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公開日：2024年04月02日
常在性原虫はアルギニン-オルニチン代謝と宿主腸管免疫応答を介してマウスにおけるClostridioides difficile病原体の発症を抑制する


https://www.nature.com/articles/s41467-024-47075-0

Huan Yang, Xiaoxiao Wu, ...Bing Gu 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、記事番号：2842（2024） この記事を引用する

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指標詳細

要旨
抗生物質による腸内細菌叢形成異常はクロストリジオイデスディフィシル感染症（CDI）の主要な危険因子であり、CDIの治療には糞便微生物叢移植（FMT）が推奨されている。しかし、その基礎となるメカニズムは依然として不明である。我々は、マウス腸内常在細菌叢の重要なメンバーであるTritrichomonas musculis（T.mu）が、好中球の動員およびIL-1βの分泌を阻害することによりCDI誘発腸管障害を軽減する一方、Th1細胞の分化およびIFN-γの分泌を促進し、その結果、杯細胞の産生およびムチンの分泌を増強して腸粘膜を保護することを明らかにした。T.muはアルギニンを活発に代謝し、宿主のアルギニン-オルニチン代謝経路に影響を与えるだけでなく、宿主の腸管内腔の微生物群集の代謝環境を形成する。この結果、C. difficile感染マウスでは腸管内腔のオルニチンが比較的低い状態になる。これらの変化はC. difficileの病原性と宿主の腸管免疫反応を調節し、CDIを緩和する。これらの知見は、腸内常在真核生物、病原性細菌、宿主免疫系が、相互に関連するアルギニン-オルニチン代謝を介して、病態の制御において相互作用していることを強く示唆しており、CDIの治療にさらなる洞察を与えるものである。

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はじめに
クロストリジオイデス・ディフィシル（C. difficile）はグラム陽性の芽胞形成性嫌気性桿菌である。C.difficileの芽胞は悪環境に耐性を持ち、数カ月間持続することから、抗生物質関連下痢の感染源となっている1,2。広域抗生物質による治療は、本来多様な腸内細菌叢を破壊し、腸管バリアを破壊する毒素を産生する株を含むC. difficileの増殖を可能にする3。C. difficile感染症（CDI）の世界的な蔓延は、人間社会に大きな経済的負担を課している4,5。CDIの主な治療法は抗生物質である。しかし、一般的に使用される抗生物質に対する耐性獲得が、強毒性C. difficile株の蔓延を促進している6。メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシンなどの抗生物質は現在もCDIの治療に使用されているが、副作用、CDIの再発、多剤耐性株の出現などの困難な脅威に直面している7,8。そのため、近年、CDIの非抗生物質療法に注目が集まっている。

新たな非抗生物質療法としては、糞便微生物移植（FMT）9,10、プロバイオティクス11,12、食事介入13,14,15などが挙げられる。抗生物質の殺菌効果とは異なり、これらの治療法は腸内細菌叢を調整してC. difficile芽胞の発芽と増殖を抑制し、宿主の免疫力を高めてC. difficileによるダメージを軽減する可能性が高い16,17。FMTは、再発性CDIの治療に広く用いられ、臨床的成功率は90％を超えている9。FMTの役割とメカニズムに関する研究のほとんどは、腸内細菌叢に焦点を当てたものであり、真菌、ウイルス、古細菌、原虫など、その他の微生物の役割は十分に注目されていない。

正常な状態では、腸内微生物は栄養素の消化吸収を助け、病原菌のコロニー形成を防ぎ、宿主の免疫力を促進する18。腸内微生物のプロバイオティクス効果に関する研究のほとんどは、細菌などの原核生物によるものであり、真菌、ワムシ、原虫などの真核生物は、Entamoeba histolytica19,20、Giardia lamblia21、Cryptosporidium22など、宿主に悪影響を及ぼすことが多い。一方、Chudnovskiyたちは、健康なマウスに常在する原虫Tritrichomonas musculis（T.mu）を発見した。T.muは、宿主の腸管上皮インフラマソームを活性化し、IL-18の放出を誘導し、樹状細胞主導型のTh1およびTh17免疫を促進する23。T.muのコロニー形成は腸内細菌叢に影響を与えることが確認された24。しかし、Chudnovskiyらは、無菌マウスにおいてTh1およびTh17細胞を誘導するにはT.muで十分であることを示し、T.muの免疫調節作用には腸内細菌叢の他の構成要素は必要ない可能性を示した23。さらに、トリトリコモナス属は、細胞内に存在するヒドロゲノソームという特殊なオルガネラによって大量のコハク酸を産生することができ、コハク酸は房細胞-IL25依存的な経路で自然リンパ様細胞（ILC）-2を活性化するだけでなく、2型免疫依存的な方法で腸房細胞やパネス細胞の増殖を誘導することができる25,26,27,28。

注目すべきことに、嫌気性トリコモナドは主に炭水化物とアミノ酸代謝からエネルギーを得ている29。研究によると、トリコモナスは増殖にアルギニンを必要とし、アルギニンジヒドロラーゼ経路は原虫細胞にATPを供給する能力を持つ30,31。アルギニンは宿主の免疫力を高めることが知られているが、そのメカニズムはまだ十分に解明されていない32。トリコモナドの代謝活動は宿主の代謝に大きな影響を与える。最近の研究では、T.muのコロニー形成が遊離コリンの生成を促進することにより、宿主のブドウ糖代謝に影響を与えることが示されている33。しかし、T.muが宿主のアミノ酸代謝にも影響を与えるかどうかは不明である。

我々は、T.muをCDIモデルに導入し、微生物叢の非細菌性常在菌がCDIの病態にどのように関与しているかを明らかにすることで、FMTの治療原理を解明し、CDI治療のための生物学的薬剤を開発することを目的とした。その結果、T.mu、C.difficileおよび宿主免疫の相互作用が、おそらくアミノ酸依存的な代謝経路を介して、宿主のCDI感受性に影響を与えていることが強く示唆された。

研究結果
T.muの腸内コロニー形成はCDI誘発の炎症と腸管障害を緩和する
先に述べたように、我々はマウスコロニーからT.muと遺伝的に同一のマウス常在原虫を単離し、同定することに成功した24。走査型電子顕微鏡で観察したところ、T.muは3本の前鞭毛と1本の後鞭毛を持つ洋ナシ型であった（補足図1A）。

T.muがマウスの健康に及ぼす影響を評価するため、WT B6マウスに精製T.muを1日おきに1回、計4回経口投与し、マウスの体重を毎日モニターした。マウスCDIモデルの構築には抗生物質を使用する必要があるため、抗生物質投与がT.muの腸内コロニー形成に及ぼす影響もモニターした。その結果、体重の変化はT.mu投与マウスと非投与マウスで同様であり（補足図1B）、T.mu接種後のマウスには下痢や猫背は見られなかった。さらに、抗生物質投与マウスではより多くのT.muがコロニー形成された（補足図1C）。これらのデータから、T.muはマウスの健康に明らかな影響を及ぼさず、我々の実験用にデザインされた抗生物質投与法はT.muのコロニー形成を阻害しないことが示唆された。

次に、T.muがCDIに及ぼす可能性のある影響を評価するために、図1Aに示すようにT.muとC. difficileの共コロニー化モデルを確立した。その結果、T.muのコロニー形成はCDIによる体重減少を有意に緩和し（図1B）、疾患活動性指数（DAI）を大幅に低下させた（図1C）。感染後48時間後、CDI群のマウスと比較して、CDI＋T.mu群のマウスは腸上皮の損傷が比較的少なく（図1D）、結腸長が長く（図1E）、組織学的スコアが低く（図1F）、杯細胞が多かった（図1G、H）。これらの結果は、T.muがCDI誘発の腸炎を有意に緩和できることを示している。

図1：T.muの腸内コロニー形成はCDI誘発の炎症と腸管障害を緩和する。
図1
7～-1日目に、NC＋T.mu群とCDI＋T.mu群のマウスにそれぞれ精製T.muを投与した。0日目にCDI群およびCDI + T.mu群の各マウスにC. difficile芽胞を投与した。感染後2日目にマウスの盲腸と結腸を採取した。T.muを投与しないNC正常マウス。NC + T.mu:正常マウスにT.muを投与。CDI：C.difficileを投与したマウス。CDI + T.mu：C.difficileとT.muを投与したマウス。A 実験デザインの概略図。B CDI後の体重変化（各群n = 10）。C 疾患活動性指数（DAI）（各群n = 10）。D 大腸の巨視的写真とH&E染色盲腸組織切片の代表画像。スケールバー： 100 μm。矢印は炎症細胞の浸潤を示す。E 結腸長の測定（各群n = 10）。F 指示したマウスから採取した糞便組織の組織学的スコア（各群n = 10）。G 標記マウスの糞便組織切片の代表的PAS染色。スケールバー 100 μm。矢印はPAS染色陽性の杯細胞を示す。H 検便組織中の杯細胞数の定量（各群n = 10）。I, J 感染後12時間または24時間の糞便中のC. difficileの植物細胞数（I）と芽胞数（J）、および感染後48時間の糞便内容物中の植物細胞数と芽胞数（n = 8/群）。K, L 感染後48時間の盲腸内容物中のC. difficileの植物細胞数（K）および芽胞数（L）（各群n = 8）。M 感染後12時間または24時間の糞便中のTcdBレベル、および感染後48時間の盲腸内容物中のTcdBレベル（各群n = 8）。実験は独立して3回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は、二元配置分散分析（B、C、I、J、M）、一元配置分散分析（E、F、H）または両側スチューデントのt検定（K、L）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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CDIはT.muのコロニー形成に影響を与えなかった。T.muコロニー形成マウスの糞便および糞便中のT.mu数は、C. difficileの有無にかかわらず差がなかった（補足図1D）。逆に、CDI群とCDI＋T.mu群では、糞便、糞便内容物および盲腸に同程度のC. difficileの植生および芽胞バイオマスが回収されたことから、T.muのコロニー形成も腸内のC. difficileコロニー形成に明らかな影響を及ぼさなかった（図1I-L）。特に、感染後12時間および24時間の糞便中に検出されたTcdB力価に代表されるC.difficileが産生する毒素レベルは、CDI＋T.mu群ではCDI群と比較して低かった（図1M）。結論として、T.muのコロニー形成はC.difficileのコロニー形成能に影響を及ぼさない代わりに、その病原性を減弱させ、したがってCDI誘発の炎症および腸管障害を軽減する。

GFマウスにおけるT.muコロニー形成はC.difficile感染を直接防御することができる
腸内におけるT.muのコロニー形成が、特にCDI時の腸内細菌叢に影響を及ぼすかどうかを調べるために、C. difficile感染マウスまたは非感染マウスから分離した糞便サンプルについて、T.muの接種の有無にかかわらず、細菌の16 s rRNA遺伝子（V3-V4領域）の塩基配列を決定した。線形判別分析（Linear discriminant analysis effect size：LEfSe）を行い、細菌組成における存在量の差を同定した。補足図2Aに示すように、T.muのコロニー形成は細菌叢の景観を大きく変化させた。通常コントロール（NC）群では、Lachnospiraceae、Erysipelatoclostridiaceae、Bifidobacteriaceaeが優勢であったが、NC + T.mu群では、Bacteroidaceae、Akkermansiaceae、Ruminococcaceaeが優勢であった。CDI後、CDI群では腸内細菌科が優勢となり、CDI＋T.mu群ではErysipelotrichaceae、Oscillospiraceae、Peptostreptococcaceae、Prevotellaceaeが優勢となった（補足図2B）。注目すべきは、CDI＋T.mu群ではCDI群に比べて腸球菌科の相対量が減少していたことである（補足図2C、D）。この細菌科の腸球菌はC. difficileの病原性を増強することが知られている34。したがって、T.muのコロニー形成の有無は、C. difficileが感染中に遭遇する可能性のある微生物群集に実際に影響を与える。

T.muが他の微生物叢の助けを借りずに直接CDIに対する防御を行うことができるかどうかを調べるために、まずT.muをコロニー形成したマウスを3mg/mLのメトロニダゾール（MNZ）で1週間処理し、マウスからT.muを除去した（補足図2E）。T.muを除去した "CDI + T.mu（MNZ）"群とCDI群の両方でCDI誘発性の病理学的所見が同程度に観察され（補足図2F-I）、T.muの存在の必要性とCDI防御との間に強い関連があることが示唆された。

次に、精製T.muを無菌（GF）マウスにコロニー形成させ、1週間後にC. difficile感染に対する効果を調べた。その結果、体重の変化はT.muを単独でコロニー形成したマウスとそうでないマウスとで同様であった（図2A）。T.muをコロニー形成しなかったGFマウスでは、CDI群ではC. difficileチャレンジ後36時間で体重減少や下痢などの症状が出現し（図2B, C）、48時間以内にすべてのマウスが死亡した（図2D）。一方、T.muをコロニー形成したGFマウスでは、CDI＋T.mu群ではほとんど症状が出現せず、C. difficile感染中（10日間モニター）、全マウスが生存した（図2B-D）。コントロールマウスと比較して、T.muをコロニー形成したGFマウスは、C. difficileの植物性バイオマス（図2E）と胞子バイオマス（図2F）は同程度であったが、糞便内容物中のTcdBの力価は、特に感染後24時間と36時間において有意に低かった（図2G）。さらに、T.muをコロニー形成したGFマウスは、腸上皮が比較的無傷で、結腸が長く、感染後の組織学的スコアが非常に低かった（図2H、I）。大腸内の杯細胞数もT.muコロニー化GFマウスで増加していた（図2J, K）。さらに、炎症性サイトカインであるCXCL1およびIL-1βの発現量は減少し、IFN-γの発現量は増加した（図2L-O）。したがって、我々の結果は、T.muのコロニー形成が、T.muによる微生物群集の変化とは無関係に、CDIに対する防御を直接的に媒介できることを示している。

図2：無菌（GF）マウスにおけるT.muのコロニー形成は、致死的なC. difficile感染を直接防御することができる。
図2
GF B6マウスを3群に分けた：正常コントロール群（NC）、C. difficile感染群（CDI）、T.mu＋C. difficile感染群（CDI＋T.mu）。7日目にCDI + T.mu群のマウスに生体外で精製したT.muを経口投与した。0日目にCDI群およびCDI + T.mu群の各マウスにC. difficile胞子を投与した。マウスは感染後36時間で犠牲にした。A T.muコロニー形成後の体重変化（NC群n = 5、NC + T.mu群n = 8）。B CDI後の体重変化（NC群n=5、CDIおよびCDI+T.mu群n=8）。C疾患活動性指数（DAI）（NC群n=5、CDIおよびCDI+T.mu群n=8）。D 生存曲線（各群n = 5）。E-G 糞便（感染後12時間または24時間）および大腸内容物（感染後36時間）中のC. difficileの増殖細胞数（E）、芽胞数（F）およびTcdBレベル（G）（ただし、感染後24時間のCDI群ではn＝5、その他の群ではn＝8）。H 結腸のマクロ写真とHE染色した糞便組織切片の代表的顕微鏡写真。スケールバー： 100 μm。矢印は炎症細胞の浸潤を示す。I 結腸長の測定と糞便組織学的スコアの定量（NC群：n=5、CDIおよびCDI+T.mu群：n=8）。J 指定したマウスの黄便組織切片の代表的PAS染色。スケールバー： 100 μm。矢印は杯細胞を示す。K 検便組織中の杯細胞数の定量（NC群：n = 5、CDIおよびCDI + T.mu群：n = 8）。L qRT-PCRを用いて大腸のCxcl1、Il1b、Ifngレベルを測定した（NC群n=5、CDIおよびCDI + T.mu群n=8）。M-O 盲腸における(M)CXCL1、(N)IL-1β、およびO IFN-γのレベルをELISA法で測定した（NC群n=5、CDIおよびCDI + T.mu群n=8）。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は二元配置分散分析（A-G）、一元配置分散分析（I, K, L-O）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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T.muのコロニー形成はC.difficile感染部位への好中球の動員を減少させる
好中球はCDI35に対する宿主の初期反応において極めて重要であることが示されている。我々のT.mu-C.difficile共コロニー形成モデルでは、C.difficile感染は正常マウスと比較して有意に好中球の大腸固有層への動員を促進した。一方、T.mu単独コロニー形成は好中球の動員には影響しなかったが、T.muはCDI後に大腸に蓄積した好中球の割合と数を驚くほど減少させた（図3A）。CDI後に大腸に集積した好中球は、骨髄から動員された可能性が高い。骨髄の好中球の比率と数は、感染後に有意に低下したからである（図3B）。このデータから、T.muのコロニー形成はCDIによる骨髄からの好中球の動員を有意に減少させ、血液中の好中球が大腸の感染部位に動員されることを示唆した。これに伴い、好中球の感染部位への動員や炎症の促進に重要であると考えられるサイトカインCXCL1、IL-36γ、IL-1β、IL-6の発現は、CDI＋T.mu群ではCDI群と比較して有意に減少した（図3D-K）。これらのデータを総合すると、T.muのコロニー形成は感染時の好中球の旺盛な動員を抑制し、おそらく過剰な免疫活性化による組織損傷を防ぐことが示唆される。

図3：T.muのコロニー形成はC.difficile感染部位への好中球の動員を減少させる。
図3
A-L C. difficile感染後2日目に、標記マウスの結腸、盲腸、末梢血、骨借液を採取した。A-C 代表的なフローサイトメトリーグラフと、(A)結腸固有層、(B)末梢血、(C)骨借体における好中球の割合と数（各群n = 8）。大腸におけるD Cxcl1、F Il36g、H Il6、J Il1bの相対発現量をqRT-PCRで測定した。盲腸におけるE CXCL1、G IL-36g、I IL-6、およびK IL-1βの濃度をELISAで測定した（各群n = 5）。L 異なる比率のC.difficile対T.mu（それぞれC.difficile：T.mu＝1：0、1：0.2、1：1、または1：5）をin vitroで好中球と混合した（各群n＝6）。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は一元配置分散分析により決定した（A-L）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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次に、T.muが好中球の機能に直接影響を及ぼすかどうかを調べた。In vitroでT.mu-C.difficile-好中球共培養系を構築したところ、C.difficileは好中球からのIL-1β分泌を十分に誘導したが、T.muはC.difficile/T.muのいくつかの異なる比率でC.difficileによるIL-1β分泌を阻害した（図3L）。これらの結果は、T.muが好中球のリクルートと好中球関連サイトカインの分泌を減少させる微調整によって、C. difficile誘発性腸炎を緩和する可能性を示唆している。

T.muは腸管IFN-γを増加させることにより腸粘膜を保護する
研究により、トリトリコモナスはTヘルパー（Th）1およびTh17応答の誘導を促進することが示されている23,36。そこで我々は、T.muがCDI時のT細胞の表現型に及ぼす影響を調べた。マウスの大腸固有層リンパ球（LPL）からTh1細胞を解析するためのゲーティング戦略を補足図3Bに示した。C.difficile感染後、T.muは大腸におけるTh1細胞の割合と数を有意に増加させたが、Th17細胞は増加させなかった（図4A, B）。圧倒的なTh1細胞誘導の表現型と一致して、CDI＋T.mu群の大腸では、CDI群と比較して高いレベルのIfng遺伝子とIFN-γタンパク質の発現が観察された（図4C、D）。一方、T.muはCDIの有無にかかわらず、大腸におけるIL-17Aの発現には影響を与えなかった（図4E）。

図4：T.muは腸管IFN-γを増加させることにより腸粘膜を保護する。
図4
A-E C. difficile感染後2日目に標記マウスの結腸および盲腸を採取した。大腸LP細胞をブレフェルジンA、イオノマイシン、PMA存在下で5時間インキュベートし、抗CD45、CD3、CD4、IL-17、IFN-γで染色した。CD4+T細胞によるIFN-γ、IL-17産生をフローサイトメトリーで解析した。代表的なフローサイトメトリーのグラフと、大腸固有層におけるA Th1細胞とB Th17細胞の割合と数（各群n = 6）。C 結腸におけるIfng mRNAレベルをqRT-PCRで測定した（各群n = 5）。盲腸におけるD IFN-γ、E IL-17AのレベルはELISA法で測定した（各群n = 6）。F-O Ifngr-/-マウスに精製T.muを1日おきに計1週間摂取させた後、C. difficileに感染させた（CT+Ifngr-/-群）。対照としてWT B6マウスを用いた（CDI + T.mu）。感染後2日目に標記マウスの盲腸と結腸を採取した。F 体重変化（各群n = 6）。G DAI（各群n = 6）。H 結腸の巨視的所見と盲腸組織切片の代表的なHE染色像。スケールバー： 100 μm。矢印は炎症細胞の浸潤を示す。I 結腸長の測定（各群n = 6）。J 組織学的スコア（各群n = 6）。K 大腸杯細胞の定量と代表的杯細胞染色像（各群n = 6）。スケールバー： 100 μm。矢印は杯細胞を示す。L MUC2の相対発現強度と代表的MUC2組織化学染色像（各群n = 6）。スケールバー： 100 μm。矢印はMUC2陽性染色を示す。感染後48時間におけるC. difficileの（M）植物細胞数、（N）胞子数、および糞便内容物中の（O）TcdBレベル（各群n = 6）。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は二元配置分散分析（F, G）または一元配置分散分析（A-E, I-O）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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IFN-γを産生するTh1細胞に加えて、自然リンパ球（ILC）、細胞傷害性T（Tc）1細胞、γδT細胞などの他の免疫細胞もIFN-γを分泌することができる。そこでわれわれは、T.muのコロニー形成が、固有層内のこれらの免疫細胞を変化させるかどうかについても検討した。その結果、T.muはCDIに伴うILC（補足図3C、D）、マクロファージ（補足図3E）、γδT細胞（補足図3F）、Tc1細胞（補足図3G）の数と割合に有意な影響を及ぼさなかった。これらの結果は、T.muのコロニー形成が主にTh1細胞によるIFN-γの分泌を促進し、CDIを防御することを示唆している。

寄生虫は宿主の腸管においてII型免疫を増強することが多いので、T.muコロニー化マウスで2型サイトカインも試験した。その結果、T.muは腸内サイトカインIL-4とIL-13の発現に有意な影響を及ぼさなかった（補足図3H、I）。従って、T.muは主にTh1型反応を促進することによってCDIを予防している可能性がある。

IFN-γがCDIに対する防御に重要な役割を果たしているかどうかを調べるために、10μgの組換えIFN-γを2時間p.i.および24時間p.i.にマウスに腹腔内注射した。difficile誘発体重減少（補足図4A）、DAI減少（補足図4B）、T.mu投与と同様に結腸長延長と組織学的スコア低下（補足図4C-E）を伴う腸管上皮障害の緩和を認めた。さらに、IFN-γ投与は、C. difficile誘導性の杯細胞およびMUC2の減少を緩和した（補足図4F、G）。これらの結果は、IFN-γがCDIに対する防御に重要な役割を果たしていることを示している。

さらに、T.muがIFN-γを介してCDIに対する防御効果を示すかどうかを調べるために、WTマウスとIfngr-/-マウスにT.muをコロニー形成させ、C. difficileを感染させた。CDI＋T.mu群ではWTマウスのCDI群と比較してT.muコロニー化によるCDI防御効果が認められたが、Ifngr-/-マウスではT.muはC. difficileによる体重減少や臨床症状を軽減できなかった（図4F, G）。T.muでコロニー形成しC. difficileに感染したWTマウス（CDI + T.mu群と表示）と比較して、T.muでコロニー形成しC. CT+Ifngr-/-群）では、大腸萎縮、大腸短縮、炎症細胞浸潤（図4H-J）、杯細胞およびMUC2の減少（図4K, L）が同程度であったことから、T.muによるCDIからの効果的な防御にはIFN-γシグナル伝達が必要であることが示唆された。さらに、CT+Ifngr-/-群のIfngr-/-マウスの糞便中では、CDI+T.mu群のWTマウスと比較して、C. difficile胞子バイオマスのレベルがわずかに増加し、TcdBレベルが増加する傾向が認められた（図4M-O）。これらの結果を総合すると、T.muはおそらくIfngに依存する経路によって、感染時に粘液を産生する杯細胞の安定性を維持し、CDI誘発のダメージから粘膜を保護していることが示唆される。

T.muのコロニー形成は腸内微生物群集と宿主のアルギニン/オルニチン代謝に影響を及ぼす
トリトリコモナス属はアミノ酸を利用してエネルギーを産生することが研究で示されている30,31。我々は、豊富な培地-Brain Heart Infusion（BHI）ブロス中で24時間in vitro培養したT.muが大量のアルギニンを消費し、培地中にシトルリンとオルニチンを放出することを見いだした（補足図5A-C）。このことは、T.muがおそらくアルギニンジヒドロラーゼ経路によってアルギニンを活発に代謝し、エネルギー利用できる可能性を示唆している。一方、同じ培養条件下でC. difficileはアルギニンをほとんど消費せず、オルニチンとシトルリンの生産量はごくわずかであった（補足図5A-C）。

次に、T.muのコロニー形成が腸内細菌叢全体のメタボロームに影響を与えるかどうかを検討した。そこで、T.muのコロニー形成の有無にかかわらず、C.difficile感染マウスから採取した糞便内容物サンプルのアンターゲットメタボロームプロファイリングを行った。その結果、CDI群で濃縮された代謝物の多くはアミノ酸代謝中間体であり（図5A）、その多くはアルギニン生合成経路に関与する中間体であった（図5B）。CDI群と比較して、CDI＋T.mu群では、糞便内容物中のオルニチンの相対レベルが低下し、代わりにシトルリンレベルが上昇した（図5C）。これは、腸内微生物群集が共有する重要な空間である腸管内腔において、T.muコロニー形成が特定のアミノ酸の豊富さ（例えば、アルギニン／オルニチンなど）に影響を与える役割を担っていることを示唆している。

図5：T.muのコロニー形成は腸内微生物群集と宿主のアルギニン／オルニチン代謝に影響を与える。
図5
A-H C.difficile感染後2日目に、示したマウスの結腸、盲腸、盲腸内容物、末梢血サンプルを採取した。CDI群およびCDI + T.mu群から採取した盲腸内容物サンプルについて、非標的メタボロームプロファイリングを実施した。様々なKEGG代謝パスウェイに濃縮された糞便内容物メタボロームの概要。縦軸はKEGG代謝パスウェイの二次分類、横軸はこのパスウェイにアノテーションされた代謝物の数（各群n = 6）。B 相対 Betweenness Centrality 法による KEGG パスウェイ濃縮トポロジー解析。各バブルはKEGGパスウェイを表し、横軸はパスウェイにおける代謝物の相対的重要度の影響値、縦軸は代謝物参加パスウェイの濃縮度有意性（すなわち[-log10(P値)]）を表す（各群n = 6）。P値はFDRをコントロールするためにBenjamini and Hochberg法で調整した。FDR調整後のP＜0.05を示した。C CDI vs. CDI + T.mu.の糞便内容物サンプル間の濃縮アミノ酸のヒートマップ。図中の各列はサンプルを表し、各行は代謝物を表す。図中の色は、このサンプル群における代謝物の相対発現量を表す。具体的な発現量の変化傾向は、右上のカラーバーの下のデジタルラベルをご覧ください（各群n = 6）。D トリコモナスにおけるアルギニンジヒドロラーゼ経路の模式図。E C. difficileにおけるL-オルニチンの生合成および分解経路。F C. difficile感染2日後のマウスの糞便中のアルギニン、シトルリン、オルニチンのレベル（各群n = 6）。G C.difficile感染2日後のマウス糞便中のプトレシン、アラニンおよび5-アミノバレレートレベル（各群n = 6）。H, I CDI2日後の標記マウスのH結腸およびI血清中のアルギニン、シトルリンおよびオルニチンのレベル（各群n = 6）。J大腸におけるNos2、Ass1、Arg1、OtcおよびOdcの相対発現量をqRT-PCRにより測定した（各群n＝5）。K 宿主のアルギニン代謝経路の図。L-N 感染後2日目に大腸組織を採取し、ARG1（赤）、iNOS（紫）、ASS1（赤）およびDAPI（青）で染色した（各群n = 6）。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は、Fishers' Exact検定（B）、一元配置分散分析（F-I, J）、両側Students' t検定（L-N）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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次に、T.muとC.difficileの両方に関連するアルギニン/オルニチン代謝に関与するいくつかの代謝中間体の標的メタボローム定量を行った（図5D、E）。その結果、C. difficileに感染していない正常コントロールのWTマウスにT.muがコロニー形成すると、糞便内容物中のアルギニンが減少し、オルニチン、シトルリン、プトレシン、5-アミノバレレートが増加した（図5F, G）。CDIは、感染していない正常マウスと比較して、糞便内容物中のアルギニンと5-アミノバレレートのレベルを劇的に減少させ、オルニチンのレベルを増加させた（図5F、G）。T.muの存在下では、C.difficileによる糞便内容物中のオルニチンの増加は抑制され（図5F）、プトレシンとアラニンのレベルはCDI群と比較して増加した（図5G）。

T.muのコロニー形成は、C.difficile感染の有無にかかわらず、大腸組織中のアルギニン／オルニチン代謝中間体のレベルも変化させた（図5H）。宿主のアルギニン代謝酵素には、アルギナーゼ1（ARG1）、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）、アルギニン・コハク酸合成酵素1（ASS1）、オルニチン・トランスカルバミラーゼ（OTC）、オルニチン・デカルボキシラーゼ（ODC）が含まれる（図5J-L）。特に、CDI群と比較して、CDI＋T.mu群では、宿主の大腸組織の代謝酵素遺伝子Nos2（iNOSをコードする）、Ass1、Otcがアップレギュレートされ、Arg1はダウンレギュレートされた（図5J）。免疫蛍光染色から、CDI＋T.mu群ではCDI群と比較して、大腸のiNOS陽性細胞数およびASS1陽性細胞数が増加し、ARG1陽性細胞数が減少していることが示された（図5L-N）。これらの結果から、T.muのコロニー形成は、腸内微生物群集のメタボロームと宿主腸管組織の代謝活性、特にアルギニン-オルニチン代謝に関与する領域横断的な相互関連代謝経路に大きな影響を与えることが示唆された。

次に、CDIによるアルギニン／オルニチン代謝擾乱に対するT.muの影響が腸内細菌叢に依存するかどうかを検討した。この目的のため、GFマウスにT.muをコロニー形成させ、1週間後にC.difficileをチャレンジさせ、感染36時間後に糞便内容物、結腸組織、血清を採取した。ターゲットメタボローム解析の結果、T.muのコロニー形成はCDIマウスと比較して、CDIによる糞便内容物のアルギニンとオルニチンの上昇を有意に抑制し、プトレシン、アラニン、5-アミノバレレートのレベルを上昇させた（補足図6A, B）。さらに、CDI群と比較して、CDI＋T.mu群では宿主の大腸Nos2およびOtcの発現レベルが上昇し、Arg1の発現が低下した（補足図6E-I）。全体として、これらの結果は、T.muのコロニー形成がC.difficile-宿主-コミュニティ間のアルギニン/オルニチン代謝に直接影響を与えることを示唆している。

iNOSとARG1は、古典的に活性化されたM1マクロファージ（iNOS+）と代替的に活性化されたM2マクロファージ（ARG1+）を定義するために用いられる。これら2つの酵素とその関連代謝産物は、マクロファージの極性化と機能の本質的な制御に基本的に関与している37。我々は、T.muのコロニー形成がC.difficile感染後のマクロファージ極性化に影響を及ぼすかどうかを考えた。そこで、C. difficile感染WTマウスから採取した大腸組織について、ARG1/[F4/80]とiNOS/[F4/80]の共免疫染色を行った。T.muに感染したマウスの腸管ではARG1+F4/80+細胞の減少が見られたが、iNOS+F4/80+細胞はT.muに感染したマウスとT.muに感染していないマウスで同程度であった（補足図7）。特に、T.muコロニー化マウスの腸絨毛先端上皮では、iNOSの発現が強く誘導されていた（補足図7）。これらの結果は、T.muのコロニー形成が、交互に活性化されたM2マクロファージだけでなく、C. difficile感染時の腸管アルギニン/オルニチン代謝の制御に関与する他のタイプの細胞にも影響を与えていることを示唆している。

アルギニン／オルニチン代謝の調節はC. difficile感染を制御するために重要である。
アルギニン／オルニチン代謝を調節することがC. difficile感染を制御できるかどうかを検討するために、飲料水にアルギニンを追加するか、オルニチンを含まない飼料を作製した。T.muのコロニー形成と同様に、C.difficile感染48時間後にアルギニンを飲料水に1％添加したマウス、あるいはオルニチンを除去した飼料を与えたマウスでは、アルギニンを飲料水に添加したマウスではアルギニンが増加し、オルニチンを除去した飼料を与えたマウスではオルニチンが減少した（図6A, B）。アルギニンまたはオルニチンを含まない食餌を補充すると、C. difficileによる疾患の重症度が有意に低下した（図6C-G）。さらに、アルギニンの補給とオルニチンを含まない食餌はともにCDI後の腸における好中球のリクルートとCXCL1とIL-1βの発現を減少させた（図6H-K）。アルギニンの補充はC. difficileのコロニー形成には影響しなかったが、糞便内容物中のTcdB力価を有意に低下させた（図6L-N）。注目すべきは、オルニチンを含まない飼料はTcdB力価とC. difficile胞子バイオマスの両方を減少させたことである（図6L-N）。しかし、飲料水にシトルリンを2％添加しても、C. difficile感染による症状や腸管障害は改善しなかった（補足図8A-E）。さらに、T.muが定着したマウスと同様に、オルニチンを含まない餌を与えたマウスも腸内でTh1細胞が増加し、腸内のIFN-γ濃度もCDI後に上昇した（図6O-Q）。これらの結果から、アルギニン／オルニチン代謝を調節することがCDIの制御に重要であることが示唆される。

図6：アルギニン／オルニチン代謝の調節はC. difficile感染を制御するために重要である。
図6
A-Q -7日目から-1日目まで、CDI＋T.mu群のマウスにT.muを1日おきに計4回投与した。CDI+Orn-free群のマウスには、-7日目から1日目までオルニチンフリー食を与えた。CDI＋アルギニン群のマウスには、-3日目から1日目まで、飲料水に1％のアルギニンを添加した。0日目にCDI群、CDI＋T.mu群、CDI＋アルギニン群およびCDI＋Orn-free群の各マウスにC. difficile芽胞を接種した。感染後2日目に標記マウスの盲腸と結腸を採取した。A, B 盲腸内容物中のAアルギニンとBオルニチンのレベル（各群n = 6）。C 感染後の体重変化（各群n = 6）。D DAI（各群n = 6）。E 結腸の巨視的写真と糞便組織切片の代表的なHE染色顕微鏡写真。スケールバー： 100 μm。矢印は炎症細胞の浸潤を示す。F 結腸の長さの測定（各群n = 6）。G HE染色した糞便組織の組織学的スコア（各群n = 6）。H, I フローサイトメトリーによる代表的なグラフと、CDI後48時間における結腸固有層中の好中球の割合と数（各群n = 6）。J, K 盲腸におけるJ CXCL1およびK IL-1βのレベルをELISAで測定した（各群n = 6）。L-N CDI後48時間における盲腸内容物中のC. difficile L型生菌数、M型芽胞数、および(N) TcdBの力価（各群n = 6）。O, P フローサイトメトリーによる代表的なグラフと、CDI後48時間における大腸固有層におけるTh1細胞の割合と数（各群n = 6）。Q C. difficile感染後48時間の盲腸におけるIFN-γレベルをELISAで測定した（各群n = 6）。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEMである。統計的有意性は、二元配置分散分析（C、D）または一元配置分散分析（A、B、F、G、I-N、P、Q）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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次に、CDIにおけるT.muの保護効果における宿主のアルギニン代謝の役割を調べたいと考えた。α-MethyI-DL-アスパラギン酸（α-MDLA）は、シトルリン-アルギニンサイクルの律速酵素であるASS138の阻害剤である。シトルリンを介した宿主のアルギニン合成を阻害するため、T.muが定着したCDIマウス（「CT+α-MDLA」群と表示）にα-MDLAを投与した（図7A）。CDI+T.mu群のT.muコロニーマウスはCDI群と比較して、糞便内容物中のアルギニンが増加していた。α-MDLA投与後、T.muコロニー形成によるアルギニンの増加は抑制された（CDI＋T.mu群とCT＋α-MDLA群の比較、図7B）。さらに、α-MDLA投与は、C.difficile感染後の体重、疾患指数、大腸病理、炎症細胞浸潤に対するT.muの保護効果もブロックした（図7C-G）。さらに、α-MDLAは、感染後の大腸における好中球の動員およびTcdB力価に対するT.muの減少効果を逆転させた（図7H-K）。これらの結果から、T.muのコロニー形成は宿主のアルギニン代謝を調節し、腸内の免疫細胞に影響を与え、C. difficileに対する感受性を低下させることが示唆された（図7L）。

図7：α-MDLAはT.muによるCDIの緩和を阻止した。
図7
A-K -7日目から-1日目まで、CDI＋T.mu群およびCT＋α-MDLA群のマウスにT.muを1日おきに計4回投与した。1日目から1日目まで、CT+α-MDLA群の各マウスに14mgのα-MDLAを1日2回腹腔内投与した。0日目に、CDI群、CDI+T.mu群およびCT+α-MDLA群の各マウスにC. difficile芽胞を接種した。感染後2日目に標示マウスの盲腸と結腸を採取した。A 実験デザインを示す模式図。B 盲腸内容物中のアルギニンレベル（各群n = 6）。C 感染後の体重変化（各群n = 6）。D DAI（各群n = 6）。E 結腸の巨視的写真と、盲腸組織切片の代表的なHE染色顕微鏡グラフ。スケールバー： 100 μm。矢印は炎症細胞の浸潤を示す。F 結腸の長さの測定（各群n = 6）。G HE染色した糞便組織の組織学的スコア（各群n = 6）。H フローサイトメトリーの代表的グラフと大腸固有層における好中球の割合と数（各群n = 6）。I-K 感染48時間後の糞便内容物中のC. difficile Iの植物細胞数、Jの芽胞数、および(K) TcdBの力価（各群n = 6）。L T.muがCDIにどのように影響を及ぼすかの仮説モデル。実験は独立して2回繰り返した。データは平均値±SEM。統計的有意性は二元配置分散分析（C, D）、一元配置分散分析（B, F-K）により決定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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考察
本研究は、常在性原虫T.muがCDIを予防することを示している。一方では、腸におけるT.muのコロニー形成は、CDIによって誘導された好中球の腸への過剰な動員によって引き起こされるダメージを軽減し、他方では、Th1細胞によるIFN-γの産生を制御することによって腸を保護する。このことは、常在性原虫T.mu、病原体C.difficile、および感染部位における宿主免疫系の相互作用に光を当てるものである。

アミノ酸代謝は原虫において重要な役割を果たしており、アルギニンジヒドロラーゼ経路は、アルギニンをオルニチンとカルバミルホスフェートに変換し、それぞれプトレシンとCO2＋アンモニアに変換することで、トリトリコモナス属の増殖にエネルギーを供給することができる29,39。このことから、T.muはアルギニンの代謝にアルギニンジヒドロラーゼ経路を利用している可能性が示唆された。一方、同じ濃厚培地で培養したC. difficileはアルギニンの代謝活性が低かった。これと一致して、T.muを培養した正常B6マウスは、WTマウスと比較して、糞便中のアルギニン濃度が低下し、シトルリン、オルニチン、プトレシンの濃度は上昇した（図5F, G）。アルギニンとオルニチンを代謝するT.muの能力は、CDIにおけるその保護的役割にとって重要であろうと推測される。その理由は、オルニチンがC. difficileのコロニー形成に利用される重要な栄養素であるという事実に関連している。C. difficileにおけるオルニチンの酸化代謝は、マウスにおける非炎症性の無症候性コロニー形成を支持している40。さらに、T.muによるアルギニンとオルニチンの調節は、宿主と腸内微生物群集の両方によって感知され、C. difficileの機能に影響を与えると考えられる。異なる微生物間の相互調節は珍しいことではない。例えば、Clostridium sardinienseはアルギニンジヒドロラーゼ経路を使ってオルニチンを産生し、それをC. difficileがスティックランド基質として吸収することを可能にする。一方、Paraclostridium bifermentansもアルギニンジヒドロラーゼ経路を使ってオルニチンを産生することができるが、自身の代謝のためにスティックランド経路を使ってオルニチンを消費することができるため、C. difficileから重要なスティックランド基質を奪い、致死的なCDI41から宿主を守ることができる。C.ディフィシルは他のクラスターXIクロストリジウムと同様に、スティックランド反応によって発酵したオルニチンを含む多様な炭素源を利用して急速に増殖する42。腸球菌は、ロイシンやオルニチンなどの発酵性アミノ酸を供給することで、抗生物質で撹乱された腸内でC. difficileの体力を高め、腸管内腔のアルギニンを枯渇させることでC. difficileの病原性を促進する34。T.muのコロニー形成が宿主や腸内微生物群集のアルギニン／オルニチン代謝にどのような影響を及ぼすかは、非常に複雑な問題であり、まだ解決されていない。

我々は、T.muのコロニー形成が、GFマウスとSPFマウスの両方において、C. difficileのコロニー形成効果に影響を与えない一方で、腸の炎症反応とC. difficileの毒性を低下させ、その結果、比較的低毒性と低炎症の状態になることを見出した。このことは、CDI後のT.muコロニー化マウスの腸管内腔におけるオルニチンレベルが比較的低下していることと相関している（図5Fおよび補足図6A）。これと同様に、CDIや炎症に抵抗性を示すマウスでは、オルニチンの酸化代謝が亢進し、腸管内腔のオルニチンレベルが相対的に低下することが報告されている40。明らかに、T.muとC.difficileの複雑な相互作用については、まだ多くのことが解明されていない。

我々のGFマウス実験は、T.muがCDIに直接影響を与えることを強く示唆しているが、T.muを試験管内で軸生育させる方法を確立できていないため、感染動物で観察された免疫調節表現型が、T.muに関連した微生物共生体、あるいは原生動物と微生物の共生相互作用の複合体によって媒介されている可能性が残っていることを述べておく。いずれにせよ、原虫とそれに関連する微生物共生体は、CDI時に異なる免疫調節特性を有する単一の微生物機能グループとして扱われるべきであると考える。

我々の研究では、T.muとC.difficileという2つの微生物間のクロストークよりも、むしろ宿主の統合的な反応に焦点を当てた。アルギニンは酵素の基質として機能するだけでなく、それ自体が濃度依存的にいくつかの酵素の発現を選択的に制御し、それによって自身の代謝に影響を与える43。その結果、T.muに感染したマウスは、C.difficileに感染していないコントロールマウスと比較して、感染後に腸内のNos2、Otc、Ass1の発現を上昇させ、Arg1の発現を低下させた（図5J-N）。これらの結果から、T.muのコロニー形成は、少なくともCDIの間、宿主の腸内アルギニン代謝に影響を及ぼすことが示唆された。T.muによるCDI防御における宿主のアルギニン代謝の役割をさらに証明するために、低分子阻害剤α-MDLAを用いてT.muコロニー化マウスのASS1生理活性を阻害したところ、この阻害剤はT.muのCDI防御効果を阻害した（図7）。したがって、T.muが宿主の代謝活性に及ぼす影響は、C. difficile感染の結果を決定する上でさらに重要な役割を果たしている。

また、T.muのコロニー形成は、好中球の過剰な浸潤を抑制し（図3）、腸内Th1細胞にIFN-γを放出させる（図4）など、宿主の腸管免疫環境を変化させることも明らかにした。これは、好中球の動員や組織の炎症に重要なサイトカインIL-1β、IL-6、CXCL1のCDI誘発発現に対するT.muの抑制効果と相関している。さらに、Ifngrノックアウトマウスでは、CDIにおけるT.muの防御効果が消失することも見いだした。C.difficile感染により腸内の杯細胞数とMUC2の産生が減少したが、T.muのコロニー形成はこの減少をWTマウスでは緩和したが、Ifngrノックアウトマウスでは緩和しなかった。我々のデータは、宿主免疫の制御におけるT.muの役割を示しており、宿主の免疫学的トーンはCDIの進行と転帰に重要な役割を果たしている23,44。

長年、食餌性アルギニンの補給は免疫系を増強する手段として用いられてきた32。我々は、T.muの宿主免疫を制御する能力がアルギニン-オルニチン代謝経路に関係しているのではないかと推測した。そこで、WT B6マウスに飲料水中のアルギニンを補充するか、オルニチンを含まない飼料を与えたところ、CDI後の腸管好中球浸潤とIL-1β分泌が減少した。さらに、宿主のASS1活性を阻害すると、腸管内腔のアルギニン濃度が低下し、CDIによる好中球の腸内への動員に対するT.muの抑制効果も減弱した。さらに、マウスにオルニチンを含まない餌を与えたところ、C. difficile感染後に腸内のTh1細胞が有意に拡大し、IFN-γの分泌が促進され、腸粘膜が保護された。これらの証拠は、腸内のアルギニン代謝を調節することが、少なくともCDI感染時の宿主免疫に影響を与えることを示唆している。さらに、これまでの報告では、オルニチンとアルギニンがC. difficileの病原性に影響を及ぼすことが示されている34,40,45,46。今回のデータは、アルギニン／オルニチンの食事操作がC. difficile毒素レベルに影響を与えることを示している。従って、相互に関連するアルギニン-オルニチン代謝軸が、宿主免疫と病原体の病原性の両方に協調的に影響を与えることによって、C. difficile感染症の結果を制御している可能性が非常に高い。

結論として、我々は腸管代謝と免疫に焦点を当て、常在性原虫T.muがC. difficileによって誘発される腸管炎症に及ぼすメカニズムを探求した。我々は、常在性原虫、C. difficile、宿主免疫系がアルギニン-オルニチン代謝軸を介して三者相互作用し、腸の恒常性を維持し、C. difficile感染を緩和するモデルを提案する。病原性疾患を緩和する常在真核生物の分子メカニズムを理解することは、病態の解明と洗練された治療戦略の開発につながる。

研究方法
動物
すべてのマウス研究は、徐州医科大学の実験動物倫理委員会（IACUC番号：202202A278、徐州市、中国）により評価された。動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力をした。4-6週齢の野生型雄性C57BL/6Jマウスを徐州医科大学から購入した。4-6週齢のC57BL/6J Ifngr-/-雄性マウスは、済南大学（中国広州市）のZhinan Yin教授から提供された。マウスは特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育・維持された。4～6週齢の雄性C57BL/6J無菌マウスは、GemPharmatech Co.Ltd（中国・南京）から購入し、無菌条件下で飼育した。すべてのマウスは12時間の昼夜交互サイクルで飼育され、標準的な実験室で滅菌された飼料と水が自由に入手できた。室温は25℃、湿度は40～70％であった。

T.muの単離と精製
T.mu保有マウスから採取した糞便内容物を滅菌PBSで懸濁し、70µmセルストレーナー（BS-70-CS、Biosharp Life Sciences、中国）で数回濾過し、PBSで3回洗浄した。T.muを濃縮したペレットを40％パーコール（17089109, cytiva, USA）に懸濁し、パーコール勾配分離を行いT.muを得た。In vivo 投与のため、各マウスに経口投与で ~2 × 106 T.mu を接種した。T.muの培養には、精製したT.muを、100 U/Lペニシリン（A6920、Solarbio、北京、中国）、0. 1mg/mLのストレプトマイシン（A100382、Sangon Biotech、上海、中国）、50μg/mLのバンコマイシン（A600983、Sangon Biotech）、50μg/mlのシプロフロキサシン（A600310、Sangon Biotech）、100μg/mlのゲンタマイシン（A506614、Sangon Biotech）、および5μg/mLのアムホテリシンB（A610030、Sangon Biotech）を含む幅広い抗生物質のカクテルを添加した。懸濁後、T.muを37℃で2日間嫌気培養し、無菌マウスに摂取させるために回収した。

走査型電子顕微鏡
以前の報告24に従い、精製T.muを固定液（PBS中2.5％グルタルアルデヒド＋4％パラホルムアルデヒド）に2時間懸濁し、3回洗浄した。その後、以下の一連のエタノール-水混合溶液を用いてサンプルを脱水した： 25%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%. 100％エタノールで処理した後、サンプルを酢酸イソアミル中で2回インキュベートした。その後、試料を臨界点乾燥機HCP-2（日立製作所、日本）で乾燥させ、試料台に取り付け、高真空コーティング装置（Leica EM ACE600、ドイツ）で金コーティングを行った。最後に、走査型電子顕微鏡Teneo VS（FEI、米国）を用いてサンプルを観察した。

C. difficile胞子の調製
C. difficile VPI 10463 (ATCC 43255)株は、中国、杭州医科大学のXiaojun Songから提供された。C.difficileの胞子は前述の方法で調製した47。C.difficileは、0.05％L-システイン（A600132、Sangon Biotech社製）を添加したBHI寒天平板上で、嫌気条件下（アネロパック、MGC社製）、37℃で2日間培養した。次に、C. difficileを0.05％L-システインを添加したBHIブロス中で37℃、嫌気的に5日間培養した。培養菌は遠心分離で回収し、冷PBSで少なくとも3回洗浄した。このペレットをPBSで懸濁し、70℃で10分間熱処理して植物細胞残渣を除去し、C. difficileの芽胞を得た。生存芽胞数を、嫌気性雰囲気の瓶内で、0.1％L-システイン、0.5％酵母エキス（A515245、Sangon Biotech社製）、および0.1％タウロコール酸ナトリウム（A601143、Sangon Biotech社製）を添加したBHI寒天プレートにプレーティングし、CFU/mLとして記録した。

C. difficile感染モデルマウス
まず、0.4mg/mLのカナマイシン（A506636、Sangon Biotech社製）、0.035mg/mLのゲンタマイシン（A506614、Sangon Biotech社製）、0. 035mg/mLのポリミキシンE（A606495、Sangon Biotech社製）、0.215mg/mLのメトロニダゾール（A600633、Sangon Biotech社製）、および0.045mg/mLのバンコマイシン（A600983、Sangon Biotech社製）を飲料水に添加した。5日後、マウスに10 mg/kgのクリンダマイシン（A600312、Sangon Biotech）を腹腔内注射した。1日後、マウスに5×106 CFUのC. difficile芽胞を経口投与した。C. difficile感染後12時間ごとに体重と疾患の症状（便の性状、体重減少、刺激に対する反応の低下）を記録し、死亡率を追跡した。疾患活動性指数（DAI）は前述の48のようにスコア化し、0（正常）から12まで変化させた。簡単に説明すると、DAIは便の特徴の臨床症状、行動の変化、および体重減少率に基づいている。各項目は0から4までのスコアで評価され、個々の値が加算されて総合スコアとなる。

T.muまたは薬物治療モデル
SPFマウスのT.mu-C.difficile共入植モデルにおいて、マウスに2×106 T.muを1週間おきに経口投与した。実験では、マウスを無作為に4群に分けた：正常マウス（NC群）、T.muを投与した正常マウス（NC＋T.mu群）、PBSを投与した後にC.difficileを感染させたマウス（CDI群）、T.muを投与した後にC.difficileを感染させたマウス（CDI＋T.mu群）。

SPF野生型マウスとは異なり、無菌野生型マウスの共培養モデルは抗生物質の前処理を必要としなかった。実験では、無菌マウスを3群に分けた：正常マウス（NC群）、PBSで処理した後にC. difficile感染させたマウス（CDI群）、T.muで処理した後にC. difficile感染させたマウス（CDI + T.mu群）。まず、CDI + T.mu群には2×106 T.muを1回接種し、CDI群には等量のPBSを投与した。7日後、CDI群とCDI + T.mu群に5 × 106 CFUのC. difficile胞子を経口投与した。36時間の観察後、マウスの糞便、盲腸内容物、大腸内容物および結腸内容物を採取し、さらに解析を行った。さらに、CDI群およびCDI＋T.mu群ともに5匹のマウスを長期生存観察のために飼育した。

T.mu排除実験では、野生型C57BL/6 Jマウスを、正常マウス（NC群）、PBS投与後C.difficile感染させたマウス（CDI群）、T.mu投与後C.difficile感染させたマウス（CDI＋T.mu群）、T.muコロニー形成後C.difficile感染排除（CDI＋T.mu＋MNZ群）の4群に分けた。まず、CDI＋T.mu群とCDI＋T.mu＋MNZ群には2×106個のT.muを投与し、CDI群には等量のPBSを投与した。1週間後、CDI＋T.mu＋MNZ群には3 mg/mLのメトロニダゾール（MNZ）を7日間投与し、9日後、CDI群とCDI＋T.mu群には上記のABXを5日間投与した。その後、マウスに10 mg/kgのクリンダマイシンを腹腔内注射した。1日後、マウスに5×106 CFUのC.difficile芽胞を経口投与により感染させた。

本モデルにおけるIFN-γの役割を検討するために、Ifngr-/-マウスを本実験に導入し、マウスを4群に分けた：正常マウス（NC群）、PBS投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI群）、T.mu投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI＋T.mu群）、T.mu投与後にC.difficile感染させたIfngr-/-マウス（CT＋Ifngr-/-群）。まず、マウスに2×106 T.muを1週間おきに経口投与した。その後、10 mg/kgのクリンダマイシンを腹腔内注射し、C. difficile感染させた。さらに、IFN-γ組換え蛋白（rIFN-γ）介入実験も行い、rIFN-γ介入群（CDI+rIFN-γ群）の各マウスに、C. difficile感染後2時間および24時間に10μgのrIFN-γ組換え蛋白（50709-MNAH、SinoBiological社、中国）を腹腔内注射した。

正常マウス（NC群）、PBS投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI群）、T.mu投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI + T.mu群）、1% T.mu投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI + T.mu群）。 mu群）、C. difficile感染3日前に1％アルギニン（Sangon Biotech）投与マウス（CDI+Argine群）、C. difficile感染7日前に2％シトルリン（Sangon Biotech）投与マウス（CDI+Cit群）、オルニチンフリー食投与マウス（Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co、 Ltd., Jiangsu, China）をC. difficile感染前7日間投与したマウス（CDI+Orn-free群）。この食事処方は発表された文献40を参照した。

本モデルにおけるアルギニノコハク酸合成酵素1（ASS1）の役割を調べるため、ASS1特異的阻害剤であるα-メチル-DL-アスパラギン酸（α-MDLA、HY-W142119、MCE、米国）の介入実験を行った。マウスを無作為に4群に分けた：正常マウス（NC群）、PBS投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI群）、T.mu投与後にC.difficile感染させたマウス（CDI＋T.mu群）、T.muおよびα-MDLA投与後にC.difficile感染させたマウス（CT＋α-MDLA群）。まず、CDI＋T.mu群とCT＋α-MDLA群に2×106 T.muを1週間おきに経口投与した。その後、マウスにクリンダマイシン10 mg/kgを腹腔内注射し、C. difficile感染させた。一方，CT+α-MDLA群では，各マウスに14 mgのα-MDLAを1日2回，3日間腹腔内接種した．

糞便または盲腸内容物中のT.muの定量
マウスの盲腸を縦に切断し、重量を測定した。新鮮な糞便または採取した盲腸内容物をPBSに懸濁した（10 µL/mg）。血球計数器を用いて原虫を数え、T.muの総数と濃度を算出した。

C. difficileおよび毒素の定量
C. difficile感染後48時間後にマウスを犠牲にし、盲腸と結腸、および糞便、盲腸内容物、結腸内容物を無菌的に取り出し、秤量し、0. 3% Triton X-100（A600198, Sangon Biotech）を含むPBSでホモジナイズし、連続希釈し、50％卵黄乳剤（HB8295, Hopebio）、0.5 mg/mL D-シクロセリン（HB0254, Hopebio）および16 μg/mLセフォキシチン（C859229, Macklin, Shanghai, China）を添加したCCFA寒天培地（HB8808, Hopebio, Shandong, China）プレートにプレーティングし、増殖細胞を定量した。C. difficile芽胞を定量するため、サンプルをさらに70℃で10分間加熱し、50％卵黄乳剤、0.5mg/mL D-シクロセリン、16μg/mL セフォキシチン、0.5％酵母エキス、0.1％タウロコール酸ナトリウムを添加したCCFA寒天プレートにコートした。Mouse CDT-B ELISA KIT (ml058147, mlbio, Shanghai, China)を用いたELISA法により、糞便中および糞便内容物中のC. difficile毒素Bの濃度を測定した。

肉眼的および組織学的評価
盲腸末端から肛門までの結腸全体を撮影し、結腸の長さを測定した。組織学的解析のため、盲腸を4%パラホルムアルデヒド（A500684, Sangon Biotech）で48時間固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（4 μm）をヘマトキシリン・エオジンで染色した。画像は顕微鏡（DP74、オリンパス、日本）で撮影した。組織学的スコアは、以前に記載された基準に従って評価した48。簡単に言えば、組織学的損傷は、上皮組織の損傷、浮腫の量、好中球浸潤に基づいて評定された。各カテゴリーを0から3のスコアで評価し、個々の値を加算して総合スコアとした。

ゴブレット細胞染色
パラフィン包埋組織切片（4μm）をそれぞれキシレン（10023418、SINOPHARM、上海、中国）および100％／100％／70％エタノール（100092683、SINOPHARM、上海、中国）で脱脂した。脱脂後、切片をPAS色素溶液B（G1049, Servicebio, Hubei, China）で15分間染色した後、暗所でPAS色素溶液Aを30分間、PAS色素溶液Cを30秒間染色した。最後に、スライドを無水エタノールに3回浸して脱水し、キシレンに2回浸して透明にした。画像はオリンパスDP74顕微鏡で撮影した。

免疫組織化学
免疫組織化学的分析のために、パラフィン包埋組織切片（4μm）を脱パラフィン、脱水し、クエン酸緩衝液（pH6.0）で抗原回収を行った。その後、切片を3％過酸化水素にさらして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、5％ウシ血清アルブミン（BSA、A8010、Solarbio、北京、中国）で30分間ブロックし、抗MUC2抗体（27675-1-AP、Proteintech、米国、1：1000希釈）で4℃で一晩染色した。切片をPBSで少なくとも3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体（GB23303, Servicebio, 1:200希釈）で1時間染色し、最後にヘマトキシリンで染色し、脱水してマウントした。画像はオリンパスDP74顕微鏡で撮影した。染色強度はImageJソフトウェアを用いて解析した。

免疫蛍光
パラフィン包埋組織切片（4μm）をキシレンに3回浸し、100％/100％/95％/90％/80％/70％のエタノール-水勾配で再水和した。その後、切片をクエン酸抗原除去液（0.1M、pH6.0）に入れ、5分間加熱した。室温（RT）まで冷却後、切片を5％BSAで1時間ブロックし、抗アルギナーゼ抗体（ab233548, EPR22033-369, abcam, England, 1：1000希釈）および抗ASS1抗体（ab170952, EPR12398, abcam, 1： 1000希釈）を4℃で一晩、あるいは抗iNOS抗体（ab283655, RM1017, abcam, 1:200希釈）と抗F4/80抗体（ab300421, EPR26545-166, abcam, 1:10,000希釈）を37℃で1時間インキュベートした。その後、切片を5回洗浄し、適切な二次抗体（PV-6001, ZSGB-BIO, 北京, 中国）を用いて20分間インキュベートした。最後に、組織切片をDAPI（C1005, Beyotime）で対比染色し、核を可視化した。画像はスキャニスター（Tissue Gnostics社、オーストリア）を用いて取得した。グループ間の比較を可能にするため、ImageJソフトウェアを用いて蛍光強度を測定した。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
マウスの盲腸を摘出し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（CW2200、Cwbio、中国）を含むRIPA溶解バッファー（KGB5203、KeyGEN Bio TECH、江蘇省、中国）でホモジナイズした。ホモジネートを氷上で30分間インキュベートした後、10000×gで10分間遠心し、上清を回収してIL-1β、IL-17A、IL-6、IL-13、IFN-γ、IL-4、IL-36GおよびCXCL1の測定に用いた。IL-1β、IL-13、IL-4、IL-17AおよびIFN-γは、製造者の説明書に従って、Mouse Uncoated ELISA Kit（Invitrogen、米国）を用いて測定した。IL-36GはMouse ELISA kits (DL-IL1F9-Mu, DLdevelop, Jiangsu, China)を用いて定量し、CXCL1はMouse ELISA kits (EM0003, Fine test, Hubei, China)を用いてメーカーの指示に従って定量した。

RNA抽出とqRT-PCR
Total RNA Extraction Kit（R1200、Solarbio、北京、中国）を用いて、製造業者のプロトコールに従って大腸組織からRNAを抽出した。RNAはPrimerScript RT Reagent Kit (RR037A, Takara, Japan)を用いてcDNAに変換した。逆転写後、7900 Fast Real-Time PCR system（Roche, Switzerland）を用い、SYBR Green qPCR Master mixes（b21203, Bimake, USA）を用いてqRT-PCRを行った。PCRプログラムは以下の通りであった： 95 °C で 10 分間、95 °C で 10 秒間、60 °C で 30 秒間、72 °C で 32 秒間のサイクルを 40 回繰り返した。β-アクチンを内因性コントロールとして用い、指示遺伝子の転写レベルはそれに対して正規化した。使用したプライマーはSupplementary Data 1に記載されている。

リンパ球の調製
大腸固有層からリンパ球を単離するために、大腸を縦に開き、PBSで洗浄して管腔内の糞便を除去し、1cmの大きさに切断した後、冷PBS中で振盪し、10mM EDTAを含む冷PBSで200rpm、37℃、30分間インキュベートして上皮細胞を除去した。次に、薄層前膜組織を断片でスライスし、5％ウシ胎児血清（FBS、HY-T1000、ExCell Bio、ウルグアイ）、100 U/Lペニシリン、0. 1 mg/mL streptomycin、1 mg/mL collagenase (11088866001, Sigma-Aldrich, USA)、1 mg/mL hyaluronic acid (935166, Sigma-Aldrich, USA)、および1 μg/mL DNase I (D806930, MACKLIN)を100 rpm、37℃で1時間培養した。インキュベーション後、消化液を70μmのセルストレーナーで濾過して単細胞懸濁液を得、40％パーコールに再懸濁し、次いで670×g、30分間、4℃で遠心分離してパーコール勾配分離を行い、薄層前膜リンパ球を得た。細胞ペレットを冷PBSで洗浄し、2％FBS含有PBSに再懸濁した。脾臓は単細胞懸濁液に直接粉砕し、赤血球溶解バッファーで処理し、脾臓リンパ球を得た。骨髄は犠牲マウスの長骨から得た。

フローサイトメトリー
好中球およびマクロファージ解析のため、単細胞懸濁液を以下の抗体で4℃、暗所で30分間染色した：PE-Cyanine7結合抗CD45（147704, I3/2. 3, Biolegend, USA, 1:200希釈）、AlexPacific Blueに結合した抗CD11b（101224, M1/70, Biolegend, 1:200希釈）、PEに結合した抗Ly6G（127607, 1A8, Biolegend, 1:200）、FITCに結合した抗F4/80（123108, BM8, Biolegend, 1:200希釈）。

Th細胞とTc細胞の解析のために、2×106個の細胞を細胞活性化カクテル（1:500希釈、423303、Biolegend）で5％CO2中37℃で5時間刺激した。5時間培養後、細胞をPBSで洗浄し、Zombie NIR Fixable Viability Kit（423105、Biolegend、1:200希釈）で10分間染色した後、PE-Cyanine7結合抗CD45（147704、I3/2.3、Biolegend、1:100希釈）、PerCP/Cyanine5結合抗CD3. 5（100328、145-2C11、Biolegend、1:100希釈）、FITCにコンジュゲートした抗CD4（100510、RM4-5、Biolegend、1:100希釈）、APCにコンジュゲートした抗CD8（100711、53-6.7、Biolegend、1:100希釈）を用いて、暗所、4℃で40分間培養した。その後、細胞を細胞固定バッファー（420801、Biolegend）で4℃で30分間固定し、細胞内染色パーマ洗浄バッファー（421002、Biolegend）で透過処理し、PEに結合した抗IFN-γ（505808、XMG1.2、Biolegend、1:100希釈）、Brilliant Violet 421に結合した抗IL-17A（506925、TC11-18H10.1、Biolegend、1:100希釈）で染色した。

自然リンパ球（ILC）の解析のために、2×106個の細胞を、FITCに結合させた抗系統（CD45R、CD11c、Gr-1、TCR β鎖、TCR γ/δ、Fc εR1α、CD4、F4/80）（103205、117305、108405、109205、118105、134305、100510、123108、Biolegend、1： 100倍希釈）、APC/Fire 750にコンジュゲートした抗CD45（103153、30-F11、Biolegend、1：100希釈）、Brilliant Violet 711にコンジュゲートした抗CD335（NKp46）（137621、29A1. 4, Biolegend, 1:100希釈）、PE/Cyanine7（135013, A7R34, Biolegend, 1:100希釈）に結合させた抗CD127（IL-7Rα）を4℃で50分間染色した。表面マーカーで染色後、True Nuclear Fix solution（424401、Biolegend社製）で1時間固定し、Brilliant Violet 605（644817、4B10、Biolegend社製、1:20希釈）に結合した抗T-bet、PEに結合した抗GATA3（653803、16E10A23、Biolegend社製、1： 20希釈）、Alexa Fluor 647（157703、W17001A、Biolegend、1:200希釈）にコンジュゲートした抗EOMES、PerCP-eFluor 710（46-6981-80、B2D、eBioscience、1:100希釈）にコンジュゲートした抗RORγ（t）をTrue Nuclear Permバッファー（424401、Biolegend）で1時間処理した。フローサイトメトリーは、FACS Canto II Flow Cytometer（BD Bioscience, USA）で行い、FlowJoソフトウェアで解析した。

In vitro共培養
C.difficileによって刺激された好中球に対するT.muの効果を調べるため、Histopaque-1119およびHistopaque-1077（50/50 v/v；Sigma、米国）を用いて二重勾配遠心後、骨髄由来の単細胞懸濁液から好中球を精製した。合計1×105個の細胞を、10％FBSを含むDMEM培地（VCM12008、VICMED、江蘇省、中国）中、37℃で培養した。その後、1×107 CFU/mL のC.difficileを加え、4時間培養を行った。

T.muがC.difficileの菌数とアミノ酸に及ぼす影響をin vitroで調べるために、2×105 CFUのC.difficileをBHIブロス中で2×105または2×106 T.muとともに、あるいはT.muを加えずに培養した。培養液を37℃で24時間嫌気培養した後、BHI寒天培地プレートにプレーティングしてC. difficileをカウントし、質量分析でアミノ酸を定量した。

アミノ酸の定量
培養液、血清、糞便内容物および結腸組織を、0.1％ギ酸を含む抽出溶媒（アセトニトリル：メタノール：水＝2：1：1）1mLに懸濁し、振盪、ホモジナイズ、超音波処理を行った後、懸濁液を-20℃でインキュベートした。1時間後、懸濁液を12,000×gで15分間遠心分離し、上清を回収してアルギニン、シトルリン、オルニチン、プトレシン、アラニン、5-アミノバレレートを液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）で定量した。

非標的メタボローム解析
LC/MSベースのメタボロミクスはMajorbio Biotech社（中国、上海）により実施された。CDI群（n = 6）、CDI + T.mu群（n = 6）、QC群（CDI群とCDI + T.mu群の全サンプルを等量混合したもの、n = 3）を分析した。簡単に説明すると、50mgの糞便内容物サンプルを正確に秤量し、メタノール：水（4：1、v/v）溶液400μLを用いて代謝物を抽出した。混合物を-10℃で沈降させ、ハイスループット組織破砕機Wonbio-96c（Shanghai Wanbo Biotechnology Co. サンプルを-20℃で30分間静置し、タンパク質を沈殿させた。13,000×g、4℃で15分間遠心後、上清をLC-MS分析用のサンプルバイアルに注意深く移した。

代謝物のクロマトグラフィー分離は、ACQUITY UPLC HSS T3カラム（100 mm × 2.1 mm i.d.、1.8 µm、Waters、Milford、USA）を装備したThermo UHPLCシステムを用いて行った。質量分析データは、ポジティブまたはネガティブイオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン源を備えたThermo UHPLC-Q Exactive HF-X Mass Spectrometerを使用して収集した。最適条件は次のように設定した：イオン源温度425℃、シースガス流量50arb、Auxガス流量13arb、イオンスプレーボルテージフローティング（ISVF）-3500V（ネガティブモード）および3500V（ポジティブモード）、MS/MSの規格化コリジョンエネルギー20-40-60Vローリング。フルMS分解能は60,000、MS/MS分解能は7500。データ取得はData-Dependent Acquisition (DDA)モードで行った。検出は70-1050 m/zの質量範囲で行われた。

LC/MS生データの前処理はProgenesis QI（Waters Corporation, Milford, USA）ソフトウェアで行い、CSV形式の3次元データマトリックスをエクスポートした。この三次元マトリックスの情報には、サンプル情報、代謝物名、マススペクトル応答強度が含まれます。内部標準ピーク、および既知の偽陽性ピーク（ノイズ、カラムブリード、誘導体化試薬ピークを含む）は、データマトリックスから除去され、冗長化され、ピークプールされました。同時に、データベースを検索して代謝物を同定した。主なデータベースは、HMDB、Metlin (https://metlin.scripps.edu/)、Majorbio Databaseである。

データはMajorbioクラウドプラットフォーム（www.cloud.majorbio.com）の無料オンラインプラットフォームを通じて解析した。任意のサンプルセットで少なくとも80％検出された代謝特徴を保持した。フィルタリング後、代謝物レベルが定量下限を下回った特定のサンプルについて代謝物の最小値をインプットし、各代謝物特徴を合計で正規化しました。サンプル調製や装置の不安定性による誤差を低減するため、サンプルのマススペクトラムピークの応答強度をsum正規化法で正規化し、正規化データマトリックスを得た。同時に、相対標準偏差（RSD）が QC サンプルの 30%を超える変数を除去し、log10 対数化を行って、その後の解析のための最終データマトリックスを得た。

KEGG PATHWAY データベース（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes、http://www.genome.jp/kegg/）49 は、分子間相互作用、生理学的・生化学的反応、および遺伝子産物間の関係を記述する代謝パスウェイを手作業でマッピングしたコレクションである。代謝物とKEGG化合物IDとのアライメント情報により、代謝物に関与する代謝パスウェイ情報を取得し、生物学的代謝プロセスへの影響を評価することができる。KEGG パスウェイの濃縮解析は、選択された代謝セットの濃縮解析を意味し、超幾何分布アルゴリズムが代謝セット内の代謝物の有意な濃縮のパスウェイを得るために使用されます。一般に、BH 法はデフォルトで P 値を補正するために使用され、補正された P 値が <0.05 の場合、このパスウェイに有意な濃縮があるとみなされます。Relative-betweeness centralityを用いたKEGGトポロジー解析。

類似した発現パターンを持つ代謝物は、通常機能的に関連している。選択された代謝濃度に含まれる代謝物について、クラスターヒートマップやサブクラスタートレンドチャートなどのクラスター解析を行いました。サンプルおよびアミノ酸のクラスタリング解析には階層的クラスタリングを使用した。階層クラスタリング法はComplete、距離アルゴリズムはユークリッドとした。

マイクロバイオーム解析
DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN, USA）を用い、製造元のプロトコールに従って、糞便内容物サンプルから全DNAを抽出した。濃度と純度はNanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific, USA）を用いて測定した。異なる領域V3〜V4の16 S rRNA遺伝子を、プライマー338 F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′）および806 R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を用いて増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のサイクリング条件は以下の通りであった： 初期化のために95℃で3分間、95℃で30秒間の変性、52℃で30秒間のアニーリング、72℃で42秒間の伸長を30サイクル行い、その後72℃で10分間最終伸長を行った。PCR産物の長さと濃度はアガロースゲル電気泳動で決定した。PCR産物はGeneTools Analysis Software (Version 4.03.05.0, SynGene)を用いて等密度比で混合した。PCR産物はAxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen, USA)を用いて精製した。シーケンスライブラリーは、NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit for Illumina（Bioo Scientific, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従って作成した。ライブラリーはMiseq PE300/NovaSeq PE250プラットフォーム（Shanghai Majorbio Technology Co.） fastpソフトウェア（https://github.com/OpenGene/fastp、バージョン0.20.0）を使用してオリジナルのシーケンス配列の品質管理を行い、FLASHソフトウェア（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash、バージョン1.2.7）を使用してスプライシングを行った。Qiime2 flowのDADA2プラグイン（またはDeblurプラグイン）を使用し、QC連結後の最適化配列のノイズを除去する。DADA2ノイズ除去後の配列は、しばしばASV（amplicon sequence variants）と呼ばれる。葉緑体およびミトコンドリア配列にアノテーションされたすべてのサンプルを削除します。その後のAlpha多様性およびBeta多様性データの解析における配列深度の影響を最小限にするため、全サンプルの配列数を20,000にスケーリングした。スケーリング後も、各サンプルの平均配列カバー率は99.09%に達した。ASVの種分類学的解析は、Sliva 16 S rRNA遺伝子データベース（v 138）に基づき、Qiime2のNaive Bayes分類法を用いて行った。腸内細菌叢のバイオインフォマティクス解析は、Majorbio Cloudプラットフォーム（https://cloud.majorbio.com）を用いて実施した。

ASVとサンプルを用いて主座標分析（PCoA）を行い、次元削減によってサンプル群集組成の違いに影響を与える潜在的な主成分を同定した。Qiime（http://qiime.org/install/index.html）を用いて、Bray-Curtis距離メトリクスに基づくβ多様性の距離を算出した。β多様性距離行列に従って階層的クラスタリングを行った。R-3.3.1（vegan）によるPCoA（Principal Co-ordinates Analysis）。ANOSIM（類似性分析）は、全グループのPCoAについてRによって実行された。

ヒートマップは、2次元のマトリックスまたは表でデータの大きさを表すために色の勾配を使用し、コミュニティの種の構成に関する情報を提示する。階層的クラスタリングは通常、種間またはサンプル間の存在量の類似性に従って行われ、その結果は群集ヒートマップ上に表示される。

各グループにおける優占種の構成比率と、異なるグループにおける優占科の分布比率は、python-2.7 veganパッケージとCircosツールを用いて可視化した。

線形判別分析(LDA)の効果量(LEfSe)(http://huttenhower.sph.harvard.edu/LEfSe)を行い、異なるグループ間で有意に豊富な細菌の分類群(ファミリー間)を同定した(LDAスコア>2, P < 0.05)。

統計分析
データは平均値±SEMで示した。グループ間の差の統計的有意性は、SPSS 20ソフトウェア（IBM Corp.）

報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されている。

データの利用可能性
本研究で得られたMass spec-based metabolomicsデータは、MetaboLightsデータベース（MTBLS9719, https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS9719）に寄託されている。16 S rRNA-seqデータはNCBI Sequence Read ArchiveデータベースSRA, PRJNA1077800に寄託されている。この研究で生成または解析された残りのデータはすべてSource Dataファイルに記載されている。ソースデータは本論文に添付されている。

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謝辞
C. difficile VPI 10463 (ATCC 43255)株を提供してくれたXiaojun Songに感謝する。資金提供は、中国国家自然科学基金82102408号（H.Y.）、81871734号（B.G.）、82072380号（B.G.）、中国博士研究基金2022M712681号（H.Y.）、江蘇省自然科学基金BK20231170号（H. Y. Y.）、広東省人民病院先進人材研究基金助成金KJ012021097（B.G.）、徐州医科大学優秀人材紹介プロジェクト助成金D2019030（H.Y.）、D2020060（X.L.）。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Huan Yang, Xiaoxiao Wu, Xiao Li.

著者および所属
中国江蘇省徐州市徐州医科大学医療技術学院徐州検査診断学重点実験室

Huan Yang, Xiaoxiao Wu, Xiao Li, Wanqing Zang, Zhou Zhou, Yuan Zhou, Ying Chen & Bing Gu

中国・江蘇省徐州市・徐州疾病管理予防センター

Wenwen Cui

中国江蘇省徐州市徐州医科大学病原生物学・免疫学教室、江蘇省免疫・代謝重点実験室、感染・免疫実験室

甲燕波・王玉剛

中国・広東省広州市・南方医科大学広東省人民病院臨床検査部

王亮・顧秉

中国江蘇省徐州市徐州医科大学動物実験センター

アンカン・フー、リアンリアン・ウー、クアンガン・チェン、ズータオ・ホアン

中国広東省広州市済南大学健康科学センター（医学部）バイオメディカル・トランスレーショナル・リサーチ・インスティテュート

Zhinan Yin

貢献
H.Y.、X.W.、Y.K.、Y.W.が研究を計画し、原稿を作成した。H.Y.、W.Z.、X.W.、X.L.、W.Z.、Z.Z.、L.W.、Z.H.、Q.C.、A.H.は実験の実施と解析を行った。X.W.、H.Y.、X.L.、L.W.、Y.Z.、Y.C.、Z.Y.、Y.K.はデータの解析と解釈に知的貢献をした。X.W.、W.C.、H.Y.は原稿を執筆した。H.Y.、B.G.、X.L.は研究資金を提供した。

連絡先
Yugang WangまたはBing Guまでご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、Rebecca Drummond氏、およびその他の匿名の査読者の方々の本研究の査読への貢献に感謝いたします。査読ファイルはこちら。

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楊 浩（Yang, H., Wu, X., Li, X. et al. 常在性原虫は、アルギニン-オルニチン代謝と宿主腸管免疫応答を介して、マウスにおけるクロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）病原体の発症を抑制する。Nat Commun 15, 2842 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-47075-0

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受領
2023年4月10日

受理
2024年3月20日

掲載
2024年04月02日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47075-0

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