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アプライド・マイクロバイオロジー・インターナショナル
微生物バイオテクノロジー第6巻第4号p. 316-325
ミニレビュー
オープンアクセス
糞便移植の名声と未来 - 合成マイクロバイオームによる次世代療法の開発


https://ami-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1751-7915.12047

ウィレム・M・デ・ヴォス
初出：2013年4月10日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.12047
引用 50
資金提供情報 資金提供情報はありません。
本誌について
セクション

概要
千年以上も前から行われてきたことではあるが、現在、患者の腸内細菌叢を改変するために糞便移植を行うことがルネッサンスとなっている。この臨床的実践は、さまざまな形態の腸内微生物を、通常は除去されているレシピエントの腸管内に大量に送り込むことからなる。糞便移植が普及している主な理由は、様々な疾患の治療に有効であることである。したがって、この方法を次のレベルに発展させる必要がある。ドナーの微生物叢を選択し、標準化し、保存するために様々な開発がなされているが、腸内微生物群集を理解し、強固なバイオテクノロジープロセスによってこれらを提供する方法を開発することは、より困難である。この寄稿では、腸内細菌叢を改変する新たな治療法の手段となる合成微生物群集の生産と同様に、最小限のマイクロバイオームという概念も取り上げている。

私たちの腸管は、特定の時空間組織を示し、個人によって組成が異なり、健康と疾病に寄与する微生物の複雑な群集によって、生まれたときからコロニー形成されている（Zoetendal et al.） 近年、ファーミキューテス門、放線菌門、バクテロイデーテス門、プロテオバクテリア門、ベルコミクロビア門の主要な門に属する腸内細菌叢の構造と機能の解明がかなり進んでいる（Rajilić-Stojanović et al.、2007）。しかし、ヒト腸内に存在する1000種を超える細菌群の大半は、まだ培養されていない（Zoetendal et al.） シークエンシング技術の進歩により、培養に依存しないハイスループットアプローチに大きな注目が集まり、腸内細菌叢の構成に関する重要なベースライン情報、3.3 Mbの参照メタゲノム、およびエンテロタイプと呼ばれるクラスターへの構造化が行われた（Qin and the MetaHit Consortium, 2010; Arumugam and the MetaHit Consortium, 2011; Huttenhower and the Human Microbiome Project Consortium, 2012）。

ハイスループット技術の応用により、成人はユニークで安定した微生物叢を持つという以前の観察が確認された（Zoetendalら、1998）。これは最近、数千人の成人の微生物叢を高精度で再現性よく深く解析した結果、すべての微生物叢が異なる組成を持つことが明らかになった（J. Salojarvi and W. M. de Vos, 未発表、HITChipという系統樹マイクロアレイを用いた観察）（Rajilić-Stojanović et al.） ヒトの微生物叢の系統的解析がこのように大規模に行われるようになったのはごく最近のことであるため、腸内細菌叢の長期的動態を扱った研究は多くない。人の被験者を1年以上にわたって深くサンプリングした縦断研究では、糞便サンプルの微生物組成は、皮膚や口腔など他の身体部位の組成とは対照的に、かなり安定していることが示された（Caporaso et al.） 同様に、健康な被験者を10年以上追跡調査したところ、糞便群集のかなりの安定性が観察され、特徴的な個人マイクロバイオームが維持されていた（Rajilić-Stojanović et al.） 他の縦断的研究では、微生物叢の構成は、食事、抗生物質の使用、腸管通過の影響を受けるが、時間帯の移動など、あまり研究されていないライフスタイル要因の影響も受ける可能性があることが示されている（Flint et al.） この動態の本質的な決定要因は、糞便サンプルやメタゲノムから検出されるバクテリオファージによって形成される可能性がある（Qin and the MetaHit Consortium, 2010; Minot et al.） 典型的な振動は観察されていないため、バクテリオファージが腸内細菌叢をどのように制御しているかはまだ明らかになっていないが、他のシステムと類似していることから、腸内細菌叢はキャリアー状態にあり、病原性バクテリオファージがその安定性に寄与していると推測される（de Vos, 1989）。

腸内細菌叢の組成とコード化能力をモニターする正確なアプローチが豊富になったことで、健常者と疾患患者の腸内細菌叢組成の違いの分析も大きく進歩した。現在、特定の腸内細菌や微生物パターン間の相関関係は、最近レビューされたように、重度の腸炎からがんや肥満まで様々な数十の疾患について決定されている（de Vos and de Vos, 2012）。しかし、微生物学的、医学的、倫理的な問題が多いため、因果関係は乏しく、立証は困難である。例外は、腸内細菌叢の糞便移植である。この方法は、因果関係を明らかにするだけでなく、様々な疾患の治療においてかなりの有効性を示し、腸内細菌叢の重要性を裏付けているため、ヒトへの介入において人気が高まっている。驚くべきことに、この治療に用いられる地味な技術と、腸内細菌叢に関する高度な知識との間には大きな乖離がある。したがって、ここでは、医療行為と微生物バイオテクノロジーの接点における次世代療法に特に注目し、この注意点を取り上げる。

糞便移植の発展：ヒトから動物への往復
微生物が発見されるずっと以前から、糞便を移植するという概念は実践されており、この医療行為がしばしば経験的なものであることを裏付けている。中国医学における糞便懸濁液の移植に関する記録は、1000年以上前にまでさかのぼる。その中には、食中毒やひどい下痢に苦しむ患者に、健康なドナーの糞便懸濁液を摂取させることで治癒させたという、宗氏王朝（4世紀）の医師、葛洪による最初の記述も含まれている。同様に、明の時代（16世紀）には、李時珍が特定の腹部疾患を効果的に治療するための糞便療法について詳述している（Zhang et al.） 驚くべきことに、獣医学的診療における腸内サンプルの移植という概念は、ヨーロッパでも同時期に使用されており、イタリアの解剖学者Fabricius Aquapendente（17世紀）は、反芻能力を失った牛におそらくルーメン液を接種する方法を記述している（Borody et al.） この方法は今日でも行われており、牛が第一胃から口 に運んで再び咀嚼したものである排莢（Cud）を用いて、幼い子牛に口腔から接種す る（Pounden and Hibbs, 1950）。さらに極端な例では、成牛に、泌乳量の多い牛の瘻孔から直接ルーメン液を接種することもある。このプロセスは、微生物と原虫の両方が移行するため、トランスフ ァウネーションとも呼ばれ、穀物給与量の多い牛のアシドーシスに有効な治療法 で、主に Streptococcus bovis の過剰増殖が原因となっている（Klieve et al.） 前世紀の後半には、孵化したばかりのヒナにニワトリの糞便を混ぜて接種する、いわゆるヌルミ・コンセプトにおいて、糞便移植が鳥類にも適用されるようになった（Nurmi and Rantala, 1973）。現在でもこの方法は実施されており、病原体を含まない鶏の糞便微生物叢の凍結乾燥製剤が製造・商品化されている（Stavric, 1992; Nakamura et al.）

約50年前、Ben Eiseman博士（Eiseman et al., 1958）の研究により、ヒトへの糞便移植が再び医療現場で行われるようになった。4人の腸炎患者を糞便浣腸（大腸経由の送達）で治療したところ、全員の急速な回復が観察された。現在の知識では、これらの患者はおそらくクロストリジウム・ディフィシル感染症(CDI)に罹患していると説明されたであろう。この報告の後、再発性または慢性CDIにおける糞便移植の成功を示す報告が何十件も登場し、最近の総説では500例を超えている（Gough et al.） これらの移植やその他の移植に用いられる様々な手段、医療現場での成功例、微生物バイオテクノロジーを応用するための選択肢について以下に述べる。

糞便移植の実践
最も単純な糞便微生物叢の移植は、腸内細菌叢の消費である。これは、事実上無菌状態で生まれ、ヒトの腸内にのみ存在する特定の微生物群によって急速にコロニー形成される幼少期に起こりやすい自然なプロセスである。つまり、私たちは皆、少なくとも1回、おそらくは複数回の糞便移植を受けた状態で人生をスタートするのである。これは、最近指摘されたように（Economist, 2012）、最初の赤ちゃん訪問や夕食の席、朝食の前に議論される問題ではない。それゆえ、使用される材料については、イエロースープ、リキッドゴールド、あるいは元の培養液を提供した同僚にちなんでジュリア・フローラ（Julia Flora）など、実にさまざまな婉曲的表現がある（Schoorel et al. 同様に、この治療法自体にも十数種類の用語があり、最近のものは「リポープレート」である（Petrof et al.） 治療の方法は実にさまざまで、単純な経口摂取、経鼻胃管または経鼻十二指腸管を介した小腸注入、食道胃十二指腸内視鏡検査または大腸内視鏡検査を介した移送、あるいは自宅で行うこともできる大腸保持浣腸による送達など、上から下まで多岐にわたる。多くの場合、腸管洗浄や下剤の服用によって腸管の微生物負荷が軽減される。また、便十二指腸注入法から大腸腸管移植法まで、実施に使用される表現も送達様式によって異なる。さらに、しばしば細菌療法や糞便微生物叢移植といった用語が使用される。しかし、以下に述べるように、移植される糞便材料には微生物以外のものも含まれているため、これらはその後の手順を正しく説明していない（図1も参照）。

図
図1
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パワーポイント
キャプション
移植用糞便材料の特性評価
微生物組成に対する関心の高さとは対照的に、糞便の生物学的組成に関するデータは少ない。典型的な英国食（炭水化物385g、タンパク質85g、脂肪108g、食物繊維22g）を摂取している成人を対象とした徹底的な研究では、糞便排出量は1日平均100gに近く、75％が水分であることが判明した。しかし、乾物を考慮すると、約半分（55％）が微生物で、残りの部分にはセルロースなどの繊維質と可溶性物質（24％）が含まれていた（図1A）（Stephen and Cummins, 1980）。後者には粘液、タンパク質、脂肪などの高分子も含まれ、おなじみの臭いを発生させるカテコール、インドール、硫化物などのコレステロール分解産物のシンクを構成する胆汁酸や、平均的な糞便サンプルで最大100mMのレベルで生成される特徴的な短鎖脂肪酸を含む、あらゆる種類の小さな可溶性分子も予想される（Flint et al.） ほとんどの糞便移植では、微生物画分を精製または濃縮する努力はなされておらず、したがって治療用製剤にはこれらの化合物のすべて、またはほとんどが含まれている。

上部腸管から投与される糞便サンプルには、希釈、混合、濾過などの前処理が施されている（Vrieze et al.） 酸素の多い状況にさらされるのを減らすために保護措置が取られるが、防ぐことはできない。この処理の前後で微生物叢を分析しても、大きな違いは見られなかった（E. G. Zoetendal and W. M. de Vos unpubl.） しかし、調製物の生存性はテストされていない。これはまた、CDI患者の大腸送達に使用され、洗浄後グリセロールなどの凍結保護剤で保存される凍結糞便サンプルについても行われていない(Hamilton et al., 2012)。糞便微生物の大部分は死滅しているか損傷していることが報告されている（図1B）。大腸で行われるパイプラインの末端発酵は、生存能力を維持するためにあるわけではないので、これは驚くべきことではない。固形物には多くの有毒成分が含まれており、中でも強力な抗菌作用を持つ胆汁が最も重要である（Begleyら、2005年）。機能性蛍光プローブを用いた高度なフローサイトメトリーを用いて、通常の食事を摂っているオランダ人被験者の糞便微生物叢の生存率が測定された（Ben-Amorら、2002年）。その結果、微生物の約半数（49％）が死滅し、3分の1（32％）が生存していること、さらにごく一部は損傷を受けており、前述したような特異的な処理でしか培養できない可能性が高いことが観察された（図1B）（Ben-Amor et al.） このようなことは、糞便移植の現在の治療法では起こりそうにない。このような治療法では、生存率を維持するために使用されている条件（Ben-Amorら、2002年）よりも、より厳密でない嫌気的・保護的条件下での操作を必要とすることが多い。

結論として、移植された微生物の大部分は死滅していると考えるのが妥当である。糞便サンプル（図1A）中に存在する他の生物学的化合物とともに、これらが糞便移植の成功に関与している可能性は否定できず、さらなる研究が必要な分野である。重要なことは、糞便サンプルから回収できる生存微生物叢は、バクテロイデーテス属、いくつかの主要なクロストリジウム属、ビフィドバクテリウム属が予想より少なく、不均一な分布を示すことである（Ben-Amor et al.） 驚くべきことに、Eubacterium halliiのような酪酸産生菌が生菌画分に存在することがわかった。このことは、乳酸と酢酸を酪酸に変換するE. halliiが、糞便移植によってインスリン抵抗性が治癒したメタボリックシンドローム被験者の回腸微生物叢に豊富に含まれていることを最近発見しており、興味深い（Vrieze et al.） 生存率に及ぼすこのような差のある効果は、移植された微生物叢と健康転帰との因果関係を明らかにすることを目的とした、さらなる研究の重要な手がかりとなるかもしれない。

糞便移植の現在の成功
過去50年間に大腸炎と再発性CDI患者の治療において糞便移植が成功したのに続き、他の様々な疾患も対象となった。重要なものは、1989年にJustin D Bennet博士によって報告された潰瘍性大腸炎（UC）の最初の症例である（Bennet and Brinkman, 1989）。Bennet博士は自らもUCに罹患し、多くの治療が失敗したことを述べた後、健康なドナーの糞便を大量に大腸に繰り返し投与することにより、ようやく治癒した。それ以来、CDI、UCなどにおける多くの応用が、主にケーススタディとして開拓されてきた（Borody and Khoruts, 2011）。現在、約半ダースの疾患で糞便移植の成功例が報告されており、そのうちのいくつかは多数の患者を治療している（表1）。再発性CDIの治療から明らかなように、経口、十二指腸、大腸への移植の成功率に大きな差はないようである。しかし、いずれの場合もドナーの選択には特別な注意が払われ、一般的な健康状態から、HIVやその他のウイルスに感染していないこと、腸の愁訴、安全でない性交渉や違法薬物の使用など、満たさなければならない基準が多数列挙されるなど、厳しさはさまざまである（Vrieze et al.） CDIやUC以外にも、微生物組成の異常を特徴とする過敏性腸症候群（IBS）も含まれる（Rajilić-Stojanović et al.、2011）。さらに、慢性疲労症候群 (Borody et al., 2012)や多発性硬化症 (Borody et al., 2003)の治療にも有効であることが示唆されているが、これらは最近の総説 (Vrieze et al., 2013)にあるように、単独の研究に基づくものにすぎない。また、移植前後のドナーとレシピエントの微生物叢の組成と機能を扱う研究も増えている（表2）。これは、糞便移植のさらなる発展に寄与するものであるため、学習曲線に加える重要なものであり、新たな介入の標準的実践となるべきである。最も関連性の高い知見のいくつかを以下に要約する。

表1. 糞便移植によって治療された疾患
疾患名 納入数 参考文献
C. difficile感染症 70 C Mattilaら（2012年）
C. difficile感染症 16 D van Noodら（2013年）
インスリン抵抗性（MetS） 9 D Vrieze et al.
潰瘍性大腸炎 6 C Borody et al.
過敏性腸症候群 30 C Andrews et al.
慢性疲労症候群 60 C Borody et al.
多発性硬化症 4 C Borody et al.
代謝性アシドーシス 1 O Schoorel et al.
AD後の再コロニー化 6 O van der Waaijら（1977）；Heidtら（1983）
症例数(N)は、異なる投与方法(D: 十二指腸、C: 結腸または大腸、O: 経口)と同様に示されている。報告された患者数が最も多い研究がリストアップされている。ADは抗生物質除染。
表2. 移植から得られた教訓
患者数 主な変化
CDI 1 多様性の増加 Khoruts et al.
バクテロイデーテスの増加
CDI 6 多様性の増加 - すべてが成功したわけではない Shahinas ら（2012年）
バクテロイデーテス属の増加 0026;ファーミキューテス属の増加
プロテオバクテリアの減少
CDI 3 多様性の増加 - 2/3のドナーと同様 Hamilton et al.
バクテロイデーテス属の増加 0026; ファーミキューテス属の減少
プロテオバクテリアの減少 0026; 放線菌の減少
CDI 9 多様性の増加-9/9でドナーと同様 van Nood et al.
バクテロイデス属、一部のファーミキューテス属の増加
プロテオバクテリアの減少
MetS 8 多様性がわずかに増加 Vrieze et al.
一部の酪酸産生菌の増加
再発性または慢性CDI患者に糞便移植が実施された500例以上の症例において、平均95％以上の疾患消失が報告されている（Borody and Campbell, 2012）。しかし、多くの研究が小規模であったり、成功した症例報告であったりするため、この数字は出版バイアスに苦しんでいる可能性がある。最近のいくつかの研究では、CDIにおける糞便移植について、多くの患者を対象とした体系的なアプローチがなされている。ヘルシンキ大学での研究では、合計70人の再発性CDI患者に大腸移植が行われ、66人（94％）が治癒した（Mattila et al.） アムステルダム医療センターで行われた別の研究では、3群間試験が設定され、42人の再発性CDI患者がバンコマイシン、バンコマイシンと腸洗浄、またはこれらの治療後に健康なドナーの糞便の十二指腸注入を受けた（van Nood et al.） 16人のCDI患者のうち13人は糞便移植後すぐに回復し、残りの3人のうち2人は2回目の注入後に回復した。これは、バンコマイシンで13人中4人または3人、バンコマイシンと腸洗浄で13人中4人または3人が治癒した他の治療法と著しく対照的である。興味深いことに、バンコマイシンをベースとした治療に反応しなかった数例には、プロトコル外の糞便移植が行われ、そのうち15例はすぐに回復した。この結果、33人のCDI患者のうち30人（91％）が治療に成功した。後者の研究では、微生物叢が広範に研究された（van Nood et al, 2013; S. Fuentes and W. M. de Vos, unpubl.） 再発性CDI患者は全員、腸内細菌叢の多様性が一貫して再現可能なほど非常に低いという特徴があり、糞便移植後すぐにドナーレベルにまで修正され、この安定した健康な状態を複数の患者で6週間追跡調査した。この分析は、新鮮な糞便（Shahinasら、2012年）または凍結した糞便（Hamiltonら、2012年）を用いた、単一（Khorutsら、2010年）または限られた数の被験者における先行研究を拡張するものであった（表2）。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、酪酸産生菌を含むいくつかのファーミキューテス（Firmicutes）の劇的な増加と、プロテオバクテリア（Proteobacteria）に属する病原性細菌の減少が観察された（van Nood et al. これはすべて、多様性は低いが炎症性の高いマイクロバイオームから、健康なマイクロバイオームの特徴を持つマイクロバイオームへの劇的な転換を示している（De Vos and De Vos, 2012）。いくつかの個人差は観察されるが、CDI移植後の微生物叢に関する本分析や他の報告でも、全体像は同じである（表2）。このことは、微生物叢の性質（新鮮か凍結か）、送達様式（十二指腸か大腸か）、あるいはドナーの所在地、出身地、食習慣は、最終的な結果に影響しないことを示している。また、CDI患者の腸内生態系が非常に乱れているため、ドナーの微生物が速やかに利用可能なニッチを占め始め、その結果、腸内細菌叢が正常に機能するようになるという、以前の観察結果も裏付けられている（Khoruts et al.）

ほとんどの糞便移植は、複数の健康なドナー（多くは家族）からの便サンプルを用いて行われる。時には、1人または優先的なドナーを用いて移植が行われることもある。しかし、最近の研究では、合計32人の再発性CDI患者が、1994年に1人の健康な中年ドナーから得た腸内微生物の混合物を浣腸し、10年以上にわたって厳密な嫌気条件下で再培養されたものを用いて治療された（Jorup-Rönström et al.） この再培養には、コレステロール源として卵黄を含む単純なペプトン-酵母培地が用いられた。通常、このような培養法は微生物の多様性を急速に減少させるが、この未定義の混合液の有効性は持続するようで、32人の患者のうち22人（69％）が治癒した。驚くべきことに、この混合液は50cmの直腸カテーテルから30mlの懸濁液として投与され、浣腸を可能な限り長く続けるための予防措置はとられたものの、事前に緩解は行われなかった。これは、腸内洗浄後に通常100g以上の糞便を挿入する他の投与方法とは対照的である。このこと、通常とは異なる投与方法、接種液の性質が、他で報告されているよりも低い治癒率を説明する要因のひとつであろう。

CDI移植の経験（van Nood et al., 2013）が示すように、患者から最善の治療を受けることを控えることは倫理的に好ましくないためであろう。さらに、対照治療を選択することは単純ではなく、特に移植の場合はそうではない。しかし、メタボリックシンドローム（MetS; Vrieze et al.） ここでは、9人の被験者からなる対照群は、治療群のように除脂肪ドナーからの糞便移植を受けず、いわゆる自家移植で自分の糞便サンプルを移植された。除脂肪ドナーからの糞便移植を受けた治療群のみが、インスリン感受性の増加によって証明されるように、MetSの消失を示した（表1）。この研究は盲検下で行われたため、初の二重盲検プラセボ対照糞便移植研究であり、観察された結果に信頼性と検出力の両方が加わった。さらに、本試験では深部微生物叢分析も実施され、再発性CDI患者の移植後よりも顕著な差は認められなかった。しかし、治癒した治療群では、わずかではあるが再現性のある違いが検出され、これは自身の微生物叢を投与された自家培養群では見られなかった（Vrieze et al.） これには酪酸産生菌（下部腸管ではRoseburia intestinalis、上部腸管ではE. hallii）の増加が含まれ、大腸菌を含むプロテオバクテリアの減少を伴っていた（表2）。このことは、再発性CDI患者の治療後に観察されたのと同様な状況、すなわち、健康なドナーとの糞便移植後に、酪酸産生能を持つグラム陰性菌によって潜在的な炎症性グラム陰性菌が減少していることを、それほど顕著ではないが、示唆している。

これまでほとんど注目されてこなかった珍しい研究に、いわゆるジュリア・フローラがある。この用語は、健康なドナーの糞便微生物叢に関するもので、無菌マウスで維持され、経口投与が容易であった（Van der Waaijら、1977年）。このジュリア・フローラは、d-乳酸の過剰産生により代謝性アシドーシスに罹患した短腸症候群の3歳の男児を救うために使用された（Schoorelら、1980）。前述したように、S. bovisの過剰増殖によるアシドーシスは牛でしばしば見られる（Klieveら、2003）。ここでは、男児の便に通常より高いレベルのグラム陽性菌が観察されたことから、同様のメカニズムによって引き起こされた可能性がある。ジュリア・フローラを5日間連日経口投与したところ、この少年は完治し、退院後9ヵ月経っても悪影響は認められなかった（Schoorelら、1980年）。

結論として、糞便移植の成功例は様々なレベルの大腸炎症から代謝性疾患まで多岐にわたる。このことは、糞便成分との明確な因果関係を提供することにより、これらの疾患と腸内細菌叢との関連性を拡大するものである（De Vos and De Vos, 2012）。微生物叢の解析はこのことを確認し、さらに拡張するもので、レシピエントの様々な分類群や機能群がドナーのそれとどのように入れ替わるのかについて、グローバルな洞察を提供するものである。さらに、経時的な微生物の変化を詳細に分析することで、MetSの場合の酪酸産生E.halliiのように、特定の細菌と健康状態との関連性を明らかにすることができる（表2）。このようなアプローチは、さらなるメタゲノム解析、機能解析、ネットワーク解析とともに、最小限のマイクロバイオームを定義し、合成微生物群集を構築するための新たな手がかりとなる豊富なデータを提供するだろう。このことは、無菌マウスで維持された、あるいは実験室で亜培養された未定義の微生物混合物が、代謝性アシドーシスの治癒や再発性CDI患者の治療に成功したことからも裏付けられている（Schoorelら、1980；Jorup-Rönströmら、2012）。合成コミュニティ開発へのさらなるステップについては後述する。

合成コミュニティに向けて
現在、腸内細菌叢が注目され、糞便移植が次の段階に進むずっと以前から、合成群集の開発に関する様々な試みが報告されてきた。それらを、最近開発された混合物とともにここに紹介する（表3）。

表3. 微生物叢移植に使用される未定義培養と定義されたコンソーシアム
宿主数 構成
無菌小児 2 ビフィドバクテリウム2株、芽胞形成菌2株（抗生物質の混入物である可能性が高い） Dietrich and Fliedner (1973)
6 無菌マウスで維持したヒト由来微生物群 Raibaud ら（1975年）
AD 患者 5 無菌マウスで維持したヒトドナー微生物群 van der Waaij ら（1977）；Heidt ら（1983）
CDI 患者 32 ヒトドナー微生物叢を 10 年間培養 Jorup-Rönström et al.
CDI マウス 20 S. warneri, E. hirae, L. reuteri, Anaerostipes sp. nov., Bacteroidetes sp. nov., Enterorhabdus sp. Lawleyら（2012年）
CDI患者 6例 E. faecalis、C. innocuum、C. ramosum、B. ovatus、B. vulgatus、B. thetaiotamicron、大腸菌（2）、C. bifermentus、P. productus Tvede and Rask-Madsen (1989)
CDI患者2 A. intestinalis、B. ovatus、Bif. adolescentis（2）、Bif. longum（2）、Bl. producta、C. cocleatum、Col. aerofaciens、D. longicatena（2）、E. coli、Eub. desmolans、Eub. eligens、Eub. limosum、Eub. rectale (4)、Eub. ventriosum、F. prausnitzii、Lach. pectinoshiza、L. paracasei、L. casei、Par. distasonis、Raoultella sp、 R. faecalis、R. intestinalis、Rum. torques（2）、Rum. obeum（2）、S. mitis Petrof et al.
AD、抗生物質の除染。E., Enterococcus（腸球菌）; C., Clostridium（クロストリジウム）; B., Bacteroides（バクテロイデス）; E., Escherichia（エシェリヒア）; P., Propionibacterium（プロピオニバクテリウム）; A., Anaerostipes（アナエロスティペス）; Bif., Bifidobacterium（ビフィドバクテリウム）; Col., Colinsella（コリンセラ）; Eub、 Eub., Eubacterium; F. Faecalibacterium; Lach., Lachnospira; Par., Parabacteroides; R., Roseburia; Rum., Ruminococcus; S., Streptococcus; L., Lactobacillus. 太字で示された種が混合物の主成分である。
腸管を除染するために抗生物質による集中的な治療を行った後に移植を行った珍しい例が、1973年の時点で報告されている。この頃、急性白血病の患者など免疫不全の患者を保護するためにアイソレーターが開発された。これらの研究のいくつかは、糞便移植の分野で活躍する人々の関心を避けてきたようなので、ここに詳述する。完全な封じ込めシステムに関する広範な報告の中で、免疫不全に陥った子供や成人が、長期の抗生物質治療後に無菌状態になることが報告されている（Dietrich and Fliedner, 1973）。これらの患者が適切な治療を受けて病気が治癒した後、通常の環境に入るためにはコロニー形成が必要であった。これは、単一菌株（ビフィズス菌、乳酸菌、大腸菌、腸球菌）の経口接種と、それに続く健康な被験者の糞便サンプルの直腸挿入のカスケードによって行われた。その結果、このような無菌の小児のうち2例では、それぞれの細菌が疾患の症状なしに直ちにコロニー形成することが判明した。1症例についてさらに詳しく述べると、500mg/day-1のゲンタマイシンを経口投与されていたgnotobioticの小児で、おそらく好気性芽胞形成性桿菌2個に汚染され、その後コロニー形成したものと思われる。この小児には、まず106個、次いで1010個のビフィズス菌の異なる菌株がミルク食とともに投与された。これらの菌株は、糞便1グラムあたり約108-1010個のビフィズス菌に成長し、芽胞形成菌に10-1000倍対抗した。4ヵ月後に糞便移植が行われ、子供はアイソレーターを出た（Dietrich and Fliedner, 1973）。

同じ頃、先天性複合免疫不全症が疑われた帝王切開分娩児に糞便移植が行われた（Raibaudら、1975年）。出産後10日目に、希釈したヒト糞便サンプルでコロニー形成された無菌マウスの腸内容物の懸濁液を与えた。これは、マウス由来のヒト化微生物叢による経口移植に関する最初の記述である。数年後、J.F.(Van der Waaij et al., 1977)と名付けられた健康なドナーから、ヒト化された非病原性微生物叢が得られたときも、同様のアプローチがとられた。生成された微生物叢は、まずJ.F.フローラと呼ばれ、後にジュリア・フローラ（上記および表2参照）、さらにヒト・ドナー・フローラ（HDF）と呼ばれるようになった。驚くべきことに、マウスでの維持期間中、大腸菌は微生物叢の主要な構成要素として失われ、主に嫌気性細菌で構成されていた（Heidt et al., 1983）。現在では、様々な研究から、無菌動物におけるヒトの微生物叢は、構造と機能が急速に変化する可能性があることがわかっている（El Aidy et al.） このJ.F.菌叢を経口接種用菌叢として使用し、抗生物質除染（AD）として知られる治療で抗生物質を投与されていた一連の免疫不全患者、つまりアイソレーターで隔離された患者5人を繰り返し（最大5回）再コロニー化した。移植前は事実上無菌状態であったが、コロニー形成後、大腸菌数は急速に増加した。しかし、移植された患者のコロニー形成抵抗性は健常人ほどではないことが指摘された（Van der Waaijら、1977年）。これがジュリア・フローラ（当時はジュリア・フローラと呼ばれていた）の組成によるものなのか、それとも損なわれた宿主の影響によるものなのかはわからないが、J.F.フローラ（当時はジュリア・フローラと呼ばれていた）の質は、若い少年の代謝性アシドーシスを治癒させるのに十分高いようであった（Schoorelら、1980年。

同じ頃、TvedeとRask-Madsen（1989）によって、合成群集を用いた一連の、しかし非常に重要な実験が報告された。彼らは20の腸内単一菌株から10株を選択し、そのうちの数株は慢性CDI患者6人から分離されたC. difficileに対して阻害活性を示した。これらの患者は、すべて直腸内に設置された健康な親族からの糞便サンプルまたは菌株混合で治療され、成功を収めた。1人の患者は糞便浣腸のみで治療され、1人は糞便浣腸が不成功に終わり、その後混合株で治療され、残りの4人は直腸に設置された混合株のみで治療された（表3）。これらの治療前の患者の糞便サンプルには、上記の後の観察と一致して、検出可能なバクテロイデス属菌は含まれていなかった（表2）。これは、5人のCDI患者を再発性CDIから治癒させることに成功した腸内細菌の合成混合物に関する初めての記述である。また、開発された混合菌が、試験された1症例において糞便移植よりも優れていることも示された。混合物は3種類のバクテロイデス属菌からなり、いずれも患者のC. difficileに阻害された。しかし、大腸菌1株とClostridium bifermentans株、Peptostreptococcus productus株はC. difficileに対して拮抗活性を示した。この文脈では、最近、腸内バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）から2成分の修飾抗菌ペプチド、チューリシンCDが検出され、in vitroおよび結腸遠位モデルでC. difficileに対して強い阻害活性を示したことに注目する必要がある（Rea et al. 合成混合物による治療を受けた患者の長期追跡調査が報告され、嫌気培養による糞便サンプルの分析が行われた（Tvede and Rask-Madsen, 1989）。その結果、主にバクテロイデス属の細菌がコロニーを形成していることが観察され、これらの細菌によるコロニー形成はC. difficileに対する自然な防御を提供する可能性が示唆された。これらの特徴的な知見は非常に注目を集めたが、新規のアプローチが報告されたときによくあるように批判もされた。プロバイオティック細菌や酵母による経口療法がより良いアプローチになりうるという指摘には、十分な反論がなされた（Seal et al., 1989; Tvede and Rask-Madsen, 1990）。10株が多すぎるのか少なすぎるのかという疑問には、現在利用可能な分子学的アプローチによってもまだ答えが出ていない。

慢性CDIの再発の多さから予想されるように、発展途上の合成コミュニティにおける最近の研究のほとんどは、この疾患に焦点を当てたものである。最近報告されたエレガントなマウス研究では、CDIモデルを用いて、コンビナトリアル・アプローチにより選択された最良の合成コミュニティーを用いた試験が行われた。最良の結果は、いくつかの新しいマウス分離株を含む6種の混合で得られた（Lawley et al.） マウスの分離株がヒトの腸管内でどのように作用するかは不明である。同様に、この混合マウス株を用いてヒトでの臨床試験を行うには、どのような規制上のハードルを乗り越えなければならないかもまだわからない。しかし、この研究は、CDI患者を治療するための合成コミュニティーを開発し、維持し、試験するための道が成功したことを明確に示している。これは、ヒト腸内細菌叢を実験室で10年以上維持した最近の研究（Jorup-Rönström et al.） 最近行われたヒトを対象としたパイロット研究では、CDIの治療に合成微生物群集を用いるという問題に改めて取り組んだ（Petrof et al.） 健康なドナーの便から様々な細菌群の合計33株を分離し、組み合わせて培養し、その後、抗生物質治療に反応しなかった再発性CDI患者2人の治療に使用した（表3）。大腸内視鏡検査により、患者は治癒したことが確認され、その結果得られた腸内細菌叢の分析から、新菌株の一部が定着していることが示された。この原理実証研究は、TvedeとRask-Madsen（1989）による以前の結果を裏付けるものである。

糞便移植の将来
伝統的な中国医学から現代的なエビデンスに基づく医学に至るまで、実験的観察により、糞便移植が一連の疾患に有効であるという明確な証拠が得られているが、再発性または慢性CDIは最もよく研究されている疾患である（Kelly, 2013; van Nood et al.） TvedeとRask-Madsen（1989）によって開拓されたように、定義されたコンソーシアムだけでなく、未定義の混合物を用いた、大世紀70年代後半から80年代前半に開始された初期の結果は、合成コミュニティが実現可能なアプローチであることを強く示している。このことは、最近行われた、しかしまだ逸話的なマウスと人間での研究でも確認されている（表3）。CDIやおそらく他の疾患の治療のために、合成微生物群集の概念をさらに発展させる必要があることは明らかである。

十数年前に提起された、どれだけの菌株や種が必要かという疑問は、いまだに現実のものとなっている。このことから、安定した群集を形成するのに必要な最小限の微生物群および／または微生物機能として定義できる最小限のマイクロバイオームという概念が提唱されている。微生物群集やそのメタゲノム、機能に関する大規模なデータセットは、世界中で収集されている。これらのデータから、微生物とその機能のネットワークを掘り起こすことで、そのような最小限のマイクロバイオームがどのようなものかを知る手がかりが得られるかもしれない。同様に、腸内微生物と宿主との相互作用の解析もシステムレベルで研究されている（Martins dos Santos et al.） これによって、ミニマムマイクロバイオームの予測に利用できる微生物の構成要素を特定することが可能になる。さらに、細菌マウスから機能化された固体表面まで、新たな微生物株を分離・培養するための多種多様な新しい手段が開発されている（Inghamら、2007；2012；Goodmanら、2011）。したがって、これらの最小限のマイクロバイオームを、合成微生物群に基づく製品に発展させる可能性は十分にある。

合成微生物群集の利点は明らかで、合成混合物の組成を制御し、望ましくない病原体やウイルスが存在しないかどうかを幅広く検査し、再現性よく製造することができる。さらに、生存能力を制御し、最適化することもできる。多くの工業的発酵がこの原理に依存しており、複数菌株のスターターカルチャーやプロバイオティクスの生産など、生存菌株の凍結乾燥または凍結組み合わせの無菌生産も含まれる（de Vos, 2011）。このような合成微生物群集を次世代治療に導入することは、患者に大きな利益をもたらし、腸内細菌叢の理解をさらに進め、医療行為と微生物バイオテクノロジーとの関係を強化することになるだろう。

謝辞
著者の研究は、欧州研究評議会の助成金ERC 250172 - Microbes Inside、フィンランドアカデミーの助成金137389および141140、オランダ科学研究機構の無制限スピノザ賞の支援を受けた。

利益相反
申告なし。

参考文献
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