南極ドライバレー河川における線虫とクマムシの腸内細菌叢の構築には宿主の同一性が支配的要因である
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公開日：2022年11月29日
南極ドライバレー河川における線虫とクマムシの腸内細菌叢の構築には宿主の同一性が支配的要因である
J. パー・マックイーン、ケイトリン・ガットーニ、...ドロータ・L・ポラジンスカ 執筆者表示
Scientific Reports 12巻 記事番号: 20118 (2022) この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
線虫とクマムシの腸内細菌叢を調査した最近の研究から、宿主と腸内細菌叢の構成に種特異的な関係があることが明らかになった。しかし、いずれの動物門においても、調べられた種はほんの一握りである。また、種間でどのようにマイクロバイオームが異なり、どのような要因がその構築に寄与しているのかは未解明のままである。南極ドライバレー河川内のシアノバクテリアマットは、これらの疑問を解決するために、識別可能な微小無脊椎動物の単純で扱いやすい自然生態系を宿している。我々は、空間的に隔離された4つの河川に共存する2種類のマット（すなわち、黒とオレンジ）を採取し、2種の線虫（すなわち、Eudorylaimus antarcticusとPlectus murrayi）およびクマムシの単体個体を手で採取し、16Sおよび18S rRNAメタバーコードを用いてその腸内マイクロバイオームを検討した。すべての腸内細菌叢（細菌および真核生物）は、分離したマットよりも著しく多様性に欠けていた。マットとは対照的に、微小無脊椎動物の腸内はシアノバクテリアが減少し、バクテロイデット、プロテオバクテリア、および真菌の分類群に差をつけて濃縮されていた。調査した要因のうち、腸内細菌叢組成は宿主のアイデンティティに最も影響を受け、環境要因（マットや河川など）はあまり重要ではなかった。腸内細菌叢組成の予測における宿主のアイデンティティの重要性は、宿主に選択された強い微生物叢を持つ他の生物と同様に、宿主にとっての機能的価値を示唆するものであった。
はじめに
多くの動物種（アブラムシ、牛、ヒトなど）の腸内細菌叢は、宿主の生理機能（栄養分の消化、病原体からの防御など）において特異的かつ重要な役割を果たすことが示されている1。これらの動物では、宿主の物理的、化学的、あるいは行動的特性によって生じる要因が、腸内細菌叢の集合と組成を決定的に促進し、その生態進化的パターンは「系統的共生」と定義されています2。しかし、宿主とマイクロバイオームとの関わり方は、実にさまざまである。例えば、一部の動物（トンボや鱗翅目幼虫など）3,4の腸内細菌は、宿主の環境の微生物群集をより反映しており、これらの微生物群を人工的に除去しても宿主の機能には影響がない5。腸内細菌群の集合のパターンやドライバーは、近縁の宿主種間でも大きく異なることがあります5,6。例えば、単一のヤマアリ科の中でも、天蓋アリ（すなわちCephalotes）は、窒素の循環と必須アミノ酸の生成に腸内細菌を利用しているが7、地上アリ（すなわちSolenopsisとPheidole）には腸内細菌6が存在せず、代わりにCephalotesが居住する天蓋には見られない窒素を豊富に含む植物と結合している8。このことは、ある動物の腸内細菌叢は環境要因のみに依存し、宿主の同一性や系統性とは無関係である一方、他の動物は両者の組み合わせによって影響を受けている可能性があることを示唆している9,10。
多くの動物の腸内細菌叢の構築と機能についての理解が進んでいるにもかかわらず、線虫とクマムシの種の微生物叢については最近ようやく研究が始まったところです。線虫は非常に多様なミクロの回虫の一種で、種の豊富さは0.5～1千万と推定されていますが、現在報告されているのは3万以下です11。分類学上の多様性に加え、線虫は生活戦略（すなわち、r-選択型とk-選択型）や食性（例えば、細菌食、雑食、植物寄生、捕食）において幅広い多様性を示す12。TardigradaはNematodaに最も近縁な門であり13,14、解剖学的な大きな違い（例：体節と8脚）にもかかわらず、その消化構造には著しい類似性がある（例：, 咽頭球と食道）、平均体長（1mm以下）、脱皮に基づく成長、食性（例：細菌食、雑食、捕食）、行動（例：採食、無水生の利用）、そして共通の食性ニッチなど、著しい類似点がある15。
線虫は分解や栄養循環などの土壌プロセスにおいて重要であり16、また植物や動物の寄生を介して農業においても重要であるため17、線虫の腸内細菌叢はクマムシのそれよりも注目されている。DNAクローンライブラリーを用いた初期の研究では、いくつかの食菌性線虫種の腸内マイクロバイオームは、異なるレベルの微生物多様性（例えば、Prionchulus sp.よりAcrobeles sp.で高い、Acrobeloides maximusよりCaenorhabditis elegansで高い）により特徴づけられることがわかりました18,19。最近、メタバーコード法を用いて、モデル線虫であるC. elegans（食虫）の微生物群集が調べられ、より詳細に記述されています20,21,22,23,24。現在、C. elegansの腸内マイクロバイオームは、その自然な生息基質（腐った果物）のマイクロバイオームとは異なることが十分に立証されている25。さらに、基質微生物群集が異なる地理的に大きく離れた場所に生息するC. elegansの個体群は、驚くほど類似した腸内細菌叢を有している20,22。さらに、C. elegansとその姉妹種であるC. remaneiの腸内細菌叢を比較すると、摂食習慣と環境ニッチの両方が類似しているにもかかわらず、組成に違いがあることがわかった20。
線虫種の腸内細菌叢は宿主のアイデンティティによって駆動されているように見えるが、C. elegansが異なる環境条件にさらされることによっても腸内細菌叢の組成に影響を与えることができるが、これはまだ十分に解明されていない。例えば、環境温度が高くなると、土壌基質中のSphingobacteriumが濃縮されるが、線虫の腸内では枯渇する。一方、他の細菌分類群（例えば、Agrobacterium）は全く逆の反応を示すことがあり22、線虫腸内マイクロバイオームの形成に環境因子が複雑に作用することが明らかにされている。クマムシのマイクロバイオームは、線虫のマイクロバイオームよりもはるかに研究が遅れているが、宿主特異的であり、周囲の環境とは一貫して異なるようである26,27,28,29,30。しかし、多様な門である線虫の中でも、宿主の同一性の影響は様々に観察されている。例えば、海洋性Litoditis属の2つの隠微な種は異なるマイクロバイオームを含んでいたが31、海洋性33属のより広範な調査では、宿主の同一性や食習慣の重要性は認められず、より確率的な集合であることが示唆されている32。残念ながら、線虫とクマムシの腸内細菌叢はほんの一握りの種についてしか解析されておらず、系統学的に多様で生態系における機能的役割が大きく異なる残りの大多数の微脊椎動物種における腸内生物群集の形成を促す要因についての理解には大きな隔たりがあります。
線虫とクマムシのマイクロバイオーム形成の要因をより系統的に評価するために、私たちはマクマード乾燥谷を簡易な自然生態系モデルとして使用した。マクマード乾燥谷は南極大陸の不凍地域で、植生のない砂利のような土壌、非常に強い風、ほとんど降水がないことが特徴である。土壌内の温度は-59℃33まで下がることがあり、1年の大半は継続的な生物活動が制限される。しかし、南半球の夏の8～12週間は、隣接する氷河を溶かすほど気温が上がり、液体の水が山の斜面を伝って下の盆地に流れ込みます34。今回の調査地であるテイラー谷には、このような季節的に活動する小川が多数あり、永久に氷に覆われた一連の湖（例：フリクセル湖）に流れ込んでいます（図1a）。これらの河川には、形態的に区別できるさまざまなタイプのシアノバクテリアマット（例：ブラックとオレンジ）が存在する（図1b,c）35。それぞれのタイプのマットは、光合成を行うシアノバクテリアの異なる種（黒はNostoc、オレンジはOscillatoriales）が優勢であることが特徴で35、1つの流れの中で互いに隣接しながら、異なるが多様な微生物群集を支えている36。一般に、ブラックマットは河川の縁辺に、オレンジマットは河川の中央部に形成される。どちらのタイプのマットも、2種の線虫（Plectus murrayiとEudorylaimus antarcticus（現在分類学的再評価中））、少なくとも2種のクマムシ（Acutuncus antarcticusとMilnesium sp.）、3-5種のワムシからなる有限で特徴のある微細無脊椎動物群集の生息域となる37, 38,39. P. murrayiはその狭い漏斗状の非武装ストマから細菌食に分類され、E. antarcticusは皮下注射針状の骨片を持ち、雑食に分類される40。E. antarcticusは藻類のみを餌とすると考えられてきたが41、Taylor ValleyのVon Guerard川における同位体CおよびN比を用いた最近の研究から、P. murrayi、クマムシ（A. antarcticusなど）、ワムシは微生物のみを摂取していると考えられるが、E. antarcticusは藻類の代わりに、または藻類に加えて上記の微脊椎動物からなる餌源に依存する可能性が示唆されている42。しかし、これらの微小無脊椎動物の正確な食物源や腸内細菌叢は調べられていないため、生態系における役割の完全な理解は限定的である。
図1
図1
本研究で使用したマットサンプルの場所と種類。(a) 南極のテイラーバレーにあるフリクセル湖流域の地図と、小川に沿った正確なサンプリング地点（白四角）（赤線。1. カナダ・ストリーム、2.ボウルス・クリーク、3.デルタ・ストリーム、4.フォン・ゲラード・ストリーム）。青線は本研究に含まれないその他の河川を示す。(b)ブラックタイプ、(c)オレンジタイプ。オレンジタイプはサンプリング後12ヶ月で再生している。写真提供：Josh Darling、Mike Gooseff。地図はArcGIS Desktop 10.8.2 (http://www.esri.com)で作成。
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本研究では、線虫とクマムシの腸内細菌叢を特徴付けるとともに、その集合体の構造化に役割を果たしうる要因（例えば、流れの同一性やマットの種類などの環境、あるいは宿主の同一性などの宿主特異的要因）を明らかにした。この南極生態系は著しく単純化され、形態的に扱いやすい微小無脊椎動物群集を支えているため、腸内細菌群の集合パターンを自然環境条件下で線虫の種レベルで研究することが可能である。腸内細菌群の細菌成分を説明するだけでなく、宿主に関連する微生物真核生物についても検討した。我々は、すべての微小無脊椎動物の腸内細菌叢は、環境要因よりも宿主の同一性によって主に説明され、したがって、ブラックマットとオレンジマット、そしてすべての河川で一貫していると仮定した。その結果、宿主に関連するすべてのマイクロバイオーム（すなわち、細菌性および真核性）は、マットの微生物群集および互いに区別されることになるであろう。
結果
群集間のα多様性の違い
線虫腸内細菌群集は、形態と一致する18S宿主データに基づいて、E. antarcticusとP. murrayiのそれぞれの種カテゴリーに割り当てられた（方法「無脊椎動物ハプロタイプ」参照）。一方、識別不能な3つの18Sクマムシハプロタイプの回収により、腸内細菌群はTardigradaに割り当てられた。Mat細菌群集は、テストした4つのα多様性指標（すなわち、Richness、Shannon's Index、Simpson's Index、Faithの系統的多様性）すべてにおいて、すべての微脊椎動物腸内細菌群の群集よりも有意（Tukey's HSD、P < 2e-16）に多様だった（図2、補表S1）。一方、群集タイプ（すなわち, mat, E. antarcticus, P. murrayi, Tardigrada）がすべてのα多様性指標に有意であった（GLM, P < 0.001, χ2(3) > 58.21 ）のに対し、マットタイプの影響は見られなかった（P > 0.65, χ2(1) < 0.21）。 21）がバクテリアのα多様性に影響を及ぼした。一方、河川はシャノンの指標とシンプソンの指標（P < 0.01, χ2(3) > 11.47）には有意だったが、リッチネスとフェイスのPD（P > 0.38, χ2(3) < 3.07）には有意ではなかった（補表S1）。また、群集の種類と流れの間の交互作用は、テストしたすべての指標で有意であった（P < 0.001, χ2(9) > 23.59）（補足表 S1a）。E. antarcticusとP. murrayiの腸内細菌叢は、Tardigradaの腸内細菌叢に比べ、Shannon's PD、Richness、Faith's PDでは多様性が低かったが（Tukey HSD, P < 0.05）、Simpsonでは差がなかった（ Tukey HSD, P > 0.39)．Richness、Faith's PD、Simpson'sでは線虫類の腸内細菌群のα多様性に差はなかったが、Shannon indexではE. antarcticusの腸内細菌群が最も多様性が低いことが示された（P < 0.05, Figure 2）。
図2
図2
黒色マットとオレンジ色マットの微生物マットと微小無脊椎動物の腸内細菌群の細菌ASVシャノン多様性（ヒル数）。横線と文字は、GLM、次にTukey HSDによる8つの群集の間の有意差（P < 0.05）を示す。
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微小無脊椎動物では、ほとんどの真核生物リードが予測通り宿主に割り当てられたが（E. antarcticus 89.25%, P. murrayi 99.10%, Tardigrada 99.45%）、除去すると、非宿主真核生物群集をさらに解析できる十分なカバレッジとシーケンス深度があった。真核生物群集は、すべての指標において、非宿主真核生物腸内群集よりも多様性が高かった（Tukey HSD, Richness, Shannon's, and Faith's PD, P < 1.884e-05; Simpson's P = 0.09） (Supplementary Table S2)．真核生物のアルファ多様性は，Shannon'sのみ（GLM, P = 0.06, χ2(1) = 3.57）マットタイプ間で差があったが，Richness, Simpson's, Faith's PD（P > 0.15, χ2(1) < 2.10）には差がなかった．ストリーム間では、RichnessとFaithのPDは有意に変動し（P = 0.02, χ2(3) > 9.82, 補足表S2a）、カナダストリームはより多様だったが（Tukey HSD, P < 0.05 ）、Shannonの指標（P = 0.22）, Simpsonの指標（P = 0.12 ）ではそうではなかった（補足表S2）。細菌の多様性と同様に、Shannon指数では、E. antarcticusの非宿主真核生物群集の多様性が最も低く、次いでP. murrayi、そして最も多様なのはTardigradaであった（Tukey HSD, P < 0.05）（表2b）。Richnessについては、すべての腸内細菌群が同様にマットよりも多様性が低く、FaithのPDでは、P. murrayiとTardigradaは互いに分離したものの、他の2つの微小無脊椎動物群のE. antarcticusに有意差が重なった（Tukey HSD, P < 0.05） (Supplementary Table S2).
細菌群集の組成の違い
黒色マットとオレンジ色マットは、2つの異質な微生物群集を形成していた。マットの種類（PERMANOVA, P < 0.003, F(1) = 3.94）と河川の種類（P < 0.003, F(3) = 4.04）は、細菌群集の構成に有意に影響したが、主にマットタイプごとに群集が分かれ（補図S1a）、カナダ流の群集だけが他の流域の群集から分離された（補図S1b）。その結果、他のすべてのストリームがNMDS空間において重複しているにもかかわらず、マットの種類（10％）と比較して、ストリームは最も多くのバリエーション（32％）を説明した（補足表S3a）（補足図S1b）。一方、微小無脊椎動物の腸内細菌は、マットの種類（補足図S2a）や流路によってクラスター化せず、宿主の同一性（E. antarcticus、P. murrayi、Tardigradaなど）によってクラスター化していた（補足図S2b）。調査したすべての因子は腸内細菌叢組成に有意な影響を与えたが（PERMANOVA, P < 0.05, F(1-6) > 0.48）、マットタイプとストリームはそれぞれ微生物群集の変動の1％と4％を説明するに過ぎなかった（補表 S4a）。一方、宿主のアイデンティティは腸内細菌群の集合体において最も支配的な役割を果たし、全変動の14％を説明した。しかし、変動の大部分（72％）は説明されないままであった。属レベルで分類すると、Tardigrada内の75％、P. murrayi内の78％、E. antarcticus内の87％の分類群がマットと共有されることが判明した。残りの腸内細菌はどのマットにも含まれず、全サンプルに渡って低濃度であった。黒色マットとオレンジ色マットは40%のASVを共有し、27%のユニークなASVは黒色マットに、33%はオレンジ色マットに割り当てられた。しかし、属レベルでは、71%の属が両方のマットタイプで観察され、ブラックマットでは17%、オレンジマットでは13%のユニークな属が観察された。
藍藻、バクテロイデッタ、プロテオバクテリアは、すべてのマイクロバイオームにおいて最も豊富な植物相であり、全生物相の86.40%を占めた（図3a、補足表S5a）。指標種の分析では、シアノバクテリア、バクテロイダス、プロテオバクテリアが4種類の微生物群集を有意に示唆することが確認された。予想通り、シアノバクテリアはマット群集の指標となる門で、他に6つの指標となる門があったが、それらの累積相対存在量は低かった（<1.2%）。E. antarcticusの腸内細菌叢では、Proteobacteriaが唯一の指標となった。一方、P. murrayiの腸内細菌叢では、Bacteroidotaが唯一の指標となり、Tardigradaの指標にもなっていた。PatescibacteriaはTardigradaの微生物群にも含まれるが、全微生物群の0.1％未満、Tardigradaの微生物群の0.28％未満であった。捕食性細菌の一種であるBdellovibrionotaは、マット（0.2%）に対してすべての腸型（1.02%）で濃縮されていた。群集内での割合が高いことと、指標種としての重要性の両方から、最も豊富な3つの門の分類群を選択して、さらに解析を行った。
図3
図3
マットと無脊椎動物腸内細菌群集の相対的存在量 (a) 細菌門、(b) シアノバクテリア属、(c) バクテロイデス属、(d) プロテオバクテリア科。横線と文字は、GLMMとTukey HSDで検証した8つの群集の間の門レベルでの統計的差異（P < 0.05）を示す。エラーバーは門全体の標準偏差を示す。
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3つの主要細菌門の相対存在度に関して、マットの種類の影響は見られなかったが、群集の種類の影響は非常に強かった（GLMM, P < 1.39e-15, χ2(3) > 72.28, Supplementary Table S7a）。河川は藍藻類とバクテロイデータの現存量に有意な影響を与えたが (P < 0.001, χ2(3) > 14.98) 、プロテオバクテリアには影響を与えなかった (P = 0.11, χ2(3) = 5.93)．藍藻については、どちらのマットタイプも全体的な相対量は同程度であったが（黒とオレンジでそれぞれ48%と45%、図3a、補足表S5a）、オレンジマットではPhormidiumが70.8%、黒マットではNostocが87.2%多く含まれた（図3b、補足表S5b）。マットと比較すると、すべての微小無脊椎動物腸内細菌叢はシアノバクテリアを著しく減少させ（図3b）、互いに比較すると同程度の量のシアノバクテリアを含んでいた。藍藻ノストックの寄与は、両マットタイプで平均19.2%から腸内細菌叢では0.2%に減少していた。腸内細菌群では、藍藻チコネマがノストックよりも一桁多く存在したが、その相対量は、すべてのマットで7.5%と腸内細菌群（3.4%）の2倍以上であった。
マットと比較して、P. murrayiとTardigradaの腸内細菌叢は、E. antarcticusではなく、同様にBacteroidotaに富んでいた（Tukey's HSD, P < 0.05） (Fig. 3c, Supplementary Table S5a)．P. murrayiとTardigradaの腸内細菌叢は、門レベルではBacteroidotaの相対的な存在量が同程度であることが特徴であるが、属レベルではTardigradaのマイクロバイオーム分類群はマットと似ているが相対存在量はより多かった。一方、P. murrayiの腸内細菌叢はマットやTardigradaとは異なり、Larkinella1属が37%を占め、他のすべての微生物叢の0.03%に比べ有意に豊富だった（図3c、補足表S5b）。Tardigrada、P. murrayi、マットはいずれも同様のプロテオバクテリア群集を含んでいたが、E. antarcticusの腸内マイクロバイオームはプロテオバクテリア、特にPseudomonadaceae科の細菌に著しく富んでいた（Tukey HSD, P < 0.05） (Fig. 3d)。E. antarcticusのプロテオバクテリアには、細胞内共生細菌として知られるRickettsiaceaeの分類群も含まれる。また、細胞内共生細菌として知られるWolbachiaは、どのマイクロバイオームにも含まれていなかった。Comamonadaceaeは、Proteobacteriaの中で最も豊富な科であるが、Polaromonasがほとんど（97.91%）を占めていた。
線形判別分析効果量アルゴリズム（LEfSe）は、これらの構成結果を確認し、さらに精緻化した。LEfSeは、4つの群集タイプ（すなわち、マット、E. antarcticus、P. murrayi、Tardigrada）（LDA効果量=4、P < 0.05）（図4）の影響を特に受ける異なる分類学的ランクで合計49の特徴的な分類群を識別したが、ストリーム（カナダ、Bowles Creek、Delta、Von Guerard）またはマットタイプ（黒またはオレンジ）について試験した場合には、特徴的分類群は存在しなかった。藍藻類（門）と藍藻綱（綱）はマット群集に最も関連する分類群であり、Proteobacteria（門）とGammaproteobacteria（亜門）はE. antarcticusの腸内群集に最も関連する分類群だった（Fig.4b）。また、酸菌門と放線菌門はE. antarcticusの腸内細菌群集を示唆する他の2つの門であったが、効果量スコアが低かった。一方、P. murrayiとTardigradaの腸内細菌群には、特徴的な門レベルの分類群は存在しなかった。その代わりに、P. murrayi腸内細菌群の最も有意な分類群はCytophagales（目）、Spirosomaceae（科）、Larkinella（属）であり（図4b）、CytophagalesとSpirosomaceaeはLarkinellaの目および科であることから分類学の一致が強調されている。また、Tardigrada属の宿主の中で最も重要な5つの分類群はすべてBacteroidia（クラス）であり、目以上のレベルで重要な分類群は1つもなかった（Fig. 4b）。また、P. murrayiとTardigradaの1つの分類群を除くすべての分類群は、同じクラス（Bacteroidia）であった。しかし、目、科、属の各レベルの指標分類群はすべて宿主特異的であった。全グループの指標となる細菌分類群のうち、細菌ツリー全体では宿主タイプの重複はほとんど見られず（図4a）、ある宿主微生物群の49分類群のうち5分類群だけが別の宿主微生物群の中に入れ子状に存在していた。
図4
図4
LEfSe（線形判別分析効果量）分析により、マット、線虫（E. antarcticusとP. murrayi）、Tardigradaマイクロバイオーム内の異なるレベルの分類学的分解能で、最も有意な細菌分類群の濃縮を表示。結果は、(a)分類学上の異なるランクを表す円（最も内側の円が門、最も外側の円が属）、およびコミュニティ固有の有意なクレード（P < 0.05）を青（マット）、赤（E. antarcticus）、緑（P. murrayi）、紫（Tardigrada）で着色したクラドグラムに視覚化されている（クラスカル・ウォリスおよびウィルコクソン検定により決定された）。(b) 各有意なクレードのLDA効果量スコアは、他の有意な分類群との比較において、その相対的な重要性を示す。クレードの識別は、クラドグラム自体に書かれているか、効果量スコアの基部にある完全な文字列に隣接して略されている。
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マットと微小無脊椎動物内の明らかに異なるマイクロバイオームは、その機能的特性の予備的予測によっても支持された。PICRUSt2を用いて、マット群集の機能プロファイル（補足図S3）は、主にマットタイプ（PERMANOVA、P = 0.04, F(1) = 2.76）、およびストリーム（P = 0.07, F(3) = 1.79）によって変化したが、ストリームはモデルにおける変動の倍以上（21.2% vs 10.9%）を説明することが示された。細菌組成データと同様に、微小無脊椎動物腸内細菌群の機能プロファイル（補足図S4）は、宿主同一性（PERMANOVA、P < 0.01, F(2) = 21.10）, マットタイプ（P = 0.04, F(1) = 2.16）, およびストリーム（P < 0.01, F(3) = 8.60）により統計的に変化していることが明らかになった。しかし，宿主の同一性は，マットの種類（< 0.1%）や川の流れ（7.2%）よりも多くのバリエーションを説明し，機能プロファイルにおいて最も重要な要因であった。
真核生物群集の組成の違い
真核生物マットの群集は、クマムシ、ワムシ、線虫、藻類で占められていた（補図S5）。マットの真核生物組成を調べたところ、マットの種類（PERMANOVA, P = 0.03, F(1) = 2.37）および河川間（P < 0.001, F(3) = 6.18）で有意差があったが、河川の方がマット種類（5.2%）よりはるかに多くの変動（40.7%）で説明できた（補表 S3b）。カナダ川はマット群集にとって特に重要であり、全体の流れの説明変数の半分を占め、この場所のマットの特異性を浮き彫りにしている。微小無脊椎動物の非宿主真核生物群集の組成の違いは、微小無脊椎動物の種類によって異なっていた。非宿主真核生物群集に対して、河川、マットタイプ、宿主タイプの影響はいずれも統計的に有意であったが（P < 0.001, F(1-3) > 1.78）、細菌群集と同様に、宿主同一性が最も変動を説明し、次いで河川 (2.5%) およびマットタイプ (0.8%) となった（補表 S4b）。指標種の分析では，メタゾアとクロロプラストダがマット群に関連し（それぞれP < 0.001, R2 = 0.69, 0.43），一方，3種の微小脊椎動物はすべて，分類学上の順位では王国レベルで菌類（P < 0.001, R2 = 0.69）の重要性を共有していた．
微小無脊椎動物腸内共生生物群では、真菌類が67.3％と最も多く、次いで微生物真核生物（SARスーパーグループを含む）、後生動物が続いた（補図S5）。マットと比較すると、すべての微小無脊椎動物腸内細菌叢は真菌に有意に（Tukey HSD, P < 3.54e-07） 富み（それぞれ3.3% vs. 48.9-78.5% ）（補足図S5b）、結果として全体の群集組成に相応の変化をもたらしている。E. antarcticusのFungiの相対量はP. murrayiとTardigradaの相対量（それぞれ48.9%、76.7%、78.5%）より有意に低かった（補足図S5b）。マットの種類とは対照的に、河川は腸内の真菌量に影響を与えた（GLMM, P = 0.03, χ2(3) = 9.00, 付表S7）。マットと比較して、すべての腸内細菌叢はPezizomycotina亜門に支配され、Blastocladiomycotaは枯渇した（Tukey HSD, P < 0.05） （補足図S5b）。また、無脊椎動物の腸内細菌群集は、EurotiomycetesとLeotiomycetesが最も多く（15.7％と9.5％）、構成的に類似した分類群の高い多様性を含んでいた。
メタゾアンは群集の種類によって相対的な存在量に有意な差があったが（GLMM, P < 0.01, χ2(3) = 84.74）、マットタイプや流れの影響はなかった（P > 0.47, χ2(1,3) < 2.51, 付表S7c）。E. antarcticusの腸内細菌叢では，P. antarcticusやTardigradaに比べて非宿主メタゾーンのASVが有意に多かった（Tukey HSD, P < 0.001, 付記図S5a）．E. antarcticusの真核生物群集は、ほとんどがクマムシ由来（22.9%）とワムシ由来（5.2%）であった（Supplementary Fig.S5c）。興味深いことに、すべての微小無脊椎動物の腸内で、ローティファーASVが同程度の相対量で検出された（Tukey HSD, P > 0.32）。P. murrayiのリードはE. antarcticusの1標本からのみ検出され、Tardigrada 94標本のうち7標本ではP. murrayiのリードは極めて低い量（< 0.1%）であった。P. murrayiの内臓やクマムシの内臓からはE. antarcticusのリードは検出されなかった。
微小脊椎動物のハプロタイプ
E. antarcticusとP. murrayiの宿主18S ASVデータは、予想通り、すべてのサンプルでそれぞれ単一種であることを示唆した。しかし、宿主の18S ASVデータからは、3つのクマムシの分子ハプロタイプが存在する可能性が示され、いずれも既知のDry Valleyクマムシ（Hypsibiidae Acutuncus antarcticus、Macrobiotidae Richtersius and Paramacrobiotus、またはMilnesiidae Milnesium）と同じ割り当てであることがわかった。テストしたアルファ多様性指標も、3つの優勢な細菌門（すなわち、シアノバクテリア、プロテオバクテリア、バクテロイダス）の相対存在度も、3つのハプロタイプ間で変化しなかった（GLM、P > 0.43, χ2(2) < 4.21）（ 補足図 S6）。細菌群集組成は、河川とハプロタイプでそれぞれ9.9%と8.1%の変動を説明し、統計的に変化したが、NMDS空間では完全に重なり合うように整列した（補足図S7）。したがって、本研究では、ハプロタイプの同一性が確認できないため、3つの宿主ハプロタイプの可能性を組み合わせて検討した。
考察
本研究は、線虫とクマムシの腸内細菌群の系統的範囲を拡大するとともに、その集合の特定の要因の重要性について新たな知見を提供するものである。多くの動物が明確なマイクロバイオームを形成する一方で、このパターンは普遍的なものではありません。むしろ、腸内細菌群集は周囲の環境を反映していたり、ランダムであったり、あるいは存在しないこともある5。線虫やクマムシのマイクロバイオームがこれまで報告されている数は限られているため、どのような要因が彼らの腸内環境を形成しているのかを予測することは困難でした。生態系における線虫やクマムシの重要性16から、様々な生息環境から幅広い宿主を調査することは非常に重要である。
我々の仮説通り、微小無脊椎動物の腸内細菌叢は、環境要因（マットの種類、河川など）よりも宿主の同定によってよりよく説明された。すべての腸内細菌は、細菌成分、真核生物成分ともに、生息する環境の微生物群集とは多様性が低く、組成的にも異なることが観察された。分類学的解像度の粗いレベル（門）では、指標分析および相対存在度の統計検定により、細菌食性のP. murrayiとクマムシのマイクロバイオームは類似しており、両者は雑食性のE. antarcticusとは有意に異なることが示された。これは腸内マイクロバイオームの構築に摂食特性が関与している可能性を示すものである。しかし、LEfSeアルゴリズムと目、科、属の相対的な存在量から、宿主の同一性が線虫とクマムシの腸内細菌叢の構築において最も支配的な要因であることが示された。環境因子（マットの種類や河川など）の役割の可能性も認められたが、これらの因子は3つの微小脊椎動物の同一性よりも少ない変動しか説明しなかった。これらの結果は、周囲の基質から比較的独立した保存された腸内細菌叢の存在を示す線虫の文献とほぼ一致する25。興味深いことに、これまでに報告された線虫の腸内は、今回調べたP. murrayiの腸内を支配していたバクテロイダス菌ではなく、プロテオバクテリア25が支配的であった。両種とも細菌食性であるが、生息場所の好み（腐敗果実と水生シアノバクテリアマット）の違いや、おそらく系統的配置（RhabditidaとPlectida）が、摂食特性よりも腸内細菌叢の構築に重要である可能性もある。それでもなお、P. murrayiのマイクロバイオームでは、Proteobacteriaが主要な構成要素であることに変わりはなかった。また、雑食性のE. antarcticusの腸内細菌は、陸上雑食性線虫Dorylaimus stagnalis43の唯一の研究と同様に、Proteobacteriaが支配的であり、線虫門全体にとって重要である可能性が示唆された。クマムシの腸内細菌叢は、これまでの報告よりもさらにバクテロイデスとプロテオバクテリアの両方に濃縮されており26,27、線虫とクマムシの腸内細菌叢におけるこれら2つの細菌群の機能的役割が示唆された。フラボバクテリウム属とフェルジニバクター属は、すべてのマイクロバイオームにおいて最も豊富な2つの属であり、他の南極クマムシ26や、特に完全給餌（すなわち、飢餓ではない）南極クマムシ30で観察されており、これが再度の食物源であることが示唆された。興味深いことに、LEfSeアルゴリズムはP. murrayiとクマムシには門レベルの有意性を認めなかったが、E. antarcticusには認めた。このことは、E. antarcticusが幅広い餌カテゴリー（すなわち、菌類、細菌、藻類、マイクロメタゾア）を食べる雑食性であるだけでなく、各餌カテゴリー内の分類群（すなわち、多くの種類の細菌）を食べる一般性であるという考えを支持するものであった。しかし、E. antarcticusの個体は、他のすべての微小無脊椎動物よりも多様性が低く、E. antarcticusの集団は幅広い分類群を摂食することができるが、個体はそうではないことが示された。
宿主の同一性」という抽象的な表現には、腸内細菌叢の形成に影響を与える様々な種特異的要因が含まれていると思われる。例えば、多くの線虫やクマムシは、一般に科や属のレベルでは細菌食性に分類されるが、種特異的な食性44が腸内細菌叢の構築に選択的な圧力をかけている可能性がある。これは、腸内細菌群の構成要素となりうる細菌は、まず動物の口を通過しなければならないという事実が、特定の細菌分類群に対する選択的バリアとして作用している可能性があり、動物のストーマの大きさが、口や消化器官に入るには大きすぎる細菌に対する選択層を課していることによって説明できるかもしれない。線虫はより小さな細菌を容易に摂取することができる45,46,47ので、この考えは支持されるだろう。同様に、我々の研究ですべての微脊椎動物の腸から大きなサイズのNostoc（細菌あたり〜4μm径48、コロニーは2cm〜20cm）が枯渇したことは、E. antarcticusがその歯状突起で大きな細胞を貫通できるかどうかは不明だが、小さなストーマサイズ（P. murrayiでは〜3μm径49）によって説明できる可能性がある。線虫の食道形態は、線虫を単に通過するのではなく、何が腸に定着できるかに関与している可能性もある。例えば、大腸菌で培養したC. elegansとP. pacificusのTEM画像では、食道研磨器の有無により、それぞれ壊れた大腸菌と壊れていない大腸菌の細胞が観察された50。P. murrayi は食道粉砕機を備えているため、腸に定着できる細菌は、この浸漬工程で生存能力を維持できるほど小さく、かつ／または抵抗性でなければならない。
形態的な制約による生物群集のフィルタリングに加え、行動的な要因も重要であると考えられる。例えば、C. elegansは食物嗜好性アッセイを用いて、C:N比の高い細菌と低い細菌を識別することができることが示されている46。このような細菌の餌の質を識別する能力は、細菌を食べることができない線虫（例えば、植物寄生性線虫）でも観察されており51、餌の質の感知はすべての線虫マイクロバイオームにとって考慮すべき重要な要因であることが示唆されている。しかし、線虫は腸に定着しない細菌でも培養可能であることを忘れてはいけません。その他にも、あまり理解されていない行動学的要因が関係している可能性があります。例えば、南極の海岸線に生息するPlectus種は、プロテオバクテリアのPolaromonas52を好んで食べることがわかった。このPolaromonasは、マットと同様に我々のすべての微小無脊椎動物で観察されたコマツナギ科の最も豊富な分類群である。さらに、Polaromonasは南極クマムシのマイクロバイオーム内に存在することが以前に報告されており30、Polaromonasが南極の微小脊椎動物にとって共通の食物源である可能性が示唆された。残念ながら、ごく少数の摂食アッセイ研究を除けば、ほとんどの線虫やクマムシの実際の摂食嗜好についてはほとんど知られておらず、生態系機能におけるこれらの役割の理解を妨げている。腸内細菌群の研究は、他の動物で行われているように、この知識を迅速に拡大するための新しいメカニズムです53。
線虫やクマムシの腸に入るものすべてが宿主に定着するわけではなく、一部の細菌は一過性の内容物に過ぎない可能性があります。この2つを区別するのは方法論的に難しいが、自然環境で多様なマイクロバイオームを確立した線虫の標本は、大腸菌の培養液に移植してもその腸内細菌群を維持することが示されており20、線虫の腸内細菌群は一度確立すると安定で変化に強いことが示唆される。腸内細菌群のごく一部には、興味深いことにマットから姿を消したものがあった（E. antarcticus内の属の13%、P. murrayiの22%、クマムシの25%）が、それらはすべて存在量が低く、共通の系統のものであった。しかし、マット中にこれらの動物が存在しないのは、分析されたマットサンプルの数が腸（251）よりも少ない（24）ことによるアーチファクトである可能性がある。全体として、本研究のすべての微小無脊椎動物種は種特異的な細菌マイクロバイオームを示し、河川やマット間でほとんど変化がなかったことから、本研究で調べた腸内コミュニティは実際の居住微生物で構成されていると考えられるが、この分野でのさらなる研究が必要であろう。
線虫やクマムシによく見られる細胞内寄生虫であるWolbachia28は、本研究ではどの無脊椎動物の腸内にも見いだせなかった。しかし、姉妹関係にあるリケッチア科の他の細胞内細菌は、非常に低濃度ではあるが検出された。また、P. murrayiの腸内では、Larkinella sp.が最も多く、かつ最も示唆に富む細菌であることが確認された。この属の機能についてはあまり知られていないが、分離株はピンク色の馬蹄形の細胞に成長するため54、将来的にはin vitroでの研究の可能性がある。しかし、現在のところ、P. murrayiの腸内にLarkinellaが濃縮されている理由や、共生機能の可能性は不明である。
本研究で採取した3種の微小脊椎動物はすべて、主に真菌からなる真核生物の腸内マイクロバイオームを含んでいた。真菌のマイクロバイオーム（すなわちマイコバイオーム）は、海産線虫で1回32、クマムシで1回30報告されているだけで、いずれもマイコバイオームがよく発達していることが示唆されている。その結果、全ての宿主で最も多く存在する真菌ASVは、Tetracladium furcatumやPyronemataceaeなどの子嚢菌類であり、いずれも河川の腐敗物を捕食する水生菌として知られている。雑食性の線虫（E. antarcticus）のマイクロバイオーム中に真菌が存在することは驚くべきことではありませんが、細菌を餌とすると推定されるP. murrayiが雑食性のものより高いレベルの真菌を含んでいたことは興味深いことです。これは、P. murrayiが菌類から栄養を得ていなくても菌類を摂取しているように見えることから、これまで線虫の摂食カテゴリーに割り当てられていたものが、生態系における線虫の機能的役割を正確に反映していない可能性を示しているのかもしれません。興味深いことに、すべての微小無脊椎動物の腸内の菌類群集はほぼ類似していたが、以前にイタリアの氷河で記録されたクマムシの菌類群集とは異なっており30、群集形成の地理的役割の可能性が示唆された。宿主以外の真核生物の腸内内容物の解析では、E. antarcticusがこの生態系における唯一の雑食・捕食者であると推定される根拠を見出した。E. antarcticusの腸内細菌は、クマムシとワムシを起源とする後生動物のASVが最も多く存在することが特徴的であった。P. murrayiとクマムシは、他の後生動物、特にワムシの相対量が少なかったが、これは直接捕食されたというよりも、壊れた細胞から浮遊するDNAをフィルターにかけた結果であると思われる。さらに、陰性コントロールには汚染の証拠がなかった。E. antarcticusの腸内でP. murrayiが大量に検出されたことは、E. antarcticusが他の線虫を常に捕食しているわけではないが、捕食する能力を保持していることを示唆しているのかもしれない。
本研究では、宿主の特定がマイクロバイオームの変動の最大割合を説明したが、変動の大部分は説明できないままであった。これは、非生物的環境要因、確率論、生物地理学、マイクロバイオーム間相互作用などの他の要因が作用している可能性を示唆している。線虫の先行研究では、腸内における細菌間競争の存在が示されており55、基質の多様性が高いほど、腸内細菌叢の確率は低くなる56,57。しかしながら、我々は、測定された環境因子に対する宿主のアイデンティティ（摂食特性よりも）が、南極ドライバレー河川に生息する線虫やクマムシの腸内細菌叢を形成する、より重要な因子の一つである可能性を示している。PICRUSt2から得られた機能プロファイルは、限られた範囲ではあるが、この生態系における機能的役割の違いを示唆するユニークな微生物相の構成と一致した。しかしながら、宿主の同一性の影響は線虫類で様々に観察されており、宿主の同一性の役割と機能的役割を確認するためには、様々な地理的位置からより多くの種を用いた追加研究が必要である。
結論
線虫とクマムシの腸内細菌については、これまでごく少数の種についてしか報告されておらず、これらの系統学的および栄養学的多様性が十分に反映されているとは言えません。その中で、これらの微生物群集を形成する原動力が何であるかを調べる研究はさらに少ない。我々は、南極ドライバレー河川のシアノバクテリアマットを自然の生態系モデルとして用い、これらのマットに生息する線虫とクマムシが、互いに、また生息する周囲の微生物群集とも異なる腸内細菌相を持つことを明らかにすることができた。細菌門レベルでは、栄養レベルは似ているが（細菌食性）系統的に異なる微小無脊椎動物（P. murrayiとクマムシ）は、系統的に近いが栄養レベルは異なる（細菌食性と雑食性）2種の線虫よりも類似したマイクロバイオームを有していたが、より正確な分類レベルでは、宿主同一性が最も重要な集合要因であった。しかし、この考えを完全に支持するためには、栄養学的および系統学的多様性の全範囲を代表する追加種を調べる必要がある。
方法
試料採取と DNA 処理
藍藻マットは、南極大陸のTaylor ValleyにあるLake Fryxell Basin (77°36′21″S 163°07′32″E) の季節的に活発な4つの川 (1. Canada, 2. Bowles Creek, 3. Delta, 4. Von Guerard) から採取した (Fig. 1)。流路長は0.49 km (Bowles Creek) から5.89 km (Delta Stream) で、平均3.2 ± 2.3 kmであった。カナダ・ストリームとボウルス・クリークはアスガルド山脈にあるカナダ氷河から流れ、デルタ・ストリームとフォン・ゲラード・ストリームはククリ丘陵にある氷河から流れている。各ストリーム内で、「黒」と「オレンジ」の両方のマットタイプがある代表的な円形プロット（半径2m）を、流量計の上流でランダムに1つ選んだ。2019年1月、滅菌メスで7cm×7cmを1枚切り出し、それぞれを滅菌100mLガラス瓶に入れ、合計24枚のマットサンプル（4ストリーム×2マットタイプ×3複製）を各マットタイプの3複製を収集した。サンプルは-20℃で凍結し、フロリダ大学に輸送し、処理まで-20℃で保存した。マットはゆっくりと4℃まで解凍し（24時間ごとに10℃ずつ上昇）、滅菌シャーレに入れ、解剖顕微鏡で観察した。Eudorylaimus antarcticus (n = 88) (現在分類学的再評価中), Plectus murrayi (n = 176), tardigrades (n = 94) と視覚的に識別された微脊椎動物個体を金属ピックで収集し、物理的に動かし、冷たい滅菌水で3回洗浄した後に攪拌した。これまでの研究では、外部に付着した微生物を効果的に除去するために同様のプロセスを確立してきた22,32。洗浄後、単一の無脊椎動物個体を、25μLの溶解バッファー（800μg/mL proteinase K, 0.2 M NaCl, 0.2 M Tris-HCL pH 8.0, 1% beta-mercaptoethanol）58を含む別々の250μLマイクロチューブに設置した。チューブは、解剖スコープで検査し、微小無脊椎動物1匹だけが溶解バッファに入れられたことを確認した。微小無脊椎動物が入っていない陰性対照チューブ（n = 7）も、同様の方法で調製した。宿主およびマイクロバイオームの全DNAは、チューブを65℃で120分間インキュベートしてプロテイナーゼK酵素の活性を最大化し、その後100℃で10分間不活性化することにより抽出された。基質マットDNAは、DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN）を用いて、300μLの混合マットスラリーからメーカーのプロトコルにしたがって抽出された。ハイスループットなメタバーコードを使用して、微小無脊椎動物個体およびそれらが分離されたマット基質内に存在する細菌および真核生物の微生物群集の特徴を明らかにした。Earth Microbiome Project のプライマーと PCR 条件を使用して、16S (515F/926R) および 18S (1391f./EukBr) rRNA 遺伝子マーカーを増幅した59 (Supplemental Methods S1)。PCR産物はゲル電気泳動で可視化し、増幅に成功したことを確認した。陰性対照を含む3つのPCR複製（それぞれ1μLのDNAテンプレートで増幅）をプールし、ニューハンプシャー大学のHubbard Center for Genome Studiesに送り、インデックス（Golayバーコードを使用）59、ライブラリー作成、Illumina HiSeq 2500 (2 × 250 bp) (Illumina Inc., CA, USA) でのペアエンドシーケンスを実施した。
バイオインフォマティクスとコミュニティーの処理
シーケンサー施設でのリードデマルチプレックスに続き、QIIME260を使用してリードの処理を行った。まず、アダプター配列とプライマー配列をcutadapt61で除去し、QIIME2のquality-filterプラグインで、平均品質スコア30以下になる塩基対を除去してリードをトリミングする品質フィルタリングを実施した。Reverse 16Sリードはquality filteringの結果、長さが足りないため廃棄し、対になっていないforwardリード（196 bp）はDADA2 pipeline62を用いて類似度100%のASVを作成するためにノイズを除去した。18Sリードを125bpにトリミングしてからDADA2で結合し、平均131bp、最大172bpの100%ASVを作成しました。両パイプラインとも、DADA2内蔵のアルゴリズムでキメラを除去しました62。QIIME1.963 の BLAST で assign_taxonomy.py スクリプトを使用して各 ASV に分類を割り当て、16S は SILVA v138 データベース、18S は SILVA v111 データベースと比較し、どちらも「未培養」と識別されたすべての参照配列を除去するようにフィルターをかけました64。群集のフィルタリングは、phyloseqパッケージ65を使用して実施されました。16S ASVテーブルの非細菌配列と18S ASVテーブルの非真核生物配列は除去された。さらに、特定の微脊椎動物宿主にヒットした18S配列は、その宿主のASVテーブルからのみ削除し、割り当てが不十分な（すなわち、クエリーカバレッジ90%未満、ID95%未満）18S ASVは、すべての宿主から削除されました。陰性コントロールで同定された配列は、実験サンプルから差し引いた。Phormidum/Phormidesmis66,67,68 のシアノバクテリアクレードは不確かなため、Phormidesmis に割り当てられたリードは Phormidium に割り当てられた。最後に、16Sリードと18Sリードの合計が100個未満のサンプルは、種の希薄化曲線が水平漸近に達したことに基づいて廃棄された。さらに、E. antarcticusの9サンプルは、特徴的な低い多様性を持つ極端な外れ値として削除された。処理・フィルタリングの結果、微小無脊椎動物251サンプル（E. antarcticus 52、P. murrayi 110、tardigrades 89）とマット24サンプルから、細菌4,233,899リード、真核生物1,040,761リードが回収されました。簡略化のため、サンプル内で検出された微生物群集全体を「マイクロバイオーム」と定義し、言及していますが、今後の研究により、腸内の常在菌と一過性の生物を区別することができるようになる可能性があることを認識しています。
統計と可視化
統計はR Version 3.6.169 (http://www.r-project.org)で実施した。アルファ多様性メトリクス（すなわち、ASV Richness、Simpsonの、Shannonの、およびFaithの系統的多様性）は、hillRパッケージ70のhill_taxaを使用してHill Numbersで計算された。群集の種類（マット、E. antarcticus、P. murrayi、Tardigrada）、マットの種類（黒、オレンジ）、河川（カナダ、Bowles Creek、Delta、Von Guerard）、および選択した相互作用がα多様性の異なる指標に及ぼす影響については、標準正規分布（αDiversityMetric ~ CommunityMatStream）を用いて同じ一般線形モデル（GLM）を用いて検定された。モデル内のテストされた変数の有意性は、II型二乗和分散分析を用いてPとχ2によって評価された。すべてのモデルは、DHARMaパッケージ71を使用して残差を調べることにより、正確なモデルを構築し、選択した。Tukey's HSDは、異なる群集の宿主の同一性間の有意性を比較するために使用した（例：オレンジマットのP. murrayiと比較したブラックマット、ブラックマットのクマムシと比較したオレンジマットのクマムシなど）。マット間および微小無脊椎動物間の全体的な群集組成の違いは、各グループに対する検討因子の重要性（R2）をより正確に評価するために、別々のBray Curtis非類似度行列（1つはマットのみ、1つは微小無脊椎動物のみ）に基づいて、vegan 2.5-772 のadonis関数で999個の並べ替えによる置換分散分析（PERMANOVA）で検定し、P値とF値で有意性を評価しました。PERMANOVAはマットについては（DistanceMatrix ~ MatStream）、微小無脊椎動物については（DistanceMatrix ~ HostIDMatStream）を用いて実行された。順序付けはphyloseq65内の距離関数で作成したNMDS順序付けプロットを用いて可視化した。一般化線形混合モデル（GLMM）は、glmmTMBパッケージのglmmTMBで構築し、河川（カナダ、ボウルスクリーク、デルタ、フォンゲラード）、マットタイプ（黒、オレンジ）、群集タイプ（マット、E. antarcticus、P. murrayi、クマムシ）の影響を検証するために実施された。murrayi, tardigrade），およびそれらの相互作用が，選択した細菌群および属の相対存在量に及ぼす影響について，すべての要因を固定効果，ストリームを追加ランダム効果として，過分散を考慮したベータ分布73（RelativeAbundance ~ CommunityMat + MatStream + CommunityStream + (1|Stream)) とした。GLMMモデルにおける被検変数の有意性はPとχ2によって評価した。微生物群集にとって最も重要な分類群を門レベルで同定するために、indicspecies パッケージを用いて 9,999 回の順列で指標種分析を行った74。さらに、線形判別分析効果量（LEfSe）を属レベルまで実施した75。LEfSeアルゴリズムは、一貫性評価（非対ウィルコクソン順位和検定 P < 0.05）と効果量（LDA）75を使用することにより、数学的（クラスカル・ワリス和順位検定 P < 0.05）かつ生物学的に有益な特徴を持つ分類群を特定する。LEfSe は、他の統計ツールでは不可能な微生物群集の分類学的ランク付けの検討を提供する。例えば、LEfSe は宿主微生物相を示すものとして科を強調できるが、その中の属やその上の目には注目しない。我々の分析では、Huttenhower lab Galaxy server75 (https://huttenhower.sph.harvard.edu/)の1-against-allメソッドとそれ以外のデフォルトLEfSeパラメータを使用して、4のLDA効果サイズスコアを適用しました。LEfSeクラドグラムはHuttenhower lab Galaxyサーバーからエクスポートされ、Adobe illustratorでわかりやすく修正された。微生物群集内の機能プロファイルの初期予測はPICRUSt276を用いて行い、上述のPERMANOVA方程式を用いて検証したが、機能予測にアンプリコンデータを用いることの限界77と南極細菌ゲノムのデータベースが限られていることから、本研究では焦点としなかった。サンプリングマップはArcGISで作成した。その他の図はすべてRでggplot2により作成した。
データの入手方法
NCBI Sequence Read ArchiveのプロジェクトID PRJNA799934 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PRJNA799934)で生リードを入手できる。バイオインフォマティックパイプライン、図作成、統計解析のコードは、http://www.wormsetal.com/antarcticstreamgutmicrobiomes および www.github.com/WormsEtAl/AntarcticStreamGutMicrobiomes で公開されている。
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謝辞
本研究で使用した試料を採取していただいたJosh Darling氏とMcMurdo Dry Valleys LTERに感謝の意を表したい。この研究は、NSF Office of Polar Programs Awards 1443578と1443373、およびフロリダ大学から資金提供を受けて実施した。
著者情報
著者名および所属
フロリダ大学昆虫学・線虫学教室、フロリダ州ゲインズビル、32611、米国
J. Parr McQueen、Kaitlin Gattoni、Eli M. S. Gendron & Dorota L. Porazinska
コロラド大学生態学・進化生物学部、ボルダー、CO、80309、USA
スティーブン・K・シュミット＆パシフィカ・ソマーズ
寄稿
J.P.M.とD.L.P.は本研究を構想した。D.L.P.とP.S.はサンプリング地点の選定を行った。J.P.M.は研究室での作業を行った。J.P.M.、E.G.、D.L.P.はデータを解析した。K.G.、E.G.、D.L.P.は結果の解釈を支援した。J.P.M.とD.L.P.は原稿を執筆し、全著者が編集と承認を行った。S.K.S.とD.L.P.は資金を提供した。
協力者
Dorota L. Porazinskaに連絡すること。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権や所属機関について中立的な立場をとっています。
補足情報
補足情報。
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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この記事の引用
McQueen, J.P., Gattoni, K., Gendron, E.M.S. et al. Host identity is the dominant factor in assembly of nematode and tardigrade gut microbiomes in Antarctic Dry Valley streams（南極ドライバレー河川における線虫とクマムシの腸内細菌群の構築における宿主の同一性）. Sci Rep 12, 20118 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-24206-5。
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受付終了
2022年7月6日
Accepted
2022年11月11日
公開日
2022年11月29日発行
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