naeem Khan1、Alex Richter1、Babu Naidu2、Mark T. Drayson1、Gary W. Middleton1* の各氏。
1バーミンガム大学医歯学総合研究所免疫学・免疫療法研究所（III）、バーミンガム、英国
2英国バーミンガム大学医学部炎症・老化研究所（IIA)
はじめに長年、抗腫瘍反応の発現においてマイナーな存在と考えられてきたB細胞は、肺がん患者の肺がん発症やチェックポイント阻害薬への反応においてキープレーヤーとして関与していることが示唆されている。肺がんでは、腫瘍微小環境における後期形質細胞およびメモリー細胞の濃縮が示されており、形質細胞のレパートリーは機能スペクトルで存在し、抑制的な表現型は転帰と相関していることが分かっています。B細胞の動態は、喫煙者に見られる炎症性微小環境およびLUADとLUSCの間で影響を受けている可能性がある。
方法：ここでは、マスサイトメトリー（CyTOF）、次世代RNAシーケンス、マルチスペクトル免疫蛍光イメージング（VECTRA Polaris）を用いた高次元のディープフェノタイピングにより、肺腺がん（LUAD）と扁平上皮がん（LUSC）のペア検体における腫瘍と循環のB細胞レパートリーには、重要な違いが存在することを示しています。
結果は以下の通りです：本研究は、56名の患者の解析に基づき、非小細胞肺がん（NSCLC）におけるB細胞コンテキストの詳細な記述について、広範な臨床病理学的パラメータを参照しながら、現在の文献に加え、洞察を与える。我々の発見は、B細胞が遠くの循環区画から腫瘍微小環境（TME）へ移動する現象を補強するものである。LUADでは、循環系レパートリーが血漿型と記憶型に偏っているが、TMEのレベルではLUADとLUSCの間に大きな違いはない。B細胞レパートリーは、他の要因の中でも、TMEおよび循環における炎症負荷、すなわち喫煙者と非喫煙者の影響を受けている可能性がある。さらに、プラズマ細胞のレパートリーは、肺がんにおいて機能的なスペクトルで存在し、この軸の抑制的な制御アームは、チェックポイント遮断後と同様に、術後の結果を決定する上で重要な役割を果たすかもしれないことを明確に証明した。これには、さらなる長期的な機能相関が必要である。
結論 B細胞およびプラズマ細胞のレパートリーは、肺がんのさまざまな組織コンパートメントにおいて非常に多様で異質である。喫煙の有無は、免疫環境における重要な差異と関連し、その結果生じる炎症性微小環境は、このような状態における形質細胞およびB細胞レパートリーに見られる機能および表現型スペクトルの原因であると考えられる。
はじめに
肺がんは、世界中でがんに関連した死亡の主な原因となっている(1)。非小細胞肺がん（NSCLC）の診断、病期分類、最終的な治療において、手術は重要な役割を担っている。切除術は、I期およびII期のNSCLCに対して選択される治療法であり、IIIA期の疾患に対しては、多剤併用療法の重要な要素である（2）。最新の病期分類法では検出できない、手術時に潜伏する微小転移性循環腫瘍細胞の存在は、腫瘍塊の切除後の再発を促進すると考えられる（3）。腫瘍微小環境における免疫応答は、腫瘍の進行や攻撃性を決定する要因としてますます重要視されている（4）。NSCLCにおける免疫研究は、主にT細胞免疫生物学に焦点を当てているが、免疫応答は、原発腫瘍と腫瘍微小環境における複数の免疫細胞タイプの間の複雑な相互作用である（5）。近年、腫瘍の生存におけるB細胞の役割が広く研究されており、まだ解明されていないことも多いが、この病気には明らかに腫瘍の増殖と抗腫瘍の両方の役割がある(6)。B細胞の存在は、卵巣、子宮頸部、NSCLCにおいて生存率の改善や再発率の低下と相関することが示されている（7-9）。IL-10を産生する免疫抑制性B細胞は、高レベルの炎症性刺激を放出する腫瘍微小環境と関連している（10）。B細胞の存在は、三次リンパ系構造の存在とともに、様々な疾患環境におけるチェックポイント阻害薬に対する反応の改善と関連しています（11-13）。さらに最近では、長い間、抗腫瘍反応の発現において小さな役割を果たすと考えられてきたプラズマ細胞が、肺がん患者におけるチェックポイント阻害薬に対する反応のキープレイヤーとして関与していることが明らかになった（14-16）。臨床反応の中心となる血漿細胞の基礎的なメカニズムや深い役割については、まだ十分に解明されていない。
これらの早期がんにおけるB細胞およびプラズマ細胞と切除後の転帰との関係を探るため、我々は、B細胞特異的CyTOFパネルによるディープフェノタイピング技術、堅牢な高次元表示技術、および回帰モデルを利用して、循環中および腫瘍微小環境内の特定のB細胞免疫表現型が、疾患特異的転帰などの様々な臨床相関に対する重要性を分析した。我々は、血液と腫瘍のサンプルを用いて、NSCLC患者におけるB細胞免疫ランドスケープのマスサイトメトリーベースのアトラスを発表した。この研究は、この疾患における免疫細胞環境についての理解を大幅に拡大するものである。
材料と方法
実験モデルおよび被験者の詳細
年齢をマッチさせた健康なドナーから末梢血単核細胞（PBMC）層をバーミンガム大学（UoB）のClinical Immunology Serviceから入手した。進行した非小細胞肺がん（NSCLC）患者からの初回血液サンプルは、外来診療で腫瘍の外科的切除前に入手し、腫瘍組織は手術時に新鮮な状態で入手した。UoB Research Ethics Approval, protocol 17/WM/0272に基づき、書面による同意がなされた。腫瘍の病期と分子プロファイリングによる組織学的サブタイプは、それぞれ放射線科医と病理医によって決定された（補足表1）。研究コホートは補足表1に記載されている。これらの患者のフォローアップの中央値は3年である。EGFR変異を示したがんは1つだけであった（EGFR+ exon 19 deletion adenocarcinoma）。40のがん（71％）はPDL1陰性であった。
多変量検定で全生存期間と無病生存期間の独立した予測因子として危険因子を検討した（補足表2）。扁平上皮癌は死亡リスクの低下と関連し（HR 0.17、p-0.014）、男性性は死亡リスクの上昇と関連した（HR 5.45、p＝0.034）。再発については、進行期（III期）がリスク上昇と関連し（HR 25.6、p=0.016）、アジュバント化学療法はリスク低下と関連した（HR 0.04、p=0.018）。
マスサイトメトリーによるNSCLCサンプルの詳細な免疫表現型分類
我々は、ペアのNSCLC患者サンプル（IASLCステージI-IIIのNSCLC患者（n=56）からの末梢血サンプルおよび新鮮なマッチした腫瘍組織）と5人の健康な年齢マッチドナーサンプル（末梢血のみ）の大規模なマスサイトメトリ分析を実施しました。すべての患者の末梢血サンプルは、外科的腫瘍切除前に採取されました。細胞は、本研究のために作成したB細胞抗体パネル（34抗体マーカー）を染色した（補足表3）。このパネルは、様々な成熟段階のB細胞（活性化、移行、辺縁帯、濾胞、胚中心、クラススイッチ、血漿）、およびB制御（Breg）細胞などの希少なB細胞集団の発現を検出するように設計されている。また、ナチュラルキラー細胞、T細胞、顆粒球のマーカーも含まれています。
サンプルの準備と取得
末梢血単核球は、BD vacutainer® CPTボトル（NH: ~130IU FICOLL™ 2.0ml）を用いて採取されました。遠心分離後、RPMI1640で2回洗浄し、凍結培地（90%熱不活性化子牛血清と10%DMSOの滅菌混合）に4-10 x106/ml の密度で再懸濁し、-80℃で凍結保存を行いました。
腫瘍の解離
新鮮な肺切除サンプルを直ちに病理組織検査室に運び、腫瘍の中心部と周辺部から組織を採取し、TMEをできるだけ多く表現できるようにしました。サンプルの1セットは、Miltenyi Tumour Storage Solutionを含む滅菌密閉容器に直ちに入れ、4℃の冷蔵庫で保管した（細胞標識および細胞測定分析標本）、サンプルの2セット目は、固定用ホルマリンを含む滅菌密閉容器に直ちに入れ、4℃の冷蔵庫で保管した（VECTRA免疫蛍光分析標本）。すべてのサンプルは、24時間以内に処理と分析のために研究室に輸送された。
単細胞分析のために、腫瘍組織は、機械的解離と組織の構造的完全性を維持する細胞外マトリックスの酵素分解を組み合わせて、単細胞懸濁液に解離された。これは、gentleMACS™ Octo dissociator（Miltenyi Biotech）を用いて、メーカーのプロトコルに従って実施された。すべての試薬はMiltenyi Biotech社から提供され、標準化された方法で再構成された。
RNA抽出
腫瘍RNAは、Qiagen RNeasy® Plus Mini Kitを用い、メーカーのプロトコールに従って抽出・精製された。腫瘍サンプルは、上記のプロトコルにしたがって解凍した。
マスサイトメトリー取得のための細胞染色
CyTOF抗体カクテル（細胞表面と細胞内を別々に行う）を事前に決定した最適な力価で調製し、Ultrafree MC 0.1μm 遠心フィルターユニット（Merck Millipore）でろ過し、抗体の凝集物を除去した。凍結保存した細胞をマスサイトメトリー実験のために、37℃での急速解凍、洗浄液による緩やかな希釈、そして遠心分離による細胞のペレット化と凍結液の除去により蘇生させた。次に、セルストレーナーキャップ付きの5mlチューブを用いて35μmのナイロンメッシュで細胞を濾過し、MaxPar Cell Staining Buffer（CSB、Fluidigm）で洗浄した。次に、細胞を5μlのFc受容体ブロッキング試薬（Human Trustain Fc blocking solution, Biolegend）と共に室温で10分間インキュベートし、その後直ちに表面抗体と共に室温で30分間インキュベートした。このインキュベーションの最後の2分間、細胞を1μMのシスプラチンとインキュベートし、生細胞（シスプラチン-）/死細胞（シスプラチン＋）識別を可能にした。反応はCSB（Fluidigm）でクエンチした。その後、MaxPar Fix I Buffer (Fluidigm®) と MaxPar Perm-S Buffer (Fluidigm®) を用いて細胞を固定し、細胞内抗体染色のために透過処理した（2回洗浄）。細胞内抗体の前に細胞を刺激することは、稀な細胞表現型の変化を避け、微小環境を反映した構成的な発現を調べるために行わなかった（17、18）。細胞を再懸濁し、荷電好酸球の非特異的結合を防ぐため、各サンプルにヘパリン溶液（2kU/mlストック）2μlを合計10分間添加した。その後、細胞内抗体カクテルを細胞に添加した。穏やかに撹拌した後、懸濁液は室温で30分間インキュベートするために放置された。次に、細胞をバッファーで洗浄し、500μlのCell Intercalation Solution（1:1000 Nucleic acid Rh103 Intercalator）に再懸濁した： Fix and Perm Buffer (Fluidigm®)) に懸濁し、4 ℃で一晩インキュベートした。
データ取得の準備
翌日、サンプルを細胞染色バッファーで2回洗浄し、1mlのMilliQ ddH2Oに再懸濁し、35μmのナイロンメッシュでろ過し（セルストレーナーキャップ付き5mlチューブ、BD）、計数した。分析前に、サンプルを0.5～1.0 x 106 cells/mlの濃度でEQ四元素キャリブレーションビーズ（Fluidigm®）を添加したMilliQ ddH2Oに再懸濁した。サンプルは、Helios 6.5.358取得ソフトウェア（Fluidigm®）を使用して、Helios装置（Fluidigm®）で300イベント/秒で取得しました。より希少なB細胞サブセットを検出する可能性を最大限に高めるため、1サンプルあたり最低75万～120万個の細胞を収集しました。非刺激マスサイトメトリーコホートにおけるIL10の検出値は低かったものの、表面表現型を考慮すると、Breg集団の可能性を反映していた。我々は、メラノーマ細胞の刺激コホートで確証的な研究を行ったが、並行して行った非刺激コホートと比較して、IL10に違いは見られなかった（19）。各サンプルから収集した個々の.fcsファイルは、Fluidigm®の.fcs concatenationツール（CyTOF正規化ソフトウェア2）を使用して連結し、データは同じツールを使用してEQ4要素のシグナルシフトに基づき正規化されました（時間経過）。
抗体標識とコンジュゲーションプロトコル
我々のコホート内のB細胞の詳細な特徴付けは、金属標識抗体を用いて行われた。金属結合抗体はFluidigmから購入するか、社内で非標識抗体に結合させました。すべての非標識抗体はキャリアフリーの状態で購入し、製造者の指示に従ってMaxPAR抗体コンジュゲーションキット（Fluidigm®）を使用して対応する金属タグをコンジュゲートしました。金属同位体はFluidigm社から入手した。各抗体の濃度は、Nanodrop 2000（ThermoFisher Scientific）を用いて、金属コンジュゲーション後に評価した。コンジュゲートした抗体は、0.05%アジ化ナトリウム（Sigma-Aldrich）を添加したPBSベースの抗体安定剤を用いて最終濃度200μg/mlまで希釈し、その後、使用に最適な濃度に滴定した。本研究で使用した各抗体の提供者、クローン、金属タグは、補足表3に示す。
マルチプレックス免疫蛍光分析
NSCLCサンプルは、4％等張ホルムアルデヒドで24時間以内に固定し、脱水してパラフィンに包埋した。各パラフィン包埋組織から切片（4μm）を切り出し、ヘマトキシリン・エオジン（HE）で染色して腫瘍の病理を評価した。
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片（4μm）は、染色前に60℃で2時間焼成した。脱パラフィン化と抗原回収（pH9、100℃で20分）は、Leica BondRx Automated IHC stainerで実施した。一次抗体の希釈は、発色性のDAB染色で個別に最適化した。対照組織はBond Polymer Refine Detection kit (DS9800)で染色し、病理医が特異性を評価した。次に、アコヤバイオサイエンス社のOpal Polaris 7 Colour Automation IHC Detection Kit（NEL871001KT）を用いて、蛍光色素の希釈を最適化し、スペクトル分離用のライブラリを作成するために、各マーカーの蛍光染色を1回行い評価しました。各マーカーは、熱不活性化ステップの影響とエピトープの安定性を評価し、それに応じてパネル内の配列を決定するために、6つの異なる位置でテストした（補足表4）。
スライドは以下の抗体で連続的に染色した： IL-10（1：400）、CD138（RTU）、抗CD4（1：200）、-CD20（1：200）、-BCL6（RTU）およびCD8（1：400）で、30分のインキュベーションを行った。二次抗体は、アコヤバイオサイエンス社のOPAL POLYMER HRP MS + RB (ARH1001EA)を使用し、10分間インキュベートした。各バイオマーカーの可視化に使用したTSA結合蛍光色素は、Opal 480、Opal 780、Opal 690、Opal 620、Opal 570、Opal 520で、インキュベーション時間は10分。オパール780は60分間インキュベートし、その前にTSA-DIGで10分間インキュベートした。スライドはProLong Diamond Antifade Mountant (Fisher Scientific Ltd, 15205739)でマウントし、イメージング前に4℃で保存した。画像取得（マルチスペクトル画像として倍率20倍）は、Vectra Polarisマルチスペクトル画像プラットフォーム（Akoya Biosciences）を用いて行い、スライド画像全体をスキャンし、病理医が選んだ7～10個の代表関心領域とした。DAPIは、スライドあたりの細胞数をカウントするために使用した。ネガティブコントロール（一次抗体の代わりにPBS）は、これらのサンプルと同時に実行した。
定量化およびデータ解析
ファイル（.fcs）は、説明したように処理および正規化され、Cytobankにアップロードされ、関心のある集団は手動でゲートされ、二軸マーカー発現はCytobankでの視覚化のために行われ、関心のあるイベントはfcsファイルとしてエクスポートされました。CD19+サンプルの「クリーンアップ」は、インタクト（103Rh+DNA染色）、ビーズなし（140Ce-）、ライブ（194/195Pt-）、T細胞CD3-（141Pr）、未熟顆粒球やナチュラルキラー細胞CD16-（209Bi）、CD45+（89Y）、CD19+ B細胞に対するゲーティングによって行われました。
下流の解析のために、fcsファイルをR（R Core Development Team, 2015）にロードした。各チャンネルのシグナル強度を、係数5でアークシン変換した（x_transf =asinh(x/5) ）。データセット内の差分発見と解析を容易にするため、BioconductorパッケージのflowCore（20）、FlowSOM（21）、CATALYST（22）、diffCYT（23）に大きく基づくRベースのハイブリッドパイプラインを採用しました。
高解像度、教師なしクラスタリング、およびメタクラスタリングは、FlowSOMおよびConsensusClusterPlusパッケージを使用して実行され、数百万の細胞のスケーリングが可能であるため、データのサブサンプリングは必要なかった（21、22）。データの可視化は，Rパッケージのggplot2をグラフエンジンとして採用したCATALYSTパッケージで行った．高次元の細胞集団を2次元で可視化するために、Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）アルゴリズム（24）を適用し、注釈付き細胞集団と同定バイオマーカーの特性を表現した。細胞量の差分解析は一般化線形混合モデル（GLMM）を用いて、マーカー強度は線形混合モデル（LMM）を用いて、diffCYTパッケージ（21、22）を介して実装し、多重仮説検定のために偽発見率（FDR）調整（ベンジャミン・ホッホベルグ法を用いて5％で）を用いて実施しました。両B細胞パネルを用いて主要な細胞サブセットを同定するために、FlowSOMは、最近接の数を定義するパラメータk（（x dim = 10 x ydim = 10） = 100）を100に設定して実行された。そして、この関数は、集団を2つからmaxk（デフォルトでは20）のクラスターにメタクラスタリングした（21）。生物学的発見を確認し、拡張するために、クラスタリングアルゴリズムは、最初の教師なし20個のメタクラスタの生物学的関連性を評価した後、最大8個のメタクラスタを検出するように修正され、アルゴリズムに従って最も重要とみなされるクラスタを推測するために実施されたものであった。さらに、選択的マーカークラスタリング・アルゴリズムを実行し、関心あるクラスタ内での真のマーカー発現を確認した。特定のB細胞クラスターをさらに定義するために、パネル上のすべてのマーカー（T細胞系を含む）を組み込んだ主成分分析（PCA）の前処理を行った後、これらのマーカー（すなわちCD3、CD4、CD8）なしで実行し、B細胞で発現せずクラスター生成プロセスに「ノイズ」を追加し生物学的関連マーカーの影響を増大させる可能性があるものを除外しました（25、26）。
RNAライブラリー調製は、Lexogen QuantSeq 3' mRNA sequencing kitを使用して実施された。FASTqファイルは、TrimomaticおよびCutadapt Rパッケージ（27、28）で品質管理を受けた。高品質なリードは、HISAT2またはSTARを用いた「マッピング」として知られるプロセスでゲノムにアライメントされ、その後RSeQCを用いた品質管理チェックが行われた（29-31）。カウント」とリードカウントファイルの生成は、STAR (31)、HTSeqまたはSubreadパッケージ (32, 33)で実施した。その後、生のリードカウントファイルをRにインポートし、DESEq2 (34)を用いて遺伝子発現の差分解析を行った。Gene Set Enrichment analysis (GSEA), Gene ontology pathway analysis, KEGG pathway analysisは、gage, clusterProfiler, pathviewパッケージ(35-37)を用いて実施した。大まかに言えば、これらの解析は、データセット中の全遺伝子をランク付けし、ランク付けされたデータセット中の遺伝子セットの全メンバーのランク位置を特定し、観察されたランクとランダムなランク分布を仮定して予想されるランクとの差を表す濃縮スコア（ES）を計算することに依存している。
統計的有意性は、対になっていない（Mann-Whitney U test）サンプルについては2-tailed nonparametric testを、2つ以上の独立したグループについてはKruskal-Wallis testを用いて決定した。単変量および多変量のステップワイズ後方消去モデルを構築した。全生存期間と無病生存期間はコホート内で決定し、グループ間差はログランク法を用いて計算した。この計算は、RでKaplan-Meier分析とCox比例ハザード回帰のためのSurvivalとSurvminerパッケージをそれぞれ用いて実施した。適切なデータのカットポイントは、ROCおよびブートストラップ解析のためにそれぞれpROCおよびcutpointr Rパッケージを使用して決定した。縦断解析における一対比較は、一対のWilcoxon順位和検定を用いて行った。統計的有意性は0.05未満とした。多重比較補正は、Benjamini-Hochberg法を用いて行った。
データの入手方法
マスサイトメトリーデータ：本研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。これは、ファイルサイズと患者の機密保持、逆仮名化、および個々の臨床試験プロトコルの方針に沿った特定の学術・研究施設でのデータ保管の必要性というロジスティックスに起因するところが大きい。ソースデータは本論文に添付されています。通信や資料請求は、GWMまでお願いします。
コードの利用可能性
著者らは、データの再現性のためのコードが公開されていることを宣言する。コードは様々なソースから転用されたが、基礎となるコード自体はいかなる方法でも修正または変更されておらず、引用されたソースから容易に入手可能である。このコードは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手することができる。
結果
詳細な免疫表現型解析により、循環型および腫瘍内B細胞集団の表現型の多様性が明らかになった。
CD19+細胞は、それ以降のすべての下流解析に引き継がれた。細胞の表現型をマッピングするために、FlowSOMクラスタリングを行い、異なる組織区画におけるB細胞クラスターの発現をヒートマップとして可視化し（図1A）、UMAPを用いてマーカーレベルの異質性を単一細胞レベルで表示した。
図1
図1 血液と腫瘍レベルでのB細胞および血漿細胞のレパートリーの違い。(A）血液腫瘍集団全体のFlowSOMクラスタリングで見られた、B細胞レパートリーにおける優勢な20クラスタを示すヒートマップです。表現型マーカーはX軸に沿って表示されている。クラスターは右のY軸に、全体集団に占める割合で表示されている。発現量の中央値は強度チャートに示され、各マーカーの発現を決定するために使用される。(B）多次元スケーリングプロット、主成分分析により、CD19+血液集団と腫瘍集団の分離を示す。血液は赤、腫瘍は緑で図示し、右側の列のカラーチャートで示した。(C) 条件、「血液」と「腫瘍」に応じて層別化したUMAPプロット。すべてのサンプルは、サンプル間で均等に代表される集団を考慮し、ランダムにダウンサンプリングされています。クラスターは右側のグラフに表示されている。各クラスターの差分視覚表現で示されるように、2つのコンパートメント（血液と腫瘍）の間に明確な違いが存在します。(D) 以前に同定された20のクラスター（1A）（左側の列）と、組織区画および個々の患者（メインパネル）ごとの各クラスターの相対正規化存在量を示す差分存在量ヒートマップ。組織タイプは、下のX軸に沿って示されている（B - 血液、青線、T - 腫瘍、オレンジ線）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。対数変化量は腫瘍に対するものである。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルを適用して、条件（血液と腫瘍）間の存在量の差の有意性を決定した。上位8つのクラスターは、灰色のバー（7、17、16、14、12、53、13）で示すように統計的に有意であった。(E) 条件、「血液」と「腫瘍」に応じて層別化した拡散マップ。すべてのサンプルは、サンプル間で均等に代表的な集団を考慮し、ランダムにダウンサンプリングされています。
成熟の様々な段階にある20の異なるB細胞クラスターを定義した（図1A）。表1（下）にすべてのクラスターを列挙し、表面マーカー発現に基づくそれらの可能性の高い表現型を説明し、文献におけるこれらの集団のオリジナルの記述から結論を導き出した（38-50）。
表1
表1 血液と腫瘍で同定されたB細胞集団。
最も頻繁に観察された集団は、CD20、CD22、IgDの高発現とIgMの低レベルを特徴とする濾胞性B細胞系（集団12、全集団の43.41％（図1A））である。活性化B細胞（IgM+ IgD+ CD25+ CD27+）（クラスター16）と移行B細胞（IgMhi IgDhi CD24hi CD38hi CD10hi CD5+）クラスター（クラスター20）は、それぞれB細胞総数の7.8%と0.99%を占めました。抗体分泌型形質細胞は、CD19の発現量が少なく、CD38陽性であることが特徴であった（クラスター7、1.38％）。クラスター15は全B細胞集団の0.39%を占め、表面Ig- CD138hi CD19lo (CD79Bhi)であり、これは非定型のプラズマ細胞集団または未熟なB細胞集団であると考えられる。メモリーB細胞は成熟の様々な段階で観察された：非定型IgD+ IgM-メモリーB細胞（クラスター18、0.32%）、完全に親和性成熟したクラススイッチB細胞（CD27hi IgD- IgM-）（クラスター14、12.13%）、二重陰性メモリーB細胞（CD27blo IgD- IgM-）（クラスター13、2.53%）です。
また、プラズマブラスト、PD-1+ CD5+細胞、PDL1+細胞、B10集団など、いくつかのB制御細胞クラスターも同定された（45-48）。これらは、CD5、CD24、CD25、CD27、CD38、CD1d、TIM-1、PD1、PDL-1、TGF-β、IL-10の細胞内サイトカイン発現などの表面マーカーを用いて特徴づけられ、頻度は様々だった（0.21％-2％）。クラスター1と9は、いずれもki67hi IL10+ CD27+ CD38+ plasmablastを表していると考えられる。クラスター2と8は未熟なPDL1+ IL10+ Bregを表し、クラスター8はCD5hiでもある。クラスター19は、PD1+ CD5hi CD25hi IL10+ Bregである。すべてのB細胞は刺激されていないため、IL-10発現はNSCLC患者および健常ドナーのin vivo免疫環境を代表するものである。
教師なし多次元尺度法（主成分分析）は、血液サンプルと腫瘍サンプルの間のB細胞レパートリーの幅広い違いを示している（図1B）。これらのサンプルは明確に分離されており、異なる環境における免疫表現型の発現の違いを示しています。各患者の血液と腫瘍のペアサンプルの間で比較次元削減分析（UMAP）を行った（図1C）。視覚的に見ると、2つの環境間でクラスター発現に明確な違いがあることがわかる。2つのコンパートメントを幅広く列挙したところ、血液では初期に成熟する濾胞B細胞とメモリーB細胞が圧倒的に多く、一方、腫瘍微小環境（TME）ではより末端に分化した形質細胞が局在していることが確認されました。
血中では、以下のものが視覚的に多く発現している：
クラスター1 - ki67+ CD27hi CD38hi CD95hi IL10int プラズマブラスト（赤色）
クラスター12 - CD20hi CD21hi CD22hi Follicular (ライトグリーン)
クラスター13 - CD27lo IgD- IgM- 二重陰性メモリー (青緑)
クラスター14 - CD27hi IgD- IgM- Class-switched Memory（アクアマリン）
クラスター16 - IgM+ IgD+ CD25+ CD27+ アクティベート（マスタード）
クラスター17 - CD19+ IgDhi IgM+ CD24- CD27- 安静型ナイーブB細胞 (ライラック)
クラスター19 - CD5hi CD25hi CD24+ PD1+ IL10lo Breg (ダークグレー)
クラスター20 - IgMhi IgDhi CD24hi CD38hi CD10hi CD5+ Transitional/Breg spectrum (ライトグレイ)
腫瘍では、以下の発現が視覚的に高い。
クラスター2 - 未熟PDL1+ IL10+ CD138+ CD38+ Breg/Natural Regulatory Plasma (Peach)
クラスター3 - Ig- CD19lo CD138dim おそらく非B細胞表現型、おそらくナチュラルキラーT細胞 (Royal Blue)
クラスター5 - CD19lo Ig- CD38- CD24lo/- CD21loメモリー細胞 (Deep Purple)
クラスター7 - CD19lo CD38hi CD24- CD27lo IgD-抗体分泌プラズマ細胞 (オレンジ)
マーカー発現の中央値解析（補足図1）により、循環系では初期B細胞および走化性表面マーカー（CD5、CD20、CD21、CD27、CXCR5）の発現が高く、一方、TMEでは終末分化および抑制細胞の発現が認められた（CD95、CD138、PDL1）。
ディファレンシャルアバンダンス解析-血液と腫瘍の比較
定義された細胞集団について、集団内のすべてのB細胞クラスターを報告するdifferential abundance（DA）分析を行った（図1D）。この方法は、2つの臨床状態の間で細胞タイプの比率を比較し、有意に異なる比率で存在する集団を強調することを目的としています。病態間の差異を検出する検出力を得るために、混合モデルを利用して反応をモデル化し、患者はランダム効果として扱われ、Nowickaら(22, 51)が説明したように患者間の変動が正式に考慮されています。細胞集団全体のDA分析により、2つの環境間で有意に存在量が異なる8つのクラスターが特定された（以下のTable 2）。
表2
表2 血液と腫瘍の間のDAテストで有意なクラスターが確認された。
Lavinらは、肺腺がんにおいて、健常組織とがん組織とで、自然界の細胞コンパートメントが有意に異なることを示した(52)。我々は、このグループから公開されているデータセットを使用し、CD19+ B細胞についてゲーティングし、健康な肺組織、血液、およびステージIの肺腺がん患者からの腫瘍サンプル間で教師なし比較主成分分析を実施した。本研究で使用した抗体パネルは、CD3+ T細胞およびNK細胞コンパートメントを特異的に調べるために設計されたフォーカスパネルである。CD19、CD27、CD38、PD1、PDL-1以外のB細胞特異的マーカーはほとんど含まれていないため、B細胞の幅広いサブセットを識別することしかできませんでした（52）。MDSプロット（補足図2）は、3つの組織タイプ間の分離を示し、a)健康な組織とがん組織、b)NSCLC患者の血液と腫瘍の間でCD19+ B細胞コンパートメントに違いがあることを示唆しています。これは、私たちがデータセットで観察した総体的な差異を裏付けるものです。補足図2では、対象集団の分離をより良くするために、幅広い集団を輪切りにしています。このグループが使用した抗体パネルと私たちが使用した抗体パネルの間には大きな異質性があるため、観察された表現型をより深く掘り下げることはできなかった。しかし、存在量の差分分析により、血中が顎骨より有意に高いクラスターがいくつか発見されました。
TMEにおける血漿細胞の存在は、表現型および機能的なスペクトラムにある。
クラスター2、3、5および7は、拡散マップ（図1E）により、TMEでより多く存在することが視覚的に示され、後者の3つは有意により多く存在することが示された。図1Eの拡散マップの分岐ベクトルは、2つの異なる分化の軸を表しています。成熟スペクトルの初期に始まるクラスター5（濃い紫色）は、エフェクターIg産生形質細胞または自然制御抑制型形質細胞に分化する可能性を持つCD19lo Ig-分化初期形質細胞である。拡散マップの上の枝はクラスター2と3（それぞれピーチとロイヤルブルー）で構成され、これらは表現型的にも機能的にも類似しており、CD138、IL-10、PDL1が低レベルで発現し、抑制的な性質を持つことを示しています。拡散マップの下側の枝は、IL10を産生するエフェクターIg形質細胞を示すクラスター7（オレンジ）を中心に広がっている。このように、TMEは、エフェクターまたは抑制的な表現型にプライミングされているプラズマ細胞の終末分化集団で構成されています。
図2Aは、TME内のB細胞集団を示しています。これらをさらに詳しく調べると、表現型のプラズマ細胞スペクトルに存在するいくつかのクラスター（9-14）が確認されました。クラスター14（CD19- CD38hi IgG+ early plasma cell）は、CD19、高いCD38発現、および初期のIgG発現により、プラズマ細胞分化の初期特徴を示す。クラスター9（CD138+ CD25hi IgG+ PDL1- IL10- terminally differentiated plasma cell）は、CD138の発現を示し、より高いレベルは、真のエフェクター末期分化形質細胞集団であるクラスター13で発現しています。クラスター13（CD138hi IgGhi PDL1lo IL10- plasma cell）はまた、制御性形質細胞表現型への早期の移行を示す、初期のPDL1発現を示す。クラスター10（CD138int IgGint PDL1int IL10int plasma cell/regulatory suppressive）は、より高いレベルのPDL1を示し、またIL10を産生し、抑制性形質細胞集団となった。クラスター11（ki67hi CD5+ CD10+ CD24hi CD25+ CD27+ PD1+ transitional）は、まだ抑制的（IL10-, CD10+, PD1+）になっていないごく初期の移行細胞集団である。このようにTMEを重点的に評価することで、浸潤する初期/後期形質細胞の表現型スペクトルがより明確になりました。
図2
図2 術後早期の再発では、腫瘍内B細胞とプラズマ細胞の浸潤が異なる。(a)腫瘍内(tme)： TME（Bヒートマップ）（左側の列）において以前に同定された20のクラスターを示すDifferential Abundance Heatmapと、再発および個々の患者（メインパネル）による各クラスターの相対正規化存在量（メインパネル）です。再発は下のX軸に沿って示されている（再発なし-青線、再発-オレンジ線）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルを適用して、条件（再発と再発なし）間の存在量の差の有意性を決定した。灰色のバーで示したように、統計的に有意なクラスタは1つだけであった（クラスタ13、p=0.038）。(B）腫瘍のみのFlowSOMクラスタリングで得られた、B細胞レパートリーにおける優勢な20クラスターを示すヒートマップ。表現型マーカーは、X軸に沿ってラベル付けされている。クラスターは、右のY軸に沿って、全体集団に対する割合とともに表示されている。発現量の中央値は強度チャートに示され、各マーカーの発現を決定するために使用される。(C）腫瘍の状態、「再発」、「再発なし」に応じて層別化したUMAPプロット。すべてのサンプルは、サンプル間で均等に代表される集団を考慮し、ランダムにダウンサンプリングされている。クラスターは右側のグラフに表示されている。比較UMAPでは、非再発患者においてクラスター13（CD138+、グレーボックス内のアクアマリンのクラスター）の腫瘍内発現が高いことが視覚的に示されています。
空間解析により免疫抑制集団の局在が明らかになった
CD4、CD8、CD20、CD138、IL-10、BCL-6の多重免疫蛍光測定法を用いて、NSCLC全体の免疫浸潤構造の変化を可視化し、術後再発を起こした患者を参照しました。腫瘍巣とは対照的に、腫瘍間質に浸潤する抑制性B細胞（制御性プラズマCD138+ IL10+およびBreg CD20+ IL10+）の割合は有意に高い（p<0.0001）（補足図4、5）。組織型、病期、リンパ管侵襲の有無、臓器胸膜侵襲の有無、死亡率によって層別化した場合、表現型に全体的または区画的な差は見られなかった。
免疫景観の構造から、エフェクター機能に関連する表現型が特定され、それが臨床転帰に相関する
我々は、再発した患者とそうでない患者との間のB細胞プロファイルの違いを調べた。TME内では、比較試験により、再発患者と非再発患者のB細胞レパートリーにおいて、最小限の有意な微妙な差異が1つだけ認められた。存在量の差の検定では、クラスター13（図2A、B）（CD138hi IgGhi PDL1lo IL10- plasma cell）が非再発患者（図2C、グレーボックス）において有意に多く存在することが判明した（p=0.03）。これらの患者の血中では、再発に関して有意な差は見られなかった。
終末分化したエフェクターおよび自然制御性プラズマ細胞は、喫煙経験者でより多く存在する
喫煙経験のない人と喫煙経験のある人のB細胞レパートリーを、2つの異なるコンパートメントに従って、存在量の差分分析を用いて比較しました。2群間の比較クラスター発現により、有意に異なる存在量のクラスターが多数同定された（図3A、補足図6）ので、以下に要約する（表3）。血液の主成分分析（補足図7）では、2群間で明確に分離していることがわかる。マーカー発現の中央値（補足図8）では、ever smokersではプラズマ細胞マーカーであるCD138とIgGが増加し、IL-10の発現量も高い。喫煙歴のない人は、初期段階の未熟なB細胞、IgD、IgM、CD38、およびホーミングマーカーCXCR5の発現が上昇していることがわかる。
図3
図3 喫煙の有無で層別化されたB細胞発現の違い。(A) CIRCULATION（血液）：循環における20の同定されたクラスター（補足図3のヒートマップ）（左側の列）と喫煙状況および個々の患者（メインパネル）による各クラスターの相対正規化存在量を示すDifferential Abundance Heatmapを示す。喫煙状況は下のX軸に沿って示されている（Ever smokers - blue line, never smokers - orange line）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルを適用して、条件（喫煙歴のある人とない人）間の存在量の差の有意性を決定した。上位9つのクラスターは、灰色のバー（10、17、16、3、19、18、20、11、1）で示すように統計的に有意であった。(b) 腫瘍内（tme）： TME（図2Bヒートマップ）（左側の列）において以前に同定された20のクラスターと、喫煙状況および個々の患者（メインパネル）による各クラスターの相対正規化存在量を示す差分存在量ヒートマップを示す。喫煙状況は、下のX軸に沿って示されている（喫煙経験者-青線、喫煙経験者-オレンジ線）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルを適用して、条件（喫煙歴のある人とない人）間の存在量の差の有意性を判定したところ、灰色のバー（11と14）で示すように、上位2つのクラスターが統計的に有意であった。
表3
表3 喫煙状態に応じたDA分析での有意なクラスター。
2群間のTME内では、差分存在量解析（図3B）により、喫煙経験者ではクラスター11および14の浸潤が有意に高いことが示された（p＝0.038）。これらはそれぞれki67hi CD5+ CD10+ CD24hi CD25+ CD27+ PD1+ transitionalとCD19- CD38hi IgG+ early plasma cell populationを表す（補足図9）。血漿細胞の浸潤は、循環とTMEの両方で喫煙経験者で高いが、TMEでの表現型の差は明らかに少ないように思われる。CXCR5発現は喫煙歴のない人の方が高い。
LUADおよびLUSCの腫瘍検体におけるTIBの次世代シーケンシング
私たちのコホートから27人の患者の両腫瘍組織の腫瘍検体のバルクRNAシーケンスを実施した。このデータセットで配列されたすべての遺伝子のフィルタリング、正規化、分散安定化変換を行った結果、14739個の遺伝子が同定された。このうち、789の遺伝子は、喫煙経験のない人（n=9）と喫煙経験のある人（n=18）の間で有意に（p<0.05）発現が異なっていた。99は、log fold change（LFC）>0、すなわち、喫煙経験のないコホートで発現が増加し、690はLFC <0、すなわち、喫煙経験のあるコホートで発現が増加した。ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）発現は、グループ間で有意な差をもって発現しており、喫煙経験者で発現が高かった（p=0.0037、Benjamin-Hochberg補正後、図4A）。免疫反応の活性化は、Gene Set Enrichment AnalysisとGene Ontology Analysisに基づき、サイトカイン産生経路と抗原処理およびシグナル伝達経路が、喫煙経験者で有意に発現が上昇した（図4B）。Nf-ĸBシグナル伝達経路の重要な炎症性遺伝子と転写因子が喫煙経験者でアップレギュレートされたのに対し、B細胞活性化因子（BAFF）はこの経路の喫煙経験者のアップレギュレート遺伝子として特定された（図4C）。
図4
図4 喫煙状況に応じて層別化した次世代シーケンサーデータ。(A）喫煙歴のある人とない人のBTKおよびiBTKの発現の違いを説明するための箱ひげ図。Rの差分遺伝子発現解析による有意性検定データを図に示す。 (B) 遺伝子セット濃縮およびオントロジー解析プロットにより、喫煙経験者で有意に発現が上昇した主要な生物学的経路を示す。P値は右側のカラーチャートにしたがって表示されている。(C) Nf-ĸBシグナル伝達カスケードに関するKEGGパスウェイ分析図。赤色で表示された遺伝子は、喫煙者において有意に上昇した遺伝子を示し、これにはBAFFのみが含まれる。緑色で強調表示された遺伝子は、喫煙経験者において有意に上昇した遺伝子を示しています。
LUADでは、LUSCと比較して、終末分化した血漿の存在と記憶表現が増加した。
組織学的サブタイプ（LUAD対LUSC）で層別化した血液およびTMEコンパートメントにおける存在量の差分解析を実施した。循環（図5A）において、3つの集団がLUADで有意に多く存在することが確認され、補足図10のUMAP上の青いボックスで区分されている。
図5
図5 組織学的サブタイプで異なるB細胞発現。(A) CIRCULATION（血液）：循環における以前に同定された20のクラスター（補足図3のヒートマップ）（左側の列）と、組織学的サブタイプおよび個々の患者（メインパネル）による各クラスターの相対的な正規化存在量を示すDifferential Abundance heatmap。腫瘍の種類は、下のX軸に沿って示されている（腺癌（LUAD）-青線、扁平上皮癌（LUSC）-オレンジ線）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルは、条件（LUADとLUSC）間の存在量の差の有意性を決定するために適用され、上位3つのクラスターは、灰色のバー（3、18、11）で示すように統計的に有意であった。(b) 腫瘍内（Tme）： TME（図2Bヒートマップ）（左側の列）において以前に同定された20のクラスターと、組織学的サブタイプおよび個々の患者（メインパネル）による各クラスターの相対正規化存在量を示す差分存在量ヒートマップです。腫瘍の種類は、下のX軸に沿って示されている（腺癌（LUAD）-青線、扁平上皮癌（LUSC）-オレンジ線）。右側の灰色のバーは、Benjamini Hochbergによる多重補正テストを考慮したp<0.05を示す。モデルの頑健性を高めるために、患者間の変動はランダム効果として扱われた。一般化線形混合回帰モデルは、条件（LUADとLUSC）間の存在量の差の有意性を決定するために適用されましたが、どのクラスターも統計的に有意なものではありませんでした。
クラスター3 - CD10+ CD38+ Transitional（ロイヤルブルー）[p=0.0032]。
クラスター11 - CD138hi IgG+ ki67int Effector Plasma（緑色）【p=0.018
クラスター18 - CD5hi CD25hi CD24int PD1+ Transitional/Breg (ライトパープル) [p=0.0086］
重要なことは、TME内では、どの集団もDAテストにおいてLUADとLUSCの間で有意ではなかったことであり（図5B）、腫瘍におけるB細胞の変化は組織型に依存しないことである。
考察
本研究は、循環と腫瘍内におけるB細胞集団の違いに焦点を当てた、NSCLCにおけるB細胞レパートリーの最も包括的な免疫細胞アトラスを、我々の知る限り提供するものである。我々は、高次元のディープフェノタイピングを用いて、循環と腫瘍内区画の間でB細胞レパートリーに明確な違いがあることを証明した。循環系では未熟なナイーブ細胞や濾胞細胞が優勢であり、腫瘍内ではより高レベルの浸潤形質細胞が存在する。これらのプラズマ細胞は、機能的および表現型的に多様である。我々は、非喫煙者ではCXCR5を高発現する未熟なB細胞の割合が高く、喫煙者ではTMEと循環の両方で血漿細胞の浸潤が高いことを示した。これらの細胞は、機能的には自然制御性抑制の表現型を示した。しかし、LUADでは、循環する終末分化形プラズマ細胞やメモリー表現型がより多く見られた。最後に、術後の転帰で層別化すると、非再発例では浸潤エフェクターIg+IL-10-プラズマ細胞のレベルが高く、抗がんエフェクターT細胞応答を増強し、抗体依存性メカニズムで腫瘍細胞死を直接媒介する機能があると考えられる。
腫瘍浸潤B細胞（TILB）とプラズマ細胞はTMEの重要な構成要素として同定されており、肺癌の転帰や進行した疾患におけるチェックポイント阻害薬への反応に関連している（11-13）。最近、肺腺癌の単一細胞解析と空間マッピングにより、高レベルの分化と体細胞超変異を伴う腫瘍組織において、血漿細胞およびメモリーB細胞が非常に濃縮された集団が初めて示されました（16）。我々は、この研究を大幅に発展させ、LUADとLUSCの両方の組織学的サブタイプを含む50人以上の患者の血液とTMEの両方の区画におけるB細胞のプロファイリングを行った。血液と腫瘍を直接比較し、2つの区画の間に代用性がないことを証明した。血漿細胞浸潤は腫瘍内において顕著に高く、濾胞期および初期記憶期のナイーブな常在B細胞が循環内に多く存在していました。注目すべきは、血中の非定型的なIgD+ IgM-メモリー集団を検出できたことである。これは、ワクチン反応と循環の文脈で以前に説明されている（49, 50, 53-56）。我々のTMEデータはHaoら（16）のデータと一致するが、血液区画の比較という粒度が追加された。Haoらは、腫瘍組織で高レベルのCXCL13産生を示し、それは癌の進行に伴って変化したことから、腫瘍由来のシグナルからTMEへのこれらの細胞の輸送が増加したことを示唆している（16）。我々のデータは、循環B細胞集団がCXCR5+であることを示し、これはHaoのデータと類似しているが、さらに循環中に存在する濾胞細胞およびメモリー細胞が、適切な走化性/抗原特異的シグナルに依存してTMEに移動することを示す。生物学的に、これはナイーブB細胞が腫瘍によって、エフェクターまたは抑制の表現型を示す終末分化した形質細胞へと分極することを表していると思われる。腫瘍組織のマルチスペクトル空間分析では、腫瘍巣とは対照的に腫瘍間質に抑制性細胞タイプ（CD20+ IL-10+およびCD138+ IL-10+）が優勢であることが示されました。このような局在は、腫瘍間質への抗腫瘍エフェクター集団の流入を抑制し、流入した免疫細胞の前述の機能的偏向を支援・促進するための免疫回避機構である可能性があります。
Haoら（16）は、次世代シーケンサーを用いて、LUAD患者16人の腫瘍サンプルにおけるTILBレパートリーを総合的に評価した。これらの早期腫瘍では、クラススイッチングクローンを示す高レベルの分化と体細胞超変異を有する後期記憶細胞および形質細胞が濃縮されていた。LUADのTMEでは、LUSCのTMEと比較して、クラススイッチされたメモリーおよびエフェクター形質細胞が同様に浸潤しており、また自然制御形質がより多く存在していることが示された。LUADの患者は、LUSCの患者と比較して、循環中のエフェクター血漿細胞のレベルが高いことが示された。LUSCのTMEでは、早期で分化度の低いプラズマブラスト/プラズマ細胞が優勢であった。LUAD (n=492) と LUSC (n=488) の CIBERSORT 分析では、同様の形質細胞の存在 (9-10%) が示され、メモリー B 細胞の浸潤がない腫瘍は予後不良であった (57). scRNA-seqデータに基づいて、LUSCではより高度な免疫異質性が仮定されている（58）。LUSCにおける変異負荷とその結果としての新抗原負荷は、LUADのそれよりも高いことが多く（30）、前者は喫煙歴とp53変異が強いことが示されている。後期エフェクター形質細胞が、LUSCで見られるような、より敵対的な炎症性TMEに移動することが、循環レベルでの2つの組織亜型間のB細胞動態の相違を説明するかもしれない。これは、組織型間の比較発現が循環系で証明され、TMEでは証明されなかったという、我々の解析が提供するユニークな視点である。
Haoらは、喫煙者において、TILB、特にIgA+およびIgG+の形質細胞および記憶細胞の有病率が高いことを示した(16)。プラズマ細胞浸潤の増加は、生存率の向上や免疫療法への反応と相関している。プラズマ細胞の分化と並行して、これらの患者におけるメモリー細胞の浸潤は、喫煙者や進行期のがんではBCRクローナリティの程度が低く、クラススイッチまたは胚中心表現型に偏っていた（16）。
我々は、常用喫煙者の循環およびTMEにおいて、後期末端分化型エフェクター形質細胞が発見されたことを明らかにした。さらに、喫煙者の血中では、抑制的な自然制御プラズマ細胞がより多く検出され、このことは、喫煙者におけるより大きな炎症環境の結果として、このグループにおけるIL-10の発現中央値の上昇と相関していると考えられた。このことは、喫煙者の腫瘍組織の機能的RNA解析によって裏付けられ、これらの患者はNf-ĸBシグナルに関わる炎症性遺伝子、特にTNFαとIL-1βを著しく過剰発現していた。特に、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現は、非喫煙者に比べて喫煙者で有意に高く、BTK阻害剤（iBTK）の発現と相関があった。BTKはB細胞発生の重要な制御因子であり、LUADの予後因子として研究されており、そのレベルの上昇は免疫細胞の活性と生存率の向上に対応している(59)。BTKは肺胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ-9発現（MMP-9）の重要な制御因子であり、肺実質におけるタバコの煙による炎症の重要な媒介因子であることが、説得力のあるマウスデータによって示されている。タバコに暴露されたApoE-/-マウスは、BTK阻害剤で同時治療するか、下流のsiRNAでMMP-9活性を抑制すると、肺胞損傷が減少した（60）。自己炎症状態においてこの分子を標的とすることで、タバコに関連する肺の過炎症が相殺され、細胞損傷の負担が軽減され、発癌の速度が遅くなる可能性があります。B細胞活性化因子受容体（BAFF-R）は、我々のデータセットでは喫煙歴のない人で上昇していることが示された。マウスのデータでは、タバコの煙が自然炎症性免疫細胞によるBAFFの発現を上昇させ、肺の炎症を引き起こす可能性が示されています（61-63）。しかし、タバコの煙が長期的にBAFFの発現を抑制し、その結果、粘膜IgAの発現が低下し、肺の炎症が増強され、ウイルス感染に対処する能力が低下するという証拠もある（64）。このようにBAFF/BAFF-Rの発現に逆説的な影響を及ぼす要因には、様々なものがあると思われるが、特にタバコの煙への曝露期間が大きい。我々のコホートでは、喫煙歴がなく、タバコの煙に全く触れていないため、BAFF-Rの発現が抑制されないことが説明できるかもしれない。したがって、これらの患者さんには、喫煙歴だけでなく、他の遺伝的要因（関連する自己炎症性疾患を含む）や環境要因（アルコール摂取、地理的な場所による汚染指数、その他の食事やライフスタイルの要因）が関与している可能性があることを念頭に置いておくことが重要である。
非喫煙者では、移行期および濾胞期の早期B細胞が循環で観察され、CXCR5の発現中央値が非常に高い。喫煙歴のあるLUAD患者のTMEでは、非喫煙者に比べてプラズマ細胞の割合が著しく高いことが観察され、喫煙者ではB細胞のクローナリティが低下していることも示された（16）。これは喫煙歴の程度とも相関していた。これは特に、完全に分化した形質細胞の表現型に当てはまります。我々のデータは、循環におけるCD138とIgGの発現の上昇によって示されるように、常喫煙者では後期エフェクター形質細胞が優勢であることを実証している。私たちが示したように、プラズマ細胞の分化軸はスペクトル上にあり、抑制的な自然制御細胞は常喫煙者でその存在を示す。喫煙歴のない人は、初期段階のB細胞や移行細胞、濾胞細胞の存在感が高まり、TMEではCXCR5hi集団が優勢であることが示されました。CXCL13-CXCR5 B細胞ケモカイン軸は、B細胞のリクルートとTLS形成に重要である。CXCR5+ B細胞は、早期LUADで非常に濃縮されている(16)。TCGAのデータでは、LUADの病理学的ステージが進むにつれて、CXCL13の発現が徐々に減少していることが示されている。タバコの煙への暴露は、TMEだけでなく循環においてもB細胞レパートリーを再形成する。試験管内でのタバコの煙への暴露は、LUADのTMEにおける免疫環境の進化に影響を与えます（65、66）。分化したメモリーB細胞集団の濃縮は、タバコに暴露されたLUADの予後不良と相関している（65）。現在の喫煙者の血中では、クラススイッチされたメモリーB細胞のレベルがかなり高いことが観察されている（67）。肺癌の喫煙者における点突然変異の数は、喫煙経験のない人の10倍であり（34, 68, 69）、絶え間ない煙による損傷は、これらの患者の肺におけるネオアンチゲンの進化したパターンをもたらし、適応免疫応答を形成している。我々は、常喫煙者におけるメモリー細胞および分化したB細胞の増加を示したが、これはおそらくこれらの患者における高い抗原負荷を反映していると思われる。実際、喫煙歴のない患者ではエフェクターCD20+細胞の数が多く、変異負荷が低いため、LUADの良好な転帰と相関している(70)。喫煙者では、CXCR5+ B細胞の発現が少ないことから、喫煙者ではゲノムの乱れや進化が進むにつれて、エフェクターサブセットを集め、抗がん反応を活性化し、TLSを形成する能力が、腫瘍脱出を促進する結果、失われる可能性があると考えられる。
腫瘍内プラズマ細胞浸潤の増加は、抗PDL1治療を受けているNSCLC患者の全生存期間の延長と関連することが報告されている（14）。POPLAR試験（71）のシングルセルRNAシーケンスデータから、活性化T細胞、IgG+プラズマ細胞、マクロファージの間に見られる高い相関性によって決まる免疫モジュール（肺がん活性化分子（LCAM1））の状態が、抗PDL1治療を受けた患者における無増悪生存率の向上と関連していることが示された。また、LCAM1hiの状態は、同様の治療を受けた患者において、全生存率が向上する傾向を示した(15)。オキサリプラチン治療抵抗性の去勢抵抗性前立腺癌のマウスモデルでは、PDL1の発現、TGF-βとIL-10の産生を通じてCD8+T細胞の疲弊を誘導するIgA+プラズマ細胞の存在が増加し、真の制御性抑制プラズマ細胞の表現型であることが示された(72)。この集団を除去することで、オキサリプラチンを用いた大腫瘍の制御が可能になる。この同じ抑制的集団は、動物やヒトの炎症性肝疾患の症例で蓄積され、抗がんエフェクターT細胞応答を阻害することが示されている（73）。進行期肺癌におけるPDL1の遮断は、TMEで作用する抑制的なプラズマ細胞の表現型を弱め、エフェクターIgG産生表現型にバランスをシフトさせる可能性がある。
私たちは、表現型スペクトルにわたるTMEへの形質細胞の浸潤を実証した。CD138+IL-10産生形質細胞の発見は、B細胞成熟のどの段階でも抑制性制御B細胞が発生しうることを示す証拠であり、これらの細胞はBLIMP-1LO表現型を示し、スイッチングIgGアイソタイプを発現する（47、74）。最近、LAG-3+ IL-10+ CD138hi形質細胞は、抗原チャレンジ後、Toll様受容体主導でIL-10を急速に誘導し、PDL-1とPDL-2を介してIL-10を独立して抑制することが示され、好ましい免疫療法のターゲットとなることがわかった（40、80）。
我々の発見は、B細胞が遠くの循環区画からTMEに移動する現象を補強するものである。この現象は、異なる組織学的サブタイプで異なり、TMEにおける炎症負荷、すなわち喫煙者と非喫煙者に影響されるものである。現在の文献に加え、本研究は、これまで腺癌患者の一部の腫瘍標本のみに限られていたNSCLCにおけるB細胞背景を、幅広い臨床病理学的パラメータを参照して詳細に記述するための洞察を提供します。
B細胞環境は、患者の循環血液中の全PBMC分画の5％であり、我々が説明する特定のB細胞表現型は、これらのB細胞および形質細胞のさらに小さな分画であることを心に留めておくことは重要である。これは、免疫生物学のこの分野を研究する上で固有の限界であり、我々が観察した条件間の有意性は、データの信頼性を確保するために、患者間のばらつきをランダム効果として扱い、教師なし、バイアスなしの方法で評価されている。生物学的関連性を確認するためには、さらに大規模なコホート研究が必要であるが、それでも本研究は、B細胞生物学に関連した肺がん領域における重要かつ詳細な比較分析を追加するものである。この手法と分析は、主観的で、よく知られたサブタイプへの偏りがあり、大規模なデータセットでは非効率的である、手動によるゲーティング手法によって制限されます。統合された機械学習法の開発は、他のOMICSデータ解析とのギャップを埋め、サイトメトリーデータから直接発達の軌跡を推測するのに役立つだろう（81）。NSCLCの根底にある正確な発症メカニズムを明らかにするためには、さらなる空間マッピングと機能研究が必要である。しかし、本研究は、肺がんにおける形質細胞のスペクトル、および異なる組織学的・臨床的疾患設定におけるこの軸の動態について、より詳細な情報を提供し、定義するものである。
データの利用可能性に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らによって、過度な予約なしに入手可能である。
倫理に関する声明
ヒト参加者を含む研究は、UoB Research Ethics Approval, protocol 17/WM/0272のもと、Written consentが提供され、審査・承認されました。患者/参加者は、この研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提供した。
著者による貢献
APとGMが実験計画を立案した。APは、サンプルの調達、処理、データ収集、分析を行った。APとGMは結果を解釈し、原稿を構成・デザインした。NK、AR、BN、MDは、原稿のデザインおよびレイアウトに対して建設的なフィードバックを提供した。すべての著者がこの論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
謝辞
Hollie BancroftとGerald Langmanの助言に感謝したい。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または支持されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインでご覧いただけます： https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1198665/full#supplementary-material
補足図1｜マーカー発現の中央値をスケーリングした箱型プロットは、集団内の全細胞について、血液と腫瘍の区画に層別した表現型マーカー発現を示す。血液は赤色、腫瘍は緑色で描かれており、右側の欄のカラーチャートで示されている。
補足図2｜多次元スケーリングプロット、主成分分析では、Lavinら（52）の公開データに基づくCD19+血液、腫瘍、正常肺組織の分離を示す。
補足表1｜コホートの人口統計学的データの概要。病理組織学的データのほか、転帰データ（死亡率、再発率、全生存期間／無病生存期間）も含まれる。
補足表2｜本コホートにおける全生存期間および無病生存期間の有意な独立予測因子を示す多変量コックス比例ハザードモデリング（Multivariate cox proportional hazards modelling）。
補足表3｜マスサイトメトリー用抗体B細胞マーカーパネル。
補足表4｜VECTRAによるマルチプレックス免疫蛍光イメージングで注目されるマーカー。
参考文献

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発行：2023年6月15日。
編集者
シルビア・クレスチョリ（キングス・カレッジ・ロンドン、イギリス
レビューした人
レベッカ・ケッセルリング（ドイツ、フライブルク大学医療センター
ラルフ・キュッパーズ（ドイツ・デュイスブルク・エッセン大学
Glauco Akelinghton Freire Vitiello, A.C.Camargo Cancer Center, ブラジル
Copyright © 2023 Patel, Khan, Richter, Naidu, Drayson and Middleton. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可される。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Gary W. Middleton, g.middleton@bham.ac.uk
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