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公開日：2023年10月09日
細菌Bdellovibrio bacteriovorusにおいて、in vitroでは型破りなDNA結合様式を持つヒストンが主要なクロマチン構成要素であること

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01492-x

アントワーヌ・ホーチャー, ショーン・ラウルセン, ...トビアス・ワーネッケ 著者一覧を見る
Nature Microbiology (2023)この記事を引用する

103 Altmetric

指標詳細

概要
ヒストンタンパク質はDNAと結合し、真核生物やほとんどの古細菌のゲノムを組織化しているが、細菌は異なるヌクレオイド関連タンパク質に依存している。相同性検索により、いくつかの細菌からヒストンホールドドメインと推定されるものが検出されているが、これらが古細菌／真核生物のヒストンと同様に機能しているかどうかは不明である。しかし、これらが古細菌や真核生物のヒストンのように機能するかどうかは不明である。ここでは、ヒストンが細菌Bdellovibrio bacteriovorusとLeptospira interrogansの主要なクロマチン構成要素であることを報告する。配列進化のパターンから、さらなる細菌群においてもヒストンが重要な役割を果たしていることが示唆される。B. bacteriovorusのヒストン（Bd0055）二量体およびヒストン-DNA複合体の結晶構造（<2.0 Å）から、保存されたヒストン-フォールドのトポロジーが確認されたが、DNA結合様式は異なることが示された。真核生物、古細菌、ウイルスの既知のヒストンとは異なり、Bd0055はDNAとエンドオンで結合し、DNAを外表面に巻き付けるのではなく、まっすぐなDNAを包む二量体の鞘を形成する。今回の研究結果は、ヒストンが生命樹全体に存在することを示すとともに、ヒストンがDNAとどのように結合するかについて、進化的に革新的な可能性があることを明らかにするものである。

主な内容
真核生物のゲノムはヌクレオソームによって組織化されている。ヌクレオソームは4つのコアヒストンで構成され、8量体を形成してDNAを2つのタイトな超らせん状のターンで包み込んでいる1。このヒストンの配列は、ゲノムへのアクセスを著しく制限している。その結果、真核生物は、転写、複製、DNA修復など、DNAを鋳型とするプロセスを調整するための複雑なアクセス制御システムに依存している2。 ヒストンは、真核生物全体で最も保存され、豊富なタンパク質のひとつである3,4,5。ヒストン・フォールド」は3つのαヘリックス（2つの短いループでつながっている）から構成され、頭から尻尾までの「ハンドシェイク・モチーフ」で二量体化する6。分岐したN末端尾部などの付加的な構造要素が、4種類の真核生物のコアヒストンを互いに区別している7,8。個々のヒストンの欠失や枯渇は、転写調節異常、細胞周期の停止、ひいては細胞死につながる9,10,11,12。

ヒストンフォールドのみからなる小さなヒストンは古細菌に広く存在し、他のヌクレオイド関連タンパク質（NAPs）とともにクロマチン構成において主要な役割を果たすことがある13,14,15,16。いくつかの古細菌では、ヒストンは細胞内で最も豊富なタンパク質の一つである15。モデル古細菌であるサーモコッカス・コダカレンシス（Thermococcus kodakarensis）では、ヒストンは必須である17。真核生物と同様に、古細菌のヒストン二量体は、DNAの連続する3本の小溝に接触することで、DNAをその外表面で曲げる。3つの独立したDNA相互作用界面は、対になったL1-L2ループの主鎖と側鎖、および中央のα1-α1界面によって形成される7,18。真核生物のヒストンが義務的なヘテロ二量体であるのに対し、T. kodakarensis由来のHTkA/BやMethanothermus fervidus由来のHMfA/B（以下、HMf/HTkヒストン）などの古細菌ヒストンは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる19,20。これらの二量体はその後、オリゴマー化して様々な大きさのスタックとなり、DNAを包んでスリンキーのような「ハイパーヌクレオソーム」を形成する18,21,22。

細菌はDNAを組織化するために、様々な小さな基本的NAPを使っている。最も広く存在するNAPはHUであるが、他にも豊富で系統に制限のあるタンパク質が存在する23,24。個々のNAPを削除しても、細菌細胞は致死しないことが多い。これは大腸菌のHUのように、ヌクレオイドの主要な構成要素であるNAPにさえ当てはまる25。ヒストンは一般的に細菌には存在しないと考えられている。しかしながら、相同性検索により、様々な細菌ゲノムからヒストンフォールドドメインと推定されるタンパク質が同定されている26。細菌のクロマチン組織化におけるこれらのタンパク質の役割については、これまで研究されてこなかった。この論文では、ヒストンタンパク質がBdellovibrio bacteriovorusとLeptospira interrogansの主要なヌクレオイド構成要素であることを示し、構造解析と分子生物学的手法を組み合わせて、ヒストンタンパク質がDNAとどのように相互作用し、B. bacteriovorusのゲノムを組織化している可能性があるかについての証拠を示す。

結果
ヒストン褶曲はいくつかの細菌群に共通する
我々は、細菌におけるヒストン折りたたみタンパク質の系統的相同性検索を行った。系統学的にバランスのとれた18,343の細菌ゲノムのデータベースを用いて、ヒストン折りたたみドメインを含むと予測される416のタンパク質を発見した（補足表1）。HUをコードするゲノムの92.8%に対し、1.86%のゲノムが少なくとも1つのヒストン折りたたみドメインをコードしていた。以前の研究と一致するように、われわれは2つの主要なヒストンサイズクラスを同定した。この2つのクラスには、通常、他の認識ドメインが存在しない（図1aおよび補足表1）。古細菌のホモログと同様に、ほとんどの細菌のシングレットには、真核生物のヒストンに特徴的な長く無秩序なN末端尾部もない16,27。生命の3つのドメインにわたるアミノ酸保存性は、特にL2ループ（特にRKTVモチーフ、図1c）において高い。古細菌ヒストンと真核生物ヒストンでは、この領域はL1-L2結合モチーフの一部としてDNAと接触している。高度に保存された「RDクランプ」がこの配列を安定化させている。細菌性シングレットはHMf/HTkヒストンより平均6残基短い。これは、細菌性一本鎖ヒストンの特徴であるα2ヘリックスが短いことが主な原因である（図1b,c）。T54との水素結合によって位置を保持されている「スプロケットアルギニン」28 R19など、古細菌ヒストンや真核生物ヒストンに通常存在するいくつかの残基は、細菌ヒストンには保存されていない（図1c）。N末端は全体としてかなりの分岐を示し、より疎水的な性質を持ち、古細菌には見られないセリン-リジンモチーフ（S9-K10）が保存されている。

図1: 細菌のヒストン型タンパク質。
図1
a, 細菌と古細菌における予測されるヒストン-フォールドドメインをコードするタンパク質（200アミノ酸未満）の長さ分布。b, 細菌とHMf/HTk古細菌の一重項ヒストンにおけるα2ヘリックスの長さ（, P = 3.24 × 10-185, 両側Mood検定, N = 1,278古細菌ヒストン, N = 180細菌ヒストン; 箱ひげ図は中央値と四分位範囲（IQR）を示し、ひげは1. 5IQRとそれ以上の値を個々にプロット）。 c, 細菌と古細菌の一重項ヒストンのWebLogo表示。細菌ヒストン（下段）と古細菌ヒストン（上段）は別々にアラインメントされ、その後、王国間の比較を可能にするためにプロファイル-プロファイルアラインメントが行われた。アラインメントギャップは、その情報価値を保持するために別の文字としてコードされ、空のボックスとして可視化されている。d,ヒストン-フォールドを含むタンパク質の植物界における分布を示す(Methods参照)細菌種樹の要約。ヒストンは棒で表されており、棒の長さはタンパク質の相対的な長さ（アミノ酸）を表すようにスケーリングされている。短い棒はシングルを表し、長い棒はダブレットや、場合によってはドメインを追加したタンパク質を表す（詳細は補足表1を参照）。

ソースデータ

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バクテリオボルスはヌクレオイドに局在するヒストンを持つ
細菌ドメイン全体にわたるヒストンの植物学的分布は、斑状である（図1dおよび補足表1）。場合によっては、これは集合体の汚染物質や最近／一過性の水平遺伝子移動を示しているのかもしれない。しかしながら、私たちは、ヒストン-フォールドタンパク質が複数の近縁姉妹系統に存在するクレードを同定した。このような系統的な持続性は、特にBdellovibrionota門（図2aおよび補足図1）とLeptospirales目（補足図2）で顕著である。

図2：ブデロビブリオのヒストン。
図2
a,Bdellovibrionota全体における一重項ヒストンの植物学的分布。 b,定量的ラベルフリープロテオミクスに基づく、B. bacteriovorus攻撃期細胞におけるタンパク質存在量の順位。c,Bd0055-mCitrine融合タンパク質を発現している株から得られた、B. bacteriovorusのライフサイクルの様々なフェーズの代表的な画像。d-f,Bd0055-mCherryおよびBd0064-mCherry（細胞質局在が既に確立されているタンパク質）のB. bacteriovorusにおける局在を示す代表的な画像と定量。c-fのイメージング実験は3連で行った。定量に用いた細胞数： N = 1,377（Bd0055-mCherry）、N = 574（Bd0064-mCherry）。平均値±s.d. g. B. bacteriovorus攻撃期細胞におけるBd0055の高い存在量と顕著なヌクレオイド濃縮（補足図5も参照）。ヌクレオイド画分には、ヌクレオイドと共沈することが以前に報告されている膜成分も濃縮されていることに注意（以前の研究については文献15を参照）。

出典データ

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Bdellovibrionotaのモデル生物であるB. bacteriovorus HD100は、二相性の細菌侵入性ライフサイクルを持つ細菌性捕食者である29。小型で運動性の攻撃期細胞は、グラム陰性餌細菌（例えば大腸菌）の外膜を破り、そこから侵入し、その後再び封鎖する。その後、B. bacteriovorusはペリプラズムから、プロテアーゼとヌクレアーゼを餌の細胞質に分泌して餌を消費し、複製と協調的な非二元分裂のサイクルを繰り返して新しい攻撃期細胞を生み出し、細胞壁と外膜の誘導破裂後、破壊された餌の殻から放出される30,31。

B. bacteriovorusは2つの一重項ヒストンをコードしている（補足表1）。Bd0055は、Bdellovibrionotaゲノムの67%に検出可能なホモログを持つ一重項ヒストンである（図1cと2a、および補足図1）。アミノ酸レベルで高度に保存されている（補足図3）。Bd3044はより長く、あまり保存されていないタンパク質で、Bdellovibrionotaゲノムの37%にしか存在しない（補足図1および3）。B.bacteriovorusのライフサイクルの様々な段階におけるこれまでのトランスクリプトームデータから、Bd0055は特に宿主での活発な複製時に高発現することが示されている（補足図4）。そこで我々は、ヌクレオイドのグローバルオーガナイザー候補としてBd0055に注目した。

攻撃期細胞の定量的ラベルフリー・プロテオミクスを用いて、タンパク質レベルでBd0055の高い存在量を確認した（図2b；定量された2,125個のタンパク質のうち12位）。注目すべきは、攻撃期細胞におけるタンパク質の存在量は、成長期におけるRNAの存在量よりも相関が高いことである。これは、成長期における転写産物レベルが攻撃期細胞におけるタンパク質レベルを予見するという、タンパク質産生におけるタイムラグと一致している（補足図4）。

Bd0055の細胞局在性を調べ、B. bacteriovorusのライフサイクル全体を通して発現をモニターするために、B. bacteriovorus HD100株を作製した。この株では、bd0055のネイティブコピーを、C末端にmCherryまたはmCitrineのタグを付けたバージョンに置き換えた。両タグ株とも、形態学的な重大な欠陥は見られず、効率的に捕食を行う。タグを付けたBd0055は、自由遊泳中の攻撃期細胞や大腸菌の餌生物侵入後など、ライフサイクルを通して強い蛍光を発する（図2c）。細胞質局在が知られているmCherryタグの対照タンパク質と比較すると32,33、Bd0055-mCherryから発せられる蛍光シグナルは細胞極から消失しており、Hoechst染色で捉えたヌクレオイドへの局在と一致している（図2d-f）。シグナルペプチドがないことと同様に、Bd0055が大腸菌の餌に分泌された形跡はなく、Bd0055が餌のクロマチンを操作するために使われた可能性は低いことが示唆された。

B.バクテリオボルス攻撃期細胞のヌクレオイド対細胞サイズ比（核細胞質比としても知られる）は非常に大きく、ヌクレオイドが細胞のごく一部を占める細菌に比べて、ヌクレオイドの共局在を目立たなくしている。さらに、攻撃期細胞ではヌクレオイドが極端に圧縮されるため、ヌクレオイドを通るいくつかの蛍光タンパク質の自由拡散が損なわれることが示されている34。その結果、蛍光シグナルの多くは、よりアクセスしやすいヌクレオイド周辺部からもたらされる可能性があり、その起源（細胞質かヌクレオイドか）の正確な特定を複雑にしている。そこで我々は、Bd0055が細胞内でヌクレオイドと共局在していることを示す証拠をさらに集めるために、2つの相補的なアプローチを試みた。

第一に、大腸菌でBd0055-GFP融合タンパク質を発現させた。大腸菌では、ヌクレオイドはそれほどコンパクトではなく、細胞内の占める割合もはるかに小さい。その結果、Bd0055-GFPはヌクレオイドと明確に共局在し、周囲の細胞質からのGFPシグナルはほとんど見られなかった（補足図5）。

第二に、Bd0055がB. bacteriovorusのヌクレオイドと会合していることを生体内で直交的に確認するために、スクロース勾配を用いたヌクレオイド濃縮実験と定量プロテオミクスを組み合わせた。溶解した攻撃期細胞のスクロース勾配から、可溶性細胞質タンパク質に富む低密度画分と、DNAおよびDNA結合タンパク質に富むヌクレオイド画分という2つの画分を分析した。RNAポリメラーゼのサブユニットは、他の細菌と同様に非常に豊富である（図2g）。しかし、Bd0055はヌクレオイド画分に最も多く含まれるタンパク質として際立っており、上部画分に比べて10倍も濃縮されている。HUやDpsなど、B. bacteriovorusゲノムにコードされている古典的な細菌NAPのホモログは存在するが、存在量は少なく、ヌクレオイド画分での濃縮度も低い（補足図5）。予測されるDNA結合タンパク質で、顕著に豊富に存在するのはBd1238（図2g）だけである。Bd1238は、他の細菌のσ54依存性転写制御タンパク質と類似性を持つ、HTHドメインを含むまだ構造解析されていないタンパク質である。

Bd0055はヒストン型二量体に折り畳まれる
Bd0055の結晶構造を1.8Åの分解能で解析した（補足表2）。Bd0055は結晶学的に2量体を形成しており、1つの単量体は2回対称性によってパートナーと関連している（図3a）。ヒストン二量体の全体的なトポロジーと、古細菌や真核生物のヒストンにも見られる、DNA結合に使われる「上面」に沿った正電荷のリッジがある（図3b）1,18。特筆すべきは、Bd0055のα2らせんは、古細菌や真核生物のヒストンに比べて7Å短く（古細菌のHMfBと比べるとらせんのターン数が1ターン短い、図1c）、ヒストン二量体全体のサイズが小さくなっていることである（図3a）。加えて、Bd0055のα3らせんは1つのらせんターンしか形成せず、残りのアミノ酸は二量体化パートナーのα2に対して伸長した配置でパッキングしている。この構造は、古細菌／真核生物のヒストンに見られる3回転のα3らせんとは異なっており、α3らせんは4つのらせん束の界面に寄与することで4量体化に関与している18。α2に保存されているヒスチジン（H49）は、細菌ヒストンには顕著に存在しない（図1c）。最後に、Bd0055二量体の塩基性リッジと反対側の表面は、HMf/HTkヒストンの表面よりも酸性である（図3b）。

図3：Bd0055はヒストン二量体を形成する。
図3
a, 古細菌ヒストンHMfB（PDB 1A7W）と重ねたBd0055の結晶構造。Bd0055はヒストンホールドの全体的なトポロジーを維持しており、α2およびα3らせんが短い。Bd0055は、特徴的なRDクランプとL1-L2ループを維持している。 b. HMfBとBd0055のクーロン表面電荷計算（3つの方向で示す）。Bd0055は、他のヒストンではDNAとの結合に重要な塩基性残基のリッジを維持しているが（上）、その反対側の面では正味の酸性電荷を持つ（下）。

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Bd0055のDNA結合は古細菌ヒストンとは異なる
蛍光偏光（FP）アッセイから明らかなように、Bd0055はin vitroでDNAと相互作用する（図4a）。我々は以前、ゲル電気移動度シフトアッセイを用いて、古細菌ヒストンHTkAが147 bpのDNAを単一の個別のバンドにシフトさせることを証明した22。HTkAはこのDNA断片を10:1程度の割合で飽和させ、タンパク質を添加してもそれ以上のシフトは生じない。対照的に、Bd0055はDNAをシフトさせ、複数の結合事象を示す複数のバンドを規則正しく並べた（図4b）。Bd0055のタンパク質/DNA比を増加させると、電気泳動移動度が減少し続けることから、異なる結合様式が示唆される（図4b）。

図4：Bd0055はHTkAとは異なる方法でDNAと結合する。
図4
a, Alexa488で標識した147 bpのDNA（Widom 601配列）とBd0055の結合をFPで測定（N = 3）。EC50、半最大有効濃度。平均値±s.d. b, EMSAでモニターしたBd0055-DNA結合（非標識147 bp DNAを使用）。Bd0055はHTkAと同様の親和性で結合するが、ゲルシフトのパターンは異なる。 c, Bd0055を二重標識147 bp DNA（Alexa488とAlexa647、FP実験と同じDNA）に滴定した。DNAと結合するのに十分な高濃度のHTkAでは、ヒストンがDNAを包み込み、高いFRETシグナルを生じる。Bd0055は、タンパク質が大量に過剰であっても、DNA末端間でFRETを起こさない（N = 3）。平均値±s.d. d, 4つのヒストン二量体と118bpのDNAを用いて、PDB 5T5K上にモデル化した仮想的なBd0055ハイパーヌクレオソームのシミュレーションによるRMSDのプロット（補足動画1参照）。500ナノ秒のシミュレーションの後、HMfBを含むハイパーヌクレオソームは安定なままであるのに対し、仮説上のBd0055ハイパーヌクレオソームはわずか10ナノ秒でバラバラになる。

出典データ

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Bd0055がDNAをヌクレオソームのような形状に曲げるかどうかを調べるために、フェルスター共鳴エネルギー転移（FRET）ドナー・アクセプター対で末端標識した147bpのDNA断片上にヒストンを組み立てた。このDNAに古細菌HTkAを滴定すると、ヌクレオソーム様構造が形成され、両末端がFRETで近接することが以前観察された18。一方、大過剰のBd0055を滴定してもシグナルは観測されなかった（図4c）。同じサンプルの蛍光偏光をモニターすることで、この条件下で両タンパク質がDNAと結合することを確認した（図4a；結合親和性に対するpHと塩の影響については補足図6を参照）。

Bd0055のこの異なる挙動をさらに調べるために、4つのHMfB二量体と118bpのDNAからなる古細菌ハイパーヌクレオソーム（PDB 5T5Kに基づく）にBd0055ヒストン構造を重ね合わせ、全原子分子動力学シミュレーションを行った。古細菌のヒストン二量体はシミュレーション中ずっと安定に積み重なったままであるのに対し、モデル化したBd0055ハイパーヌクレオソームは数ナノ秒以内に展開する（図4dおよび補足動画1）。シミュレーションの間、Bd0055二量体はDNAに結合したままであるが、タンパク質間相互作用を通じて他の二量体と接触することはもはやないため、DNA上で安定な四量体を形成できないことが示唆される。

この結論は、HMfAまたはBd0055のいずれかを高レベルで発現している大腸菌株のクロマチンの比較マイクロコッカールヌクレアーゼ消化によってさらに支持された。HMfA発現株のクロマチンを消化すると、ハイパーヌクレオソーム形成と一致するバンドのはしごができるのに対し、Bd0055発現株ではハイパーヌクレオソームの足跡を示すような決まったサイズの断片は観察されなかった（補足図7）。

これらの違いを、高分子集合体の分子量と形状を評価する第一原理的アプローチである分析的超遠心法（AUC）によってin vitroでさらに調べた。147bpのDNA断片は、15個のHTkAの二量体で飽和した（S値は8でそれ以上増加しない）。一方、Bd0055の二量体は同じDNAに60個以上加えることができ、その結果、12S以上で沈降するはるかに大きな複合体ができた（補足図8）。この結果は、HTkAとBd0055が採用している結合様式と化学量論が全く異なることを示す、直交する証拠である。

Bd0055がDNAとどのように結合するのかを理解するために、35 bpのDNA断片と複合体化したBd0055の結晶構造を解いた（補足表2）。この構造から、Bd0055はDNAの小溝を横切る1つのL1-L2結合界面だけで接触していることがわかった（図5a）。このエッジオン相互作用の分子的詳細は、他の既知のヒストンで観察されたものと非常によく似ている。L1-L2モチーフは生命の全領域にわたって保存されているが、他のほとんどすべてのヒストン-DNA複合体では小溝に達するスプロケットアルギニンが欠けている（図1c）。驚くべきことに、DNAは正電荷を帯びたヒストン表面の周りで曲がるのではなく、まっすぐな軌道を描く。さらにヒストン2量体は、L1-L2界面を通して次の2つのリン酸に結合し、同じ相互作用をしているが、180度反転している（図5b）。このフィラメントは、塩基性DNA結合リッジとヒストン2量体1と5の酸性下面が関与するヒストン2量体間のタンパク質間相互作用、および2量体1と4の間のN末端尾部の交換を介して安定化される（図5c）。このヌクレオヒストンフィラメントは、ヒストン対DNAの比が2.5bpあたり1ヒストン二量体であることを特徴としており、DNAを溶媒から完全に保護することによって、既知のヒストンの慣例を逆転させている。他の既知のヒストン-DNA複合体はすべてヒストンが内側にあり、30bpあたり1ヒストン2量体という化学量論でDNAを巻き込んでいるため、DNAの二重らせんの形状が大きく歪む（図5b）。

図5：Bd0055はDNAの末端から結合し、まっすぐなDNAを包み込む。
図5
a,35bpのDNAと複合体化したBd0055の結晶構造。DNAの小溝を横切るL1-L2ループとリン酸骨格との相互作用を示す。b, 上部：Bd0055二量体は、5つのリン酸（各鎖に2-3個ずつ）に結合し、静電的相互作用を介して隣接する二量体と相互作用することにより、dsDNAを包接する。DNA上でフィラメント化する連続した二量体を青色の濃淡で示す。下図：古細菌HMfBが、4つのらせん束構造（PDB 5T5K）を介して連結したヒストン2量体のコアにDNAを巻きつけている様子。d,Bd0055のA48H, S45F, I61L（Bd0055-tetra）を変異させると、DNA末端をFRET近接させることができるが、YAIEを挿入してα2を延長したり（Bd0055-α2）、N末端を欠失させたり（Bd0055-∆AEVL）しても、すべての変異体が依然としてDNAと結合しているにもかかわらず、効果はない（補足図9参照）。三重で行った実験の平均±s.d.。

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Bd0055とDNAの異常な相互作用の推定されるメカニズム
Bd0055と他のヒストンとの間の3つの主な構造の違いが、この結合様式の原因であると考えられる。第一に、N末端が同じDNA鎖上の二量体間の相互作用を促進し、線維構造を安定化させる可能性がある。第二に、Bd0055のα2らせんが短いため、DNAが極端に曲がって短くなった二量体の外側に巻き付かなければならない可能性がある。第3に、古細菌ヒストンの4量体化に関与する重要な残基が存在せず、特にA48に相当する位置にヒスチジンが存在する（図1cと5c）。

これらの違いがBd0055がDNAをラップできない原因になっているかどうかを調べるために、in vitroで代償変異体を作り、FRETを使って147 bpのDNAをラップする能力を測定した。Bd0055のN末端4アミノ酸の欠失も、α2への4アミノ酸の挿入も、DNA末端間でFRETシグナルを生成するタンパク質にはならなかった（図5d）。対照的に、HTkAの古細菌四量体化ドメインを模倣した変異（A48H, S45F, I61L；図5e）は、Bd0055がDNA末端をFRET距離内に収めることを可能にした。これらのアミノ酸は、いずれの結合様式においてもDNA相互作用には関与しておらず、またこれらのアミノ酸を変異させてもBd0055のDNA結合能力は損なわれない（補足図9a）。147bpのDNAを結合する4量体化変異体について観察されたFPシグナルの大きさは、HTkAのそれとほぼ一致し、左へのシフトは、HTkAと比較してBd0055のDNAに対する親和性が高いことを示している（図5d）。また、未解決の4量体界面の構造予測から、HMfBの結晶構造（PDB 5T5K）やHTkAの予測構造と同様の界面を形成する可能性が示唆された（補足図9b-e）。これらのデータは、野生型Bd0055が4量体を形成できないことが、古細菌や真核生物のヒストンで観察されるように、DNAを外周に巻き付けることができない原因であることを示唆している。このことは、HMfB変異導入で得られた以前の知見や、49位にヒスチジン残基を持たない古細菌ヒストンの小集団を解析した結果とも一致する。いずれの場合も、これらのヒストンは安定な四量体界面を形成できなかった20,35。

捕食と餌に依存しない成長にはおそらくBd0055が必要である
我々は、bd0055の生理的役割を調べるために、その欠失を試みた。大腸菌や他のモデル細菌とは異なり、バクテリオボルスでは誘導性プロモーターシステムなど、本質性を調べるための高度な遺伝学的ツールが利用できない。そこで我々は、確立されたサイレント遺伝子欠失法31,36を用いて、野生型HD100バックグラウンドでbd0055を欠失させる試みに何度も着手した。これらの試みの結果、欠失株は得られず、133株が野生型に復帰した。ここでいう復帰とは、選択的な条件下で増殖が起こった場合であり、耐性カセットの標的遺伝子への組み込みが成功したことを示唆するが、その後の検査で標的遺伝子のコピーが無傷であることが判明した場合である。これは例えば、B. bacteriovorusでよく見られる倍数体の結果として起こりうる。また、HD100で欠失が得られなかった理由が捕食の障害にあるのかどうかを確かめるため、宿主非依存株HID13（文献37）でbd0055の欠失を試みた。これらの試みでは、欠失は成功せず、150個が野生型に戻った。必須性の鉄壁の証明ではないが、上記の結果から、bd0055はおそらく捕食時および捕食に依存しない成長時のフィットネスにとって重要であることが示唆される。この結果はまた、2番目の、より少ないヒストン型タンパク質であるBd3044が、Bd0055の欠損を容易に補うことができないことも示唆している。

ヒストンはBdellovibrionota以外の細菌にも豊富に存在する。
B.bacteriovorusは、クロマチンの主要な構成要素としてヒストンを用いるという点で、細菌の中でユニークなのだろうか？公開されている遺伝子発現データを調べ、さらにトランスクリプトームおよびプロテオームデータを作成した。転写産物レベルでもタンパク質レベルでも、いくつかの遠縁の細菌でヒストン型タンパク質が高発現していることがわかった（図6a）。また、PlanctomycetotaやElusimicrobiaなど、遺伝子発現プロファイルが得られないクレードにおいても、ヒストン遺伝子の系統学的な持続性が顕著に観察された（補足図10-13）。

図6：他の細菌におけるヒストン。
図6
a, RNAおよび／またはタンパク質レベルでのヒストン型タンパク質の高発現は、系統的に離れたクレードの細菌で明らかである。データソース： c. L. interrogansヒストン-フォールドタンパク質の高存在と顕著なヌクレオイド濃縮。

出典データ

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私たちは、レプトスピラ症の原因菌であるL. interrogansのヒストン（Uniprot ID: A0A2H1XGH2 gene ID: LA_2458）が非常に豊富であることに特に興味を持った。以前の研究38では、このヒストンは細胞内で4番目に多く存在するタンパク質（定量された1,502個のタンパク質のうち）であったが、われわれもそれを再現し、2,433個のタンパク質のうち2番目に多いことがわかった（図6aおよび補足図14）39。Bd0055の結果と同じように、このヒストンはアミノ酸レベルで高度に保存されており、相同体はレプトスピラリス目（Leptospirales）のすべてのメンバー（腐生菌種と病原性種を含む）に存在する（図6b、補足図2および15）。DNAとの相互作用の分子的詳細はまだ解明されていないが、ヌクレオイド濃縮実験と質量分析によって、非常に高い存在量と強いヌクレオイド濃縮が確認された（図6c）。最後に、L. interrogansのゲノムからこのヒストンをコードする遺伝子を削除する試みは何度か失敗しており、この種においてもヒストンはおそらく必須であることが示唆された。

考察
今回の結果は、クロマチンの主要な構成要素としてヒストンを使っているのは、真核生物と古細菌だけではないことを示している。少なくとも2つの細菌、B. bacteriovorusとL. interrogansもそうである。B. bacteriovorus HD100由来の細菌ヒストンBd0055は、古細菌や真核生物のホモログと構造的には似ているが、DNAを外表面に巻き付けるのではなく、DNAの端に結合してオリゴマー化し、in vitroでDNAを完全に包み込む高密度のヌクレオヒストン線維を形成する。これは、既知のヒストンがDNAを曲げたり歪めたりしてヌクレオソーム（真核生物）やハイパーヌクレオソーム（古細菌）を形成し、DNAを部分的にアクセス可能な状態にするのとは異なるメカニズムである。このようなインサイド・アウトの配置は、ヒストンがDNAをどのように構造化するかという従来の考え方とは根本的に異なる。

このようなヌクレオヒストンフィラメントがin vivoで形成されるかどうか、またどのような条件下で形成されるかはまだ確立されていない。

B.バクテリオボラスのライフサイクルは、Bd0055が生体内でどのように利用されるかを知る手がかりになるかもしれない。特に重要なのは、攻撃期の細胞はヌクレオイドが高度に圧縮されており、小さな蛍光タンパク質でさえ透過できないことである34。ヌクレオイドは宿主細胞への侵入後間もなく脱落し、B. bacteriovorus細胞が分裂する準備が整うまで、よりコンパクトでないヌクレオイド状態が持続する。この時、各娘細胞の新しく複製されたゲノムは、再び高度にコンパクト化されたヌクレオイドに離散的にパッケージされる39。Bd0055ヌクレオヒストンフィラメントは、新生ゲノムの分離や、攻撃期の極端な圧縮の管理に貢献しているのかもしれない。例えば、ヌクレオイド周辺部では、ヌクレオヒストンフィラメントが細胞質環境からヌクレオイドの残りの部分を保護し、おそらくインターフェースしている可能性がある。クロマチン免疫沈降法（chromatin immunoprecipitation followed by sequencing：ChIP-Seq）あるいは関連するアプローチを用いて、Bd0055のゲノム結合様式を決定することは、この疑問に答えるための論理的な次のステップであろう。

私たちが観察した結晶格子は、隣接するヌクレオヒストンフィラメント上のヒストンの相互作用を通して、細菌ヒストンがより高次のファイバーパッキングを生成する可能性を示唆している（補足動画2）。フィラメント間の相互作用はそれほど強くないようであるが、Bd0055二量体の3つのDNA結合領域のうちの1つがDNAとのさらなる相互作用に利用可能であり、ヌクレオヒストンフィラメント間の相互作用を可能にするかもしれないことは指摘しておく価値がある。B. bacteriovorusとL. interrogansのトモグラムは、生体内でDNAファイバーが時折密にパッキングしていることを示唆している40,41が、これらがヌクレオヒストンフィラメントであるかどうかはまだ確立されていない。

ヒストンはおそらく他の細菌でも機能している。われわれは、Bacteria（細菌）領域の多様な生物におけるヒストン配列の証拠を示す。コードされたタンパク質はしばしば非常に豊富であり、少なくとも他の1つの細菌、L. interrogansでは必須である可能性が高いことがわかった。レプトスピラヒストンはBd0055と、より短いα2ヘリックス、保存されたL2ループ、古細菌の4量体化に寄与するヒスチジンの欠如など、特異的で重要な特徴を共有している。今回の発見は、他の細菌ヒストンがBd0055と同じようにDNAと結合するのかどうか、ヒストン遺伝子配列はいつどのようにして獲得されたのか、そしてそれらはどのような機能を果たしているのかを調べる道を開くものである。これらには、TFIID、SAGA、CENP-TSWX（内側キネトコア複合体の構成要素）のような高分子複合体の一部として存在し、DNAと相互作用しない真核生物のヒストンフォールドのように、DNA結合以外の機能も含まれるかもしれない42。

方法
ヒストン折りたたみタンパク質の相同性調査
既知のヒストン折りたたみドメイン（Histone (PF00125)、CBFD_NFYB_HMF (PF00808)、DUF1931 (PF09123)）のPFAM HMMモデルを、HMMERパッケージ(v.3.1b2)のhmmsearchを使用し、再現性を確保するために-cut_gaオプションを付けて、18,343の細菌ゲノムからなる系統学的に多様なデータベース（補足表3）に対して検索した。さらに、8つの原核生物のヒストン折りたたみシード配列のリストを文献26から入手し、Jackhmmer (HMMER v.3.1b2)による相同性検索に使用した。P<1×10-3のJackhmmerの結果を保持した。ヒットは結合され、200アミノ酸より長いタンパク質は破棄された。データベース内のすべてのプロテオームはNCBIから入手した（2020年5月20日アクセス）。GenBankプロテオームファイルが入手できない場合は、Prodigal (v.2.6.3)をデフォルト設定で使用してプロテオームを予測した。

α2の長さの解析（図1b）では、α2の系統的同定を容易にするために、ヒストンフォールドタンパク質のキュレーションセットを考慮した。バクテリアのシングレットは、DUF1931 HMMヒットを除去し、さらに65アミノ酸より長いタンパク質を除去することによって、ヒストンフォールドタンパク質のバルクからフィルターにかけられた。HMf/HTk型古細菌ヒストンは、細菌と古細菌のヒストン-フォールドタンパク質のアラインメント20に基づく系統樹から除外した。次にJpred4（文献43）を用いて各ヒストンの二次構造を予測し、これらの予測に基づいてα2の長さを計算した。α2はペプチド領域L28-L32（HMfB座標、図1c参照）に重なるらせんとし、1,458例中1,439例でタンパク質中の最長らせんとして同定された。α2の長さの異常値（図1b参照）は手作業で精査され、二次構造の予測ミスによるもので、α2が2つの小さならせんに分割されていることが多い。これらの異常値を除去しても結論には影響しなかった。

タンパク質アラインメントと系統樹
すべての種の樹はGTDB (https://gtdb.ecogenomic.org/)から得た。樹形はiTol (v.6.7)でレンダリングし、Adobe Illustratorでファイナライズした。

最良の相互ブラスト
アミノ酸保存性（補足図3および15）を計算するために使用された最良の相互ブラストヒットは、Rライブラリmetablastr（v.0.3）のblast_best_reciprocal_hit関数を使用して得られた。

細菌培養
B. bacteriovorus HD100は、凍結ストックから二層YPSCプレートで培養して初期増殖させ、その後、大腸菌S17-1を含む液体カルシウム/HEPESバッファーで培養した。カナマイシン耐性大腸菌S17-1株（pZMR100）を、カナマイシン耐性B. bacteriovorus株の培養のための餌料として使用した。培地は必要に応じてカナマイシン（50 µg ml-1）を添加した。

宿主非依存性のB. bacteriovorus株HID13は、前述のようにYP培地で30℃で培養した37。

L. interrogansはEMJH培地中、30℃で107個/mlの菌密度に培養した。細胞を4,000×gで20分間遠心分離して回収し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。得られたペレットは、使用するまで-80℃で凍結保存した。

全細胞抽出物の調製
全タンパク質は、iSTプロテオミクスキット（下記参照）を用いて、-80℃で凍結した未分画ペレット約5mgから抽出した。実験は、タンパク質抽出ステップで生物学的二重複製を行い、プロテオミクスステップでは各生物学的複製を技術的に二重複製した。

ヌクレオイド濃縮とタンパク質精製
ヌクレオイド濃縮はref. 45に記載されている方法で行った。凍結ペレット（～10 mg）を0.5 mlの緩衝液A（10 mM Tris-HCl pH 8、5 mM EDTA、100 mM NaCl、20%スクロース）と100 μlの緩衝液B（100 mM Tris-HCl pH 8.2、50 mM EDTA、0. 6 mg ml-1リゾチーム）；氷上でインキュベートした後、0.5 mlのバッファーC（10 mM Tris-HCl pH 8.2、10 mM EDTA、10 mM スペルミジン、1% Brij-58、0.4% デオキシコール酸塩）を加えた。リゾチームのインキュベーションは、B. bacteriovorusに対しては氷上で10分間、L. interrogansに対しては室温で10分間行った。スクロース勾配（10-60%）は、ベックマン・コールターの透明チューブ（14×89mm）に10%ずつ2mlずつ手動で注入した。勾配液は実験前に4℃まで冷却した。溶解した細胞をグラジエント上に沈め、4℃に予冷したBeckman Optima遠心機内のSW41-Ti Beckman Coulterローターで10,000 r.p.m.で遠心した。加速度は、ランの開始時と終了時の両方で最小値に設定した。可溶性細胞質タンパク質はチューブの上部に向かって低密度に沈殿した（「上部画分」）。一方、ヌクレオイドは膜タンパク質46,47とともに高密度に沈殿し、不透明で粘性のあるバンドとして同定された（「ヌクレオイド画分」）。両方の画分からのタンパク質を濃縮し、文献15に記載されているようにメタノール・クロロホルム処理をして精製した。15. 次に、以下に述べるように、iST PreOmicsキットを用いて質量分析用のサンプルを調製した。実験は、タンパク質抽出ステップでは生物学的3連複で行い、プロテオミクスステップでは各生物学的複製を技術的に複製した。

質量分析用のタンパク質調製
全細胞抽出物および異なるヌクレオイド濃縮画分からのタンパク質は、すべてiST 8x Preomicsキットを用いて処理した。超音波処理ステップは、Bioruptor Plus（高強度設定）を用いて、製造元の推奨に従って実施した。Eppendorf Thermomixer Cを用いた95℃での熱変性と超音波処理後、NanoDrop分光光度計（メソッドスコープ31）を用いて205nmの吸光度から総タンパク質量を推定した。その後、全細胞抽出物には合計100 µg、B. bacteriovorus (L. interrogans)のショ糖画分には37.5 (36.5) µgの材料を使用した。酵素消化（LysC/トリプシン）は、Eppendorf Thermomixer Cで37℃、500 r.p.m.で90分間行った。各実験について、すべてのサンプルは、LC負荷緩衝液中で-80℃で保存するまで、同じ日に同じキットを用いて処理した。

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）
クロマトグラフィー分離は、Ultimate 3000 RSLC nano液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Scientific）とThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos（B. bacteriovorus ヌクレオイド濃縮サンプル）またはOrbitrap Q-Exactive質量分析計（その他すべてのプロテオミクスサンプル）をEASY-Sprayソースを介して結合して行った。

Velosでのサンプル分析では、ペプチド溶液を注入し、トラップカラム（Acclaim PepMap 100 C18, 100 μm × 2 cm）にロードし、2%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸中、8 μl min-1で脱塩と濃縮を行った。次に、ペプチドをオンラインで分析カラム（EASY-Spray PepMap RSLC C18, 75 μm × 50 cm）に250 nl min-1の流速で溶出した。ペプチドは120分間の段階的グラジエントを用いて分離された。90分間は1-22%のバッファーB（すなわち99-78%のバッファーA）、その後さらに30分間は22-42%のバッファーB（バッファーAの組成：95/5% H2O/DMSO + 0.1% FA、バッファーB：75/20/5% アセトニトリル(MeCN)/H2O/ジメチルスルホキシド(DMSO) + 0.1% ギ酸(FA)）、その後のカラムコンディショニングと平衡化。溶出したペプチドは、正極性で動作する質量分析計で、データ依存取得モードを使用して分析した。フラグメンテーションのためのイオンは、30,000分解能での最初のMS1サーベイスキャンから決定され、その後、最も豊富な上位10イオンの衝突誘起解離が行われた。MS1およびMS2スキャンのAGCターゲットはそれぞれ1×106および3×104に設定され、最大注入時間はそれぞれ500msおよび100msであった。サーベイスキャンのm/z範囲は350-1,500で、正規化コリジョンエネルギーは35%に設定し、電荷状態スクリーニングを有効にして+1電荷状態をリジェクトし、最小フラグメンテーショントリガー信号しきい値は500カウントに設定した。

Q-Exactive質量分析計でのサンプル分析には、Ultimate 3000 RSLCナノ液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Scientific社製）とOrbitrap Q-Exactive質量分析計（Thermo Scientific社製）をEASY-Sprayソースを介して接続し、クロマトグラフィー分離を行った。ペプチド溶液を注入し、トラップカラム（Acclaim PepMap 100 C18、100μm×2cm）にロードし、2%アセトニトリルと0.1% TFA中、8μl min-1で脱塩と濃縮を行った。その後、ペプチドをオンラインで分析用カラム（EASY-Spray PepMap RSLC C18, 75 μm × 75 cm）に200 nl min-1の流速で溶出した。詳細は以下を参照。

B. bacteriovorus全細胞抽出物プロテオミクスのための具体的なダウンストリーム設定
ペプチドは120分間のグラジエントを用いて分離した。90分間は4-25%のバッファーB、その後さらに30分間は25-45%のバッファーB（バッファーBの組成：80%アセトニトリル、0.1%FA）、そしてその後のカラムコンディショニングと平衡化。溶出したペプチドは、データ依存取得モードを使用して、正極性で質量分析した。フラグメンテーションのためのイオンは、70,000の分解能での最初のMS1サーベイスキャンから決定され、その後、17,500の分解能で上位12個の最も豊富なイオンの高エネルギー衝突誘起解離(HCD)が行われた。MS1およびMS2スキャンのAGCターゲットはそれぞれ3×106および5×104に設定され、最大注入時間はそれぞれ50msおよび50msであった。サーベイスキャンのm/z範囲は400-1,800で、正規化コリジョンエネルギーは27に設定し、未同定イオンと+1イオンの電荷排除を有効にした。動的排除は45秒に設定した。

L. interrogansプロテオミクスのための具体的なダウンストリーム設定
90分間のグラジエントを用いてペプチドを分離した。60分間は4-25%のバッファーB、その後さらに30分間は25-45%のバッファーB（バッファーBの組成：80%アセトニトリル、0.1%FA）、その後のカラムコンディショニングと平衡化。溶出したペプチドは、データ依存取得モードを使用して、正極性で質量分析した。フラグメンテーションのためのイオンは、70,000の分解能での最初のMS1サーベイスキャンから決定され、次いで17,500の分解能で最も豊富な上位10イオンのHCDが行われた。MS1およびMS2スキャンのAGCターゲットはそれぞれ3×106および5×104に設定され、最大注入時間はそれぞれ50msおよび100msであった。サーベイスキャンのm/z範囲は350-1,800で、正規化コリジョンエネルギーは27に設定し、未同定イオンと+1イオンの電荷排除を有効にした。動的排除は45秒に設定した。

プロテオミクスデータ処理
データはMaxQuantソフトウェアプラットフォーム（v.1.6.10.43）48を使用して処理され、各生物のGenBankプロテオームに対して内蔵のAndromeda検索エンジンによってデータベース検索が行われた。逆デコイデータベースアプローチは、ペプチドスペクトルの一致に対して1%の偽発見率(FDR)で使用された。検索パラメーターは以下の通り：最大ミス切断は2、固定修飾はシステインのカルバミドメチル化、可変修飾はメチオニンの酸化、タンパク質N末端のアセチル化、アスパラギンの脱アミド化、グルタミンのピログルタミン酸への環化。ラベルフリー定量（LFQ）が有効で、LFQの最小比カウントは1であった。'match between runs'機能が使用され、マッチングとアライメントの時間制限はそれぞれ0.7分と20分であった。

Orbitrap Q-Exactiveで生成されたデータは、代替パイプラインであるpFind (v.3)を使用して処理されました。このパイプラインは、与えられたサンプルに存在するペプチド修飾を偏りなく同定することができます49。このパイプラインによって同定された上位5つの修飾は、MaxQuantの検索空間に追加され、以前と同様に正規化アバンダンス（IBAQ）が計算されました。この追加ステップは、目的のタンパク質の正規化アバンダンス推定値に影響を与えず、この追加ステップの有無にかかわらず、サンプル全体のアバンダンス値は非常によく相関しています（rho > 0.99, P = 0）。

ヌクレオイド濃縮解析
MaxQuantによるタンパク質の定量後、相対的ヌクレオイド濃縮解析を行った15。RパッケージDEP（v.1.8.0）を用いて、可溶性画分とヌクレオイド濃縮画分のタンパク質強度（LFQ）を比較した。全体的に、膜局在が予測されるタンパク質が強固に濃縮されていることが観察され、このアプローチの妥当性が示された（補足図16）。

RNA抽出と配列決定
RNEasyキット（Qiagen社製）を用いて、宿主非依存的に増殖したB. bacteriovorus HID13および-80℃で凍結したAquifex aeolicusペレット（Archaeenzentrum Regensburg, Germanyより購入）から、DNase I処理を含めて全RNAを抽出した。RNAの品質はAgilent 2100 Bioanalyserを用いて評価した。

B. bacteriovorus HID13からのRNA抽出は、細胞を10mlの新鮮なYP培地で光学密度（OD）0.1に希釈し、密度0.6になるまで培養した（30℃で20時間、振盪培養）。各レプリケートについて、2mlの培養液を最高速度で回転させ、スナップ凍結し、RNA抽出まで-80℃で保存した。

B. bacteriovorusサンプル（すべてのRNAインテグリティナンバー（RIN）スコア>9.5）については、NEBNext rRNA depletion kit（Bacteria）を用いてリボソームRNAを枯渇させ、NEBNext Ultra II Directional RNA Library prep kit for Illuminaを用いてメーカーの指示に従ってライブラリを作成した。ペアエンド55 bpリードはNextSeq 2000シーケンスシステムでデュアル8 bpインデキシングで作成した。A. aeolicusサンプル（すべてのRINスコア>5）については、イルミナのRibozeroキット（Bacteria）を用いてrRNAを枯渇させ、メーカーの指示に従ってTruSeq Stranded Total RNA LTキットを用いてライブラリを作成した。シングルエンド50 bpリードは、MiSeqでシングル6 bpインデキシングで作成した。

RNA-seq解析
A. aeolicus（シングルエンドリード）についてはBowtie2（v.2.4.4）50を、B. bacteriovorus（ペアエンド）についてはBWA（v.0.7.17）を用いて、トリミングされていないリードをマッピングした。全遺伝子のリードカウントは、PythonパッケージHTSeq（v.0.6.1）を用いて推定した51。

B. bacteriovorusの蛍光顕微鏡観察
Bd0055のC末端に蛍光色素mCherry/mCitrineを融合させ、停止コドンを除いた遺伝子をPCR増幅し、蛍光色素遺伝子を増幅した。続いて、Geneartアセンブリーキット（Invitrogen）を用いて、製造者の指示に従って、ギブソンクローニングを行い、動員可能な広宿主域ベクターpK18mobsacBに導入し、これを前述のようにB. bacteriovorus HD100に結合させた52。PCR増幅は、フュージョンポリメラーゼ（New England Biolabs）を用い、メーカーの指示に従って行った（プライマーは補足表3を参照）。

細胞は、Apo ×100 Ph3 油対物レンズ（NA：1.45）を装着した Nikon Ti-E 蛍光顕微鏡で撮像し、画像は Nikon NIS ソフトウェアを使用して Andor Neo sCMOS カメラで取得した。蛍光画像には以下のフィルターを使用した：mCherry（励起：555 nm、発光：620/60 nm）、DAPI（Hoechst 33342）： (励起：395 nm、発光：435-485 nm）。最終濃度5 µg ml-1のHoechst 33342の添加によりDNAを染色した。mCitrine発現細胞は、Leica DMRB顕微鏡（位相差および微分干渉コントラストによる透過光照明）で撮像した。捕食中のmCitrineを画像化するため、細胞を固定し（1%パラホルムアルデヒド、5分間、150 mMグリシンを用いてクエンチ）、1×PSB中DAPIでDNAを染色した（遠心分離による5分間の染色除去）。

大腸菌での蛍光顕微鏡観察
Bd0055 C末端GFP融合体（GGSGGGGSGGフレキシブルリンカーで分離）の発現を可能にするベクターをATUMに注文した（バックボーン参照pD441-CC、T5プロモーター）。このベクターを大腸菌K-12 MG1655に形質転換した。Bd0055-GFPの局在をモニターするために、接種したばかりの培養物（1:100、定常期接種物）をLB培地で1.5時間培養した後、最終濃度1 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して発現を誘導した。誘導の3時間後に細胞を回収し、パラホルムアルデヒド（1％、37℃で10分間）を用いて固定し、グリシンを用いてクエンチした。ヌクレオイドはDAPIを用いて可視化した。

大腸菌からのタンパク質精製
Bd0055（または変異体）のオープンリーディングフレームを大腸菌での発現用にコドン最適化し、5'側と3'側にそれぞれ35bpと22bpのオーバーハングを持つ二本鎖DNA（dsDNA）gBlock（IDT）に合成した。このgBlockを無制限クローニングによりlac誘導性アンピシリン耐性pET発現ベクターにクローニングした。このタンパク質は、細胞がOD〜1.0に達した後、0.4 mM IPTG誘導を用いて一晩培養したBD大腸菌細胞で発現させた。2時間後に細胞を回収し、4℃で20分間、6,000 r.p.m.で遠心した。培地をデカントし、細胞を液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。細胞を氷上で30分間解凍し、溶解バッファー（50mM Tris pH7.5、5mM EDTA、0.1% Triton X-100、5mM b-メルカプトエタノール（BME）、1mM AEBSFプロテアーゼ阻害剤、50mlあたり1錠のPierce Completeプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。その後、超音波処理（1秒オン／オフ、1分間を3ラウンド）で細胞を溶解し、16,000 r.p.m.で20分間、4℃で遠心した。溶解液を0.45μmのフィルターで濾過し、AKTA Pure FPLCの5ml SP HPカラム（Cytiva）で、バッファーA（0M NaCl、50mM Tris-HCl pH 7. 5、1mMトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）、1mM AEBSF）から1M NaCl（1M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.5、1mM TCEP、1mM AEBSF）まで、40カラム容量にわたってリニアグラジエントを行った。タンパク質は通常300mM NaCl付近で溶出した。Bd0055は280 nmにほとんど吸収がないため、画分を均一にサンプリングし、SDS-PAGEで分析した。Bd0055を含むフラクションをプールし、バッファーAで希釈して100mM NaClにした後、5mlのHeparin HPカラム（Cytiva）にアプライした。タンパク質は、40カラム容量（CV）にわたってバッファーAからバッファーBへの直線勾配で溶出され、タンパク質は通常450mM NaClで溶出された。120mlのS75カラム（Cytiva）にロードし、10%グリセロールを含むバッファーB中で、タンパク質の典型的な保持容量は74-82mlであった。画分をプールし、濃縮し、分注した後、液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。

アポタンパク質の結晶化
保存バッファー（1 M NaCl、1 mM EDTA、50 mM HEPES pH 7.5、10% グリセロール）中の組換え型Bd0055を、母液（3.2 M (NH4)2SO4、100 mM BICINE pH 9）中で、垂下滴下拡散により結晶化させた。1 µlのタンパク質と1 µlの母液をカバースリップ上で穏やかに混合し、1 mlの母液を含む24ウェル結晶トレイのあらかじめグリスアップしたウェルにシールした。結晶は24時間以内に形成され、3日以内に成熟した。X線回折データをRigaku XtaLAB MM003 X線回折計で収集し、DIALS (v.3.14)でインデックスを作成した。分子置換はPhenix (v.1.20)を用い、構造はCoot (v.0.9.8.5)で精密化した。短い理想化されたαヘリックスが検索モデルとして使用され、残りのほとんどの構造はAutoBuildを使用して自動的に構築された。最終的な残基はCootで手作業で配置した。

DNA結合（FP）
反応バッファー（10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM HEPES pH 6）中で、タンパク質濃度がDNAプローブより低くなるまで連続希釈することにより、10 nM Alexa488 末端標識147 bp DNAに、Opentrons OT-2液体処理ロボットを用いてタンパク質（50 µM）を滴定した。r.t.で15分以上インキュベートした後（一晩インキュベートしても全体的な結果は変わらなかった）、BMG Labtech CLARIOstarマイクロプレートリーダーを用いて蛍光偏光データを収集した。データはGraphPad Prism (v.9)で分析し、[Inhibitor]対反応、4パラメータ非線形回帰曲線に当てはめた。

DNA結合（FRET）
FRET実験はFP実験と同時に行われ、使用した147bpのDNAはAlexa488の反対側にAlexa647蛍光体で標識されていた。データはBMG LabtechのCLARIOstarで488 nmの光を励起し、647 nmの発光を記録して収集した。データはPrismで解析し、[インヒビター]対反応、4パラメータ非線形回帰曲線に当てはめた。

異なるバッファー条件下での結合は、OpenTrons OT-2リキッドハンドリングロボット用のカスタムスクリプトを用いたFP実験によって決定された。10 nMの40 bp dsDNA Alexa488標識DNA（IDT製）を用い、4種類のpH（5、6、7、8）、7種類のNaCl（0-250 mM）濃度をスクリーニングした。

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
DNA（1μM、147bp）を反応バッファー（10mM NaCl、1mM EDTA、50mM HEPES pH7.5）中で様々な濃度のタンパク質と混合した。反応液を80%グリセロールと1:1で混合し、r.t.で15分以上インキュベートした後、10%ネイティブPAGE（0.2×TBEランニングバッファー、150V、90分）で泳動した。ゲルは臭化エチジウムで染色し、適切なレーザーとフィルターを用いてTyphoonゲルイメージングシステムで可視化した。

MNase消化
Bd0055のコドン最適化、高コピー、ラムノース誘導性発現ベクターをATUMから入手した（pD861-SR）。一晩培養した大腸菌（W3110株）を1:50で接種し、LB培地で2時間、さらにLB+5mMラムノースで4時間培養した。Mnase消化は文献54と同様に行った。54に2つの変更を加えて行った：培養容量は10mlから15mlに増やし、消化時間は一定（15分）に保ち、酵素濃度は1×を4U ml-1のMnase（ThermoFisher）に対応させて変化させた（補足図7）。実験は4重反復で行い、代表的なゲルを補足図7に示す。

分子動力学シミュレーション
HMfBハイパーヌクレオソーム構造は、ChimeraX（v 1.6）とChimera（v 1.17.3）55,56で、PDB 5T5Kを拡張して4つのHMfB二量体と118bpのdsDNAを含むように構築した。Bd0055ハイパーヌクレオソーム構造は、Bd0055アポ構造をHMfBハイパーヌクレオソームにドッキングすることによって構築した。溶媒を明示的に用いた全原子分子動力学シミュレーションは、ff14SB、bsc1、tip3p力場（それぞれタンパク質、DNA、水）を用いてAMBER18で行った。構造はプロトン化し、水素質量を再分割した（AMBERのparmedで実装）。構造は、構造を少なくとも25Å囲む立方体のボックスに配置し、カリウムイオンを用いて電荷を中和し、水分子で水和した。1回目はタンパク質とDNA分子を拘束して溶媒を弛緩させ、2回目は系全体を弛緩させた。最小化した構造を300Kに加熱し、ゆっくりと1.01325気圧にした。これらの系を4fsステップで500nsシミュレーションした。シミュレーションは、CU BoulderのBlanca Condoクラスターを使用し、NVIDIA GPU（RTX6000sまたはA100s）で行った。二乗平均平方根偏差（RMSD）解析は、AMBER18を通してcpptrajを用いて行った。

DNA/タンパク質結晶化
長さ35bpから45bpのDNA断片で、ランダムな配列を持ち、GC含量が〜50%のものを、EMSAを用いて、Bd0055と個別の複合体を形成する能力についてスクリーニングした。35bpのDNA（配列：5'TCTTGCACTAAGAGCTACTGGAGTGCGTCAGATGT3'）

は、タンパク質とDNAの比率がおよそ4：1で離散的なDNAシフトを形成することから選択された（タンパク質をさらに添加すると、より高いスミアにシフトした）。DNA（75 µM）と1,200 µMタンパク質（1:16）を結晶化バッファー（10 mM NaCl、0.1 mM EDTA、50 mM HEPES pH 7.5）中で混合し、結晶化バッファーに対してr.t.で透析した。ハンギングドロップ結晶を、母液（15% PEG 550 MME、50mM HEPES pH 8.0）に対して1:1の複合体で4μl滴下し、20℃でインキュベートした。結晶は一晩で形成され、1週間以内に成熟した。大きな立方晶は輪切りにし、30％グリセロールで洗浄して凍結保護し、液体窒素で瞬間凍結した。X線回折データは、ALSシンクロトロン（12,397.9 eV、225 mm検出器、∆Φ = 0.25）で収集し、DIALS57でインデックスを付けた。分子置換はPhenix58を用いて行い、構造はCoot59（SBGrid60で実装）で精密化した。アポBd0055構造は、2つの一本鎖DNA（ssDNA）断片（2bpと3bp）と共に検索モデルとして使用された。その結果、2本のssDNAと3本のssDNA（対になっていない）を含む非対称なユニットが、1個のBd0055二量体に結合していることが示された。結晶格子の高度な対称性はタンパク質によって決定され、DNA配列による対称性の破れを上書きする。

AUC
AUC実験は、An50TIローターを用いたBeckman Coulter Proteomelab XL-A分析用超遠心機で行った。サンプルは、50 mM MES、10 mM NaCl、1 mM EDTA pH 6.0中で、500 nM 147 bp 601-sequence DNA（おおよそ0.6 OD）を用いて調製し、サファイア窓付きセルで回転させた。データは30,000 r.p.m.、20℃で150回スキャンして吸光度をモニターすることにより収集した。データはUltraScan3で、標準的な処理プロトコル（2DSA、GA、GA-MC）61に従って処理した。最初のスキャンを取得する前に溶液からクラッシュアウトした濃度は処理しなかった。

四量体界面の予測
HTkA、Bd0055またはBd0055-tetraの配列は、AlphaFold (v.2.3.2)を用いて多量体モードで4量体として折りたたまれた62。その後、ChimeraXを用いて、PDB 5T5KのHMfBの二量体にアラインメントした。

遺伝子欠失
B. bacteriovorus HD100のbd0055オープンリーディングフレームのマーカーレス欠失変異体を作製する試みは、bd0055オープンリーディングフレームの最初の2コドンと最後の3コドンと下流1,000bpのフランキング領域を持つ上流1,000bp領域をPCR増幅し、これらをギブソンアセンブリーによって動員可能な広宿主域ベクターpK18mobsacBに融合することによって行った。使用したプライマーは以下の通りである： Bd0055_UP_F; Bd0055_UP_R; Bd0055_DN_F; Bd0055_DN_R （補足表3）。

このコンストラクトをB. bacteriovorus HD100にコンジュゲートし、得られたエキソンジュガントをカナマイシン感受性についてスクリーニングし、遺伝子欠失または野生型への復帰を調べるためにPCRでスクリーニングした。スクリーニング用プライマーは以下の通りである： Bd0055KO_S_F 5' atctggagcttcacttcccg 3'およびBd0055KO_S_R 5' ggtgatgatccgggctctaa 3'。

L. interrogansにおける標的変異誘発のために、LA_2458のコード配列と標的遺伝子の脇の配列に相同な0.8-0.9kbの配列を置き換えたカナマイシン耐性カセットをGeneArt (Life Technologies)により合成し、L. interrogansでは複製できない大腸菌ベクターにクローニングした。プラスミドDNAを、Biorad Gene Pulser Xcellを用い、前述63のようにエレクトロポレーションによってL. interrogans serovar Manilaeに導入した。エレクトロポレーションした細胞を、50μg ml-1カナマイシンを添加したEMJH寒天プレートにプレーティングした。プレートは、乾燥を避けるため、密封したプラスチック袋かホイルに包んで、30℃で4週間インキュベートした。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
全てのデータセットは公開されている。プロテオミクスデータはPRIDE（PXD039405）に、RNA-seqデータはGEO（accession GSE220534）に寄託されている。使用したゲノムはすべて、利用制限なしで公開されている（補足表4）。構造データはProtein Data Bankに寄託されている（apo Bd0055はPDB 8FVX、DNA結合Bd0055は8FW7）。本研究で使用したプライマーとオリゴは補足表3に示す。生の顕微鏡画像はZenodo (https://zenodo.org/record/8255694)に寄託されている。通信および資料請求は、K.L. (karolin.luger@colorado.edu)またはT.W. (tobias.warnecke@lms.mrc.ac.uk)まで。ソースデータは本論文とともに提供される。

コードの利用可能性
解析スクリプトはR v.3.6.2を用いて実行した。図を再現するために必要なスクリプトは https://github.com/hocherantoine/BHF/ で入手できる。

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参考文献のダウンロード

謝辞
RNA配列決定についてはLMS Genomics Facilityに、結晶構造解析についてはCU BoulderのA. Erbseに感謝する。本研究は、Wellcome Trust Investigator Award in Science (209437/Z/17/Z, P.R., J.T., C.L., R.E.S.)、UKRI MRC core grant (MC-A658-5TY40, T.W., A.H., K.M.S.)、Howard Hughes Medical Institute (K.L., S.P.L.)の助成を受けた。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Antoine Hocher、Shawn P. Laursen。

これらの著者は共同で本研究を監督した： Antoine Hocher、Karolin Luger、Tobias Warnecke。

著者および所属
医学研究評議会ロンドン医学研究所（英国、ロンドン

アントワーヌ・ホッハー、キャサリン・M・スティーブンス、アレックス・モントーヤ、パヴェル・V・シュリアハ、トビアス・ヴァルネッケ

インペリアル・カレッジ・ロンドン医学部臨床科学研究所（英国・ロンドン

アントワーヌ・ホーチャー、キャサリン・M・スティーブンス、アレックス・モントーヤ、パヴェル・V・シュリアハ、トビアス・ワーネッケ

米国コロラド大学ボルダー校分子・細胞・発生生物学部

ショーン・P・ラウセン

ノッティンガム大学クイーンズ・メディカル・センター生命科学部、医学部、イギリス、ノッティンガム

ポール・ラドフォード、ジェス・タイソン、キャリー・ランバート、R・エリザベス・ソケット

パリ・シテ大学パスツール研究所、CNRS UMR 6047、スピロヘータ生物学ユニット（フランス・パリ

マチュー・ピカルドー

コロラド大学ボルダー校生化学科（米国コロラド州ボルダー

カロリン・ルーガー

ハワード・ヒューズ医学研究所、米国メリーランド州チェビーチェース

カロリン・ルガー

貢献
A.H.はプロジェクトを開始し、すべてのバイオインフォマティクス解析、シーケンス実験、プロテオミクス（上流の細菌培養と生化学を含む）を実施した。S.P.L.は、大腸菌で発現させたBd0055のすべてのin vitro実験（生物物理学的特性解析、結晶構造解析、構造解析）とMDシミュレーションを行った。K.M.S.はヒストンホモログのキュレーションとヒストンタンパク質の汎細菌解析に協力した。A.M.とP.V.S.はプロテオミクス研究を行った。P.R.はB. bacteriovorusのBd0055-mCherryおよび-mCitrine融合株を作製し、J.T.により顕微鏡的な表現型解析を行った。C.L.とP.R.は捕食性および餌非依存性培養におけるbd0055の遺伝子欠失を試みた。M.P.はL. interrogansの生化学にバイオマスを提供し、LA_2458の遺伝子欠失を試みた。R.E.S.、K.L.、T.W.がプロジェクトを監督した。A.H.、S.P.L.、K.L.、T.W.はデータ解析と解釈を主導し、全著者の意見を取り入れて論文を執筆した。

対応する著者
Antoine Hocher、Karolin Luger、Tobias Warneckeのいずれかにご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読者の報告書はこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
補足情報
補足図1-16および表2。

報告概要
査読ファイル
補足表1
補足表1と3を1つのファイルにまとめたもの。

補足データ1
補足図のソースデータ。

補足動画1
補足動画1。

補足動画2
補足動画2

補足データ2
PDBモデル。

ソースデータ
ソースデータ Fig.
図1a,bの統計的ソースデータおよび図1cのアラインメント。

ソースデータ Fig.
図2b,e-gの統計的ソースデータ。

ソースデータ Fig.
図4a,c,dの統計的ソースデータ。

出典データ Fig.
図5dの統計的出典。

出典データ Fig.
図6a,cの統計的出典データ。

権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Hocher, A., Laursen, S.P., Radford, P. et al. In vitroで型破りなDNA結合様式を示すヒストンは、細菌Bdellovibrio bacteriovorusの主要なクロマチン構成要素である。Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01492-x

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受領
2023年05月03日

受理
2023年09月08日

出版
2023年10月09日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-023-01492-x

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クロマチン構造
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ネイチャー微生物学 (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)

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