社会的マイクロバイオームにおける共通の進化経路

哉百名


社会的マイクロバイオームにおける共通の進化経路

https://academic.oup.com/mbe/article/40/7/msad153/7218899?login=false

ネルソン・フラザォン、イザベル・ゴルド 著者ノート
分子生物学と進化、第40巻、第7号、2023年7月、msad153、https://doi.org/10.1093/molbev/msad153
発行：2023年7月4日
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要旨
社会的ネットワークは腸内細菌の生態系に影響を与え、ヒトやその他の動物の腸内細菌叢の種構成を形成する可能性がある。腸内常在菌は、健康な宿主にコロニーを形成する際に進化し、急速なペースで適応することができる。ここでは、宿主から宿主への細菌伝播が、哺乳類の腸内における大腸菌の進化に及ぼす影響を評価することを目的とした。マウスを用いたin vivoの実験的進化アプローチにより、同一世帯に生息する宿主間での大腸菌の伝播率は1日あたり7％（±3％の2×標準誤差[2SE]）であることがわかった。突然変異-選択-移動の単純な集団遺伝学モデルの予測と一致し、宿主内進化に起因する共有事象のレベルは、同居マウスにおいて大きく向上し、同じ食餌と習慣を持つ宿主は、類似したマイクロバイオーム種組成を持つだけでなく、類似したマイクロバイオーム進化ダイナミクスを持つことが期待されることを示している。さらに、大腸菌の突然変異蓄積速度は、体制の社会的背景にかかわらず、3.0×10-3（±0.8×10-3 2SE）変異/ゲノム/世代と推定された。我々の結果は、腸内マイクロバイオームにコロニー形成する新菌株の適応進化を形成する上で、宿主を超えた細菌の移動が影響していることを明らかにした。

細菌伝播、マイクロバイオーム、腸内適応、進化速度、突然変異、プロファージ
問題のセクション 発見
副編集長 ディーパ・アガシェ
はじめに
同じ空間を共有する個人は、そうでない個人よりも類似した微生物叢組成を保有することが知られている。ヒトでは、同居者間でかなりの菌株共有が認められ、腸内マイクロバイオームと口腔マイクロバイオームでそれぞれ12％と32％の菌株共有率が観察された（Valles-Colomer et al.） このことは、同居している場合に増加する宿主間の微生物の移動が、マイクロバイオームにおける種の多様性を構造化する重要な要因であることを示している（Johnson and Clabots 2006; Johnson et al. 2008; Siranosian et al.） 実際、共食いであるマウスの同居は、宿主間の微生物叢種構成の多様性を低下させることが示されている。宿主の免疫表現型に関する多くの研究でも、微生物叢のばらつきを減らす目的で同居が一般的に行われている（Ericsson and Franklin 2015）。

マウスとヒトの両方における新たなデータは、各微生物叢種の株内で大きな進化的変化が起こりうることを示している（Garud and Pollard 2020）。単一株または複数株の常在菌でコロニー形成された無菌マウス（Li et al. 2015; Barroso-Batista et al. 2020; Yilmaz et al. 2021）、または本来の微生物叢を持つマウス（Barroso-Batista et al. 2014; Lescat et al. 2017; Frazão et al. 2019, 2022）では、数日、数週間、または数ヶ月で進化的変化が観察されている。ヒトメタゲノムの時系列データも、数カ月以内にいくつかの適応的進化事象が起こりうることを示している（Garud et al.）

宿主をまたがる細菌の伝播が、腸内微生物の分子進化のパターンにどのような影響を及ぼすかを解明し始めるには、デメが宿主を模倣するメタ集団の集団遺伝学理論が有用である（Pannell and Charlesworth 1999; Booker et al.） メタ集団の文脈における適応の理論モデルは、新たな有益な突然変異の蓄積から生じるクローン集団（すなわち細菌）の適応進化の速度は、デメ（すなわち個々の宿主）間の移動／伝達の量に影響されるはずだと予測する。特に、移動のレベルが一定であれば、移動がない場合に比べ、適応の割合は増加するはずである（Gordo and Campos 2006; Yeaman and Whitlock 2011）。このモデルは通常、単一の微生物種を対象としているため、腸内生態系に特徴的な多種の微生物による複雑性は無視されている。しかし、その予測は、種内競争の強さが種間競争の強さよりもはるかに高い条件下では、生態系レベルの複雑さに対して頑健であるべきである。このような条件は、一般化ロトカ・ヴォルテラのようなマイクロバイオームの多様性と安定性を説明することを目的とした生態モデルを16s RNAデータに当てはめたときに観察される（Coyte et al.）

ここで我々は、マウスの腸にコロニーを形成する新しい系統の進化経路が、宿主の社会環境によってどのような影響を受けるかを研究している。伝播実験と進化実験の両方を行った。前者は同居マウス間での大腸菌感染率を推定するためのものであり、後者ではin vivo実験進化を用いて以下の仮説を検証した： 1）同居によって常在菌の進化速度が増加すること、2）高い移動速度によって宿主間で蓄積される共有進化事象の数が増加すること、である。この仮説を、進化の2つの重要な過程である水平遺伝子移動（HGT）と突然変異の蓄積について検証する。HGTの下では、たった1匹のマウスで起こった適応的事象が、マウスのメタ集団全体に急速に伝播すると予想される。突然変異蓄積の下では、宿主内の適応進化が異なる適応突然変異を持つクローン間の激しい競争によって特徴づけられる場合、社会的体制において対立遺伝子の共有率が高くなると予想される。実際、同じ環境（例えば、同じ食餌）で生活する宿主内でクローン干渉が蔓延している場合、移動／伝達により、有益な対立遺伝子の組み合わせを最も多く持つ細菌クローンが、宿主間でより急速に拡散する可能性がある。

結果
突然変異-選択-移動と遺伝的漂流のモデル
宿主間伝播が宿主間で共有される突然変異のスペクトルに影響を与えると予想される条件を定量化するために、突然変異-選択-移動と遺伝的ドリフトのモデルを用いた（材料と方法を参照）。シミュレーションの結果、移住者数が≫1の場合、メタ集団は単一集団として振る舞い、すべての有益な突然変異がデメ間で共有されることが予測された（図1Aおよび補足図S1A、オンライン補足資料）。もう一方の極端な例では、移住者の数が極端に少ない場合、デミーは独立した集団に近い振る舞いをし、共有される適応的多型のレベルは非常に低くなると予想される。

図1.
マウス間での大腸菌感染。(A）細菌伝播のモデル。すべての突然変異が同じ効果を持つモデル（singleS型）と、突然変異が指数関数的に分布するモデル（exp型）における、共有される進化イベントのレベルと移動の関係。パラメータ値 N = 10000, Ud = 0.01; Ua = 0.00001; Sd = 0.1; Sa = 0.1。集団は400世代の間に突然変異を蓄積し、腸内での大腸菌進化の時間スケールは27日である。(B）移動率を推定するための実験デザイン。マウスは非社会的環境（個別ケージ）にいる間、シアン（CFP）またはイエロー（YFP）蛍光タンパク質を発現する大腸菌クローン（107 CFU）でコロニー形成された。実験Iでは、マウス（n = 2）は8日目に社会的環境（同居）に移され、実験II（n = 2）では、マウスは15日目に社会的環境に移された。(C)非社会的および社会的環境下で糞便中のCFPおよびYFP大腸菌量を評価した。社会的環境（同居）におけるマウスと期間を示す。エラーバーは2SEを表し、破線は検出限界（糞便中330CFU/g）を示す。大腸菌感染率（％）：マウス腸内の大腸菌のうち、ケージ内に残っているマウスからの感染に起因するものの割合。誤差は2SEを表す。補足資料オンラインの補足表S2を参照。
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マウス間での大腸菌の伝播。(A）細菌伝播のモデル。すべての突然変異が同じ効果を持つモデル（singleS型）と、突然変異が指数関数的に分布するモデル（exp型）における、共有進化イベントのレベルと移動の関係。パラメータ値 N = 10000, Ud = 0.01; Ua = 0.00001; Sd = 0.1; Sa = 0.1。集団は400世代の間に突然変異を蓄積し、腸内での大腸菌進化の時間スケールは27日である。(B）移動率を推定するための実験デザイン。マウスは非社会的環境（個別ケージ）にいる間、シアン（CFP）またはイエロー（YFP）蛍光タンパク質を発現する大腸菌クローン（107 CFU）でコロニー形成された。実験Iでは、マウス（n = 2）は8日目に社会的環境（同居）に移され、実験II（n = 2）では、マウスは15日目に社会的環境に移された。(C)非社会的および社会的環境下で糞便中のCFPおよびYFP大腸菌量を評価した。社会的環境（同居）におけるマウスと期間を示す。エラーバーは2SEを表し、破線は検出限界（糞便中330CFU/g）を示す。大腸菌感染率（％）：マウス腸内の大腸菌のうち、ケージ内に残っているマウスからの感染に起因するものの割合。誤差は2SEを表す。補足資料オンラインの補足表S2を参照。

シミュレーションはまた、ある時点まで蓄積された有益な突然変異の頻度の合計から推定される進化速度M(t)は、移動速度が増加するにつれて増加するはずであることを予測した（補足図S1B、オンライン補足資料）。しかし、M(t)の違いを検出する検出力は、この統計量に大きな分散が観察されることを考えると、高い再現数を必要とする。母集団の平均フィットネスに関しては、シミュレーションの結果、異なる伝播率でも同程度であることが予測された（補足図S1C、オンライン補足資料）。個体群中の高頻度突然変異の割合（50％以上）については、移動率が高いほど高くなるとシミュレーションは予測した（補足図S1D、オンライン補足資料）。

同居下における高レベルの系統伝播
本研究の最初の実験（伝播実験）は、同居動物間の大腸菌伝播率を推定するために行った。それぞれ異なる中性マーカー（黄色蛍光タンパク質（YFP）またはシアン蛍光タンパク質（CFP））を持つ2つの同系大腸菌株（補足表S1およびS2、オンライン補足資料）を用いることで、同居後の宿主間の移動の程度を定量化することができた。蛍光標識株の1つが別の動物に感染すると、その後の感染エピソードは最初のものと区別できなくなるため、同居から18時間後の1つのタイムポイントでのみマウスをサンプリングして感染率を推定した（補足表S2および図1C、オンライン補足資料）。CFPとYFPは、マウスの腸内における以前のコンペティションで中立マーカーとして振る舞うことが判明した（Sousa et al.） 実験デザインは図1Bに記載されている：各マウスは、T日間（T＝7または14日、図1B-実験IおよびII、それぞれ）の間、標識された系統、CFPまたはYFPのいずれかでコロニー形成された。この期間の後、宿主間のマイクロバイオーム伝播を可能にし、宿主間の大腸菌の伝播速度を定量化するために、マウスを同居させた（社会的体制）。コロニー形成2週間後の同居（実験II）は、宿主内適応がすでに起こっている可能性がある期間後にも感染が起こるかどうかを調べるために行った。感染実験に用いたCFPおよびYFP大腸菌標識株はいずれも、すでに標識株でコロニー形成されている別のマウスの腸にコロニー形成することができ、その侵入能を示した（図1C）。マウス間での大腸菌の伝播は広範囲にわたり、非常に速いことがわかった（図1C、補足表S2、オンライン補足資料）。YFP系統とCFP系統の両方でのコロニー形成は、両動物の同居から24時間以内に起こった。移動速度が一定であると仮定すると、平均して1日あたり1.5×107個（±1×107、2×標準誤差[2SE]）の大腸菌が新しいマウスに感染する（補足表S2、オンライン補足資料）。従って、この大腸菌株の1日当たりの伝播率は7％（±3％2SE）と推定される（図2Cおよび補足表S2、オンライン補足資料）。この割合は無菌マウス（Vasquezら、2021年）で観察された割合に近い。このことから、同居飼育は移動の多いレジームであり、理論的には対立遺伝子の共有率が高くなると予想される（図1Aおよび補足図S1A、オンライン補足資料）。

図2.
社会的・非社会的文脈における大腸菌の進化実験。(A)非社会的または社会的レジームでマウスに経口摂取させた大腸菌クローンの負荷量。エラーバーは2SEを表す。検出限界（破線）は糞便中330 CFU/g。(B)特定の変異（例えば、psuK/fruA、ybi/fiu、yjfL/yjfM、frlR、rnd）を持つ大腸菌の、社会的体制で生活するドナーマウスからレシピエントマウスへの伝播例。より詳細な情報は、補足資料オンラインの補足表S6、図S5、S6を参照。
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社会的・非社会的文脈における大腸菌の進化実験。(A)非社会的または社会的体制でマウスに経口投与した大腸菌クローンの負荷量。エラーバーは2SEを表す。検出限界（破線）は糞便中330 CFU/g。(B)特定の変異（例えば、psuK/fruA、ybi/fiu、yjfL/yjfM、frlR、rnd）を持つ大腸菌の、社会的体制で生活するドナーマウスからレシピエントマウスへの伝播例。より詳細な情報は、補足資料オンラインの補足表S6、図S5、S6を参照。

同居下での分子進化速度
上述した伝播実験により、同居マウスでは細菌の移動が一般的であることを証明した後、マウスの腸内における分子進化のパターンに伝播なしと伝播ありのどちらが影響するかを調べるために、実験設定を変えて新たな実験セット-進化実験-を行った（補足図S2、オンライン補足資料）。これらの進化実験では、すべてのマウス（伝播なしレジーム： A2、B2 G2、H2、I2；高伝播体制： A1、B1、C1、およびG1、H1、I1）には、YFPを発現する単一の大腸菌株をコロニー形成させ、感染率は前述の感染実験で観察されたものと同一と仮定した。6匹中5匹が非社会的な生活をしており、大腸菌のコロニー形成に成功したのに対し、社会的条件下ではすべてのマウスがコロニー形成に成功した（図2Aおよび補足表S3、オンライン補足資料）。少なくとも1ヶ月間（27日間）はコロニー形成に成功したが、非社会的環境と社会的環境における侵入大腸菌の負荷量に有意差は認められず、log10 6.3（±0.58, 2SE）CFU/g糞便程度で安定した（図2Aおよび補足図S3, オンライン補足資料）。

次に、マウスの腸内で1ヶ月（27日）または3ヶ月以上（104日）進化したクローンのプールの塩基配列をイルミナ技術を用いて決定し、リードを祖先のゲノムにマッピングした（補足表S4、オンライン補足資料）。適応進化の徴候である並列変異は、以前（Barroso-Batistaら 2014; Frazãoら 2019; Barroso-Batistaら 2020; Frazãoら 2022）と同様に、社会的環境および非社会的環境の動物から分離された大腸菌集団の両方に存在することが注目された（補足表S5、オンライン補足資料）。psuK/fruA、frlR、rnd、yfjL/yfjM、ybiX/fiuのような変異の伝播は、以前のサンプリングポイントからの集団の塩基配列を決定することで遡ることができた。これにより、変異が最初に選択され、その後同じケージ内の残りのマウスに伝播したマウスを同定することができた（図2Bおよび補足図S5、S6、表S6）。S5 and S6 and table S6 Supplementary Material online）。遺伝子間変異psuK/fruAは平行変異であったため、プソイドウリジンからのピリミジンヌクレオチドの産生に関連し、適応的であると考えられた。frlR変異は、腸内で一般的かつ適応的な変異標的であることがわかった。対応する遺伝子はフルクトースセリシンの消費に役割を果たしており、ごく最近、マウスの腸における大腸菌の走化性とAI-2シグナル伝達に関与していることが示唆された（Laganenkaら、2023）。rnd変異は前駆体tRNAのプロセッシングに影響を与えると予想され、yfjL/yfjMは大腸菌欠損プロファージCP4-57に関連し、ybiX/fiu変異はヒドロラーゼ遺伝子（ybiX）のプロモーター領域に影響を与える可能性がある（図2Bおよび補足図。S5とS6、表S6オンライン補足資料）。社会的環境下でマウスから採取したクローンでは同義変異は検出されず、すべての動物で非同義変異と同義変異の比率dN/dS = infinityとなった。個別にケージに入れられたマウスから単離された個体群では、dN/dS比はわずか3/5の動物で>1であった（補足表S5、オンライン補足資料）。dN/dS統計は、細菌感染が起こっているときに適応進化が強くなる可能性を示唆しているが、適応進化が起こっているときでもdN/dSが検出できない可能性があることに注意することも重要である（Kryazhimskiy and Plotkin 2008）。

次に、それぞれの宿主における突然変異蓄積の動態が、その宿主の社会環境によってどのような影響を受けるかを定量化した。大腸菌が社会的または非社会的環境でコロニー形成した場合の進化速度（図3AおよびB、補足表S5、オンライン補足資料）は、M（t）をあるサンプリング点における世代数で割って評価した。M(t)は、あるサンプリング時点における集団の全変異の対立遺伝子頻度の合計であり、ランダムにサンプリングされた個体クローンにおける変異の期待数に近似する（Good et al.） 社会的レジームでは1世代あたりゲノムあたり平均3.8×10-3（±1.0×10-3 2SE）の割合で突然変異が蓄積し、非社会的レジームで観察された割合より高かったが有意差はなかった： 図3Bと補足表S5（オンライン補足資料）より、社会体制はこれらの実験で追跡された世代数の分子進化速度に影響を与えなかったことが示唆される。

図3.
社会的および非社会的状況における大腸菌の分子進化。(A) in vivo進化における大腸菌の突然変異蓄積。突然変異M(t)は、時間（世代）に沿った各サンプリング点における対立遺伝子頻度の合計に対応する。(B) M(t)に基づく大腸菌の進化速度。世代あたりのゲノムあたりの大腸菌進化率は、M(t)を社会的および非社会的レジームの各生物学的レプリカの各マウスの世代数で割って計算した。補足資料オンラインの補足表S5を参照。生物学的複製1にはマウスが含まれる： A1、B1、C1(社会的体制)、A2、B2(非社会的体制)。生物学的レプリカ2にはマウスが含まれる： G1、H1、I1（社会的レジーム）とG2、H2、I2（非社会的レジーム）。棒グラフは社会的レジームまたは非社会的レジームにおける進化の平均速度を表す。(C)27日目または104日目に非社会的または社会的レジームで生活するマウスから分離された侵入者大腸菌集団で観察された共有または適応的進化事象の割合(D)。27日目または104日目に侵入大腸菌集団で観察された共有的または適応的な高頻度進化事象（50％以上）の割合。統計は割合の二項検定に対応する。
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社会的・非社会的文脈における大腸菌の分子進化。(A）生体内進化における大腸菌の突然変異蓄積。突然変異M(t)は、時間（世代）に沿った各サンプリング点における対立遺伝子頻度の合計に対応する。(B) M(t)に基づく大腸菌の進化速度。世代あたりのゲノムあたりの大腸菌進化率は、M(t)を社会的および非社会的レジームの各生物学的レプリカの各マウスの世代数で割って計算した。補足資料オンラインの補足表S5を参照。生物学的複製1にはマウスが含まれる： A1、B1、C1(社会的体制)、A2、B2(非社会的体制)。生物学的レプリカ2にはマウスが含まれる： G1、H1、I1（社会的レジーム）とG2、H2、I2（非社会的レジーム）。棒グラフは社会的レジームまたは非社会的レジームにおける進化の平均速度を表す。(C)27日目または104日目に非社会的または社会的レジームで生活するマウスから分離された侵入者大腸菌集団で観察された共有または適応的進化事象の割合(D)。27日目または104日目に侵入大腸菌集団で観察された共有的または適応的な高頻度進化事象（50％以上）の割合。統計は割合の二項検定に対応する。

社会的体制は進化的事象の共有を促進する
マウス1匹あたりに蓄積された突然変異の数は、社会的環境ではわずかに少なかった（中央値：社会的環境3.5 vs 非社会的環境6、Mann-Whitney両側検定U = 5、P = 0.08；補足表S4、オンライン補足資料）。同居マウスの最初のコホートでは、12個中9個（75％）の突然変異が3匹すべてに共通していたのに対し、2番目のコホートでは8個中6個（75％）が共通していた。非社会的環境では、最初のコホートでは16個中4個（25％）の突然変異のみが全マウスに共通していたが、2番目のコホートでは1個も共通していなかった（補足表S4、オンライン補足資料）。マウスの腸に常在する大腸菌の存在（Frazão et al. 2019）（補足図S4、オンライン補足資料）と一致して、同じ期間（27日間：約400世代）に15件のファージ駆動型HGT事象が検出された。このうち、11事象は同居動物（社会的体制、n = 6マウス）で発生した。一方、個体ケージ動物（非社会的体制、n = 5マウス）では4事象しか観察されなかったが、これは常在株が5匹中2匹にしか存在しなかったためである（補足図S4、オンライン補足資料）。一方、非社会的環境では、常在菌がコロニー形成している2匹の動物でのみファージによるHGT事象が観察された（補足表S7、オンライン補足資料）。

次に、個体間でどれだけの進化イベント（突然変異やファージ駆動型HGT）が共有されているかを評価した。コロニー形成後27日目（約400世代）の時点で宿主間で共有された進化的事象（突然変異とファージ駆動型HGT）の割合は、社会的環境下では77.4％（31の進化的事象のうち24の事象が共有）と、非社会的体制下の11.8％（34の事象のうち4）よりも有意に高かった（割合の二項検定、P < 0.00001；図3Cおよび補足表S4、S7、S8、オンライン補足資料）。次に、長期間の進化を経た後でも、同居マウスにおける対立遺伝子の共有のレベルが高くなるかどうかを調べた。最初のコホートマウスで104日間（約1,500世代）進化させた大腸菌クローンのプールの塩基配列を決定した。進化イベントの共有率は、1,000世代以上進化した後でも、非社会的環境（15％）よりも同居下（68.2％）の方が有意に高かった（割合の二項検定、P < 0.00001；図3Cおよび補足表S4、S7、S8、オンライン補足資料）。重要なことは、2つの社会的レジーム間において、善意の適応的進化事象、すなわち独立した2匹以上のマウスで観察された事象に注目すると、社会的レジームの方が遺伝的並列性が高いという同じ傾向が観察されたことである（図3C）。27日目（約400世代）の時点で宿主間で共有されていた適応的事象（突然変異とファージ駆動型HGT）の割合は、非社会的体制の12.5％（16事象中2事象）に比べ、社会的環境下では83.2％（18事象中15事象）と有意に高かった（割合の二項検定、P < 0.00001；図3Cおよび補足表S7、S9、S10、オンライン補足資料）。さらに、104日後（約1,500世代）でも、社会的レジーム下の動物では適応的イベントの割合が85.7％と、非社会的条件の35.3％よりも有意に高かった（割合に関する二項検定、P = 0.02444；図3Cおよび補足表S7、S9、S10、オンライン補足資料）。

社会体制は高頻度進化イベントの割合を増加させる
社会体制が進化イベントの頻度軌跡に影響を与えるかどうかを理解するために（モデルによって予測されるように；補足図S1D, オンライン補足資料）。S1D, Supplementary Material online）。まず、社会的レジームまたは非社会的レジームのマウスから分離された大腸菌集団で観察された全イベントのうち、高頻度イベント（>50%）の割合を分析した。高頻度（図3D、頻度50％以上）に達した突然変異またはHGT事象の割合は、大腸菌が社会的レジームで生活するマウスにコロニー形成された27日目（約400世代）では、独立したケージに入れられた動物の17.6％よりも41.9％と有意に高かった（割合の二項検定、P = 0.03156、図3Dおよび補足表S8、オンライン補足資料）。104日目（約1,500世代）でも、同居マウスでは高頻度イベント（図3D）の割合が77.3%と高いままであったが、独立したケージで生活しているマウスでは50%に過ぎなかった（割合に関する二項検定、P = 0.03662；図3Dおよび補足表S8、オンライン補足資料）。同じ解析を善意の適応事象（複数の独立した動物で観察された突然変異および/またはファージ駆動型HGT事象）のみに焦点を当てて行ったところ、高頻度事象の割合（図3D、補足表S9およびS10、オンライン補足資料）は、社会的または非社会的条件のマウスから分離された大腸菌集団間で有意差はなかった。これは、変異イベントの総数と比較して、観察された変異イベントの数が限られていたため、統計的検出力が不足していたためかもしれない。とはいえ、適応的事象はすべての進化的事象を考慮した場合と同じ傾向を示し、つまり社会的体制では高頻度事象の数が多いことがわかった（図3D、補足表S9とS10、オンライン補足資料）。

考察
哺乳類腸内の細菌進化は、主に哺乳類の健常宿主間での細菌伝播が起こらない非社会的条件下で研究されてきた（Barroso-Batistaら、2014、2015；Lourençoら、2016；Lescatら、2017；Sousaら、2017；Frazãoら、2019、2022；Ghalayiniら、2019；Ramiroら、2020）。我々の知る限り、微生物叢を有するマウスにおける細菌伝播の有無における大腸菌の進化を、ここで初めて比較した。われわれは、社会的または非社会的な体制で生活するマウスの腸内に大腸菌が定着した場合の大腸菌の進化を比較するために、細菌伝播のマウスモデルを確立した。その結果、同じケージに生息するマウスでは、各マウスの腸内にコロニー形成する大腸菌の7％（±3％ 2SE）が、毎日の移動イベントに起因することがわかった。大腸菌はマウスの腸に定着して1週間も経たないうちに、突然変異とファージによるHGTが同時に起こることで、より良好なコロニー形成に適応することが知られている（Frazão et al.） ここで我々は、適応した大腸菌がすでに腸に定着している場合でも、宿主間での大腸菌の伝播が起こる可能性があることを観察した。興味深いことに、あるマウスに最初にコロニーを形成したクローンが、進化の1ヵ月後に必ずしも優勢になるとは限らず、この種では優先効果（Sprockett et al.

大腸菌の集団サイズは、集団の変動性の程度とドリフトに対する淘汰の有効性を決定する上で重要な要素であるが（Charlesworth 2009）、感染による影響は受けず、社会的または非社会的に生活するマウスから分離された集団は同様の負荷を示した。微生物叢を持つマウス間で伝播する大腸菌細胞は、無菌動物を用いた研究（Vasquez et al.2021）で推定された10％の移動と同程度であったことから、微生物叢の有無にかかわらず、大腸菌は宿主間で非常に同程度の割合で伝播することが示唆された。興味深いことに、我々は、社会的な体制で生活するマウスにおいて、同じ株の大腸菌（異なる蛍光マーカーを発現）の侵入と共存を示し、Bacteroides fragilis（Leeら、2013年）のような腸内の他の重要な種で観察される菌株コロニー形成抵抗性が、大腸菌種にはないことを示唆している。

重要なことは、集団の全ゲノム配列決定により、宿主から宿主への細菌感染が蔓延している社会的レジームでは、大腸菌の進化は常に非同義変異と同義変異の比率が高いという特徴を示し、これは適応的ハプロタイプの強い選択による進化を示すが、非社会的レジームではこの現象が少ないことが明らかになったことである。

われわれの細菌伝播の理論モデルでは、宿主間の細菌の移動の結果が、宿主間で共有される進化的事象の数という点で、進化過程に影響を及ぼすと予測した。モデルシミュレーションの結果、マウス間の移動クローン数が十分に大きい場合（≫1）、同居マウスのメタ集団は単一集団として機能し、遺伝的変化は宿主間で共有されることが予測された。一方、移行クローン数が非常に少ない場合、各ホストは独立した集団として行動し、遺伝的進化の共有度は極めて低くなる。実際、大腸菌集団では、社会的条件下で共有された進化的事象（全体的および適応的）の割合が有意に高かった。これらの観察結果は、突然変異プロセスだけでなく、ファージによる進化イベントにも関連している。後者のプロセスを研究することができたのは、マウスのコホートが、侵入菌株に移行可能ないくつかの活性型プロファージを持つ常在性大腸菌でコロニー形成されていたため、腸内で一般的な糖を消費する適応的可能性が付与されたからである（Frazão et al.） 適応的変異過程は、社会的または非社会的体制から分離された両方の侵入者大腸菌集団において、ほとんど同じ生物学的過程、すなわち、プソイドウリジンからのピリミジンヌクレオチドの生産（psuK/fruA変異）とフルクトースセリシンの消費（frlR変異）を標的とした。

ファージは、多くの環境、すなわちマウスやヒトの腸内において、細菌群集の組成と多様性を形成する重要な役割を果たすことが知られている（Kim and Bae 2018; Frazão et al.） ここで我々は、ファージが駆動するHGT事象、すなわちファージNefとKingRacが、以前に観察されたように、侵入者である大腸菌ゲノムに転移したことを観察した（Frazão et al.） このプロセスは、常在菌と侵入菌の両系統とのコロニー形成が起こった場合に限られるものの、社会的または非社会的な条件とは無関係であった。とはいえ、社会的な体制下では、宿主を介した細菌の伝播により、これらの適応的なファージ主導の事象が同居動物全体に広がった。

社会体制下では、進化的事象の総頻度が侵入者集団で有意に高くなり、適応的事象も同様の傾向を示すことがわかった。これはシミュレーション・モデリングでも予測されたことで、細菌伝播のレベルが高いほど、高頻度の突然変異が多く見られた。このことは、非社会的な状況とは異なり、社会的な体制では、高い頻度に達した有益な突然変異は他の宿主に伝播しやすく、ドリフトの障壁を回避しやすいはずであることを示唆している。

伝播中に進化した侵入者集団は、多様化選択の兆候を示さなかった。それどころか、これらの個体群は遺伝的均一性を示し、dN/dS比が上昇していた。本研究により、大腸菌の進化速度は社会的環境でも非社会的環境でも変わらず、平均3.0×10-3（±0.8×10-3 2SE）変異/ゲノム/世代であることも明らかになった。考えられる説明としては、社会的な環境では、大腸菌の伝播により、各動物の適応突然変異の数がより多くなると予想される。集団内を掃引することにより、伝播した適応的突然変異は遺伝的多様性を減少させ、感染したマウスの非適応的突然変異の数を減少させ、非社会的状況と同じ分子進化速度を保ちながら、より高い適応進化（高いdN/dS比）をもたらすと考えられる。

興味深いことに、発見された進化速度は、細菌の宿主間伝播が行われていないin vitroでの先行研究（Good et al.2017）やin vivoでの研究（Frazão et al.2022）で報告されたものと同様である。したがって、以前に提案されたように（Frazão et al. 2022）、大腸菌は時計のような進化の速度に従っているように見えるが、今回のデータは、大腸菌が進化する宿主の社会的背景とは無関係であることを示している。

我々は、細菌に作用する選択圧は宿主の社会的地位に依存し、哺乳類の腸内に定着する細菌の進化史を解析する際には、移動の影響を考慮すべきであると結論付けた。さらに、社会的状況とは対照的に、社会的孤立は精神的情緒的ストレスにつながり、臓器や組織の正常な発達を損ない（Grigoryan et al.2022）、腸内細菌叢を変化させる可能性がある（Donovan et al.2020）。このような宿主の社会的地位に関連する違いは、細菌伝達以外にも選択圧の付加的な層を構成し、腸内細菌の進化の差に寄与している可能性がある。

今回の知見は、腸内細菌叢に侵入する新たな細菌株の進化が宿主の社会的環境に強く影響される可能性があることを示しており、社会的条件と非社会的条件を比較するさらなる実験的進化研究が必要である。

材料と方法
大腸菌クローン
本研究で使用した大腸菌クローンは、Supplementary Materialオンライン版の補足表S1に記載されている。祖先および進化した大腸菌クローンは、ブレイン・ハート・インフュージョン（BHI）またはルリア・ブロス（LB）中、通気下、37℃で培養した。培地は指定された場合、抗生物質を添加した。適切な抗生物質を添加したLB寒天プレートに糞便の1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）希釈液を一晩播種し、蛍光実体顕微鏡（SteREO Lumar、Carl Zeiss社製）を用いて蛍光コロニーをカウントすることによりYFP標識菌数を評価した。

In Vivoでの大腸菌感染および進化実験
マウスはストレプトマイシン（5 g/L）入りの水を24時間飲んだ後、4時間の餌と水の飢餓状態にした。その後、約108コロニー形成単位（CFUs）の侵入大腸菌懸濁液を100μL経口投与した。伝播実験では、CFPまたはYFP蛍光を発現する大腸菌クローンを用いて、動物間での細菌の伝播を評価した。進化実験では、マウスC2を除き、マウスの同腹子A1/A2、B1/B2、C1/C2、G1/G2、H1/H2、およびI1/I2をすべて経口投与し、単一の侵入者大腸菌クローン（YFP）で腸内コロニー形成に成功させた。同じ文字は同腹の動物を表し、1番または2番はそれぞれマウスが社会的または非社会的体制にあることを意味する。大腸菌でコロニー形成された11匹のマウスのうち5匹（A2、B2、G2、H2、I2）は、以前の研究（Frazão et al.） 6～8週齢のC57BL/6J雌マウスを、Instituto Gulbenkian de Ciência（IGC）の動物施設において、特定病原体フリー（SPF）バリア条件下で換気ケージ内で飼育した。実験に使用したマウスの腸内細菌叢は、その動物にとって自然なものであり、無菌動物に決められた微生物叢を導入した結果ではない。糞便ペレットは回収され、後の分析のために-80℃で15％グリセロールに保存された。この研究プロジェクトは、ICGの倫理委員会（ライセンス番号：A009.2010）および実験動物の使用を規制するポルトガルの国家機関（Direção Geral de Alimentação e Veterinária [DGAV]、ライセンス番号：008958）によって倫理的に審査・承認された： 008958). 動物を用いた実験はすべて、飼育、畜産、動物福祉に関するポルトガル法（Decreto-Lei n° 113/2013）および欧州法（Directive 2010/63/EU）に従った。

進化した大腸菌集団の全ゲノム配列決定
汚染を避けるために抗生物質を添加したLBプレートで増殖した大腸菌集団（1,000クローン以上の混合）からDNAを抽出した（40）。DNA濃度と純度は、それぞれQubitとNanoDropを用いて定量した。DNAライブラリーの構築とシークエンシングは、IGC Genomics施設がイルミナプラットフォームを用いて行った。集団あたりの平均カバレッジは200×で、生リードの処理とバリアント解析は既述のように行った（Frazão et al.）

細菌伝播モデル
変異-選択-移動と遺伝的ドリフトのモデルを用いて、マウスの腸にコロニーを形成する大腸菌の集団間で共有される変異のランドスケープに対する細菌伝播の影響を予測した。簡単のため、収容力（N）が等しい2つのデムが存在すると仮定する。個体はそれぞれのデメ内でクローン的に繁殖し、1世代あたりUdの割合で劇症突然変異を獲得し、Uaの割合（通常はUdの1/100；Perfeito et al. 最も単純なモデルでは、劇症突然変異の影響（Sd）と有利突然変異の影響（Sa）は一定であると仮定される。平均SdまたはSaの指数分布から両方の突然変異の効果を取ったフィットネス効果の分布も、定性的な予想の一般性を確立するためにモデル化される。各ディーム内で淘汰が働き、N個の個体がそのフィットネスに従って選ばれる。このモデルでは宿主環境外での突然変異効果のトレードオフを無視し、暗黙のうちに直接接触による伝播を仮定している。移動は選択に従い、移動率mに従ってポアソン数の移動者(Nm)が2つのDem間で交換される。Dem間で共有される適応のレベルを測定するために、ゲノムの各個体の適応部分は有限サイズGと適応突然変異のバイアリルモデルで明示的にモデル化される。したがって、新しい有利な対立遺伝子に向かう突然変異率は1世代あたり1部位あたりUa/Gである。不利な突然変異は無限部位モデルに従うが、これは原理的に有利な突然変異よりもはるかに数が多いからである。

統計解析
線形混合効果モデルを用いて、9日目から27日目までの侵入大腸菌の時間的負荷差を解析した。分散分析（ANOVA）検定は、社会的群と非社会的群における進化速度の比較に用いられた。2つのレジーム（社会性と非社会性）における割合の比較には二項検定を用いた。P < 0.05を統計的有意性とみなした。

補足資料
補足データはMolecular Biology and Evolutionオンライン版で入手可能。

謝辞
Evolutionary Biologyグループの有益な議論に感謝する。また、IGCのRodent Facility、Genomic Facility、Bioinformatics Unitの職員の方々のご協力に感謝する。N.F.は "Fundação para a Ciência e Tecnologia"(FCT)のフェローシップSFRH/BPD/11075/2015の支援を受けた。この研究は、「Programa Operacional Regional Lisboa 2020」のFEEI-"Fundos Europeus Estruturais e de Investimento"、FCTおよびFCTプロジェクトPTDC/BIA-EVL/7546/2020からの国家資金によるプロジェクトGlobal Gut Health Nature Research/Yakult Grant 623877およびONEIDAプロジェクト（LISBOA-01-0145-FEDER-016417）からも支援された。

著者貢献
I.G.とN.F.は本研究を計画し、コーディネートした。N.F.は実験を行った。I.G.はシミュレーションを行った。N.F.とI.G.は結果を分析し、最終承認を得て原稿を執筆した。

データの入手
生シーケンスリードは、bioproject PRJNA930727の名前でsequence read archiveに寄託された。変異-選択-移動と遺伝的ドリフトのモデルのコードは、GitHubプラットフォームで公開されている（https://github.com/isabelgordo/SharedEvolutionSocialMicrobiomes.git）。

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