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発行：2023年4月1日
好塩性古細菌の菌糸と芽胞への細胞分化について

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37389-w

シュウクン・タン
シャオヤン・ズィー
...
徐 萍
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Nature Communications 14巻、記事番号：1827（2023） この記事を引用する
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アブストラクト
細菌の中には、細胞分化や多細胞化を伴う複雑なライフサイクルを持つグループがある。例えば、Streptomyces属の放線菌は、多細胞の植物性菌糸、空中菌糸、および胞子を形成する。しかし、古細菌では、同様のライフサイクルはまだ報告されていない。我々は、ハロバクテリウム科のいくつかのハロアルカイアが、ストレプトマイセス菌と同様のライフサイクルを示すことを明らかにした。塩沼から分離されたYIM93972株は、菌糸と胞子への細胞分化を行う。他の近縁株も菌糸を形成することができ、比較ゲノム解析により、ハロバクテリウム科のこのクレードのメンバーに共通する遺伝子シグネチャー（特定の遺伝子の明らかな獲得または喪失）を指摘した。分化しない変異体のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム解析から、YIM93972株ではCdc48ファミリーATPaseが細胞分化に関与している可能性が示唆された。さらに、YIM93972株の推定オリゴペプチドトランスポーターをコードする遺伝子は、相同遺伝子群（bldKA-bldKE）の欠失を有するStreptomyces coelicolor変異体の菌糸形成能力を回復できることから、機能の同等性が示唆された。我々は、YIM93972株をハロバクテリウム科の新属の新種として提案し、Actinoarchaeum halophilum gen.nov.sp.nov. このように、古細菌の一群に複雑な生活環が存在することを示したことは、古細菌の生物多様性と環境適応の理解に新たな一面を与えるものである。
はじめに
古細菌は原核生物の一種で、バクテリアとは構造的に似ているが、進化的には異なる生物である。古細菌は、普遍的な遺伝子（主に翻訳システム構成要素をコードする）の系統樹が大きく異なるほか、DNA複製や転写機構が一部異なる、膜脂質や細胞壁の構造が異なる、膜や細胞壁の生合成に関わる酵素機構が異なる、いくつかの固有の補酵素や固有のRNA修飾など、多くの主要点で細菌と異なる1. 古細菌の細胞形態は、葉状のSulfolobus acidocaldarius2、糸状のMethanospirillum hungatei3やThermofilum pendens4、棒状のThermoproteus tenax5やPyrobaculum aerophilum6、さらには角型のHaloquadratum walsbyi7などバクテリア細胞と同じで、驚くべき多様性が発見されています。これらの古細菌細胞の明確な形状は、細胞壁と細胞骨格によって維持されています。しかし、メタノサルキナのシスト形成のような限定的な細胞分化を含む古細菌生物学の研究が広がっているにもかかわらず、これまでのところ、古細菌の大きな形態変化を伴う複雑な細胞分化の報告はない。このように古細菌では、桿菌やクロストリジアでは胞子を形成し、シアノバクテリアではヘテロシストやアキネートを形成し、特に粘菌や放線菌では複雑に分化したコロニーを形成するなど、細菌では多様な細胞分化が見られるが10、古細菌では複雑な細胞分化が見られないことが対照的である。
本研究では、塩沼の堆積物から分離された、菌糸と胞子への細胞分化を示すハロアーキアグループを紹介する。このハロアーキアの形態形成は、視覚的にストレプトミセス菌の形態形成に類似している。比較ゲノム解析の結果、このような古細菌の形態形成に関連する遺伝子の獲得と喪失の可能性が示唆された。Cdc48ファミリーATPaseをコードする遺伝子と、推定オリゴペプチドトランスポーターをコードする遺伝子群は、非分化変異体のマルチオーム解析により、細胞分化に関与している可能性が示唆された。驚くべきことに、ハロアーキア由来のこの遺伝子群は、相同遺伝子群（bldKA-bldKE）を欠損させたStreptomyces coelicolor変異体の菌糸形成を回復させることができた。これらの結果は、古細菌の形態に関する新たな知見を提供するとともに、古細菌の生物多様性や環境適応に関する理解を深めるものである。
結果および考察
複雑な形態的分化を示す新しいハロアーキアルの系譜
低塩分環境における放線菌の多様性を調査していたところ、中国の新疆ウイグル自治区にある七条京塩湖から、明確な増殖パターンを持つ予想外の超好塩性古細菌が偶然発見されました。この新規株はYIM 93972と命名され、これまで好塩性放線菌の分離に主に用いられてきた20%NaCl (w/v) 添加のModified Gause (MG) 寒天平板を用い、37℃、4週間の標準希釈平板法により土壌試料から分離した11. YIM 93972のコロニーは、黄色、オレンジ色、赤色の枝状フィラメントと白色の気生菌糸からなり、複雑な細胞分化を経て（図1a、補足図1a）、固体培地（図1b I-III）および液体培地（図1b IV）の両方で胞子（0.5-0.7 × 1.0-1.2 μmサイズ）を生産していることが確認された。他の胞子形成株12と同様に、この新しい好塩性古細菌の胞子は70 ℃までの熱ストレスに耐性を示した。一方、基質ハイファ（SH）は60 °Cまで耐性を示した（補足図1b）。胞子の熱ストレスに対する高い耐性は、その保護・修復能力により、極端な塩分環境下でも生き残ることができるのかもしれない。YIM 93972の最適な増殖は、40-45℃、3.8-4.3M NaCl、7.0-7.5pHで観察された（補足資料1）。透過型電子顕微鏡（TEM）により、細胞の収縮、隔壁の形成、棒の分離から鎖の形成まで、胞子の分化のさまざまな段階を明らかにした（図1b VおよびVI）。このように、この新しいハロアルケオンの細胞分化には、基質・空中菌糸の成長と胞子形成が含まれ、Streptomycesの形態形成に類似していることがわかった。
図1 ハロアルケオンのYIM93972株の特徴。
a ISP 4培地で培養したYIM 93972株の15日後および29日後の耐塩性（n = 3） b 25% NaClを含む固体および液体ISP 4培地で培養したYIM 93972株のコロニー形態（I）および走査型電子顕微鏡写真（EM）（n = 3）. 基質菌糸（II; bar, 10 μm）、空中菌糸（III; bar, 10 μm）、および長い棒状の胞子鎖（III; spore size, 0.5-0.7 × 1.0-1.2 μm）の走査型EMイメージ。液体ISP 4培地で生育した菌糸の走査型EM画像（IV; bar, 5 μm）。胞子形成後にISP 4プレートから採取した細胞の透過型EM画像（VおよびVI）（バー、200 nm）。 c 全組織メタノリセートの薄層クロマトグラフィー分析。レーン：1, Haloferax volcanii CGMCC 1.2150T; 2, YIM 93972; 3, Escherichia coli K12. d 一次元薄層クロマトグラフィーによるYIM 93972の極性脂質組成の分析。レーン：1, YIM 93972; 2, Halomarina oriensis JCM 16495T; 3, Halomarina salina ZS-57-ST。原点は一番下にある。略号： FAMEs、脂肪酸メチルエステル；GDEMs、グリセロールジエーテル部位；GLs、糖脂質；PGP-Me、ホスファチジルグリセロールリン酸メチルエステル；PGS、ホスファチジルグリセロサルフェート．TGD-1：ガラクトシルマンノシルグルコシルジエーテル；TGD-2：グルコシルマンノシルグルコシルジエーテル；S-TeGD：硫酸化ガラクトシルマンノシルガラクトフラノシルグルコシルジエーテル；S-TGD-1：硫酸化ガラクトシルマンノシルグルコシルジエーテル。
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16S rRNA遺伝子の解析から、YIM 93972はHalocatena pleomorpha SPP-AMP-1Tと96.65%の同一性を持つ近縁種であり、この2種はHalobacteriaceae科内の別系統を示すと考えられる。YIM 93972は放線菌に似た形態的特徴を示すが、それ以外は典型的な古細菌で、特に膜脂質にグリセロールジエーテル部位（GDEM）とホスファチジルグリセロールリン酸メチルエステル（PGP-Me）を含み、S層細胞壁を持つ（図1c、d、補図2、補論データ1）。また、ゲノム解析やプロテオミクスデータから、多くの極限好塩性古細菌と同様に、YIM 93972は光駆動型イオン輸送体として機能する7回膜貫通型タンパク質ハロロドプシン（補足図3）を産生することが判明した。しかし、YIM 93972は、いくつかの超好塩性古細菌で確認されているC50カロテノイド、バクテリオルベリンの生合成に関わる酵素（特に、リコペンエロンガーゼ、halo.01227）をコードする遺伝子を欠いており、その生産はハロホドプシンによって調節されている13, 14。
YIM 93972とその近縁種の生態系分布を調べるため、新疆ウイグル自治区の愛鼎湖、大南湖、大番城東湖、宇尊ブラク湖から15個の土壌サンプルを採取し、YIM 93972の16S rRNA遺伝子配列に基づいて設計した一対のPCRプライマーで環境DNAから16S rRNA遺伝子を増幅した。Aiding Salt Lakeの2つの土壌サンプルにおいて、47の16S rRNA遺伝子の配列が得られ、YIM 93972とともにクレードを形成することが示された（補足図4aのOTU13、補足データ18の配列）。このように、YIM 93972と関連するハロアルカイアは、ソルトレイクの環境に広く存在していることがわかった。さらに、これらの塩湖の同じ土壌試料から、同じ方法でYIM 93972に関連する古細菌の分離をModified Gause寒天培地プレート上で行ったところ、YIM 93972に関連する古細菌の分離が試みられた。最終的に、Aiding塩湖の3株YIM A00010、YIM A00011、YIM A00014、Uzun Brac塩湖の2株YIM A00012、YIM A00013が、形態的に分化した新規古細菌株として確認された（図2a）。
図2：形態分化したハロアーキア類の形態と系統。
a ISP 4培地で培養した7種の形態形成ハロバクテリアの14日後および28日後のコロニー形態（1行目）および走査電子顕微鏡写真（2、3行目）（n = 3） b, ハロバクテリア内の形態形成分離株（緑）の系統的配置図. 最尤系統樹（IQ-Tree59、LG + F + R10モデル）は、130のHalobacteriaゲノムの間で普遍的であり、これらのいずれにおいても最大4つのパラログを追加する268のオルソログ遺伝子に基づくものである。このツリーは、次の60のHalobacterium-Halodesulfurarchaeumクレードに根ざしている。分岐サポート値はaBayesを用いて推定した。スケールは、アミノ酸部位ごとの置換数。
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16S rRNAの系統樹から，インドの人工塩田から分離されたH. pleomorpha SPP-AMP-1T15と日本の海水水族館から分離されたHalomarina oriensis JCM 16495Tが，形態的に分化した新6菌株に最も近接する既知種であると考えられた（補図4b）．H. oriensis JCM 16495Tの細胞は不規則な球形または円盤状であったが、H. pleomorpha SPP-AMP-1Tの細胞は棒状のほかに多形であった。この2株と他の多形株（Haloferax volcanii CGMCC 1.2150T 17とHaloplanus salinarum JCM 31424T 18）を採取して形態比較した。20%NaClを含む同じISP 4培地では、H. pleomorpha SPP-AMP-1TのみがYIM 93972と同様の分化形態を示した（図2a、補足図5および6）。これらのことから、様々な低塩環境において、形態分化する（以下、簡略化して形態形成する）ハロアーキアという別グループが広く存在することが示された。
形態形成ハローアケアーのゲノム的特徴
形態形成ハロアーキア（特に、菌糸の分化と胞子形成を行うハロアーキアを指す）の生態をさらに深く理解するため、YIM93972と他の5つの形態形成株の全ゲノムを解読した。YIM 93972のゲノムは、主要染色体（2,676,592 bp、G + C含有率57.2%、予測遺伝子数2803）、小型染色体（844,905 bp、G + C含有率54.7%、予測遺伝子数722）、3つのプラスミドからなる（補足図7、補足資料2a）。YIM 93972のゲノムは、主要染色体と小染色体上に、3744個の予測タンパク質コード遺伝子、47個のtRNA、2個のrRNAオペロン（2個の16S rRNA遺伝子は99.8％の同一性を持つ）を包含していることが確認された。形態形成ハローキティ株の6本のゲノムはすべてサイズの異なる2本の染色体から構成されていたが、それ以外では多くの異なるゲノムの特徴を確認した（Supplementary Data 2, Supplementary Data 2b-f）. 特に、YIM A00010とYIM A00011のゲノムサイズ（それぞれ5.97Mbと5.82Mb）は、他の4株のゲノムサイズ（平均3.23Mb）に比べて大幅に大きい。6株のうち、YIM A00013だけがYIM 93972のように2つのrRNAオペロンを持っていたが、前者のゲノムは後者に比べてプラスミドを持ち、包含する遺伝子数も少なかった。
そこで、14,870個のハロアーキアのオーソログ遺伝子のクラスター（haloCOGs; Supplementary_data_file_1） を構築した。ハロバクテリア属の130のゲノムに普遍的に保存されている268の低パラロジーのハロCOGを系統解析した結果（補足データ3）、YIM 93972とH. pleomorphaを含むその形態的近縁者は、ハロバクテリア科内のHalomarina oriensisとクレードを形成した（図2b、補足_data_file_2）。形態形成ハロアルカイアは、厳密に保存された2053個のオーソログ遺伝子のコアを共有するが、他のハロバクテリアに共通する336個の遺伝子を欠く（Supplementary Data 3, Supplementary Data 4a）。YIM 93972の3744個の予測遺伝子のうち3208個については、少なくとも1つの非形態性ハロアルカイオンにオルソログが同定された。ハロアルカイオンの遺伝子の有無のパターンを種樹にマッピングした後、ハロバクテリアクラスにおける遺伝子の獲得と喪失の歴史について最尤法で再構築が得られた。形態形成ハロアルカイアの祖先は3903個のハロCOGを含むと推定され、そのうち1420個は形態形成クレードと姉妹クレードとの共通祖先を分ける木の枝に表れたが、339個の新しい遺伝子が得られた（補足データ4b）。
いくつかの遺伝子の喪失は、これらの新しいハロアルカイアの形態形成（菌糸の形成、細胞運動の欠如など）に関連していると思われた（Supplementary Data 4c）。これらには、形態形成しないハロアーキア19の棒状細胞形状の制御に関与するCetZ（FtsZ3）の欠損、アーキエラム、ハロバクテリアやメタノミクロビア20に代表されるHaloferax volcaniiのPilB3遺伝子座に代表されるハロバクテリアタイプ4のピリシステムがある。形態形成ハロアルカイアでは棒状細胞は観察されず、cetZの欠損と複雑な菌糸の分化との間に機能的な関連があることが示唆された。逆に、形態形成性ハロアーキアでは、MreB様タンパク質のhalo.02163ファミリーが拡大し、他のハロアーキアに共通するMreB様タンパク質のhalo.02581ファミリーは消失している。MreBがバクテリアの重要な細胞形状決定因子であることを考えると21、これらの発見は、これらの古細菌の多形性に関連すると思われる細胞骨格組織における特定の変化をさらに強調している（補足図8）。
獲得した遺伝子のうち、7つの形態形成ハロ古細菌すべてで厳密に保存され、我々のゲノムセット中の他のハロバクテリアでは存在しない遺伝子が61個存在する。これらの獲得遺伝子には、AAA+ATPaseであるCdc48の明確なホモログ（halo.06695, ORF_0238）が含まれていた。このスーパーファミリーのタンパク質は、細胞周期制御、DNA複製、細胞分裂、ユビキチン-プロテアソームシステムなど、様々な細胞プロセスで重要な役割を果たし22, 23、形態分化に寄与する可能性がある。また、バチルス菌の胞子の主要な構成要素であるInhA1の遠いホモログであるM6ファミリーメタロプロテアーゼ（halo.06530 and halo.06177, ORF_0582 and ORF_1236）も注目すべき事例である24。ほとんどの古細菌では、S層は表面認識と細胞形状の維持に重要な役割を果たす唯一の細胞外皮成分である25, 26. 形態形成期の古細菌は、S層形成糖タンパク質（halo.06692, ORF_1400）を明確に共有しており、これがユニークな形態に関係している可能性がある。さらに、プロテオミクスデータから、YIM93972はORF_1400とORF_1704がコードする2種類のS層タンパク質を生成することがわかった（補足図9a-d）。形態形成ハローアケアで獲得され、場合によっては重複している残りの遺伝子のほとんどについて、機能予測はないか、一般的な予測しかなかったが、これらの遺伝子の多くは、予測される膜貫通タンパク質または分泌タンパク質をコードしていた（補足データ4b、d）。これらのタンパク質のいくつかは、アスパラギン酸に富む反復配列を持ち、胞子形成性放線菌の胞子発芽を活性化することが知られているCa2+イオンを調整することができる27。
胞子形成細菌は、エネルギー貯蔵と胞子保護のために、独特の低分子化合物を使用している。我々は、トレハロース生合成と利用28、ジピコリン酸生合成29、ポリ（R）-ヒドロキシアルカン酸生合成30に関与する、形態形成ハロアルカアの7ゲノム全てに存在する遺伝子を特定した（補足データ3）。比較オミックスデータによると、胞子形成に関与する低分子化合物の生合成に関わる遺伝子、すなわちポリ(R)-ヒドロキシアルカン酸合成（ORF_2608）と4-ヒドロキシテトラヒドロジピコリネート（ORF_1392）は、mRNAレベルで3.6倍と7.8倍、タンパク質レベルでそれぞれ1.3倍と1.6倍に発現が上昇していることが明らかになりました。このことから、ポリ(R)-ヒドロキシアルカン酸は胞子の重要な貯蔵分子である可能性が示唆された。ポリヒドロキシアルカン酸は、いくつかの放線菌種でも菌糸や胞子に蓄積される30。しかし、これらの遺伝子はすべて、非形態形成性Halobacteriaにも広く存在している。形態形成ハロアルカイアのすべてのゲノムに存在するもう一つの注目すべき遺伝子モジュールは、MoxRファミリーATPaseとvon Willebrand factor type A (vWA) domain containing proteinからなり、細菌の多細胞化と強く関連している31。
ランダム変異導入と比較マルチオミクスにより、複数の形態形成遺伝子が発見される
形態形成ハロアーキアにおける細胞分化の遺伝的基盤を明らかにするために、YIM93972の胞子を用いてニトロソグアニジン（NTG）化学変異誘発を行った。元の1110個の変異体コロニーから4世代連続培養した結果、5個のtransitional（弱い空中菌糸）変異体と3個のbald（空中菌糸なし）変異体を得た（補足図10a、b）。これら8つの変異体のゲノム配列を解析したところ、3つのハゲ変異体すべてでタンパク質をコードする遺伝子配列に2つの変異が、遺伝子の上流に1つの変異が、5つの移行変異体のうち3つの変異体で遺伝子の上流に1つの変異が確認された（補足図10c、Supplement Data 5）。3つのハゲ変異体では、2つの遺伝子内変異はORF_0238（AAA+クラスのATPase、Cdc48ファミリー）の非同義G1067A置換とORF_0964（RNAメチルトランスフェラーゼ、SPOUTスーパーファミリー）の同義C309T置換であり、第3の変異はORF_2797（ParB様DNA結合タンパク質）の非コード領域におけるT136G置換だった。5つの移行変異体において、3つの変異体（T2、T4、T5）に共通する変異は、ORF_1717（Uncharacterized protein）の上流の遺伝子間領域におけるC69Tだった。
YIM 93972の実験的な遺伝子系がないことから、同定した変異と変異表現型との関連性の可能性をさらに明らかにするため、2つの移行型および3つのハゲ型変異体について全トランスクリプトーム解析（図3a、補足データ6-9）および定量プロテオーム解析（図4a、補足図11、補足データ10-12）を実施しました。その結果、すべての移行型変異体（変異体T2の2つの生物学的複製を除く）およびハゲ変異体のトランスクリプトームにおいてORF_0238のG1067A置換が確認されたが、野生型のトランスクリプトームでは確認できなかった（補足図10d、補足データ7）。さらに、ORF_0238は、ハゲ変異体ではタンパク質レベルで3.9倍（p < 0.001）ダウンレギュレートされていた（補足データ11-12）。Cdc48ファミリーの系統解析の結果、ORF_0238は形態形成ハローキティに特異的な枝に属していることがわかった（補足図12）。これらのことから、ORF_0238はYIM93972の胞子形成と形態分化に機能的に重要である可能性が示唆された。
図3：YIM 93972株野生型および非分化型変異体のトランスクリプトーム解析。
a トランスクリプトーム解析のワークフローを模式的に示す。野生型コロニーと形態変異体から、空中菌糸（AH）と基質菌糸（SH）を代表する培養物を採取した。変異体については、2つの移行型（T）と3つのハゲ型（B）のコロニーを選択した。各サンプルは3回のテクニカルリピートを含む。W-SHおよびW-AHのサンプルは、それぞれ合計16枚の培養プレートを無作為にプールした。各変異体サンプルについて、合計32枚の培養プレートを無作為にプールした。 b 21サンプルのトランスクリプトームプロファイリングに関するスピアマンの相関係数を示す。x軸とy軸は、各2サンプル比較におけるlog2変換した遺伝子強度を表す。 c 差異発現遺伝子のヒートマップ。赤はアップレギュレートされた遺伝子、青はダウンレギュレートされた遺伝子を示す。2群間の統計的な差は、両側不対t検定を用いて分析した。P < 0.05は統計的に有意とみなされた。 d 全異常発現遺伝子の発現クラスター。すべての発現異常遺伝子は、Mfuzz（v2.58.0）75により、異なるサンプルにおけるmRNAレベルの遺伝子発現値に基づく変化倍率に従って、異なる発現グループにクラスタリングされた。 e COG機能カテゴリーによる発現異常遺伝子の機能分類。COGのカテゴリは以下の通りである。J：翻訳、リボソーム構造および生合成、K：転写、L：複製、組換えおよび修復、B：クロマチン構造および動態、D．D：細胞周期制御、細胞分裂、染色体分配、V：防御機構、T：シグナル伝達機構、M：細胞壁/膜/エンベロープの形成、N：細胞運動、U：細胞内輸送、分泌、小胞輸送、O：細胞内輸送： O：翻訳後修飾、タンパク質ターンオーバー、シャペロン、C：エネルギー生産と変換、G：糖質輸送と代謝、E：アミノ酸輸送と代謝、F：ヌクレオチド輸送と代謝、H：コエンザイム輸送と代謝、I．脂質輸送・代謝、P：無機イオン輸送・代謝、Q：二次代謝産物の生合成・輸送・異化、R：一般機能予測のみ、S：機能不明。
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図4：YIM93972株野生型および非分化型変異体のプロテオーム解析。
a マルチプレックス比較解析のためのTMT手法の概要。略号： AHは空中菌糸、SHは基質菌糸、Wは野生型、Tは移行型変異体、Bは禿げ型変異体。変異体については、移行型コロニー2個とハゲ型コロニー3個を選択した。各グループは2つの技術的反復を含み、野生グループはW-SH1およびW-SH2、移行グループはT1-SH1およびT1-SH2、ハゲグループはB2-SH1およびB2-SH2であった。W-SHとW-AHのサンプルには、それぞれ合計16枚の培養プレートを無作為にプールした。各変異体サンプルについて、合計32枚の培養プレートをランダムにプールした。 c 10サンプルのプロテオームプロファイリングに関するスピアマンの相関係数。x軸とy軸は、各2サンプル比較におけるlog2変換されたタンパク質強度を表す。 d 差異的に発現したタンパク質のヒートマップ。赤は発現量の多いタンパク質、青は発現量の少ないタンパク質を示す。2群間の統計的な差は、両側無対称のSignificance A70を用いて分析した。P < 0.05は統計的に有意とみなした。 e 全異常発現タンパク質の発現クラスター。Mfuzz (v2.58.0)75により、異なるサンプルにおけるタンパク質の発現量に基づく変化量に応じて、すべての制御不能タンパク質を異なるグループに分類した。 f COG機能カテゴリーによる制御不能遺伝子の機能分類。COGカテゴリの注釈は、図3の凡例に記載されている。
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菌糸分化の遺伝的基盤をさらに明らかにするため、野生型の気生菌糸と基質菌糸の両方から得たトランスクリプトームと定量的プロテオームを、基質菌糸のみ（気生菌糸がないことから）から得た形態形成変異体のものと比較した（図3a、bおよび4a-c、補足図11a-e）。定量的解析の結果、野生型と変異型の両方の基質菌糸に比べて、野生型の空中菌糸で有意に発現が上昇した遺伝子107個（図3c-d、補足データ9、補足データ19）、タンパク質118個（図4d、e、補足データ12、補足データ20）が見つかった。発現量の異なる遺伝子やタンパク質は、翻訳、転写、代謝、イオン輸送において主要な役割を果たす（図3eおよび4f、Supplementary Data 13）。特に、ATP-binding cassette (ABC) peptide transporter operon (I染色体上のORF_2669-ORF_2673)は、野生型の気生菌糸で著しく発現が上昇した (Fig. 5a, b, Supplement Data 14)。このオペロンでは、ペプチド結合タンパク質（ORF_2669）がmRNAレベルおよびタンパク質レベルでそれぞれ6.91倍および1.6倍に有意にアップレギュレートされていた（図5c、Supplementary Data 21）。
図5：YIM93972株の胞子形成関連遺伝子。
a 様々な分化条件下での典型的な遺伝子発現プロファイルをmRNAおよびタンパク質レベルで示す。略号： AHは空中菌糸、SHは基質菌糸、Wは野生型、Tは移行型変異体、Bはハゲ変異体。 bはYIM93972株におけるペプチドABCトランスポーターの遺伝子構成。矢印はORFの大きさと方向を示す。 c ペプチドABCトランスポーターコード遺伝子のmRNAおよびタンパク質レベルでの発現量。トランスクリプトームデータでは、2群間のmRNAレベルでの遺伝子発現をTPM値で算出し、W-AH/W-SH（n＝3）、T-SH/W-SH（n＝6）、B-SH/W-SH（n＝9）からの平均値±MSDで示した。プロテオミクスデータにおいて、2群間のタンパク質レベルでの遺伝子発現を強度により算出し、W-AH/W-SH（n＝2）、T-SH/W-SH（n＝3）、B-SH/W-SH（n＝4）の平均値±MSDとして示した。2群間の統計的差異は、mRNAレベルでは両側無対称のt検定（群間）、タンパク質レベルではSignificance A70（群内）を用いてそれぞれ算出した。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. fold changeとp-Valueは、図5cのSupplementary Data 4に示した。 d 形態変異体は、毒性ペプチドbialaphos（n = 3）に対して耐性がある。上記の菌株を、0（左プレート）および0.8（右プレート）μg/mLのbialaphosを含むISP 4寒天プレートで14日間培養した。
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Streptomyces coelicolorは、空中菌糸形成のシグナルとなるオリゴペプチドの輸入に、別のATP-binding cassette (ABC) transporterを用いることが明らかにされている32。YIM 93972も同様にABCトランスポーターを使ってペプチドを菌糸体に取り込むのかどうかを調べるため、オリゴペプチドパーミアーゼを介して細胞に侵入する抗生物質であるバイラフォスに対する移行型およびハクト型変異体の耐性を調べた33。その結果、野生型のみがビアラホスに感受性を示したが（図5d）、すべての変異体は1.0 μg/mL以下の濃度までこの抗生物質に耐性を示した（補足図13）。S. coelicolorのオリゴペプチドパーミアーゼ（図6a）とのタンパク質配列の類似性は低いものの、YIM93972のORF_2669-ORF_2673オペロンが空中菌糸と胞子形成に関与していると仮定した。オリゴペプチド輸送オペロン（bldKA-KE）の欠失は、S. coelicolor34において禿げた表現型（基質菌糸のみが存在する）を引き起こした。そこで、YIM93972のORF_2669-ORF_2673オペロン全体をS. coelicolor M145 ΔbldKA-KE/pIB139 mutantに導入したところ（補足データ15、16）、空中菌糸形成と胞子形成が回復することがわかった（図6b）。したがって、YIM93972のORF_2669-ORF_2673オペロンは、シグナルオリゴペプチドを取り込むことで空中菌糸形成に関与し、S. coelicolorのbldKA-KEオペロンと機能的に同等である可能性が示唆された。
図6：形態分化におけるペプチドパーミアーゼの役割：Streptomyces coelicolorのbldKA-KE欠失変異体とYIM 93972の相同オペロンとの相補性。
a S. coelicolor M145のbldKオペロンとYIM93972のORF_2669-ORF_2673の比較；矢印は遺伝子のサイズと方向を示し、アミノ酸配列の同一性の割合は各遺伝子に示されている。b M145/pIB139、ΔbldKA-KE/pIB139、ΔbldKA-KE/pIB139-bldKA-KE、ΔbldKA-KE/pIB139-orf_2669-orf_2673間の菌糸表現型の走査型EMによる比較（バー、5μm）。M145のbldKA-KEを欠損させると、空中菌糸と胞子の発生が阻害された。この表現型は、bldKA-KEまたはORF_2669-ORF_2673で補完すると野生型レベルに近くまで回復した（n = 3）。
フルサイズ画像
放線菌、シアノバクテリア、胞子嚢菌では、複数の転写制御因子（TR）が複雑な細胞分化に関与している35, 36, 37, 38。我々の転写制御因子およびプロテオミクスデータでは、47の転写制御因子が基質菌糸に比べ、気中菌糸で有意に発現量が増加または減少していることがわかった（Supplementary Data 17）。その中には、リン酸の取り込みを制御する4つのTR（ORF_0890, ORF_0891, ORF_1046）や、細胞運命制御因子YlbF（YheA/YmcA/DUF963ファミリー）のORF_1998が含まれており、これらはすべて有意に発現が上昇した。ORF_1998のオルソログはBacillus subtilis39のコンピテンス発生と胞子形成に関与している。また、別の発現量増加遺伝子であるORF_ 1932は、バイオフィルム形成のキープレイヤーであるグローバルTR BolAをコードしている39,40,41．さらに、胞子のエネルギー貯蔵分子であるポリ（R）-ヒドロキシアルカン酸の生合成に関わる遺伝子と同じオペロンにコードされるAbrBファミリーTRもアップレギュレーションされていた。これらの結果は、形態形成古細菌の細胞分化において、異なるTRが主要な役割を担っていることと整合的である。
以上、複雑な細胞分化を示すハロアーキオンの生物学的、遺伝学的、生化学的特徴を報告した。この分化のメカニズムはまだ解明されていないが、我々の発見は、いくつかの遺伝子、特に、すべての非分化変異体で変異していた明確なCdc48様ATPaseが関係していることを示唆している。形態形成性ハロアルカイアは互いに近縁であり、ハロバクテリアの系統樹ではハロバクテリア科の中で明確なクレードを形成していることから、この複雑な表現型は比較的最近生まれたものと考えられる。いくつかの細菌群で独立に進化した複雑な細胞分化が、他の古細菌でも独立に出現したのかどうかは、まだ明らかにされていない。
分類学的記述
前述のように、16S rRNAおよび連結保存遺伝子の系統解析により、YIM 93972株はHalobacteriaceae科の近縁種Halocatena pleomorphaとクレードを形成することが示された。YIM 93972株とH. pleomorpha SPP-AMP-1T株とのBLASTによる平均塩基同一性（ANIb）値は70.59%であり、Halobacteria分類における属定義のためのカットオフ値<75%よりはるかに低かった42. さらに、YIM 93972とH. pleomorpha SPP-AMP-1Tの間のAAIが68.4%と低いことから、YIM 93972が属レベルで新規であることが確認されました42。YIM 93972株の基質菌糸は胞子嚢を形成し、成熟した空中菌糸は胞子鎖を形成し、胞子は表面に皺のある円柱状であった。YIM 93972株の呼吸性キノンはMK-8とMK-8(H2)である（補足図14）。MK-8(H2)の異性体が異なることにより、YIM93972株の呼吸性キノンは、メナキノンMK-8のみを含むH. pleomorpha SPP-AMP-1Tのそれとは異なる。また、本菌の主要な極性脂質は、クロマトグラフィーにより、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロールリン酸メチルエステルおよび5種類の未同定の糖脂質であることが確認されたが、H. pleomorpha SPP-AMP-1T は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロールリン酸メチルエール、グリコシルマノシルグルコシルジエター、硫酸化グリコシルマノシルグルコシルジエターがある。系統学的、形態学的な違いの他に、本分離株は化学分類学的マーカーによって近縁属と区別される（補足データ1）。以上の結果から、YIM 93972TはHalobacteriaceae科の新属の新種として位置づけられ、Actinoarchaeum halophilum gen.
Actinoarchaeum gen.nov.の解説
アクチノアルケウム（Ac.tino.ar.chae'um. Gr. n. aktis -inos, a ray; N.L. neut. n. archaeum (from Gr. adj. archaios -ê -on, ancient), archaeon; N.L. neut. n. Actinoarchaeum ray archaeon, refer to the radial arrangement of filaments).
好気性で極めて好塩性のストレプトミセス様コロニーで、改良ISP 4培地上で褐色の基質菌糸が白色の空中菌糸と白色の胞子を持つ終末胞子嚢を形成する。主な極性脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロールリン酸メチルエステルおよび5種の未同定糖脂質である。主要なメナキノンはMK-8とMK-8(H2)である。ゲノムDNAのG＋C含量は約56.3mol％である。タイプ種はActinoarchaeum halophilumである。推奨される3文字の略語： Aah。
Actinoarchaeum halophilum sp.novの解説
アクチノアルカエウム・ハロフィルム（ha.lo'phi.lum. Gr. n. hals halos, salt; N.L. adj. philus -a -um, from Gr. adj. philos -ê -on, friend, loving; N.L. neut. adj. halophilum, salt-loving).
形態学的，化学分類学的，および一般的な特徴は，上記の属の特徴に準ずる。細胞の増殖には2.1-6.0M NaCl、pH6.0-9.0、25-50℃、Mg2+ (0.01-0.7M) が必要である。最適な増殖は3.8-4.2M NaCl、pH7.0-7.5、40-45℃の条件下で起こる。オキシダーゼ弱陽性、カタラーゼ陰性。硝酸塩還元、ツイーン（20、40、60、80）、カゼイン、ゼラチンの加水分解に陽性、インドール、H2Sの生成に陰性。酢酸、クエン酸、デキストリン、フルクトース、フマル酸、グルコース、グリセロール、リンゴ酸、マンニトール、マンノース、ピルビン酸、ラムノース、スクロース、トレハロースは単独の炭素源として利用されるが、ガラクトース、乳酸、ラクトース、キシリトールとキシロースはそうではない。酸は、上記のいずれの単独炭素源からも生成されない。本菌はMK-8およびMK-8(H2)を含む。極性脂質は、PG、PGP-Meおよび5GLを含む。ゲノムDNAのG+C含量は56.3%である。タイプ株は、中国新疆ウイグル自治区の塩湖の土壌サンプルから分離されたYIM 93972T (=DSM 46868T = CGMCC 1.17467T)。
方法
単離、同定、形態観察
沈殿物サンプルは、中国新疆ウイグル自治区の七丈塩湖から採取した。単離は、標準的な希釈平板法を用いて、次のものを含むModified Gause（MG）培地11上で行った（g/L）：可溶性デンプン、5；レンコンデンプン、5；KNO3、1；MgSO4・7H2O、0. 5；K2HPO4、0.5；NaCl、200；寒天、20；1mLの微量溶液（2％FeSO4-7H2O；1％MnCl2-4H2O；1％ZnSO4-7H2O；1％CuSO4-5H2O；pH7.2に調整）。プレートは37℃で少なくとも6週間インキュベートした。アクチノバクテリア様の糸状コロニーを持つ分離株は全て回収された。なお、16S rRNA遺伝子に基づく同定では、YIM 93972株の16S rRNA遺伝子が、細菌性16S rRNA遺伝子のユニバーサルプライマーでは増幅できず、古細菌性16S rRNA遺伝子のプライマーが機能することから、より注目された。さらに、YIM93972株の細胞形態を走査型電子顕微鏡（Quanta 2000, FEI, Hillsboro, OR, USA）を用いて、異なる濃度のNaClで観察した。YIM 93972株の20日齢の培養から得た細胞を、氷上でOsO4蒸気中で30分間固定し、Schubertら43の方法で改良した2μm等孔メンブランフィルター（ミリポア、東京、日本）上で濾過した。固定した培養物を50-100%エタノール混合液で脱水し、CO2中で臨界乾燥させ、10nmの金-パラジウムでスパッタコーティングした。細胞は、XL30 ESEM-TMP (Philips-FEI, Eindhoven, Holland) を用いて3 kVで画像化した。胞子の温度耐性を調べるために、胞子をニトロセルロース転写膜によって基質ハイファから分離した（詳細は下記参照）。胞子と機械的に破断した基質菌糸を懸濁液（2 OD）の調製に用い、60、70、80、90℃で15分間バッティングした（コントロール、37 ℃）。その後、100μLの懸濁液を20%NaClを含む固体ISP 4培地に散布し、30日間培養を行った。画像は10日ごとに採取した。
YIM 93972のような菌株をより多く得るために、新疆ウイグル自治区の愛徳、大南、大番城東、ウズンブラク塩湖で採取した土壌サンプルに対して同様の分離を行った。最終的に5つのハロアルカイアが分離され、形態的な分化が確認された（20%NaClを含むMGプレートで37℃、3-4週間培養）。このうち、YIM A00010、YIM A00011、YIM A00014はAiding塩湖のサンプルから、YIM A00012とYIM A00013はUzun Brac塩湖のサンプルから分離された。これら4つの塩湖におけるYIM 93972とその近縁種の多様性をさらに理解するために、15個の土壌サンプルの全DNAから直接、YIM 93972特異的プライマー（Forward primer: 5′ -GGGCGTCCAGCGGAAACC-3′ ; Reverse primer: 5′ -CCATCAGCCTGACTGTCAT-3′ ）を用いて16S rRNA遺伝子を増幅した。PCR産物は2％アガロースゲルから分離し、製造者の指示に従ってAxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）を用いて精製し、Quantus™ Fluorometer（Promega, Madison, WA, USA）を用いて定量化した。精製したアンプリコンを等モル量でプールし、Majorbio Bio-Pharm Technology Co.の標準プロトコルに従ってIllumina MiSeq PE300プラットフォーム（Illumina, San Diego, CA, USA）でペアエンドシーケンスを行った。Ltd.（中国・上海）の標準プロトコールに従った。(中国、上海)の標準プロトコールに従って行った44。
ゲノム配列決定
YIM 93972株の全ゲノムDNAは、DNeasy Power Soil Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて抽出されました。DNAの品質は1%アガロースゲル電気泳動で評価し、純度はNanoDrop™ 2000 spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。適格なゲノムDNA（5μg）は、Pacific Biosciences RSIIシーケンサー（Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA）を用いてSMRTシーケンスに供された。Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP, v2.3.0)パイプラインを使用し、デフォルトパラメータ45で高品質のde novoアセンブリを生成した。他の5つの分離株のゲノムDNAも同様に抽出し、同じ手順で品質を評価した。その後、ゲノムDNAを2つのフェッチに分割し、Oxford Nanopore (PromethION)を用いて塩基配列を決定した。生データセットはフィルタリングされ、Canu (v1.5)46 によってサブスレッドが組み立てられ、さらにPilon (v1.22)47 によって修正された。さらにキャリブレーションを行うために、Illumina NovaSeq 6000による第2世代シーケンスデータセットを用いてアセンブルしたゲノムの誤差を調整し、高品質のリードを取得してギャップなしの1つまたは複数のコンティグを生成しました。YIM 93972のrRNAとtRNAは、それぞれRNAmmer (v1.2)48 とtRNAscan-SE (v1.3.1)49 を用いて予測されました。遺伝子の予測およびアノテーションは Prokka (v1.14.6) を用いて行った。サーキュラマップはDNAPlotter (v1.11)50で作成した。詳細なアセンブルとアノテーションの結果は、Supplementary Data 2a-fに示されている。
比較ゲノムと系統樹
ハロバクテリア122株の完全ゲノムは、NCBI Genomesサイトからダウンロードした。また、多形性ハロアルカイオンのHalocatena pleomorpha SPP-AMP-1T (GCF_003862495.1)と近縁の非多形性ハロアルカイオンのHalomarina oriensis JCM 16495T (GCF_009791395.1) のコンティグレベルゲノムアセンブリが同じソースからダウンロードされています。これらの124のハロバクテリアゲノムにコードされるタンパク質配列と、本研究で得られた6つのゲノムにコードされるタンパク質配列を解析して、遺伝子間のオーソロジー関係を確立した（Supplementary_data_file_1）。まず、MMseqs2（v14-7e284）51を用い、配列類似度の閾値を0.5として全てのタンパク質配列をクラスタリングした後、以下の手順を何度か繰り返してクラスタをさらに精密化した：
MUSCLE（v5）52を用いて得られたクラスターアラインメントをHHSEARCH（v3.3.0）で比較し、全長の類似性を示すクラスターを統合した53；
統合されたクラスターアラインメント52に対して、FastTree (v 2.1.11)54 を用いて近似ML系統樹を再構築し、中点で根を張り、樹をサブツリーに解析し、分類学的カバー率（サブツリー内の異なるゲノム集合体の数）とパラロギー指数（集合体あたりの平均配列数）の比率を最大化しました；
この手順により、ハロバクテリア遺伝子の比較進化ゲノミクス解析のために、14,870個のオーソログ遺伝子のクラスター（シングルトン配列を除く）（haloCOGs）セットを作成した。HHSEARCH53を用いて、CDD55およびarCOG56の配列プロファイルとHaloCOGのアラインメントを比較することにより、HaloCOGの機能的アノテーションを得た。
ハロバクテリアのゲノムレベルの系統を決定するために、130ゲノムの完全補完と最大4つの追加パラログを持つ268のハロCOGを使用した（補足データ3、Supplementary_data_file_2）。パラログが存在する場合、パラログ間のBLOSUM6257アラインメントスコアとアラインメントコンセンサスに基づき、インデックスオルソログを選択した。これらの268のhaloCOGのアラインメントのカラムは、ギャップの最大割合（0.667）と最小の均質性（0.05）に対してフィルタリング58されました。連結されたアライメントには71,586のアミノ酸部位が含まれていた。系統樹はIQ-Tree（v2.2.0）59を用いてLG+F+R10モデルで再構築し、内蔵モデルファインダーで選択し、Rinke et al. 2021（補足 _data_file_2）60 に従ってルート付けを行った。
ハロバクテリアにおける遺伝子の獲得・喪失の歴史（補足データ4b, c）は、GLOOME（v201305）61を用いて、haloCOGの系統パターンとハロバクテリアの系統樹から再構築されました。系統樹の特定の端にある遺伝子の獲得または喪失は、この端のそれぞれの端にある祖先ゲノムと子孫ゲノムの間のこの遺伝子の存在の事後確率の変化から推測された。確率の変化が0.5を超える場合、その遺伝子が獲得または喪失したものと解釈した（補足データ4および4c）。
形態異常変異体のスクリーニングとゲノムリシークエンス
低分化変異体および未分化変異体を得るために、ニトロソグアニジン（NTG）に基づく変異誘発実験を YIM 93972 の野生型に適用した。胞子懸濁液は、（g/L）：（可溶性デンプン、10；K2PO4、1；MgSO4、1；（NH4）2SO4、2；NaCl、250）を含むISP 4培地に滅菌ガラスビーズ（直径5mm；10mL培地あたり1g）を37℃、3日間添加し、胞子の数が108/mLに調整されて作成した。NTG処理は、0.2〜1mg/mLと濃度を変えた胞子懸濁液を90gで振ったインキュベーター上で30℃、30分間インキュベートすることにより行った。10mLのサンプルを2400gで5分間収穫し、20mLの滅菌NaClで胞子を3回洗浄した。胞子の致死率は、前述の通りLIVE/DEADTM BacLight™ bacteria viability kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)で測定した62。致死率〜85％のNTG処理胞子を102および103/mlに希釈し、100μLのアリコートを25％NaClを含むISP 4培地プレートに均等に広げ、37℃で28日間インキュベートした。分化が不十分な変異体（transitional）および未分化な変異体（bald）は、さらなるマルチオミクス研究のために4回培養および継代した（補足図10a）。多くの変異体の形態的表現型は、次の継代培養で回復した。そのため、4世代後には、安定した形態変異表現型を持つ移行型変異体5体とハゲ型変異体3体のみが残った。YIM 93972株の形態変異をさらに確認するために、上記のように走査型電子顕微鏡による細胞形態の確認も行った。野生型コロニーと比較して、2つの移行型コロニーでは基質菌糸が分岐し、ごくまれに空中菌糸が見られた。しかし、3つのハゲコロニーには分岐した基質菌糸しかなかった（補足図10b）。
比較トランスクリプトーム
野生型の空中菌糸および基質菌糸の収集は、空中菌糸の完全胞子化後（固体培地培養28日）にYIM93972株の生菌107/mLを収集し、直径85mmのペトリ皿で20%NaClと2%寒天を含む培地ISP4上に覆った0.20μm BioTrace NTニトロセルロース転写膜（Pall China, Beijing, China）の層上に撒いた。このプレートを37℃、21日間培養した。合計96枚の培養プレートを用意し、生物学的複製として6群に分けた。ニトロセルロース膜上で増殖した気中菌と、ニトロセルロース膜を貫通した基質菌は、それぞれ平べったいヘラで掻き取ることで回収した。2つの移行型および3つのハゲ型変異体については、機械的に破壊された等量の菌糸を上記と同じプレート上に散布した。各変異体について合計192枚の培養プレートを用意し、生物学的複製として6群に分けた。28日目に基質となる菌糸を回収した。各菌株について、合計6つのプール菌糸を回収し、その半分をトランスクリプトーム解析に、もう半分をプロテオーム解析に使用した。
全 RNA は、既報の通り抽出し、解析した63。簡単に説明すると、Trizol法を用いて全RNAを抽出した。TruSeqTM Stranded Total RNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) を用いてcDNAライブラリを調製し、その後、Illumina HiSeq 2000 system (Illumina, San Diego, CA, USA) でペアエンド100 bpシーケンシングした。サンプルごとのRNA-Seqリードは、Bowti2（v2.4.2）64を用いてリファレンスにマッピングされた。TPMの推定にはRSEM65（v1.3.3）を使用した。SNP解析はSAM tools66 (v1.12)で行った。詳細な品質管理は、Supplementary Data 6およびFig.3bに示した。比率が1.5倍を超え、p値が0.05より小さい遺伝子（Student's t-test）を制御されているとみなし、さらなるバイオインフォマティクス解析に用いた（図3dおよびSupplementary Data 9）。
比較プロテオーム
プロテオーム解析のために、空中菌糸と基質菌糸を溶解バッファー［9M Urea、10mM Tris-HCl（pH8.0）、30mM NaCl、5mM iodoacetamide（IAA）、5mM Na4P2O7、100 mM Na2HPO4（pH8. 0）、1 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM グリセロリン酸ナトリウム、1％ホスファターゼ阻害剤カクテル2、1％ホスファターゼ阻害剤カクテル3、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（1錠／10 mL溶解バッファ）］で溶解し、記載67のようにSoniprep超音波処理機（Sientz、Ningbo、Zhejiang、China）により10分間（2秒オンおよび4秒オフ、振幅30%）破砕した。ライセートを16,200g、4℃で10分間遠心分離し、デブリを除去した。抽出された全細胞溶解物（TCL）の品質と濃度は、10％SDS-PAGEによって検出された（補足図11a）。テクニカルレプリカは、野生群、移行群、ハゲ群でそれぞれ設計した。
各サンプルからプールした同量のタンパク質（120μg）を、5mMのジチオスレイトール（DTT）で45℃、30分間還元し、次いで10mMのヨードアセトアミド（IAA）で室温、30分間アルキル化した。アルキル化したサンプルを10% SDS-PAGE (0.7 cm) 68で前洗浄し、12.5 ng/μL トリプシン69で37℃、14時間インゲル消化した。各分化条件から等量のペプチドを10-plex TMT labeling (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) に使用した。TMT標識は以下のように行った：野生基質菌糸（W-SH）技術的複製は126および127Nで、野生型空中菌糸（W-AH）は127Cで、移行基質菌糸（T-SH）技術的複製は128Nおよび128Cで、T-SH生物的複製は129Nで、バルド基質菌糸（B-SH）技術的複製は130Nおよび130Cで、B-SH生物的複製は129Cと131で、製造者のプロトコルに従ってラベル化した（図 4a）。標識ペプチドを混合し、真空乾燥機（LABCONCO CentriVap, Kansas City, MO, USA）を用いて乾燥した。
混合したTMT標識ペプチドを、Rigol L-3120 HPLCシステム（中国・北京）上のDurashell C18 high pH reverse phase (RP) column (150 Å, 5 μm, 4.6 × 250 mm2, Bonna-Agela Technologies Inc., Newark, DE, USA) で既報67のように分画した。簡単に説明すると、溶媒グラジエントは、バッファA（98%二重蒸留H2Oおよび2%ACN、pH10、水酸化アンモニウムで調整）とバッファB（2%二重蒸留H2Oおよび98%ACN、pH10）で構成されていた。混合したサンプルをバッファーAに溶解し、ロード後、60分間のリニアグラジエント（0%B 5分、0-3%B 3分、3-22%B 37分、22-32%B 10分、32-90%B 1分、90%B 2分、100%B 2分）でペプチドを分離しました。LCの流速は0.7mL/minに設定した。カラムは45℃に保たれた。溶離液は1分ごとに回収した（補足図11b）。60フラクションを乾燥させ、10フラクションに連結した（補足図11c）。結合したペプチドはLC-MS/MS分析に供した。
フラクションは、Easy-Nano LC 1200分離後、Q Exactive HF質量分析計（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）で分析された（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）。簡単に説明すると、サンプルをセルフパックキャピラリーカラム（内径75μm×50cm、1.9μm C18）にロードし、135分のリニアグラジエント（4-8%Bで13分、8-25%Bで86分、20-50%Bで21分、50-90%Bで3分、90%Bで12分）で溶出しました。フルMSスキャンは、m/z範囲が375-1,400で、分解能は1.2×105、最大注入時間（MIT）は80ms、自動利得制御（AGC）は3.0×106に設定された状態で行った。MS/MSスキャンでは、電荷状態が2から6の最も強い15個のペプチドイオンを、高エネルギー衝突誘起解離（HCD）によるフラグメンテーションにかけた（AGC：1×105、MIT：100 ms、分解能：6×104）。動的排除は30秒とした。
すべての生ファイルをMaxQuant (v1.5.6.0) で、YIM 93972株のタンパク質データベース (3744 エントリ) と245の共通汚染タンパク質配列 (http://www.maxquant.org) に対して検索しました。完全なトリプシンペプチドは、2箇所までのミス切断が可能であった。メチオニンの酸化は動的修飾とし、システインのカルバミドメチル化、ペプチドN末端とリジンのTMT修飾は静的修飾として設定した。図4bは、MSによる同定と定量を示したものである。詳細な品質管理は補足図11d, eに示した。9つのタンパク質発現クラスターは図4eに示した。1.5倍以上のタンパク質の変化があり、p値が0.05（有意水準A70）より小さいものを制御されているとみなし、さらにバイオインフォマティクス解析に使用した（図4eおよび補足データ12）。
異種発現と機能解析
YIM 93972 由来の ORF_2669-ORF_2673 がコードする推定オリゴペプチドトランスポーターの特性を明らかにするため、固体 ISP 4 培地を用いてバイラフォス（0.1 μg/mL から 1.0 μg/mL まで、間隔 0.1 として）耐性試験34、67を実施した。次に、遺伝子クラスターbldKA-KEを欠失させたStreptomyces coelicolor M14571で遺伝子ORF_2669-ORF_2673の異種発現を実施した。ΔbldKA-KE変異体は、既述の通りCRISPR-Cas9ゲノム編集法により構築した72。使用した菌株とプラスミドはSupplementary Data 15に、プライマーはSupplementary Data 16に記載した。簡単に説明すると、bldKA-KEの上流領域（1139bp）および下流領域（1310bp）を、それぞれプライマー対bldKA-KE-up-F/RおよびbldKA-KE -down-F/Rを使用して増幅した。シングルガイドRNA（sgRNA）転写カセットは、プラスミドpKCCas9dOからプライマーbldKA-KE-gRNA F/Rを使用して得た。次に、プライマーbldKA-KE-gRNA-FおよびbldKA-KE-down-Rを用いたオーバーラップPCRにより上記3つの断片をアセンブルし、その後Spe IおよびHind IIIで二重消化した。組み立てた断片をpKCCas9dOにクローニングし、野生株M145にコンジュゲート導入した。その後、構築した菌株を、プラスミドpKCcas9-bldKA-KEを除去するために、37℃、アプラマイシンを含まない固体MS培地で培養した。プライマーbldKA-KE-J-F/Rを用いて正しいダブルクロスオーバーコロニーを確認したところ、ΔbldKA-KE変異株が得られた。
M145ゲノムDNAを鋳型として、M145由来のbldKA-KEとYIM93972由来のORF_2669-ORF_2673をそれぞれプライマー対bldKA-KE-F/RとORF_2669-ORF_2673で取得した。増幅産物をpIB139ベクターにクローニングし、相補的プラスミドpIB139-bldKA-KEおよびpIB139-ORF_2669-ORF_2673を生成した。得られたプラスミドをΔbldKA-KE変異体に導入したところ、ΔbldKA-KE/pIB139-bldKA-KE株とΔbldKA-KE/pIB139-ORF_2669-ORF_2673株の二つの相補的な株が得られた。空ベクターpIB139はM145株に移植し、ポジティブコントロールとした。オリゴペプチドABCトランスポーターORF_2669-ORF_2673の菌糸分化制御に対する役割を評価するためにS. coelicolorにおいて、M145/pIB139、ΔbldKA-KE/pIB139、ΔbldKA-KE/pIB139-bldKA-KE、ΔbldKA-KE/pIB139-orf_2669-orf_2673の4株の同一生存胞子を接種して、ISP4寒天プレートで37℃に培養しました。各寒天プレートに約700個の可視クローンを増殖させた。上記4つの構築された菌株の78時間培養の基質および空中菌糸を、走査型電子顕微鏡（Nova NanoSEM 450, FEI, USA）で観察した。
YIM 93972の細胞壁S層タンパク質の特性評価
YIM 93972のS層タンパク質は、以前に記載された方法で抽出した73。ログ期中期の細胞を 3500 g で遠心分離して回収し、ペレットを 20 mM Tris-HCl (pH6.5), 1.0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), および 1x protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland) を含む細胞溶解バッファに再懸濁し、Soniprep sonicator (2 s on and 4 s off, amplitude 25%) で 10分間破裂した。細胞破片は、4000gで15分間、4℃で遠心分離することにより除去した。上清をさらに250,000g、4℃で1時間超遠心分離した。その後、ペレットを4%SDS、50mM Tris(pH8.0)、20mM DTTを含むバッファーに溶解し、細胞壁タンパク質を得た。20μgの細胞壁タンパク質を、5mMのDTTで45℃、30分間還元し、10mMのIAAで室温、30分間アルキル化した。12%SDS-PAGEで5cm分離した後、クマシーブルーG-250染色したゲル上の区別できるバンドに基づいて、レーン全体を25のフラクションにスライスした。さらにゲル片を1立方ミリメートルのゲルに切り出し、トリプシン（12ng/μL）で37℃、14時間インゲル消化した。トリプシンペプチドは、高pH RPクロマトグラフィー分離後にLTQ-Orbitrap Velos質量分析計で分析。取得した生ファイルは、一般的な汚染タンパク質配列とともに、YIM93972株のタンパク質データベース（3744エントリ）に対してMaxQuant（v1.5.6.0）に提出されました。ペプチド番号≧2に基づくYIM93972株の注釈付きタンパク質データベースとのペプチドプロファイルマッチングにより、ORF_1400とORF_1704を含む2つのS層タンパク質が検出された（補足図9a-d）。
統計学と再現性
株培養、走査型EM像、透過型EM像、は少なくとも3回の独立した実験を行った。トランスクリプトームおよびプロテオミクスデータセットにおける2群間の統計的差異は、それぞれ両側無対称t検定（群間）およびSignificance A70（群内）を用いて分析された。P < 0.05を統計的に有意とみなした。データの統計解析と可視化はR（v4.1.2）を用いて実現した。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
本研究で作成したゲノムおよびトランスクリプトームデータは、それぞれアクセッションコードCP071306-CP071310およびGSE168067でGenBankに寄託されています。アンプリコンシーケンスの生リードをGenBankに、アクセッション番号PRJNA703326で寄託しています。プロテオミクスMSデータセットはすべてiProX74データベース（識別子IPX0002724000）、またはProteomeXchange（識別子PXD023481）から入手可能である。YIM_A00010株、YIM_A00011株、YIM_A00012株、YIM_A00013株、YIM_A00014株のゲノムの生リードが、それぞれアクセッションコードJAKCFJ000000000、JAKCFK000000000、JAKCFL000000000、JAKCFM000000000、JAKCFN000000000でGenBankに寄託されています。Halobacterial COG data archive (supplementary_data_file_1.tgz) および phylogenetic trees and alignments archive (supplementary_data_file_2.tgz) は https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/wolf/_suppl/halo22/ からダウンロードできます。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
このプロジェクトの初期段階において、Wen-Jun Li博士のサポートに感謝する。また、菌株、試薬、考察について、Xiu-Zhu Dong博士、Yong-Jun Liu博士、Lei Song博士、Man Cai博士に感謝する。S 層タンパク質抽出に関する議論をしてくれた Lingyan Li 博士に感謝する。新しい一般名と新しいエピテットの語源についてAharon Oren教授に、批判的な読み方と編集についてLeonard Krall、Felix Cheung、Xu-Na Wu教授に感謝する。また、実験とデータ処理に協力してくれたShu-Jia Wu、Jin-Shuai Sun、Wen-Hui Wu、Jie Ma、Xue Wangに感謝します。P.X.、G.P.Z.、S.K.T.、X.Y.Z.、Y.Z、 B.B.L.およびF.C.H. は、中国国家基礎研究計画（2022YFA1304600および2020YFE0202200）、医学革新基金（2022F12010、20SWAQX34およびAWS17J008）、中国国家自然科学基金（32141003、31901037、31870824、91839302、32071431、31760003、32060003、32070668、92151001および31800001）から支援を受けた、 the Beijing-Tianjin-Hebei Basic Research Cooperation Project (J200001), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-017, 2019-12M-5-063 and 2022-I2M-C&T-B-082), the Foundation of State Key Lab of Proteomics (SKLP-C202002, 2021-NCPSB-001, SKLP-K201704, & SKLP-K201901) and Major Science and Technology Projects of Yunnan Province (202002AA100007). K.S.M.、Y.I.W.、E.V.K.は、米国保健福祉省（National Institutes of Health, National Library of Medicine）の学内資金による支援を受けています。
著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： Shu-Kun Tang, Xiao-Yang Zhi, Yao Zhang, Kira S. Makarova, Bing-Bing Liu.
著者と所属
雲南省微生物研究所、教育部微生物資源重点実験室、雲南大学生命科学部、650091、中国・昆明市
Shu-Kun Tang, Xiao-Yang Zhi, Bing-Bing Liu, Yu-Rong Zhao, En-Yuan Li, Yu-Zhou Feng, Ming-Xian Xiang, Zhi-Qian Lin, Rui Li, Min Yin & Ling-Ling Yang
中国医学科学院生命科学研究所プロテオミクス研究室、北京プロテオーム研究センター、北京国立タンパク質科学センター、プロテオミクス・新薬研究開発ユニット、プロテオミクス駆動がん精密医療研究ユニット、中国北京市、102206、中国
Yao Zhang, Zhen-Peng Zhang, Song-Hao Jiang, Tao Zhang, Pei-Ru Chen, Jia-Hui Shi, Cheng Chang, Lei Chang, Hui-Ying Gao, Fu-Chu He & Ping Xu
国立生物工学情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所、8600 Rockville Pike, Bethesda, MD, 20894, USA
キラ S. マカロワ、ユーリ I. ウルフ、ユージン V. クーニン
南洋理工大学生物化学工程学院河南工業微生物資源・発酵技術重点実験室（中国・南洋市・473004年
劉秉秉（リュウ・ビンビン）、張雪（チャン・シュエ
上海師範大学生命科学学院（中国・上海、200234年
鄭国松＆呂茵華
中国国立上海ヒトゲノムセンター・上海生物医薬技術研究所上海MOST健康・疾病ゲノム重点実験室（中国・上海市・201203年
鄭 華淳
河北大学生命科学学院微生物多様性研究応用重点実験室（中国河北省、071002年
姜松昊、陳培露、石佳慧、徐萍
中国科学院西北生態環境資源研究所砂漠・砂漠化重点実験室 蘭州市730000番地
陳錫明（チェン・シーミン
新疆農業科学院微生物研究所（中国・ウルムチ市、830091年
カイ・ルー＆ユン・ワン
雲南省農業科学院生物技術・遺伝生殖資源研究所 〒650205 雲南省昆明市?
張忠凱
中国武漢市武漢大学薬学院教育部コンビナトリアル生合成・創薬重点実験室微生物学教室 430072
タオ・ティエンシェン＆シュー・ピン
西華学園大学食品生物工程学院（中国）610039成都市
グァン トンウェイ（Tong-Wei Guan
江蘇大学食品・生物工程学院（中国・鎮江市・212013年
崔 亨琳
中国上海市復旦大学生命科学部基礎医学科・微生物工学科医学分子ウイルス学重点実験室（MOE/NHC/CAMS)
趙国平（ちょうこくへい
中国・貴州大学医学部（550025・貴陽市
徐 萍
広州中医薬大学第二附属病院中医学湿潤症候群国家重点実験室 〒510120広州市錦町1-1-1
徐 萍
貢献度
P.X.、S.K.T.、E.V.K、G.P.Z.が実験を計画した。K.L.とY.W.は環境試料を採取した。S.K.T.とB.B.L.は、Y.R.Z., E.Y.L., Y.Z.F. の協力を得て、菌株分離、多相分類解析、YIM93972と他の6種の形態分化したハローアケオン菌株すべての培養、SSU rRNA検証を実施した、 M.X.X., Z.Q.L., X.Z., R.L., M.Y., L.L.Y., T.W.G., H.L.C., Z.K.Z. および T.S.T. M.X.X と Z.Q.L. は T.S.T., P.X, Y.Z. および S.K.T の指揮下で熱ストレス実験を行い、 X.M.C は YIM93972の変異誘発実験 を実施しました。H.J.Z.は野生株と変異株のゲノム配列決定を行った。X.Y.Z., K.S.M., Y.I.W. がゲノムアノテーションと系統樹解析を行った。Y.Zは、S.H.J., T.Z., P.R.C., J.H.S., C.C., L.C., H.Y.Gの協力のもと、すべてのプロテオーム実験とデータ解析を行い、X.Y.ZとY.Zはトランスクリプトーム解析、すべての図と表の配置を担当しました。P.X.、Z.P.Z.、Y.Z.、K.S.M.は転写制御因子解析を行った。Z.P.Z.とS.H.J.はデータ解析とアップロードを手伝った。Y.H.L.とG.S.Z.は、遺伝子相補実験に必要なすべての組換えプラスミドと遺伝子欠失株の構築を行った。F.C.H.は、6つの細胞分化型好塩性古細菌に関する記事のフレームアレンジに協力した。P.X.、Y.Z.、G.S.Z.、Y.H.L.、S.K.T.は、胞子遺伝子のクラスター検証の設計と実施をG.P.Z、E.V.K、K.S.Mの助けを借りて行い、X.Y.Z., Y.Z., K.S.M., P.X, E.V.K, G.P.Z は、すべての著者からの助けを借り原稿執筆した。
対応する著者
Shu-Kun Tang、Eugene V. Koonin、Guo-Ping ZhaoまたはPing Xuに対応する。
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競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
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Tang, SK., Zhi, XY., Zhang, Y. et al. Cellular differentiation into hyphae and spores in halophilic archaea. Nat Commun 14, 1827 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37389-w
引用元：ダウンロード
2022年6月15日受理
2023年3月14日受理
2023年4月1日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-37389-w
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