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発行：2022年5月26日
インターロイキン2のアストロサイト標的遺伝子導入は、脳内常在制御性T細胞数を特異的に増加させ、病的な神経炎症から保護する
リディア・イシイ
エマニュエラ・パスキュート
...
エイドリアン・リストン
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Nature Immunology 23巻878-891ページ（2022年）この記事を引用しています。
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メートル法詳細
アブストラクト
病態を予防し、回復させる免疫調節生物製剤の能力は、最近の臨床診療を一変させました。しかし、神経炎症領域での実用化には、局所的な免疫調節のための有効なターゲットと、血液脳関門を通過できる送達システムの両方が必要である。最近、脳に常在する制御性T（Treg）細胞の小さな集団が同定され、その特徴が明らかにされたことで、そのような治療標的の可能性が示された。我々は、脳内インターロイキン2（IL-2）レベルが、脳内Treg細胞の制限因子であることを明らかにした。アストロサイトへの遺伝子導入法を開発し、低分子のオンスイッチで時間的な制御を可能にし、反応性アストロサイトでの産生を高めて炎症部位への導入を空間的に方向付けることができました。脳特異的IL-2デリバリーを行ったマウスは、外傷性脳損傷、脳卒中、多発性硬化症モデルにおいて、末梢の免疫系に影響を与えることなく、保護されました。これらの結果は、脳特異的IL-2遺伝子導入が神経炎症に対する効果的な保護であることを検証し、神経炎症患者に多様な生物製剤を送達するための汎用的なプラットフォームを提供するものである。
主な内容
急性中枢神経系（CNS）外傷は、45歳未満の死亡および障害の主な原因である1。外傷の原因は様々ですが、共通の最終結果は、患部の神経細胞の実質的な損傷、または神経細胞の喪失です。このことが、患者に典型的に見られる認知機能、感覚運動機能、人格の変化の背景にあると考えられている1。これまで、「神経中心」アプローチを採用した薬物療法は、中枢神経系損傷の治療において顕著な臨床的利益をもたらすことができず1,2、このアプローチが狭すぎることを示している。急性中枢神経系傷害は、中枢神経系に常在する免疫細胞（ミクログリア、アストログリア）と末梢免疫細胞の脳実質への浸潤を伴う多細胞応答を引き起こすと現在認識されている3。CNSの初期反応における免疫活性化の神経保護効果を支持する証拠がある一方で、活性化が長期化すると必ず神経毒性を示すようになる3,4。免疫系の関与により、免疫調節生物学的製剤は重要な治療選択肢として登場した。しかし、神経炎症の臨床領域で免疫調節生物製剤を使用するには、まず、中枢神経系で有効な抗炎症作用を持つ生物製剤の同定と、血液脳関門を通過できる送達システムの開発を並行して行う必要がある。
IL-2は、Treg細胞の生存と増殖をサポートする能力から、高い可能性を持つ免疫調節生物学的製剤である。Treg細胞は強力な免疫調節能力を持ち、血液や二次リンパ系臓器に多く存在し、健康なCNSには少数の集団が存在している5。IL-2補給による循環型Treg細胞の拡大および神経炎症の抑制能力は十分に実証されているが、これらの効果は二次リンパ系器官におけるTreg細胞の機能に起因している可能性がある。例えば、多発性硬化症（MS）の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデル6,7や、脳卒中8,9や外傷性脳損傷（TBI）モデル10などの神経炎症モデルマウスにおいて、全身性のTreg細胞枯渇後に、より深刻な病理が観察される。T細胞が炎症カスケードを引き起こすEAEのような神経炎症性疾患では11、Treg細胞の枯渇は、脳内の組織常在Treg細胞の役割に関係なく、神経病原性T細胞の末梢プライミングと浸潤を促進する。脳卒中やTBIのような傷害による神経炎症においても、一般的に機能評価に用いられる全身性のTreg細胞枯渇は、大量の末梢性炎症12を引き起こし、病的な結果をもたらす可能性がある10．このように、神経炎症病態の制御における、末梢に存在するTreg細胞とは対照的に、中枢神経系に存在するTreg細胞の関与は、依然として不明である。この不明な点は、神経領域におけるIL-2の臨床的有用性における重要な制限の1つであり、全身的な効果とは対照的に、CNSに基づく影響の可能性を定義する必要があることを示している。
全身性IL-2送達とCNSベースのIL-2送達の機能的区別は、神経炎症性疾患におけるあらゆる治療法の利用にとって重要である。CNSの炎症を制御するメカニズムとして、循環Treg細胞の増殖を促進するために全身性のIL-2供給に依存する治療は、並行して全身性の免疫抑制を引き起こすため、臨床で広く採用されることはないだろう。これに対して、CNSに特異的にIL-2を増加させれば、末梢の免疫抑制を引き起こすことなく神経炎症を治療できる可能性がある。我々は、合成生物学的回路を用いて、末梢の免疫系はそのままに、IL-2を局所的に産生させ、CNSベースのIL-2によって神経炎症を高効率で制御することを実証した。さらに、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベースの治療薬送達システムにより、生物学的産生を時間的・空間的に絶妙に制御することができ、脳への生物学的送達の問題に対する解決策を提供する。4つの独立した神経炎症モデルで実証された神経保護作用は、脳特異的IL-2遺伝子導入の臨床利用への明確な道筋を示し、幅広いクラスの神経炎症性疾患や傷害に適した多様な生物製剤の導入のためのプラットフォームとなる可能性を示している。
研究成果
脳内IL-2がTreg細胞の拡大と神経保護を促す
Treg細胞の炎症を防ぐ強力な能力により、IL-2発現の増加（Treg細胞集団を拡大する能力が証明されている13）は、神経炎症性病態の魅力的な治療戦略となっている。末梢臓器において、IL-2の主な供給源は、活性化されたCD4+コンベンショナルT（Tconv）細胞である。Treg細胞と活性化CD4+ T細胞間の負のフィードバックループは、通常、IL-2の供給を制限し、安定したTreg細胞ニッチを形成している14。対照的に、脳では、IL-2レベルは血清の約10倍低く（図1a）、最も一般的なIL-2産生細胞タイプはニューロンである（Extended Data Fig.1）。Treg細胞はIL-2飢餓時にアポトーシスが増加するため13、我々はTreg細胞によるIL-2オートクリン発現のトランスジェニックモデルを用いて、制限因子としてのIL-2を克服することを目指した（図1b）。IL-2サイレンシングを効果的に回避することにより、Foxp3Cre Rosa-IL-2マウスは、末梢Treg細胞数の著しい拡大を示した（図1c）。しかし、注目すべきことに、脳での拡大は起こらない（図1c）。末梢でのIL-2産生増加による拡大効果は、主に、脳に常在するCD69+集団ではなく、循環表現型のTreg細胞で観察された（図1dおよび拡張データ図2a）。これらの結果は、神経炎症性病態を治療するためのIL-2末梢投与が実用的であることを制限するものである。
図1：IL-2の局所発現は、Treg細胞の脳特異的な拡大を促進する。
a, ELISAで検出されたIL-2レベル（各群n = 5） b, IL-2発現のためのトランスジェニックシステムの概略図 c, d, CD4+T細胞内のFoxp3+細胞の頻度（n = 5, 5; c）およびTreg細胞内のCD69+細胞（n = 5, 6; d）。 e, ELISAによって検出したIL-2レベル（n = 11, 8) f, CD4+T細胞内のFoxp3+細胞の頻度 (n = 8, 4, 5). Foxp3+細胞の絶対数。 g, Foxp3とCD25の共発現を示すfの代表的フローサイトメトリープロット。 h, 野生型マウスとαCamKIIIL-2マウスの脳、脾臓、血液をフローサイトメトリーで比較した（n = 4, 3）。 i, 中脳のTreg細胞の表面レンダー画像。3匹のマウス個体サンプルの代表画像を示す。j, 野生型マウスとαCamKIIIL-2マウスの脳をフローサイトメトリーで比較した（n = 4, 4; 64,927 cells plotted）。主要マーカー（CD64、MHCII、PD-L1、CD80、CX3CR1、CD45）で構築したミクログリアのt-distributed stochastic neighbor embedding（t-SNE）。 k、クラスターの定量化。 l、タモキシフェン処理したCD45.2αCamKIIIL-2マウスにパラビオしたCD45.1マウス。パラバイオティックペアの血液および脳におけるCD4+ T細胞集団内のTreg細胞の割合（n = 7）。 m、パラバイオティックペアの脳におけるCD45.1またはCD45.2ドナーからのTreg細胞の割合。a、c-f、hおよびk-mのデータは、平均値±s.e.m.で示されている。統計分析は、対にならない両側スチューデントt検定（dおよびe）、多重検定補正を伴う両側スチューデントt検定（c、hおよびk）、二元分散分析（ANOVA；eおよびm）および一元分散分析（f）で実施した。a、jおよびkを除くすべての実験は、独立して繰り返した（≧2回）。 pTreg、末梢性Treg細胞。
出典データ
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そこで私たちは、脳細胞によるIL-2の異所性発現によって、血液脳関門の不透過性を利用することを試みた。低レベルのIL-2を細胞種特異的に発現させるトランスジェニック発現系を用い、Creドライバーを用いてオリゴデンドロサイトやニューロンでのIL-2発現を活性化することができた（図1b、e）。オリゴデンドロサイトのPLP-Creドライバーは全身にさらなる効果をもたらしたが、神経細胞のαCamKII-CreによるIL-2発現は、Treg細胞の脳特異的な拡大をもたらした（図1f、g）。Treg細胞のFlowSOMクラスタ解析により、野生型脳のTreg細胞と比較して、αCamKIIIL-2脳のTreg細胞は、ナイーブクラスタ（CD26LhiCD44lo）が大幅に枯渇し、複数の居住マーカー（CD69、CD103、ST2およびKLRG1）およびCD25hiCD69+PD-1+クラスタを発現するクラスタで非常に有意に富んでいた（図1hおよび拡張データ図2bおよびc）。CD25とプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の上昇は、IL-2曝露によって誘導されることが知られており15、このことから、常在TLEG細胞が豊富であることが示唆される。イメージングに基づくアプローチでは、血管系を越えてTreg細胞の増加が観察され（図1i、補足図1、補足動画1および2）、脳の広い範囲に分布していた（補足図2）。血管基底膜マーカーであるラミニンα4との共染色でも同様の結果が得られ、αCamKIIIL-2マウスでは冠状切片全体にまばらに分布するTreg細胞数の増加が認められた（補足図3および補足資料1）。フローサイトメトリーでは、評価した脳領域全体でTreg細胞数の増加が観察された（補足図4）。α-2マウスの非トレッグ細胞脳内常在白血球集団では、集団頻度やマーカー発現のシフトが限定的であり、わずかな変化しか観察されなかった（Extended Data Fig.） 単細胞配列決定により、CD4＋T細胞コンパートメント内で、居住Treg細胞クラスターのみが、脳IL-2供給により頻度に影響を受けることが示された（補足図5c）。この数値的な拡大を除けば、Treg細胞集団に主要な転写変化は観察されなかった（補足的な図6）。脳内Treg細胞の拡大は、ニューロンの電気生理学を変化させず（Extended Data Fig.3）、主要な有害な行動変化（Extended Data Fig.4）や過剰死亡率（18ヶ月まで生存率90%に対して対照同腹子は93%；n = 11, 15）を生じさせなかった。
標的集団、すなわちCD4+ T細胞とミクログリア（脳の主要な免疫細胞タイプ）で誘発される転写変化を調べるために、我々はシングルセルシーケンスに目を向けた。バルクCD4+ T細胞とCD11b+ミエロイド細胞を選別し、正規のマーカーの発現に基づいてTreg細胞とミクログリアを同定した（補足図7）。シングルセルシーケンスにより、ミクログリアにおける主要組織適合性複合体クラスII（MHCII）関連遺伝子の発現が増加し、脳内Treg細胞とミクログリア間の相互作用が強化される可能性が確認されたが、それ以外の主要な転写の変化は検出されなかった（補足図7）。MHCIIタンパク質発現の増加はフローサイトメトリーによって検証され、αCamKIIIL-2マウスではミクログリアの約15％がMHCIIを発現し、それ以外のミクログリアは正常で炎症マーカーや活性化マーカーは発現しなかった（図1j、kおよび補足図7）。例外はプログラムデスリガンド1（PD-L1）で、αCamKIIIL-2マウスのミクログリア上で増加し（補足図7）、脳のTreg細胞におけるPD-1発現の増加と一致した（Extended Data Fig.2）。Treg細胞におけるPD-1の関与は、細胞をアポトーシスから保護するため15、これらの相互作用パートナーは、IL-2アップレギュレーション後に観察されたTreg細胞の拡大に寄与している可能性がある。これらの結果は、血液脳関門が介入に有利に働く珍しい例であり、IL-2の脳特異的発現により、末梢Treg細胞への標的外影響なしに、常在Treg細胞集団の局所的拡大がもたらされたことを示している。
我々は以前、脳内常駐型Treg細胞集団を半一過性の移動性集団として特徴付け、播種細胞の大半は数日以内に急速に死滅または離脱するが、約5％は居住表現型を獲得して数週間滞在する5。 脳内送達IL-2は主に、より効率的な播種を可能にするか、既に居住するTreg細胞の選択的拡大（または保持）により機能するかどうかを調べるために、αCamKIIIL-2と野生型マウスとのパラビオースを実行しました。これにより、1つの循環系が2つの脳に供給され、一方（野生型）はIL-2のレベルが正常で限界に達しており、他方（αCamKIIIL-2）はIL-2のレベルが血清のレベルまで上昇しているというシステムを構築した。循環細胞の平衡化後、αCamKIIIL-2マウスは、コントロールやパラバイオティックペアではなく、脳に常在するTreg細胞の増加を示すことがわかった（図1l）。このことは、拡大が補充された脳ニッチに限定され、循環因子を介して伝達されないことを示している。第二に、野生型脳とαCamKIIIL-2脳の両方で、脳内常在Treg細胞集団は、ホストとドナーのTreg細胞と同等の表現をしていた（図1m）。これらの結果から、脳特異的なIL-2レベルが、末梢系とは機能的に異なるニッチとして、流入するTreg細胞の集団動態を制御する制限因子であることが示された。
脳と末梢のTreg細胞集団が区画化されたIL-2ニッチに依存していることを確認した我々は、次に、脳のIL-2を補充することで神経炎症主導の病態を緩和できるかどうかを調べようとした。IL-2およびTreg細胞療法は他の文脈で報告されているが16,17,18,19、これらのアプローチは全身のTreg細胞集団を拡大し、したがって観察された効果はCNS局所効果に明確に帰することはできない。IL-2の脳特異的な補充が、全身的な免疫抑制とは無関係に神経傷害に影響を及ぼすかどうかを検証するために、我々は、急性傷害を与えるためにTBIの制御皮質衝撃モデルを使用した。野生型マウスでは、この傷害は通常、傷害の14日後に広範囲の炎症媒介性神経変性をもたらす（補足図8）。一方、αCamKIIIL-2マウスは、損傷部位の損傷に対して高い保護効果を示し（図2a）、病変サイズが縮小し、神経組織の一部が保存された（図2b、c）。微小グリオーシスは、TBI後の大脳皮質では観察されなかったが、αCamKIIIL-2マウスでは、TBI後の線条体でIba1強度の増加が見られた（図2d）。アストログリオーシスはマウスの遺伝子型に影響されなかった（図2e）。αCamKIIIL-2マウスでは解剖学的に部分的に保存されているにもかかわらず、脳内の白血球流入は、TBI前にすでに存在していたTreg細胞頻度の増加を除けば、比較的変化しなかった（図2f、gおよび補足図9）。これらの結果は、脳局所特異的IL-2産生が神経炎症誘発性病態の強力な抑制因子であることの原理を証明するものである。
図2：IL-2の脳特異的発現による神経炎症からの保護。
a, 対照同腹子およびαCamKIIIL-2マウスを6週目にタモキシフェン処理し、12週目に中等度TBIを誘発する制御皮質衝撃を与えた。マウスはTBIの15日後に検査した（n＝3、3）。損傷部位の脳表面の損傷を示す代表的な写真。矢印は、衝撃を受けた部位。スケールバー、0.5cm。 b、皮質衝撃の14日後の皮質組織の代表的な免疫蛍光染色。GFAP（アストロサイト）、NeuN（ニューロン）、DAPI（核）。スケールバー、50μm。 c, 半球全体に対する割合で示した病変領域（n = 3, 3）。 d,e, 皮質および線条体におけるIba1（d）およびGFAP（e）の相対発現レベル（同側半球と対側半球における発現比；n = 4, 4）。 f, TBI誘発した野生型およびCamKIIIL-2マウスの脳灌流の高次元フローサイトメトリによりTBI後15日に比較（n = 4, 4）。CD45+CD11b-細胞内のCD4+、CD8+およびγδ（ガンマデルタ）T細胞の頻度。 g、野生型およびαCamKIIIL-2マウスからのTBI誘発灌流脳を、TBI前、またはTBI後15日目に高次元フローサイトメトリによって比較した（1群あたりn = 4）。CD4＋T 細胞内の Treg 細胞の頻度（左）および Treg 細胞の絶対数（右）。c-gのデータは、平均±s.e.m.として示される。データは、個々の生物学的複製物、1群あたりn＝3または4匹のマウスとして示される。統計解析は、対にならない両側スチューデントt-テストまたは一元配置分散分析（g）を用いて行った。
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デュアルロックIL-2システムが脳内Treg細胞の拡大を促進する
次に、このトランスジェニックシステムを、臨床的な可能性を秘めた遺伝子デリバリーアプローチに応用することを目指した。IL-2マイクロターゲットの生物学的特性を向上させ、かつ神経細胞をターゲットとしないようにするため、IL-2の発現をGFAPプロモーターを用いてアストロサイトに移行させた。GFAPを介したIL-2発現には、いくつかの理論的利点がある。（1）アストロサイトは効率的な分泌細胞で、脳内に広く分布している。（2）TBIのような神経炎症イベントでは、局所的にアストログリオシスが起こる（図3a）。（3）アストログリオシス時にはGFAPプロモーターがより活発になり、脳の炎症領域に貨物生産が集中する。（図3b）。アストロサイトを発現系として活用するために、我々は、アストロサイトで広く強固な発現を駆動することができる改変GFAPプロモーターと組み合わせたAAV-PHP.Bを用いたIL-2の「デュアルロック」送達系を設計しました（図3c）。このシステムは、PHP.Bカプシドを全身に投与した場合に見られる中枢神経系（脳と脊髄）への遺伝子送達の向上20,21と、アストロサイト（GFAP）に限定された改変型内因性プロモーターを使用するという二次特異性を兼ね備えており、（周辺）標的外導入によりカーゴ発現が促進されないようにする。この「デュアルロック」システムにより、アストロサイト主導のカーゴ発現が実現しました。AAV-PHP.B.GFAP-GFP (PHP.GFAP-GFP; 図3c)を用いた緑色蛍光タンパク質（GFP）発現により評価しました。S100β+GFAP+およびS100β+GFAP-皮質アストロサイトの両方がトランスジーンを発現することができ、ニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトまたはNG2+細胞との共同発現は限られていた（図3c、d）。カーゴの発現上昇は、TBI衝撃部位の周辺で観察され（図3e）、内因性プロモーター活性（図3b）で見られたアップレギュレーションが、ベクター中の外因性GFAPプロモーター（図3b）によって忠実に再現されたことが実証された（図3b）。
図3：デュアルロック遺伝子導入システムによる脳への合成送達。
a, 野生型マウスに制御された皮質衝撃を与えて中等度のTBIを誘発し、TBI後1、2、3および7dで検査した（n = 5）。Aldh1l1免疫染色で確認した、病変部に隣接する皮質（黄色で描画）または対応する対側皮質領域におけるアストロサイトのカバー率の代表画像（左）と定量化（右）（n = 3）。スケールバー、100 µm。統計解析は、多重検定補正を伴うt検定を用いて行った。 b, TBI14日後の大脳皮質（黄色）および線条体（青色）におけるGFAPの代表染色（左）および定量化発現（右）（n = 5）。c, GFAPプロモーターは、特徴的な細胞形態とアストロサイト特異的マーカーであるGFAPとS100βの免疫染色に基づいて、成体マウス脳のアストロサイトに遺伝子発現（GFPスコアリングで評価）を制限していることがわかる。NeuN（ニューロン）、APC（オリゴデンドロサイト）、PDGFRα（NG2+細胞）、Iba1（ミクログリア）のカウンターステインを行った場合、標的外発現は検出されなかった。スケールバー、20 µm。データは、PHP.GFAP-GFP（コントロール）ベクターを投与した少なくとも3匹のマウスの3枚のスライスの代表値。 d, PHP.GFAP-GFP処理マウスにおけるGFPと細胞系列マーカーの共焦点の定量化。 e, 野生型マウスに中程度のTBIを誘発する制御皮質衝撃を与え、PHP.GFAP-GFPで処理して処理後14日目に検査した。衝撃部位を囲む同側領域または対応する対側皮質領域におけるGFP産生の代表画像。スケールバー、100 µm。a、b、dのデータは平均値±s.e.m.で示す。統計解析は、多重比較検定付きの対にならない両側スチューデントのt検定を用いて行った。 a.u., 任意単位.
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AAV-PHP.B.GFAPシステムによる脳特異的な発現を検証した後、IL-2の送達に応用できるかどうかを検討した。AAV-PHP.B.GFAP-IL-2（PHP.GFAP-IL-2）送達を用いると、14日間にわたり、脳のIL-2生産が3倍増加した（図4a）（図4b）ことが確認されました。脳内IL-2濃度の増加は、脳内Treg細胞の頻度（図4c）および絶対数の増加（図4d）と並行していた。脳内Treg細胞の増加は、表在性または深在性頸部リンパ節では観察されなかったが（拡張データ図5a〜d）、梨状体では反映された（拡張データ図5e，f）。Treg細胞集団の拡大は用量依存的であり（図4e,f）、脳に限定され、血液、脾臓または他の末梢組織におけるTreg細胞の拡大はなかった（図4gおよび拡張データ図5g,h）。拡大したTreg細胞は、CD69+住宅表現型であり（図4h）、血管系を超えた脳組織で観察された（図4i、補足図10、補足動画3および4）。決定的なことは、末梢のTreg細胞の拡大（図4h）または脳内の非Treg細胞の集団サイズおよび表現型（補足図11）のいずれかに関して、主要なオフターゲット効果は観察されなかったことである。PHP.GFAP-IL-2治療は忍容性が高く、300日以上のモニタリングを通じて過剰な死亡率は見られなかった（n = 14）。神経細胞機能（電気生理学的測定）およびアストロサイト機能（Ca2+イメージング）はいずれもPHP.GFAP-IL-2処理によって影響を受けず（拡張データ図6）、処理したマウスに行動異常は観察されなかった（拡張データ図7）。血液脳関門は、遺伝子導入後も組織的および機能的に無傷であった（Extended Data Fig.8）。PHP.CamKII-IL-2処理後、神経細胞由来のIL-2でも同程度のTreg細胞拡大が観察され（拡張データ図9）、IL-2のTreg細胞拡大に対するソース非依存的な効果が示された。したがって、PHP.GFAP-IL-2による二重ロック法は、神経炎症性病態の治療に望まれる主要な特性、すなわち、脳におけるIL-2産生の増加、迅速かつ持続的な効果、および免疫抑制の汎化を避けるために作用部位が限定されていることを併せ持っています。
図4：IL-2の脳へのデュアルロック送達は、局所Treg細胞を拡大する。
a, PHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処理した14日後の野生型マウスの脳でELISAにより検出したIL-2レベル（n = 6, 11）b, PHP.GFAP-IL-2で処理したマウス（n = 10, 9, 5, 9, 5, 4, 5 and 8）脳でのIL-2レベルの時間的変化。c,d, PHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処理したマウスの脳におけるCD4+ T細胞の割合（c）または絶対数（d）として、Treg細胞拡大の時間経過（n = 4, 9） e, 野生型マウスに1 × 109 (n = 3, 5), 1 × 1010 (n = 3, 5) または 1 × 1011 (n = 3, 4) ベクターゲノム（総量）を投与した、 PHP.GFAP-GFP または PHP. GFAP-IL-2を静脈注射し、投与14日後の灌流脳における従来のT細胞（左）およびTreg細胞（右）の頻度（e）または絶対数（f）を評価した（1 × 109および1 × 1010群はn＝3、5、1 × 1011群はn＝3、4）。 g、血液、脾臓および灌流マウス脳からPHP.GFAP-GFP-およびPHP. GFAP-IL-2処理マウスを、Treg細胞数について高次元フローサイトメトリーで比較した（n = 7, 5 blood; n = 12, 11 spleen and brain）。 h, perfused brainからの主要マーカー（CD4, CD8, Foxp3, CD62L, CD44, CD103, CD69, CD25, PD-1, Nrp1, ICOS, KLRG1, ST2, Ki67, Helios およびCTLA4）で構築したCD45+CD11b-CD19-CD3+ T細胞のt-SNE。色は注釈付きFlowSOMクラスターを示し、結果は棒グラフで定量化されている（n = 3, 5）。平均値±s.e.m. i, PHP.GFAP-GFPおよびPHP.GFAP-IL-2処理マウスの中脳におけるTreg細胞の代表画像（表面レンダリング共焦点切片）である。3匹の個々のマウスサンプルの代表画像を示す。スケールバー、10μm。a-hのデータは平均値±s.e.m.で示す。すべての実験は独立して繰り返した（≥2回）。統計解析は、非対称の両側スチューデントt検定（aおよびh）、ダネットの多重比較検定付き一元配置分散分析（b）またはボンフェローニ補正付き二元配置分散分析（c〜g）を用いて行った。
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IL-2デリバリーにより神経炎症からの保護が得られる
二重ロックPHP.GFAP-IL-2の治療効果を検証するため、対照のPHP.B（GFPをコード）またはPHP.GFAP-IL-2でマウスを処理し、TBIに曝露した。強い保護効果は、組織学（図5b,c）および磁気共鳴画像法（MRI；図5d）によって示されるように、受傷後14日目に皮質組織の損失が減少し、総形態学レベル（図5a）で明らかであった。PHP.GFAP-IL-2処理マウスの損傷した大脳皮質では、アストログリオシスが有意に減少していた（図5e）。神経保護効果は行動レベルでも観察され、TBI後のマウスのモリス水迷路および新規物体認識行動テストにおける成績不良は、PHP.GFAP-IL-2投与マウスでは完全に逆転した（図5f-h）。これらの結果は、合成IL-2送達の神経保護能を検証するものである。
図5：IL-2の脳への遺伝子送達は、外傷性脳損傷時の神経学的損傷を効果的に防止する。
a, PHP.GFAP-IL-2（-14日目）またはPHP.GFAP-GFPコントロールで処理した野生型マウスに、制御された皮質衝撃を与えて中程度のTBIを誘発し、TBI後14日目に検査した（n = 5, 6）。脳表面の代表的な断層写真。スケールバー、0.5cm。 b、TBIの14日後の皮質組織の代表的な免疫蛍光染色（n = 5, 6）。NeuN（神経細胞）、BrdU（増殖）、DAPI（核）。c. -14日目にPHP.GFAP-IL-2またはコントロールベクターで処理した野生型マウス（左）（n = 9, 10）、またはPHP.GFAP-IL-2で処理したRag1ノックアウト（KO）マウス（右）におけるTBI14日後の皮質欠損面積の定量化（右）。 d、TBI後1、7、14、35、150日目にPHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処置したマウスにおける病変サイズの代表MRIおよびMRIベースの定量化（コントロールn = 16、16、12、11、10； IL-2 n = 16、16、16、12、9）。e,大脳皮質と線条体におけるIba1とGFAPの相対的発現量（同側半球と対側半球における発現量の比；n = 5, 6）。 f,獲得学習中のモリス水迷路テストにおいて、PHP.GFAP-GFP処理マウスとPHP.GFAP-IL-2処理マウスでTBIあり・なし（偽）の場合に隠れたプラットフォームを見つけるまでの時間。P値はTBI PHP.GFAP-GFPとTBI PHP.GFAP-IL-2の比較（n = 12, 12）。 g, 探索試験中に標的象限に費やした総時間の割合（n = 12, 12）。 h, 新規物体認識パラダイム2日目に古い物体より新規物体を探索した時間の割合（n = 10, 12, 12, 12）。i, PHP.GFAP-GFPコントロールまたはPHP.GFAP-IL-2で処理したマウス（-14日目）に制御された皮質衝撃を与え、TBIの15日後に調べた（n = 3, 4, 4）；偽TBIはPHP.GFAP-GFP群に含まれた。偽マウス、TBIおよびPHP.GFAP-IL-2処理TBIマウスの脳を、CD4+ T細胞の割合としてのTreg細胞の頻度について、フローサイトメトリーで比較した。c-iのデータは平均値±s.e.m.として示され、すべての実験は独立して繰り返された（≧2回）。統計分析は、ノンパラメトリックのMann-Whitney Uテスト（cおよびe）、偶然レベルに対する一元配置分散分析（i）（gおよびh）または二元配置分散分析（c、fおよびd）を用いて実施した。
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作用機序を検証するために、まず適応免疫の欠損したRag1ノックアウトマウスにTBIとPHP.GFAP-IL-2処理を施した。TBIを受けた野生型マウスと比較して、TBI後のRag1ノックアウトマウスの病変は一般に小さく（図5c）、TBIの病態における適応免疫の一部の役割と一致した。PHP.GFAP-IL-2を投与した場合、Rag1-knockoutマウスは脳を標的としたIL-2発現による有益な効果を示さなかった（図5c）。これらの結果は、神経細胞やグリア細胞への直接作用に基づくIL-2作用のメカニズムを正式に除外するものである。しかし、この効果は、アンフィレグリン産生の増強を伴う脳内Treg細胞（図5i）の増加（補足図12）以外には、炎症性流入（補足図12）にほとんど変化が見られなかったことから、局所環境の改変を介したものと考えられる。処理によりミクログリオシスの形成が抑制され、PHP.GFAP-IL-2処理マウスではTBI後のミクログリアの増加が抑制された（補足図12a）。そこで、TBIまたは偽手術を施した治療マウスと対照マウスのT細胞およびミクログリアのシングルセル・トランスクリプトーム解析を行った。同定されたT細胞クラスター（拡張データ図10）の中で、頻度にシフトが見られる唯一の集団はTreg細胞であり、PHP.GFAP-IL-2処理マウスでは、偽薬およびTBI動物の両方で増加した（図6a）。拡大したTreg細胞のトランスクリプトームはほぼ保存されており、IL-2受容体成分や抗アポトーシス遺伝子Bcl2が増加していた（図6b）ことから、固有のエフェクター分子のアップレギュレーションではなく、数の増加による有効性が示唆された。ミクログリアは、恒常性ミクログリアと活性化ミクログリアの2つのスーパークラスタに分類された（図6c、dおよび拡張データ図10）。活性化したミクログリアはTBI後に急激に増加したが、活性化した状態のミクログリアの割合は、IL-2処理マウスとコントロールマウスで同等であった（図6e）。IL-2処理した活性化ミクログリアでは、MHCIIをコードする遺伝子のアップレギュレーションが顕著な転写変化として観察された（図6fおよび拡張データ図10）。注目すべきは、IL-2処理したマウスのMHCIIhiミクログリアは、活性化ミクログリアクラスター内で異なるサブクラスターを形成していたことである（図6c、d）。主な活性化サブクラスターが古典的な疾患関連ミクログリア（DAM）転写プロファイル22を発現する一方で、MHCIIhiサブクラスターは炎症性メディエーターの発現量が低かった（図6gおよび拡張データ図10）。IL-2投与は、活性化したミクログリアが古典的なDAM表現型から離れ、非典型的なMHCIIhi表現型に偏ることと関連していた（図6e）。MHCIIhiミクログリアは病変の境界部に集積しており（図6h）、このユニークな集団は神経毒性の炎症に対する緩衝材として機能すると考えられる。
図6：IL-2の脳内投与は、TBIの際にミクログリアの転写分岐を促進する。
a-h, -14日目にPHP.GFAP-IL-2（またはPHP.GFAP-GFPコントロールベクター）で処理した野生型マウスに、中等度のTBIを誘発するために制御された皮質衝撃を与えるか偽手術を行った。TBIの14日後、T細胞とミクログリアを灌流した脳の同側半球から選別し、10倍のシングルセル・トランスクリプトミクスを行った。 a、T細胞は、Extended Data Fig. 10a、bで定義したマーカーに基づいて、クラスター化し注釈を付けた。b、PHP.GFAP-GFP処理マウスとPHP.GFAP-IL-2処理マウスのTreg細胞クラスターにおける遺伝子発現の差を示すボルケーノプロット（偽薬群およびTBI群）。c, 各治療群におけるクラスターごとの細胞の位置を示すミクログリア均一多様体近似投影（UMAP）表現。 d, ApoeおよびH2-Eb1の発現に基づくクラスター注釈。追加の炎症マーカーの発現は、拡張データ図10eに示す。e,恒常性ミクログリアクラスターと活性化ミクログリアクラスターの定量化、および活性化ミクログリアクラスター内でのDAMおよびMHCIIhiサブクラスターの相対的寄与。 f,活性化ミクログリアクラスターの遺伝子発現がPHP間で異なることを示すVolcano plot。 g, DAMとMHCIIhiのサブクラスターについて、治療群に依存しない遺伝子発現の差を示すボルケーノプロット。 h, TBI後14日目の皮質組織の代表的な免疫蛍光染色（n = 5, 6）。NeuN、MHCII、DAPI、Iba1。スケールバー、50μm。aおよびeのデータは平均値±s.d.で示す；TBIは1群あたりn = 3、偽薬は1群あたりn = 1。統計解析は、対にならない両側スチューデントt検定（aおよびe）を用いて行い、ボルケーノプロットでは、差分発現の負の二項検定を用いた（b、fおよびg）。
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デュアルロックシステムの汎用性を検証するため、これらの知見を他の神経炎症性病態に拡張しました。虚血性脳卒中のマウスモデルをテストした。遠位中大脳動脈閉塞術（dMCAO）を施行する前にPHP.GFAP-IL-2で前処置を行ったマウスを用いた。対照マウスと比較して、PHP.GFAP-IL-2投与マウスは巨視的に小さな病変を生じ（図7a）、14日目の組織学的病変サイズは〜50％減少し（図7b）、誘導後1〜14日目にMRIで検出される病変サイズの減少を示した（図7c）。光血栓性脳卒中モデルでは、PHP.GFAP-IL-2で前処理したマウスは、巨視的損傷の減少を示し（図7d）、瘢痕組織と虚血組織の識別を組み合わせて定量化した梗塞サイズの〜30％減少を示した（図7e）。dMCAOモデル（補足図13）および光血栓モデル（補足図14）の両方で、免疫学的コンパートメントの分析により、損傷後の脳内のT細胞（CD4+、CD8+およびTreg細胞）数の増加が示されたが、治療による目立った追加効果はなかった。次に、MSのEAEモデルに目を向けました。マウスの前処理を利用して、PHP.GFAP-IL-2を投与したところ、MOGモデルにおいて、発症率の低下、臨床経過時間の短縮、累積臨床スコアの低下が認められました（図7f）。脳卒中モデルと同様に、脳の免疫学的組成は、抗炎症性サイトカインの産生の上昇が観察されたものの、存在するTreg細胞の数を含め、評価した時点ではほとんど変化しなかった（補足図15）。脳卒中とEAEの両方で、PHP.GFAP-IL-2初回投与から4週間以上経過した時点で、コントロールマウスと治療マウスで脳常在Treg細胞が平衡化していることから、1回のAAV投与で最大限の効果が持続するか、治療由来のTreg細胞の増加を病態由来のTreg細胞が不明瞭にする交絡効果のいずれかが示唆される。さらに、これらのモデルでは、終末期にTreg細胞が正常化したにもかかわらず、有効性が観察されたことから、主要な効果が疾患の初期段階で実施されたか、ミクログリアなどの局所集団の免疫調節がTreg細胞数の上昇期を越えて拡大することが示唆されます。
図7：複数の神経炎症性病態におけるデュアルロックIL-2遺伝子導入の神経保護的有用性。
a, -14日目に対照のPHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処置した野生型マウスにdMCAO脳卒中を与え、脳卒中の15日後に、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）補助定量化（n = 7, 10; b）および縦MRIベース定量化（n = 11, 17; c）でマクロな損傷（破線で囲んだ）に関して検査した. d,e, Control PHPで処置した野生型マウス. GFAP-GFP または PHP.GFAP-IL-2 で -14 日目に処理した野生型マウス（n = 5, 5）に光血栓性脳梗塞を発症させ、脳梗塞 1 日後に巨視的損傷（代表画像、病変の輪郭あり；d）および TTC による脳梗塞損傷の定量化（e）。 f, EAE は、コントロールベクター (PHP.GFAP-GFP) または PHP.GFAP-IL-2 で -14 日目に処理し（n = 15, 14）、野生型マウスに誘導した。発生率、毎日の臨床スコア（平均±s.e.m.）および累積平均臨床スコア。すべての実験は独立して繰り返した（≧2回）。統計解析は、対にならない両側スチューデントt検定（bおよびe）、対にならないノンパラメトリックマンホイットニーU検定（f）、または二元配置ANOVA（fおよびc）を用いて実施した。
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このアプローチのトランスレーショナルな可能性を調べるために、PHP.GFAP-IL-2治療を治癒的な文脈でテストしました。まず、制御された皮質衝撃モデルを用い、PHP.GFAP-IL-2の前処理により、発達した病変の大きさが減少した（図5b、c）。治療的なアプローチとして、まずマウスにTBIを施し、損傷後にPHP.GFAP-IL-2で治療しました。予防的アプローチと同様に、治療的アプローチでは、コントロール処理したマウスで観察されたものに比べて、発症した病変の大きさが減少した（図8a）。しかし、脳卒中では、脳卒中誘発後にPHP.GFAP-IL-2を治療的に投与しても、dMCAOモデル（図8b）および光血栓モデル（図8c）のいずれにおいても、結果として生じる病変の大きさは減少しませんでした。このことは、IL-2産生の不利な動態が、脳卒中後に起こる急速な損傷に有効でないことを示唆している。そこで、二次脳梗塞のモデルを開発した。片方の半球に光血栓性脳梗塞を誘発し、マウスをPHP.GFAP-IL-2またはコントロールで治療し、14日後に反対側の半球に光血栓性脳梗塞を誘発した。このとき、一次脳梗塞の後にIL-2を投与すると、二次脳梗塞の病変サイズが有意に縮小した（図8d）。MSについては、再びEAEモデルを用いたが、マウスが臨床症状を呈するまで待ってから、対照のPHP.BまたはPHP.GFAP-IL-2で処理した。驚くべきことに、PHP.GFAP-IL-2の保護効果は依然として観察され、15日目までに臨床的時間経過が分離し、累積臨床スコアが急激に減少した（図8e）。
図8：複数の神経炎症性病態に渡るデュアルロックIL-2遺伝子デリバリーの神経保護的有用性。
a、マウスにTBIを施し、その後PHP.GFAP-IL-2またはPHP.GFAP-GFPで処理し、TBIの14日後に調べた（n = 9、9）。b, マウスにdMCAO脳卒中を与え、PHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処理し、TTCを用いた定量化のために脳卒中後15dに検査した（n = 11, 13）。c, マウスに光血栓性脳梗塞を与え、PHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処理し、TTC補助定量化のために脳梗塞後1d（n = 4, 4）または14d（n = 6,5） を調べた。 d, 2次脳卒中のTTC補助定量化（n = 17, 17). e、野生型マウスにEAEを誘導し、誘導の10日後に、マウスをPHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処置した（n = 18, 19；青矢印）：発生率、毎日の臨床スコア、累積平均臨床スコア（n = 15, 14）. f, PHP.TetO-IL-2.GFAP-rtTAのデザイン。 g, 野生型マウスにコントロールベクターまたはPHP.TetO-IL-2.GFAP-rtTAを投与し、PBSまたはミノサイクリンでギャバリングした。脳内Treg細胞の数は、処置の11日後に評価した（n＝5、5、4）。追加群は、ミノサイクリン中止の1週間後に評価した（n＝6、4）。 h、脳内のCD8＋T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞およびCD4＋Tconv細胞の頻度（各群n＝5）。 i、野生型マウスにTBIを行い、その後コントロールベクターを行った。j, 野生型マウスにTBIを行い、その後PHP.TetO-IL-2.GFAP-rtTAで処理し、ミノサイクリンの併用または非併用を行った。k,マウスにdMCAO脳梗塞を与え、コントロールベクター＋ミノサイクリン、またはミノサイクリンなしまたはミノサイクリンありのPHP.TetO-IL-2.GFAP-rtTAで処理した。l、野生型マウスにEAEを誘導し、誘導後10日目にPHP.TetO-GFP.GFAP-rtTAまたはPHP.TetO-IL-2.GFAP-rtTAを、ミノサイクリンありまたはなしで処理した（グループあたりn = 10）。発症率、日々の臨床スコア、累積平均臨床スコアを示す。データは平均値±s.e.m.であり、すべての実験は独立して繰り返された（≧2回）。統計分析は、対にならない両側スチューデントt検定（a、dおよびj）、対にならないノンパラメトリックマンホイットニーU検定（eおよびi）またはTukeyの検定による二元配置ANOVA（g）を用いて実施した。
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脳特異的なIL-2送達システムの開発により、臨床的な神経炎症の文脈で使用される可能性がある。しかし、臨床への応用には、投与量の変更と中止が可能であることが必要である。このような臨床的に望ましい機能を追加するために、我々は「Tet-On」システムを通じて3層目の制御を加えた。このシステムでは、IL-2の発現はTetO依存性プロモーターの制御下でシフトし、rtTA活性化因子はGFAPプロモーターによって制御された（図8f）。血液脳関門透過性薬剤であるミノサイクリンに応答できるように、改良されたrtTAが使用された23。この「トリプルロック」AAVは、デュアルロックシステムと同様にTreg細胞の脳特異的な拡大をもたらしたが、ミノサイクリンの存在下においてのみであった（図8g）。脳に存在する他の主要な白血球集団は、頻度に影響を受けなかった（図8h）。ミノサイクリンの中止後、脳のTreg細胞数は1週間以内にベースラインレベルに戻った（図8g）。このトリプルロックシステムを疾患文脈で検証するために、まずTBIを用いた。ミノサイクリン単独では病変の大きさは変化しなかったが（図8i）、トリプルロックとミノサイクリンの組み合わせによる治療を受傷後に行うと、結果として生じる病変の大きさが大幅に減少した（図8j）。一方、脳梗塞では、この治療法は病変の大きさを変化させず、病態の速度論とは相容れないことを裏付けている（図8k）。最後に、EAEでは、トリプルロックシステムとミノサイクリン治療を組み合わせて、病気の症状が出た後に投与すると、症状の停滞が早くなり、累積病変も少なくなりました（図8l）。これらの結果から、脳内IL-2発現を制限するトリプルロック遺伝子導入システムは、有効性と用量制御という臨床的に重要な要件を兼ね備えていることが確認された。
考察
我々は、脳特異的IL-2が神経保護剤として有用であることを実証し、臨床応用に適したデリバリープラットフォームを開発した。遺伝子導入により、脳内IL-2濃度が上昇し、その後、常在Treg細胞頻度が遅れて上昇することがわかり、EAEにおける治療後の臨床経過への影響と一致している。脳卒中では、現在の治療法が脳卒中後3時間を超えると急激に効果を失うため24、IL-2の遅れは、傷害前の保護体制と傷害後の効果のない治療との間の格差の原因となりうる。IL-2が介在する保護機構は、直接的、間接的の両方が考えられるが、最も単純な説明は、IL-2が局所Treg細胞集団を拡大する能力を持っていることである。脳はTreg細胞にとって比較的IL-2不足の環境を提供し、この状態はアポトーシスを誘発し、集団のサイズを制限することが知られている13。TBIとPHP.GFAP-IL-2を投与したRag欠損マウスで実証されたように、IL-2治療が適応免疫系の存在に依存していることは、脳内投与IL-2の神経保護効果の主要な媒介者がTreg細胞であることと一致する。しかしながら、神経原性IL-2が、少なくとも部分的には、他の細胞タイプへの作用を通じて機能する可能性を否定するものではない。代替メカニズムが特定されていない一方で、脳内Treg細胞の頻度と治療効果の間に厳密な一致がないことに注意することが重要である。各神経炎症モデルにおいて、評価した時点では、病態に起因する免疫変化が、治療に起因する免疫変化を上回っている。しかし、病態の変化と臨床進行への影響は、必ずしも時間的に連動していないことを考慮することも重要である。したがって、疾患や傷害の初期に一過性の脳内Treg細胞増加のパルスが、治療効果が洗い流された時点で、長期にわたる病態の改善を促すかもしれない。
IL-2の非正規的な効果の可能性を除外することなく、脳内Treg細胞の拡大は、局所的な免疫調節のための機能的にダイナミックなメディエータを提供する。Treg細胞は、複数の抗炎症剤を産生する能力があり、その多くは、神経炎症の治療に臨床で使用されている25。また、Treg細胞は、直接的な免疫抑制の役割を超えて、重要な修復機能を有している7,26。Treg細胞集団を拡大するためにIL-2を使用することは、理想的な免疫抑制メディエーターを特定する問題を回避し、代わりに、局所的な微小環境の合図を感知して反応することができるTreg細胞の適応的な特性を利用することができる。しかし、局所的に増殖しても脳内に存在するTreg細胞の数が少ないことから、より一般的な細胞種が効果増幅器として必要である可能性が高い。ミクログリアは、その転写プロファイルが治療によって大きく変化することから、この推定される中間体として魅力的な候補である。特に、TBIマウスをコントロールした活性化ミクログリアは、古典的な炎症性転写プロファイルを獲得したが、IL-2処理マウスの活性化ミクログリアのかなりのサブセットは、炎症性マーカーを追加せずに、MHCII発現を急激に上昇させた。この発現量の増加は、傷害の境界に沿った局在と相関しており、拡大する神経毒性領域に対する緩衝材としての潜在的な機能を示していた。MHCIIのアップレギュレーションと炎症マーカー発現の抑制との関連は興味深いものである。ミクログリアにおけるMHCIIの早期発現は、傷ついたCNSの保護と修復の強化に以前から関連していた27,28。MHCIIの発現は、ミクログリアとTreg間の直接的な同族間相互作用の能力向上を示し、複数の抗炎症メディエーターの局所産生を増加させる可能性がある。あるいは、MHCIIのシャペロンであるCd74は、我々の系では非常に発現が高く、ミクログリアの炎症性分極を直接阻害している29。DAMコンパートメントでは、IL-2投与により、TBIや他の神経炎症性疾患の治療薬として提案されている抗炎症性Spp1（オステオポンチン）30の発現量も増加した31．しかし、Treg細胞の多能性機能は、複雑な相乗効果をもたらすため、単一の分子メディエーターによる単純化されたモデルには注意が必要である。
IL-2は生物学的に強力であるにもかかわらず、治療薬への組み入れは遅々として進んでいない。半減期が15分と短いため、常に投与するか、大量に投与する必要があり、その結果、生物学的標的が変化する（血液脳関門への直接作用を含む32）。AAVを介したIL-2の全身投与も含め、神経炎症性疾患や神経変性疾患を遅らせるIL-2の能力が原理証明研究によって実証されている17,18,19（文献16）。しかし、グローバルな免疫抑制は、特に感染症に対する感受性が高い患者において、神経炎症性疾患と戦うための実行可能な戦略ではない33。局所的なIL-2産生は、全身的なIL-2投与がもたらす好ましくない結果を回避する、代替的なアプローチを提供する。
ここでは、健康な脳ではニューロンがIL-2の主要な供給源であるという観察に基づき、概念実証の段階でαCamKII+ニューロンを局所IL-2産生の供給源として使用した34．しかし、治療環境においては、アストロサイトは、その非常に効率的な分泌システム35によって促進され、送達源として優れた特性を有する可能性がある。さらに、アストロサイトの末端は、脳内T細胞が集中する血管系ゾーンに近接しているという利点もある5。神経傷害や疾患の病態生理にアストロサイトが関与していることは、生物学的増幅プロセスとして機能する可能性がある。反応性グリオーシスは、分子レベルではあまり理解されていないが、未解決の場合、神経細胞の減少に伴い、大きく劇的に変化するように見える36。しかし、今回の目的では、GFAPプロモーターのアップレギュレーションとアストログリオシスが、反応性アストログリオシスの領域付近にIL-2産生を集中させるのに役立った。したがって、このシステムは、神経損傷の分子シグネチャーを利用して、治療反応を増幅し、解剖学的に方向づけるという、天然の「レオスタット」の特徴を備えているのである。
今回開発・検証されたトリプルロックIL-2システムのような遺伝子導入システムには、高い可能性がある。初期の失敗によりAAVベースのシステムの臨床導入は遅れたが、優れた安全性プロファイルを持つ改良型ベクターは、脊髄性筋萎縮症に対するZolgensma（onasemnogene abeparvovec、静脈内投与）など、規制当局の承認を得ており37、他のCNS疾患も集中的に調査中38。AAVベースのベクターは、分裂している細胞と分裂していない細胞の両方を導入することができ、固有の免疫原性が低いため、アデノウイルスベースやレンチウイルスベースなどの代替ベクタータイプの制限の多くを回避することができます。さらに、AAVベースのベクターは強力で持続的な導入遺伝子の発現が可能であるため（ヒトで4年以上39、非ヒト霊長類で15年以上40）、このようなシステムを使用すれば、長期にわたる治療効果が期待でき、MSなどの進行性または再発性の病気やTBIなどの慢性疾患を伴う傷害において魅力ある提案となる。脳卒中においても、治療期間が短いため、IL-2の持続的な遺伝子導入が臨床的に有用であると考えられる。脳卒中患者の10％が90日以内に二次的な脳卒中を発症している41。PHP.Bは、静脈注射によるマウスCNSへの導入に優れているため、ここでは使用されたが20、非ヒト霊長類ではより悪い結果が観察されており42、ひいてはヒトでも期待されるところである。直接注射や髄腔内投与はこの問題を克服できる可能性があるが、侵襲性の高い処置であることに変わりはない。全身投与でより効率的に中枢神経系に浸透する代替AAVカプシドを採用すれば、臨床的に非侵襲的な性質を維持し、既存の免疫43や潜在的な標的外毒性を回避できる可能性があります。ここで開発された送達システムは、系統の特定にカプシドではなく、内因性プロモーターの修正版に依存しているため、ヒトで使用する代替AAVカプシドに容易に適合させることができる。アストロサイトの分子的不均一性という最近の知見から、さらに改良を加え、治療薬送達の特異的な微小解剖学的標的を可能にするプロモーター要素を提供することができる。今回検証したような低分子誘導剤との結合は、用量漸増機能と安全性-引出し能力の両方を提供する。ミノサイクリンをベースとしたシステムは、適切な生体内分布と、ミノサイクリン自体がマイルドな神経保護剤であり、TBI45に有効である可能性があるため、相乗効果が期待できる興味深いものである。CNS病態の神経炎症性要素を治療するための実行可能な代替手段がないため、臨床開発のためにトリプルロックIL-2送達システムをさらに調査することが必要である。
方法
マウス
C57BL/6バックグラウンドでFoxp3-Creトランスジェニックマウス46、αCamKII-CreERT2トランスジェニックマウス47、Plp1-CreERTトランスジェニックマウス48、IL-2-GFPマウス49およびRag1-ノックアウトマウス50を使用した．Rosa-IL-2マウスは、内因性Rosa26プロモーターを用いて、Rosa26遺伝子座にfloxed-STOP配列とIl-2-IRES-Gfp配列を含むカセットを挿入することによって作製し51、C57BL/6バックグラウンドで使用した。マウスは特定の病原体を含まない条件下で、温度と湿度が制御された部屋で12時間の明暗サイクルの下、餌と水に自由にアクセスできるように飼育された。すべての動物処置は、関連する国内および欧州のガイドラインを考慮して、KU Leuven動物倫理委員会（P035/2015、P015/2014、P209/2015、P043/2016、P082/2018、P124/2019）、University of Amsterdam（CCD 4925、AVD1110020184925）またはBabraham Institute Animal Welfare and Ethics Review Body（PP3981824）によって承認されました。本試験では、特に指定がない限り、雄および雌のマウス（8～12週齢）の両方を使用しました。研究用マウスの年齢と性別、および治療方針は、動物倫理委員会と協議の上、選択した。タモキシフェン（シグマ社、T5648）は、10mg ml-1でコーン油（シグマ社）に可溶化させた。5〜7週齢のマウスに、体重1kgあたり100mgの投与量を用いて、48時間間隔で3回、腹腔内注射した。ミノサイクリン（PBSビヒクル）は、体重1kgあたり50mgで、毎日経口ガベージにより投与された。マウス実験のサンプルサイズは、動物倫理委員会と連携して、検出力計算とパイロットデータに基づいて選択され、過剰な動物使用なしに確実な感度を得ることができるようにした。マウスは無作為に選択され、実験グループの同一性に関して盲検化された状態で、実験手順と臨床測定を行う動物技術者が、様々な実験グループに組み入れた。行動学的手法については、補足情報を参照されたい。
パラビオシス
パラバイオーシスについては、7～10週齢の雌マウスのペアを手術前14～21日間同居させた。C57BL/6.SJL-Ptprca/BoyJマウス（CD45.1）を、タモキシフェンで前処理したαCamKIIIL-2マウス（CD45.2）と10週間パラビオさせた。ペアのマウスは吸入イソフルランで麻酔され、3.5% vol/volの導入と2.5-3.0% vol/volの維持を行った。カルプロフェンは体重1kgあたり10mg、ブプレノルフィンは体重1kgあたり0.1mgの用量で、手術前に腹腔内投与した。手術部位から毛皮を除去した。マウスを仰向けに寝かせ、手術部位をベタジン液で消毒し、次いで70％エタノールで消毒した。各動物の剃毛した側面に、肘の上0.5cmから膝関節の下0.5cmまで縦に皮膚切開を行った。皮下筋膜から皮膚を静かに剥がし、0.5cmの自由皮膚を作り、縫合してパラビオティックペアを作製した。
外傷性脳損傷
中等度の皮質TBIを、微調整を加えた制御皮質衝撃モデルを用いて誘発した。雄マウスをタモキシフェン（6週齢）またはベクター（10週齢）で処理した。12週目に、マウスを5％イソフルランを用いて麻酔し、定位フレームに設置した。マウスは処置の間中、2%イソフルランで麻酔されたままであった。開頭手術を行い、左半球をラムダからブレグマの範囲に窓を作った。インパクトピストン（Leica Impact One）は3mmの金属製チップを持ち、20°の角度で左皮質の上に置かれた。以下の設定を用いて衝撃を与えた： 5.5 m s-1の速度、1 mmの衝撃深度、300 msの滞空時間。衝撃の直後、頭蓋骨を交換し、瞬間接着剤で取り付けた。皮膚を縫合して傷を閉じ、マウスをヒートパッド上で完全に目覚めるまで回復させた。偽グループは開頭手術を受けたが、衝撃は受けなかった。TBIによる脳の灌流欠損は、衝撃後24時間および7-14日目にMRIで測定した。フローサイトメトリープロファイリングと免疫組織化学分析は、衝撃の14日後に行った。
実験的自己免疫性脳脊髄炎
8～12週齢の雌マウスにEAEを誘導した。活動性EAEを誘導するために、50μgのMOG35-55ペプチド（Covalab）を、2mg ml-1の結核菌（Sigma）を含むComplete Freund Adjuvantで乳化して、マウスに免疫した。そして、免疫後0日目と2日目に200ng ml-1の百日咳毒素(List Biochemicals)を投与した。臨床スコアは、0から5までのスケールで技術者がブラインドで評価した（参考文献52）。
光血栓性脳梗塞
光血栓性病変モデルを用いて局所皮質虚血を誘発した。マウス（雄、12週齢）は、酸素/空気混合気中2.5%イソフルランで麻酔し、呼吸をモニターし、直腸温を加熱板（TCAT-2LV Controller, Physitemp Instruments）で37±0.5℃に維持した。デジタルディスプレイ（David Kopf Instruments）に取り付けた定位フレームで固定した後、皮膚を1cm正中線切開して頭蓋骨を露出させた。次に、生理食塩水に3 mg ml-1の濃度で100 µlのローズベンガル（Sigma）を尾静脈から注入した。照明には、波長565nmの2.4mmレーザービーム（L4887-13、浜松ホトニクス）を前肢機能を司る運動野（ブレグマから0.5mm吻側、1.8mm外側）に当てた。ローズベンガル注射後5秒に、無傷の頭蓋骨を通して脳を5分間照明した。照明後、切開部を縫合し、動物に500μlの生理食塩水と0.05mg/kg体重のVetergesic（Ecuphar）を皮下投与した。回復中、マウスは別のケージに入れられ、ケージの半分が紫外線ランプの下に置かれた後、自宅のケージと収容施設に戻された。脳卒中後、最初の1週間は毎日マウスをモニターし、その後は毎週動物の健康状態を確認した。二次性脳梗塞のマウスには、一次性脳梗塞の後にAAVを静脈内投与しました。その後、2週間かけて回復させた後、同じ手順で反対側の半球に二次脳梗塞を発症させました。動物の不必要な苦痛を避けるため、マウスは5日以内に重度の衰弱を示すか、体重が20％減少した場合、安楽死させた。
脳卒中後24時間に、マウスをDolethal（20 mg ml-1; Vetoquinol）の過量投与で麻酔し、PBSで経心的に灌流した。脳を採取し、マウス脳マトリックス（Zivic Instruments）を用いて1mm切片に切断した。各動物について、梗塞を囲む合計6つの切片を集め、光から保護しながら、PBS中の1％（wt/vol）TTC（Sigma-Aldrich）溶液中で20℃、25分間インキュベートした。染色後、切片をガラス板に置き、通常の写真用カメラ（Nikon）で写真を撮った。虚血初期に生じた浮腫を補正するため、Swansonら53が提供する方法に従って脳卒中面積を算出した：［病変面積］＝［対側面積］-［全未損傷面積］とし、対側半球に対する割合で表示した。同側の未損傷領域の特定には、欠損した瘢痕組織とTTC染色された虚血領域の合計を囲む領域をマッピングした。
遠位中動脈永久閉塞症
10週齢の雄マウスを、基本的に記載されている通り54、ただし若干の修正を加えて、永久dMCAOに供した。簡単に言うと、マウスを2％（vol／vol）イソフルランで麻酔し、体温を維持するためにヒートパッド上に側臥位で配置した。目の脱水を防ぐために眼軟膏（Duratears；Alcon）を塗布した。手術部位を剃毛し、エタノールで消毒した後、左耳と眼球の間に垂直な皮膚切開を行った。次に、皮膚に手術用窓を開け、側頭筋を手術用はさみで背側と先端側に分離し、筋肉を除去せずに側頭骨を露出させた。中大脳動脈（MCA）を確認し、MCA分岐部位にマイクロドリル（Stoelting社製）で穴をあけた。その後、残った骨とその上にある硬膜を鉗子で取り除いた。その後、電気手術器（ERBE ICC 50）を8Wに設定し、バイポーラ凝固鉗子（先端0.4mm；ERBE）を用いてMCAの永久閉塞を行った。手術中、手術部位は生理食塩水で保湿した。MCA閉塞（血流低下）を目視で確認した後、筋肉を元の位置に戻し、傷口を縫合・消毒し、予熱環境下で動物を回復させた。手術中にくも膜下出血を発症したマウスは、試験から除外した。シャム動物は、最終的な凝固ステップを除いて、同じ手術手順に従った。
磁気共鳴イメージング
TBIを受けたマウスは、受傷後1日、1週間、2週間、4週間、3ヶ月後にスキャンされた。dMCAOを行ったマウスは、受傷から1日後、1週間後、2週間後にスキャンを行った。MRI測定は、9.4T Bruker BioSpec小動物用MRシステム（20cm水平ボア；Bruker BioSpin）で、送信用に内径7.2cmの直交共振器、受信用にアクティブデカップルマウス脳表面コイル（Rapid Biomedical）を使用して行った。スキャナーは600mT m-1のアクティブシールド勾配セットを装備していた。マウスはイソフルラン麻酔（100％（vol/vol）O2中の1〜2％（vol/vol）イソフルランを鼻マスクから投与）下でスキャンされた。直腸温と呼吸数を連続的にモニターし（SAII）、呼吸数が80～100回/分になるようにイソフルランレベルを調整した。直腸温は37℃に維持した（36-37.5℃）。
最初のローカライザースキャンに続いて、MRIプロトコルは、繰り返し時間（TR）4.5秒、有効エコー時間（TE）40ms、レア係数8、平均1、行列256×256、視野（FOV）20×20mm、500μm厚の24スライスの軸上T2-強調スピンエコーシーケンスを用いた。パラメトリックT2マップの算出のために、T2強調MRIと同じスライス方向で、以下のパラメータを用いたマルチスライスマルチエコーシーケンスを取得した： TR4.0秒、TE12ms、1平均、マトリックス128×128、FOV20×20mm、厚さ500μmの24スライス。パラメトリックな見かけの拡散係数を算出するために、拡散強調MRIを以下のパラメータで取得した： TR2.0秒、TE20ms、1平均、マトリックス128×128、FOV20×20mm、厚さ500μm、スライス間200μm、b値0、100、300、500、800、1,000および1,500。最後に、以下のパラメータを持つ3次元（3D）グラディエントエコーシーケンス（FLASH）を取得しました： TR30ms、TE7ms、20°パルス、マトリックス160×160×96、FOV20×20×12mm、等方性分解能125μmである。オペレーターは、実験グループに対してマスクされた。すべてのMR画像は、Bruker BioSpinソフトウェアParavision 6.1を使用して処理された。パラメトリックT2マップと見かけの拡散係数マップは、Paravision 6.1において、ピクセル単位の単指数フィットを用いて算出した。病変体積の定量化には、Paravision 6.1ソフトウェアを使用した。
AAVベクターの作製と精製
AAV-PHP.Bの生産は、Vigene SciencesまたはVectorBuilderによって、古典的なトリトランスフェクション法を用いて行い、その後のベクターの滴定は、定量PCRベースの方法論を用いて行った21,55。AAV-PHP.B.GFAP-IL-2 および PHP.B.αCamKII-IL-2 では、マウス IL-2 コード配列と 5′ および 3′ 非翻訳領域（アクセッション番号 BC116845）を一本鎖 AAV2 由来の発現カセットにクローニングし、そこに 2. 2kbのヒトGFAPプロモーター56または全長のマウスCamKIIプロモーター（遺伝子ID：12322）、ウッドチャック肝炎転写後調節要素およびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を含む一本鎖AAV2由来発現カセットにクローニングした。コントロールベクターは、IL-2コード配列をenhanced green fluorescent protein (EGFP, Vector Biolabs)をコードする配列と交換することにより調製した。
PHP.B.TetO：IL-2.sGFAP：rtTA（V7/V14）は、7xTetO配列と最小限のCMVプロモーターがIL-2を駆動し、短いヒトGFAPプロモーターがrtTA融合タンパク質を駆動して、Val7/Val14変異を含むように改変してミノサイクリン応答を強化したものだった。
いずれの場合も、特に指定がない限り、ベクター（総量100μl）を1回あたり1×109ベクターゲノムでマウスに静脈内投与した。バッチ濃度は、生物学的読み出しとして脳Treg細胞拡大を用いて正規化した。マウスは、特に指定がない限り、AAV注射から少なくとも14日後に実験手順に使用された。
フローサイトメトリー
マウスは、ケタミン（体重1kgあたり87mg）とキシラジン（体重1kgあたり13mg）の混合液を腹腔内注射し、深く麻酔した。氷冷PBSで経心灌流する前に、右心室から血液を採取した。血液は赤血球溶解により調製し、リンパ系臓器からの単細胞懸濁液は機械的解離により調製した； 脳組織からの単細胞懸濁液は、2mM MgCl2、2mM CaCl2 20% FBSおよび2mM HEPES pH7を補充したRPMI 1640中で、1mg ml-1 コラゲナーゼ IV (Thermo Fisher) 、300μg ml-1 ヒアルロニダーゼ (Sigma-Aldrich) および40μg ml-1 DNase I (Sigma-Aldrich) を用いて37℃で30分間の消化を行い準備した。 4 (Gibco)、機械的破砕、濾過（100μmメッシュを通して）、勾配遠心分離（40% Percoll GE Healthcare、600g、10分、ブレーキなし）による白血球の濃縮が続く。絶対細胞数の推定には、最初のステップで計数ビーズを「スパイクイン」し、調製中の細胞損失の計算を可能にした。非特異的結合は、2.4G2上清を使用してブロックされた。細胞内サイトカイン産生を評価するため、細胞を酢酸ミリスチン酸ホルボール（1μg ml-1; Sigma-Aldrich）、イオノマイシン（1μg ml-1; Sigma-Aldrich） およびブレフェルジンA（2μg ml-1; BD）存在下で4時間培養した。細胞を固定し、eBioscience Foxp3 staining kit (eBioscience)を用いて透過処理した。細胞表現型は、細胞タイプを特定するマーカーと活性化状態を評価するマーカーを含む、ハイパラメーターフローサイトメトリーパネルを用いて評価した。データはBD FACSymphonyで取得し、パネルは、（1）CD45、CD4、CD8α、CD3、CD19、NK1. 1、Foxp3、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780、CD103、CD62L、GITR、CD25、ニューロピリン1、ST2、PD-1、CTLA4、KLRG1、Helios、CD69、ICOS、CD44、T-bet、TCRγδおよびKi67； または（2）CCR6、CD80、TCRγδ、CD45、Foxp3、MHCII、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780、pro-IL-1β、CD25、Ly6G、ST2、CX3CR1、PD-L1、TNF、CD44、Ki67、CD4、Ly6C、TrkB、CD19、CD69、CD8α、LAMP1、CD64、CD11b、CD3、TGF-β、ストレプトアビジンとした； または（3）Foxp3、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780、IL-17、CD4、IFN-γ、CD8α、TNF、CD3、アンフィレグリン、IL-10、CD11b、CD19、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、TCRγδ、プロIL-1β、TCRβ、IL-2、NK1． 1. 脳パネルについては、脳サンプル全体を取得した。データはAutoSpill57を使用して補正されました。マウス細胞の例は、常に生物学的複製を連結したものとして表示した。細胞選別は、CD4、CD11b、CD45、TCRβ、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780およびCD25を含むパネルでBD FACSAria IIIを使用して実施した。フローサイトメトリーデータ収集は、FACSDiva version 8.0.2 (BD) またはSpectroFlo (Cytek) を用いて実施した。フローソーティングは、FACSDiva version 8.0.1 (BD)を用いて実施した。脳内Treg細胞定量化のための代表的なゲーティングを補足図16に示す。
蛍光免疫染色
マウスは、ケタミン（体重1kgあたり87mg）とキシラジン（体重1kgあたり13mg）の混合液を腹腔内注射して深く麻酔し、PBSに続いて4％緩衝ホルマリン溶液で経心的に灌流した。脳を取り出し、10％緩衝ホルマリン溶液で一晩固定し、組織凍結培地（Shandon Cryomatrix embedding resin, Thermo Scientific）で保存するまでは30％スクロースで保存し、-80℃で保存した。切片（20-50 µm）を50 mM NH4Cl-PBSで15分間洗浄し、0.5% Triton X-100-PBS中の10%正常ロバ血清で20℃、1時間プレブロックをした。Aldh1l1免疫蛍光は、10mMクエン酸ナトリウムバッファー（pH6.0）中80℃で30分間、熱誘導エピトープ回収を必要とした。切片を、Foxp3（1：500希釈；MAB8214、R＆D systems）、CD4（1：250希釈、100506、BioLegend）、Iba1に対して指示された一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした（1． 1,000希釈；014-19741、Wako）、GFAP（1：500希釈；ab4674、Abcam）、CD31（1：100希釈；MA3105、Invitrogen）、S100β（1：1000希釈；S2532、Sigma-Aldrich）、APC（1：250希釈；ab16794、Abcam）、NeuN（1： 500希釈；ABN90P、Millipore）、GFP（1：300希釈、132002、Synaptic Systems；1：1000希釈、600-401-215、Rockland；1：500希釈、600-101-215、Rockland）、GFAP（1：1000希釈；173004、Synaptic Systems）、PDGRα（1． 200希釈；APA5、BD Pharmingen）、Aldh1l1（1：200希釈；ab87117、Abcam）、MHCII（1：400希釈；eBiosciences、14-5321-82）およびlaminin-α（1：500希釈；af3837、R＆D Systems）を用いた。その後、切片を適切なフルオロフォア結合二次抗体（Thermo Scientific, BioLegend）と20℃で90分間インキュベートした。各抗体のインキュベーション後、スライスを0.1% Triton X-100-PBSで10分間、3回洗浄した。すべての切片をDAPI（1：1,000希釈）で15分間インキュベートし、ProLong Gold（Invitrogen）またはFluoromount-G（Southern Biotech）でマウントした。画像は、Zeiss LSM 780共焦点顕微鏡（×60 Apochromat/NA 1.4）、自動正立Leica DM5500 B顕微鏡（×20 HC Plan-Apochromat/NA 0.70 ）、Nikon A1R Eclipse Ti共焦点（×60 Apochromat/NA 1.4 ）または浜松オルカ Flash 4.0 V3カメラ搭載 Zeiss Axioscan Z.1 スライドスキャナー（×20 Plan-Apochromat/NA 0.8 ）を使って得た。Axioscanの画像はエクスポートされ、10%のファイルサイズに圧縮されました。蛍光測定値はバックグラウンドのために補正された。その後の画像処理は、米国国立衛生研究所ImageJソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij/download.html）を用いて実施した。
血液脳関門の構造的完全性は、氷冷した4％PFA-PBSでマウスを経心臓灌流した後に評価した。その後、脳を頭蓋骨から取り出し、2つの半球に分割した（中矢状面において）。右半球はFrozen Section Medium（Thermo Fisher）にて直ちにクライオモールド（Sakura）に埋め込み、ドライアイスで凍結し、さらに使用するまで-80℃に保存した。左半球は4%PFA-PBSで4℃、一晩ポストフィックスした。脱水後、サンプルはクライオモールドでパラフィンに包埋し、さらに使用するまで20 °Cで保存した。脳をパラフィン切片用に5μmスライス（HM 340 E, Thermo Fisher）または凍結切片用に20μmスライス（CryoStar NX70, Thermo Fisher）に切断した。凍結保存切片は、ZO-1（1:500希釈；617300、Invitrogen）、claudin-1（1:200希釈；51-9000、Thermo Fisher）、E-cadherin（1：500希釈；610181、BD）およびCD31（1：100希釈；DIA-310、Dianova）染色に使用されました。パラフィン切片を使用して、オクルディン（1:100希釈；33-1500、Invitrogen）およびCD31（1:100希釈；DIA-310、Dianova）を染色した。切片を0.3% Triton X-100-PBSで透過処理した。0.3% Triton X-100-PBS中の5%正常ヤギ血清で20℃、1時間ブロッキングした後、切片をブロッキング液中で一次抗体とインキュベートし、4℃、一晩放置した。PBSで洗浄後、切片をPBSまたは0.3% Triton X-100-PBS中の蛍光色素結合二次抗体（Alexa Fluor-488 goat anti-rabbit/Alexa Fluor-488 goat anti-mouse (1:400 dilution; A11008/A11001, Thermo Fisher) or Alexa Fluor-633 goat anti-rat (1:400 dilution; A21094, Thermo Fisher) ）で染色した。 1% Triton X-100-PBS、20℃で1-1.5時間、カウンター染色はHoechst試薬（Sigma-Aldrich；PBSで1：1,000希釈）で行いました。共焦点レーザー走査型顕微鏡は、40倍の対物レンズ（NA 1.4）を装備したZeiss LSM780共焦点顕微鏡を使用して実施した。画像ファイルはエクスポートされ、さらなる解析はImageJで行われた。
表面モルフォロジーイメージング
マウスの脳の潜在的な変形を視覚化し、全体的な形状を評価するために、Bioptonics 3001 OPTスキャナーで器官全体を撮像した。サンプルは、自家蛍光f-OPT58と反射光59を用いて撮像した。サンプルの全回転を撮影するために、0.9°の角度ピッチで400枚の画像を取得した。その結果、NReconソフトウェア（バージョン1.7.1.6; Bruker）を用いて3Dボリュームが再構成され、Arivis（バージョン 2.12.5; Rostock）を用いて可視化されました。
シングルセルRNAシークエンス
単細胞懸濁液は、フローサイトメトリーのセクションに記載されているように調製した。アクチノマイシンD（Sigma）5μMを、細胞分離および染色手順の間に添加した。12週から16週齢の雄マウスで、同じ産駒のものを使用した。生きたCD11b+CD45+とCD4+CD45+CD11b-またはTCRβ+CD45+CD11b-細胞のいずれかをBD FACSAria IIIを用いてソーティングし、0.04%BSA-PBSに懸濁した。ソーティング後、LUNA-FL dual fluorescence cell counter (Logos Biosystems)を用いて細胞数および生存率を確認した。各実験では、各チャンネルに約8,700個の細胞を加え、5,000個の細胞回収を目標としました。セルカウントと品質管理後、サンプルを直ちに10x Genomics Chromium Controllerにロードし、Single Cell 3′ Kit v3を用いて、メーカーの指示に従いライブラリー調製を実施しました。Qubit 2 Fluorometer (Thermo Fisher)とBioanalyzer HS DNA kit (Agilent)を用いて、推奨されるポイントでライブラリーの品質をチェックしました。ライブラリーは、推奨されるペアエンドシーケンスワークフロー（v3リードパラメータ、28-8-0-91サイクル）を用いて、Illumina NovaSeq 6000またはIllumina HiSeqプラットフォームで配列決定した。平均して、ライブラリーは細胞あたり50,000リードの深さまで配列された。
データは10x Genomics社のCell Ranger v.3.1 (αCamKIIIL-2データセット)またはv.6.0 (PHP.GFAP-IL-2 データセット)で前処理を行った。得られたカウントマトリックス（与えられた細胞における各遺伝子の転写物（ユニークな分子識別子）の数を示す）は、特に断りのない限り、デフォルトパラメーターによる標準パイプラインに従って、R v.3.6.3 (https://www.r-project.org/)60 と Seurat (https://satijalab.org/seurat/; v.3.1.5)61 （αCamKIIIL-2 dataset）、または v.4.0.1 と v.4.0.5 (PHP.GFAP-IL-2 dataset) を用いて分析した。解析の前に、高品質の善意の単一細胞のみを含むように計算された異なる品質指標に基づいてデータをフィルタリングした。5個未満の細胞で検出された遺伝子はフィルターで除外されました。低品質の細胞または空の液滴（200未満の遺伝子を持つものとして識別される）および500未満のユニークな分子識別子カウントを持つ細胞もフィルタリングされました。最後に、死にかけた細胞を示すミトコンドリアリードが広範囲に存在するライブラリもフィルタリングされた。結合されたデータセット内の各細胞の特徴的な発現測定値は、総発現量によって正規化され、対数変換されました。クラスタリングの前に、Unique Molecular Identifiers（UMI）番号とミトコンドリア遺伝子発現による不要な変動が取り除かれた。遺伝子発現の線形変換（'scaling'）も行い、遺伝子発現のばらつきについて細胞間で正規化した。
様々な細胞集団を識別するために、Seurat解析パッケージを使用して、遺伝子発現データに対して次元削減アプローチを適用した。まず、PCElbowPlot()関数を用いた主成分分析の形で線形次元削減を行い、主成分を取得した後、発現データの類似性に基づく次元削減アプローチを行った。t-SNEおよびUMAP削減は、遺伝子発現データにおいて最も変動が大きい主成分分析のサブセット（エルボープロットで決定）に対する非線形次元削減に使用した。次に、A k-最近傍アルゴリズムを投影に適用して共有最近傍グラフを生成し、これを用いて、LouvainアルゴリズムによるFindClusters()関数を用いて、分解能0.4、1,000回の反復でクラスタが生成されました。このように、遺伝子発現が類似している細胞は、これらの「コミュニティ」にまとまっている。クラスターが生成されると、既知のマーカー遺伝子の発現を使用して、細胞タイプの同一性を割り当てた。細胞の割合の比較は、ボンフェローニ補正をかけたt-testを用いて計算した。パスウェイ解析は、GAGE (v.2.40.2)62, Pathview (v.1.30.1)63 および clusterProfiler (v.3.18)64 を用いて行った。
高感度マウスIL-2イムノアッセイ
血清は、全血から、血液を20℃で30分間インキュベートした後、2,000gで10分間遠心分離して得た。血清サンプルは、アッセイ希釈バッファー（Life Technologies）で希釈（1：40）した。組織サンプル（5mg）を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Life Technologies）を含む300μlタンパク質定量サンプル溶解バッファー（Life Technologies）中に入れた。組織を、製造者の推奨に従って、Lysing Matrix Dを用いたFastPrep装置（MP Biomedicals）においてホモジナイズし、そして4℃で20分間シェーカー上でインキュベートした。得られたライセートを16,000gで1分間、4℃で遠心分離した。組織溶解物および血清からのIL-2レベルは、製造者の説明書（Life Technologies）に従って、ProQuantum High-Sensitivity mouse IL-2 immunoassayを使用して調べた。
急性期脳スライスにおける機能的イメージング
アストロサイトの機能的イメージングおよびニューロンの多電極アレイ電気生理学を含む脳スライスの手順は、補足情報に記載されている。
血液-脳脊髄液関門および血液-脳関門透過性の定量化
血液-脳脊髄液（CSF）バリアおよび血液-脳関門透過性65は、CSF採取の1時間前に4-kDa FITC-デキストラン（Sigma）を体重1kgあたり75mg静脈内注射することにより測定した。CSFは、cisterna magna puncture法を用いて第4脳室から得た。その後、マウスを0.2%ヘパリン-PBSで灌流し、脳組織を単離した。CSFサンプルを滅菌PBSで100倍に希釈し、λex 485 nmおよびλem 520 nmの蛍光を測定することにより、血液-CSFバリア漏れを判定した。脳サンプルは小片に切断し、ホルムアミド中で37℃で一晩振盪しながらインキュベートした。最高速度で15分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清を滅菌PBSで2倍に希釈し、485nmのλexと520nmのλemでの蛍光を測定することにより、血液脳関門漏れを判定した。
統計情報
サンプルサイズは、適切な検出力を持つ既発表の研究に基づいています。データの収集と解析は、実験条件について盲検化された状態で行われた。マウスは、実験開始時に治療群に無作為に割り付けられた。データの分布は正規分布と仮定した。模範となる組織学的画像は、実験グループ全体に見られる発現パターンに酷似しているものを選択した。2群間の比較は、非対称の両側Student's t-testsを用いて行った。必要な場合は、ポストホックホルムの多重比較検定またはシダックの多重比較検定を行った。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）は適切な場合に使用された。データが正規分布していない場合はノンパラメトリック検定を行った（視覚的チェックのためのQQプロットとプールした残差のShapiro-Wilk正規性検定）。図中の凡例で報告されているnの値は、特に指定がない限り、動物の数を表す。数値は平均値±s.e.m.で表し、P < 0.05のとき有意差とした。グラフはGraphPad Prism（GraphPad Software v9.2.0）を用いて作成した。
t-SNE、FlowSOM、ヒートマップ解析は、R（バージョン3.6.2）で社内スクリプト（66[Roca et al, 2021 arXiv]）を使って行った。FlowSOMクラスターは、非教師的な方法でマルチマーカーの類似性に基づいて形成される。クラスターは、クラスター形成後のマーカー発現の比較に基づき、各クラスターの固有のマーカープロファイルを文献ベースの命名法に整合させながら注釈を付けた。Treg細胞クラスターの主な注釈は、ナイーブ（CD62LhiCD44lo）、活性化（CD62LloCD44hi）、レジデント（活性化、さらにCD69、CD103、KLRG1、ST2の発現に富む）、末梢（Nrp1-）で、さらに独自のマーカー分布に基づいてクラスターを注釈している。t-SNEプロット間の差は、t-SNEアルゴリズム（準備中の原稿）と同じアプローチで計算した。これらの点確率から、元の空間に対するt-SNE空間のクロスエントロピーの分布をプロットごとに求めた。次に、クロスエントロピー分布の差についてコルモゴロフ・スミルノフ検定を行い、プロット間のすべてのペアワイズ比較を評価した。その結果得られたP値はHolm法で補正した。デンドログラムは、コルモゴロフ・スミルノフ統計量を距離尺度として用いた階層的クラスタリングによって得られた66。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご参照ください。
データの入手方法
本研究で作成した単細胞RNA配列データセットは、Gene expression OmnibusのアクセッションコードGSE153427およびGSE179176で公開されています。資料請求は、対応する著者にお願いします。ソースデータは本論文に添付されています。
利用可能なコード
αCamKIIIL-2解析コードは補足資料2、PHP.GFAP-IL-2解析コードは補足資料3に掲載されています。
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謝辞
本研究は、VIB、ERC Consolidator Grant TissueTreg（A.L.へ）、ERC Proof of Concept Grant TreatBrainDamage（A.L.へ）、ERC Starting Grant AstroFunc（M.G.H. に）の支援を受けた。 )、ERC Proof of Concept Grant AD-VIP(M.G.H.へ)、FWO Research Grant 1513616N(M.G.H.), Thierry Latran Foundation Grant SOD-VIP(M.G.H.), ERNAET Chair(H2020-WIDESPREAD-2018-2020-6; NCBio: 951923; to M. G.H.）、FWO Research Grants 1503420N（to E.P.）および1513020N（to J.W.）、A SAO-FRA pilot grant（20190032, to E.P.）、Biology and Biological Sciences Research Council through Institute Strategic Program Grant funding BBS/E/B/000C0427 and BBS/E/B/000C0428 and the Biotechnology and Biological Sciences Research Council Core Capability Grant to the Babraham Institute. E.P.、V.L.、M.M.、P.G.、J.W.、A.d.B.はFWOからのフェローシップにより支援を受けています。R.L.はFWO Flandersのシニアクリニカルインスペクターである。P.B.、O.A.、C.P.F.は、C.P.F.へのERA-NET-NEURONグラントEJTC 2016とオランダ科学研究機構（NWO）の支援を受けています。著者らは、マウスの飼育についてJ. Haughton（VIB）、AAVの設計と製造に関する助言についてM. Rincon（VIB）、技術サポートについてK. Vennekens、 P. -A. PenttilaおよびKUL FACS Core、J. WoutersおよびKUL Molecular Small Animal Imaging Center（MoSAIC）、S. WalkerおよびBabraham Institute Imaging Core、VIB Bio-Imaging Core、VIB Single Cell Sequencing Core、R. Breedijk, M. HinkおよびUniversity of AmsterdamのLeeuwenhoek Center for Advanced Microscopy。
著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： Lidia Yshii、Emanuela Pasciuto、Pascal Bielefeld、Matthew G. Holt、Adrian Liston。
著者と所属
VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research、Leuven、ベルギー
Lidia Yshii, Emanuela Pasciuto, Loriana Mascali, Pierre Lemaitre, Marika Marino, Stijn Verschoren, Vasiliki Lagou, Antina de Boer, Jérôme Wahis, Jens Verhaert, Axelle Kerstens, Suresh Poovathingal, Teresa Prezzemolo, Keimpe Wierda, Eline Creemers, Sebastian Munck, Robin Lemmens, Bart De Strooper, Ludo Van Den Bosch, Matthew G. Holt & Adrian Liston
KU Leuven, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Leuven, Belgium.
Lidia Yshii、Emanuela Pasciuto、Loriana Mascali、Pierre Lemaitre、Vasiliki Lagou、Teresa Prezzemolo、Adrian Liston
KU Leuven - Department of Neurosciences, Leuven, Belgium（ベルギー
Lidia Yshii, Emanuela Pasciuto, Marika Marino, Stijn Verschoren, Antina de Boer, Jérôme Wahis, Jens Verhaert, Axelle Kerstens, Keimpe Wierda, Eline Creemers, Sebastian Munck, Robin Lemmens, Bart De Strooper, Ludo Van Den Bosch ＆ Matthew G. Holt
アムステルダム大学理学部スワマーダム生命科学研究所、オランダ、アムステルダム
パスカル・ビーレフェルド、オイハネ・アビエガ、カルロス・P・フィッツシモンズ
バブラハム研究所免疫プログラム、バブラハム研究キャンパス、ケンブリッジ、英国
パスカル・ビーレフェルド、ジェームズ・ドゥーリー、ルブナ・クーザー、オリバー・T・バートン、サマル・H・K・タリーン、カルロス・P・ロカ、カイラシュ・シン、カーリー・E・ホイト、エイミー・ダッシュウッド、メリエム・アロウー、エイドリアン・リストン
ハッセルト大学バイオメディカル研究所（BIOMED）心臓・臓器システム（COST）（ベルギー、ディープンベーク
Hannelore Kemps、Pascal Gervois、Annelies Bronckaers
VIB Bio-Imaging Core, Leuven, Belgium（ベルギー
アクセル・ケルステンス＆セバスチャン・ムンク
KU Leuven, Faculty of Psychology, Laboratory of Biological Psychology, Leuven, Belgium
Zsuzsanna Callaerts-Vegh
VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Electrophysiology Expertise Unit, Leuven, Belgium
ケインペ・ヴィエルダ＆エリーヌ・クリーマーズ
VIB Center for Inflammation Research（ベルギー・ゲント市
Junhua Xie, Elien Van Wonterghem & Roosmarijn E. Vandenbroucke
ゲント大学理学部生物医学分子生物学科、ベルギー、ゲント市
Junhua Xie, Elien Van Wonterghem & Roosmarijn E. Vandenbroucke
トゥールーズ感染症・炎症性疾患研究所（INFINITY）、INSERM UMR1291、CNRS UMR 5051、トゥールーズ、フランス
メリエム・アルールー
KU Leuven, Department of Imaging and Pathology, Biomedical MRI, Leuven, Belgium.
Willy Gsell & Uwe Himmelreich
ルーヴェン大学病院神経科、ベルギー、ルーヴェン
ロビン・レメンス
ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン認知症研究所（イギリス・ロンドン
バート・デ・シュトゥルーパー
ポルト大学医療研究センター（i3S）、ポルト、ポルトガル
マシュー・G・ホルト
貢献度
L.Y.とE.P.は、実験の設計と実施、データの評価と解釈、原稿を執筆した。P.B.は実験を行い、データを解釈し、知的インプットを提供し、原稿を編集した。L.M.、P.L.、M.M.、J.D.、L.K.、S.V.、H.K.、PG、A.B.、O.T.B、 J.W.J.V. K.S. C.E.W. A.K. Z.C.-V. S.P. T.P. K.W. A.D. J.X. E.V.W. E.C. WG.and O.A. は実験を実行。V.L.、S.H.K.T.、C.P.R.はバイオインフォマティクス解析を行った。U.H.はMRI解析を行った。M.A.は、科学的なインプットを行った。S.M.、R.E.V.、A.B.、R.L.、B.D.S.、L.V.D.BおよびC.P.F.は知的インプットと試薬を提供した。M.G.H.とA.L.は、本研究の構想、監督、資金提供、原稿執筆を行った。
対応する著者
マシュー・G・ホルトまたはエイドリアン・リストン宛に通信してください。
倫理に関する宣言
競合する利益
VIBおよびBabraham Instituteは、原稿に含まれる研究に基づく特許PCT/GB2020/052148の所有者であり、L.Y., E.P., J.D., M.G.H. およびA.L.は商業化により経済的利益を得る可能性がある。残りの著者は、競合する利害関係はないことを宣言している。
査読
ピアレビュー情報
プライマリーハンドリングエディター： L. A. Dempsey、Nature Immunologyチームと共同で。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data Fig. 1 神経細胞におけるIL-2レポーターの発現。
IL-2GFPマウスと非トランスジェニック対照の健康な灌流マウスの脳を免疫組織化学的にGFPレポーターの発現を評価。中脳のGFP発現NeuN+細胞のシングルおよび複合チャンネル共焦点画像、非トランスジェニックコントロールと比較。 b, 抗GFP IL-2レポーター（緑）、Iba1（赤）、GFAP（紫）およびDAPI（青）。中脳のGFP発現細胞のシングルおよび複合チャンネル共焦点画像、非トランスジェニックコントロールと比較。すべての画像は、3匹のマウス（n = 3/グループ）の代表的な切片である。スケールバー：50 µm。
Extended Data Fig. 2 神経細胞IL-2産生による脳制御性T細胞特異的効果。
a, 野生型マウスとFoxp3IL-2マウスの脾臓をフローサイトメトリーで比較した（n = 4, 6）。脾臓のTreg細胞上の主要マーカー（CD25、CD44、CD62L、CD103、CTLA4、Helios、ICOS、Ki67、KLRG1、Neuropilin1、PD1、ST2、Tbet）の頻度。 b、野生型マウスおよびαCamKIIIL-2マウスの脳を高次元フローサイトメトリーにより比較した（n = 4, 3）。Treg細胞上の主要マーカーの頻度定量化。 c、主要マーカーで構築された血液、脾臓および脳のTreg細胞のtSNE。色は注釈付きFlowSOMクラスターを示し、定量化は補足図5 f.に記載。tSNEは取得後にプールしたサンプルで実行し、定量化は個々のサンプルで実行した（n = 4, 3）。住宅クラスターは、CD25hiCD69 + PD1 + CD103 + として特徴付けられる。 d, 野生型マウスおよびαCamKIIIL-2マウスの脳からの全白血球のtSNE、定量化を伴う系統マーカーに構築された。tSNEは、個々のサンプル（n = 4, 3）で定量化が行われ、プール後のサンプル上で実行した。 f、主要マーカー（CD62L、CD44、CD103、CD69、CD25、PD-1、Nrp1、ICOS、KLRG1、ST2、Ki67、Helios、T-bet、CTLA4）に基づく脳のCD4従来型T細胞のtSNE実行（取得後にプールしたサンプルに対してtSNEを行い、定量は個々のサンプルで実行（n＝4、3）。色は注釈付きFlowSOMクラスター、定量化、gはマーカー発現頻度。 hは、主要マーカーで構築された脳内CD8 T細胞のtSNE。色は注釈付きFlowSOMクラスター、定量化、iはマーカー発現頻度を示す。 j, 主要マーカーに基づく脳内NK細胞のtSNE（取得後にプールしたサンプルでtSNEを実行し、個々のサンプルで定量化を行った（n = 4、3）。色は注釈付きFlowSOMクラスターを示し、定量化、kはマーカー発現頻度。データは平均値±s.e.m.で表示されている（a,b,d-k）。統計解析は、複数の対にならない両側スチューデントのt-testを用いて行った。
出典データ
Extended Data 図3 αCamKIIIL-2マウスにおける正常な長期増強。
野性型およびαCamKIIIL-2同腹子の脳スライスにおいて、Schaffer collateral-CA1神経シナプスからフィールド興奮性シナプス後電位（fEPSPs）を記録した。入出力曲線は、500～2750mVの範囲で250mV刻みの単刺激を加え、各スライスについて記録した。a傾きとb振幅を解析した（n = 4,4）．長期増強（LTP）は、3つの高周波トレイン（シータバースト刺激（TBS））を加えることで誘導した： 100刺激；100Hz）を5分間隔で3回行い、長期増強（LTP）を誘導した。ベースライン決定後、fEPSPを55分間測定した。cの傾きとdの振幅の経時変化が解析された。ボックスプロットは、ベースライン（左）の定量化を表す（振幅： 最小値（0、02845）、25％パーセンタイル、（0.2020、0.3137）、中央値（0.3471、0.4084）、75％パーセンタイル（0.6997、0.6627）、最大値（1.203、0.7302）；傾き（Slope．最小値 (0.06911, 0.08740), 25% パーセンタイル (0.08134, 0.1182), 中央値 (0.2409, 0.1463), 75% パーセンタイル (0.3236, 0.2653), 最大 (0.4574, 0.2747) と最終LTP（右）（振幅．最小値（132.1、130）、25％パーセンタイル（132.4、130.8）、中央値（152.7、145.7）、75％パーセンタイル（176.5、191.1）、最大値（177.9、202）; 傾き．最小値（138.2、131.3）、25％パーセンタイル（138.7、134.4）、中央値（151.3、150.3）、75％パーセンタイル（170.3、191.6）、最大値（173.0、203.2）). 平均値±s.e.m. (n = 4,4)。統計解析は、対にならないノンパラメトリックのMann-Whitney U-testで行った。
出典データ
Extended Data 図4 脳内制御性T細胞を拡大したマウスにおける正常な行動。
αCamKIIIL-2と同腹のコントロールマウスの行動評価 a, ロッドにかかった時間、300秒のテストを4回繰り返した平均（n = 23, 17） b, オープンフィールド、移動距離とコーナーにかかった時間（n = 23, 16） d, 巣作りスコア（n = 24, 18） e, 明暗テスト、ライトゾーンに入る待ち時間とライトゾーンにかかった時間（n = 20, 17）。g, 強制水泳試験中の不動時間（n = 24, 16） h, 見知らぬマウス（S）と空の部屋（E）との相互作用を監視する社会性試験試行（n = 28, 18） i, 文脈獲得条件付け中の凍りつき行動の時間経過（n = 28, 18） j, 一般化試験中の文脈識別（n = 28, 18） k, モーリス水迷路での空間学習。隠れたプラットフォームを見つけるまでの経路長（n = 28, 18）、5日後と10日後のプローブテスト、反転学習後（n = 28, 18）。すべてのデータは平均値±s.e.m.で表示される。すべての実験は独立して2回繰り返した。統計解析は、多重比較補正付き二元配置分散分析（h、i、j）または二元反復測定（RM）分散分析（k）を用いて実施した。
出典データ
Extended Data Fig. 5 PHP.GFAP-IL-2は、排出リンパ節に影響を与えることなく、脳内の制御性T細胞を拡大させた。
マウスをPHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2で処理し、灌流したマウス（n = 4-5, 4-9）のフローサイトメトリーでTreg数を評価した。 a, 表在頚部リンパ節（n = 4, 4）およびb深在頚部リンパ節（n = 4, 4）のCD4 T細胞の割合として、Treg細胞の頻度を示す。c, 表層頸部リンパ節（n = 4, 4）、およびd 深部頸部リンパ節（n = 4, 4）におけるTreg細胞の絶対数。 e, PHPから14日後の梨状体におけるTreg細胞の頻度とf 絶対数。 GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2処理（n = 5,5）。 g、PHP.GFAP-GFPおよびPHP.GFAP-IL-2処理したマウスの血液、脾臓および灌流マウス脳を、Treg数について高次元フローサイトメトリで比較した（n = 6, 6血液； 12, 11 脾臓と脳）。h、PHP.GFAP-GFPおよびPHP.GFAP-IL-2処理マウスの灌流臓器を、Treg頻度についてフローサイトメトリーで比較した（n＝5／グループ）。 mLN、腸間膜リンパ節；SC、脊髄；IEL、上皮内白血球；LPL、lamina propria白血球；PP、パイエルズパッチ。統計解析は、対にならないノンパラメトリックのMann-Whitney U-testを用いて実施した。
出典データ
Extended Data Fig. 6 IL-2の上昇は、アストロサイトやニューロンの機能に対して検出可能な効果をもたらさなかった。
急性期脳スライスにおけるアストロサイトのCa2+イメージング a, 左、SR101+アストロサイト（点線円）。b、平均化されたΔF/F0トレース±s.e.m. c、ΔF/F0振幅（左）と曲線下面積（AUC）（右）のボックスプロット。ヒゲは最大値および最小値を表す。AUCについては、最小値（240.1、249.1）、25%パーセンタイル（338.1、338.7）、中央値（381.8、385.1）、75%パーセンタイル（443.8、442）、最大値（699.3、702.3）。ΔF/F0振幅については、最小値(1.006, 1.007), 25% Percentile (1.604, 1.648), Median (2.139, 2.161), 75% Percentile (2.664, 2.665), Maximum (4.542, 4.239) d, Averaged ΔF/F0 traces± s. e.m. e, ΔF/F0振幅（左）とAUC（右）のボックスプロット。 n = 3 mice/group、nastrocytes = 609, 646 for PHP.GFAP-GFP and PHP.GFAP-IL-2, respectively. ヒゲは最大値と最小値を表す。ΔF/F0振幅について： 最小値 (1.086, 1.075), 25% Percentile (1.578, 1.617), Median (2.007, 1.980), 75% Percentile (2.431, 2.348), Maximum (4.463, 3.489). AUCについては 最小値（280.6、279.3）、25％パーセンタイル（332.3、339.7）、中央値（366.4、371）、75％パーセンタイル（408.7、409.2）、最大値（704.4、659.5）．PHP.GFAP-GFPおよびPHP.GFAP-IL-2処理マウス（n = 4,4）のfEPSPを用いて神経細胞機能を測定した。入出力曲線は、単刺激を加えて記録した。傾きf, g, 振幅を解析した。LTPは3回の高周波刺激（100刺激；100Hz；矢印シータバースト刺激-TBS）を加えることで誘導した。ベースライン後、fEPSPを測定した。h、傾き、i、振幅の経時変化を分析した。ベースライン（左）と最終LTP（右）の箱ひげ図。平均値±s.e.m. ヒゲは最大値、最小値を表す。ベースライン時の傾きについて： 最小値 (0,08681, 0,09894), 25% Percentile (0.08875, 0.1164), 中央値 (0.1248, 0.1473), 75% Percentile (0.3407, 0.2212), 最大値 (0.4659, 0. 2584). 2584）、最終LTPの傾きについては、最小値（154.8、169.4）、25％パーセンタイル（159.4、169.7）、中央値（184、174.9）、75％パーセンタイル（204.8、214.1）、最大値（208.3、225.8）となった。ベースライン時の振幅については、最小値（0.1941、0）、25％パーセンタイル（0.2298、0.2979）、中央値（0.3279、0.3897）、75％パーセンタイル（0.8083、0.5444）、最大値（1.139、0.7234）．最終LTPの振幅について：最小値（166.9、148.7）、25％パーセンタイル（171、155.3）、中央値（188.7、177.2）、75％パーセンタイル（204.8、181.9）、最大値（208.4、1828.） 非対称、ノンパラメトリックのMann-Whitney U-test。
出典データ
Extended Data 図7 PHP.GFAP-IL-2投与マウスの正常な行動。
a,ロッドにかかった時間（300秒×4回の繰り返し試験の平均）（n = 15,15） b,オープンフィールド（移動距離とコーナーにかかった時間）（n = 15,15） c,Nesting behavior（n = 15,15） d,Morris water mazeにおける空間学習。e, 5日後、10日後、反転学習後のプローブテスト(n = 15,15) f, 文脈獲得条件付け中の経時的な凍結行動(n = 15,15) g, 一般化テスト中の文脈識別(n = 15,15) h, 空室（E）と比較して見知らぬマウス（S1）との交流をモニターするソサビリティテスト試行(n = 15,15). 平均値±s.e.m. すべての実験は独立して2回繰り返された。統計解析は、対にならない両側スチューデントのt-testを用いて行った。
出典データ
Extended Data Fig. 8 PHP投与後の血液脳関門の完全性の確認。
PBS、PHP.GFAP-GFPまたはPHP.GFAP-IL-2を投与した野生型マウスについて、投与後14日目に血液脳関門（BBB）の完全性を評価した。 a, CD31、Zonula occludens-1 (ZO-1) およびDAPI、b CD31、Occludin (OCLN) およびDAPIを組織学的に評価する。c、CLDN1とDAPI、またはE-カドヘリン/CDH1とDAPIについての組織学的評価。スケールバー、50 µm。d, マウスに4 kDa FITC-デキストランを静脈注射し、脳脊髄液（CSF）、小脳、皮質、海馬で定量した（n = 6, 7, 6 CSF; 5, 5, 4 Cerebellum, Cortex, Hippocampus）。平均値±s.e.m.
出典データ
Extended Data Fig. 9 PHP.CamKII-IL-2処理後の脳特異的なTregの拡大。
CamKIIプロモーターは、成体マウスの脳において、遺伝子発現をニューロン（NeuN陽性）に限定する（GFPスコアリングで評価）。GFAP（アストロサイト）のカウンター染色を行った場合、オフターゲット発現は検出されなかった。左のパネルは海馬、右のパネルは大脳皮質。スケールバー：20 µm。データは、PHPを投与した4匹の独立したマウスのそれぞれから1枚のスライスに見られる代表的な画像である。b、PHP.CamKII-GFP投与マウスにおけるGFPとNeuNおよびGFAPとの共焦点化の定量化。c、IL-2のレベルは、1×109、1×1010または1×1011の総ベクターゲノムPHP.CamKII-GFP（コントロール）またはPHP.CamKII-GFPを投与した野生型マウスから得られた組織サンプルから測定した。CamKII-IL-2（n＝7,7,5,8,8）。d, 野生型マウスに1×109, 1×1010, 1×1011ベクターゲノム（総量）のPHP.CamKII-GFPまたはPHP.IL-2を静脈内投与した。 CamKII-IL-2を投与し、投与14日後に灌流した脳またはe脾臓における従来のT細胞（左）およびTreg細胞（右）の数を評価した（n＝5群）。 f、脳およびg脾臓におけるCD4 T細胞に対するTreg細胞のパーセンテージである。統計解析は、Sidak補正を伴う二元配置ANOVAを用いて実施した。
出典データ
Extended Data Fig. 10 TBI中のIL-2の脳内投与に伴う転写解析。
14日目にPHP.GFAP-IL-2（またはPHP.GFAP-GFPコントロールベクター）で処理した野生型マウスに、制御された皮質衝撃を与え、中程度のTBIを誘発するか偽手術を行った。TBIの14日後、灌流した脳からT細胞とミクログリアを選別し、10倍速シングルセル・トランスクリプトミクスを行った。 a, T細胞データのUMAP発現プロット。CD3d、CD4、CD8、Foxp3、IL-2RA、Sel1の発現パターンを重ね合わせて、種々のT細胞集団を特定。 b, T細胞のUMAP表現。治療グループ間での種々のT細胞タイプの相対数を表示。c、偽マウス（左）とTBI（右）に対するPHP.GFAP-GFPとPHP.GFAP-IL-2処理マウスのCD4 Tconvクラスターにおける遺伝子発現の差を示すボルケーノプロットである。 e, マイクログリアデータのUMAP発現プロット。Lpl, Cst7, Axl, Itgax, Spp1, Ccl6, Csf1, H2-Aaの発現パターンに差があることが示されている。g, PHP.GFAP-GFPマウスとPHP.GFAP-IL-2マウスとの間の恒常性ミクログリアの遺伝子発現の差を示すボルケーノプロット（左）およびTBI（右）。h, PHP.GFAP-GFPマウスとPHP.GFAP-IL-2処理マウスのミクログリアにおける差分遺伝子濃縮に基づくKEGGパスウェイのフィルターされた概要（偽薬とTBIの条件） i, 「抗原処理と提示」（KEGG mmu04612）についてのパスビュープロットを、示された4つの差分遺伝子発現比較間の平均ログ倍変化を用いて示す.TBIについてはn = 3/グループ、偽薬についてはn = 1/ グループ。統計解析は、Seuratの標準解析パイプラインを用いて、差分発現の負の二項検定を用いて行った（f、g）。
補足情報
補足情報
補足図1-16、資料1-3、方法、参考文献、ソースデータ
報告書の概要
補足映像1
野生型脳におけるCD4+ T細胞。CD4（緑）、Foxp3（赤）、CD31（白）、DAPI（青）で染色した野生型灌流脳の3Dサーフェスレンダリング。中脳における従来のCD4+ T細胞とTreg細胞の代表的な映像。
補足ビデオ2
αCamKIIIL-2脳における脳内Treg細胞。CD4（緑）、Foxp3（赤）、CD31（白）、DAPI（青）で染色したαCamKIIIL-2灌流脳の3D表面レンダリング。中脳における、2つの従来型CD4+ T細胞と4つのTreg細胞からなるCD4+ T細胞クラスターの代表的な映像。
補足動画3
CD4（緑）、Foxp3（赤）、CD31（白）、DAPI（青）で染色したPHP.GFAP-GFP処理灌流脳の3Dサーフェイスレンダリング。中脳内の従来のCD4+ T細胞とTreg細胞の代表的な映像。
補足ビデオ4
PHP.GFAP-IL-2処理した脳内のTreg細胞。CD4（緑）、Foxp3（赤）、CD31（白）、DAPI（青）で染色した、PHP.GFAP-IL-2処理した灌流脳の3Dサーフェスレンダリング。中脳にある3つのTreg細胞からなるCD4+ T細胞クラスターの代表的な映像。
出典データ
ソースデータ 図1
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータFig.5
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータFig.6
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
個別データポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ 拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ 拡張データ Fig.
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ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
ソースデータ拡張データ Fig.
個々のデータポイント、統計的なソースデータ。
権利と許可
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Yshii, L., Pasciuto, E., Bielefeld, P. et al. Astrocyte-targeted gene delivery of interleukin 2 specifically increases brain-resident regulatory T cell numbers and protects against pathological neuroinflammation. Nat Immunol 23, 878-891 (2022). https://doi.org/10.1038/s41590-022-01208-z
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2022年3月01日受領
2022年4月11日受理
2022年5月26日発行
発行日2022年6月
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41590-022-01208-z
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