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機能性食品ジャーナル
第116巻 2024年5月 106157号
α-リノレン酸を豊富に含む亜麻仁油の食餌補充は、腸のホメオスタシスを再構築し、マウスの腸-肝臓軸を介して抗腫瘍免疫を改善することにより、同所性肝細胞がんに対する抗PD-1防御を増強する
著者リンク オーバーレイパネルを開くJian Liu a 1, Yiwei Li b 1, Wenke Shen b, Ting Wang b, Yuanyuan Liu b, Junbai Ma b, Xiaoxu Zhang a, Ting Li a, Wenyan Tian a, Xiaolong Ma a, Lina Zhang a, Ke Li b, Ming Li a, Xiaoxia Zhang c, Qing Liu a, Hao Wang b
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https://doi.org/10.1016/j.jff.2024.106157
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ハイライト

ALAが豊富なFOの介入は、マウス同所性肝細胞癌に対する抗PD-1の抗腫瘍効果を増強する。

ALAの抗腫瘍効果は腸内細菌叢の調節と密接に関係している。

ALAリッチFOと抗PD-1抗体の併用は、肝細胞癌の微小環境の改善に寄与する可能性がある。

ICI治療におけるALAの増強は、SCFAの増加に一部依存している可能性がある。

要旨
抗プログラム細胞死（PD）-1抗体による免疫チェックポイント阻害療法は、多くの悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めているが、奏効率が低いという問題が残っている。本研究では、肝細胞癌に対するPD-1免疫療法の効果に対するα-リノレン酸（ALA）の相補性について検討した。その結果、ALAとPD-1免疫療法の併用が、優れた腫瘍増殖抑制効果を発揮することを見出した。さらに、ALAとPD-1免疫療法の併用は、血漿中および腫瘍組織中の多様なT細胞サブセットおよび抗腫瘍免疫関連サイトカインレベルを有意に変化させた。興味深いことに、腸内細菌叢と短鎖脂肪酸（SCFA）を調節し、肝臓のリポ多糖（LPS）を減少させるとともに、腸のタイトジャンクションタンパク質の発現を上昇させることにより、腸内細菌叢の異常は介入後に顕著に抑制された。これらの結果を総合すると、ALAのサプリメントは抗腫瘍免疫を強化し、腸内ホメオスタシスを再構築し、肝細胞癌に対するPD-1治療に寄与することが示された。

グラフ抄録

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キーワード
α-リノレン酸抗PD-1療法肝細胞癌腸内細菌叢

1. はじめに
   肝細胞癌（HCC）は肝癌の大部分を占め、原発性肝癌の80～90％以上を占める（Caligiuriら、2022年）。慢性炎症、腸内細菌叢、環境因子などの複雑な指標が肝細胞癌の進行と密接に関連していることを示唆する証拠が蓄積されている（Llovetら、2023年、Schneiderら、2022年）。免疫状態はがんの病態生理に不可欠である。したがって、免疫チェックポイントを調節することは、がん患者の腫瘍免疫寛容を解除するための新たな治療戦略である。過去数十年にわたり、プログラム細胞死-1（PD-1）は、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）とプログラム細胞死リガンド2（PD-L2）に結合することにより、T細胞の活性化を負に制御してきた。例えば、活性化T細胞のアポトーシスを誘導し、T細胞を疲弊させ、さらには腫瘍細胞の免疫逃避によるT細胞の増殖と活性化を阻害する（Shengら、2020、Xueら、2021）。さらに、PD-1遮断抗体が腫瘍特異的CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）の再活性化を介して効果的な腫瘍根絶を達成する能力は、現在では確立されたパラダイムである（Zhangら、2023）。抗腫瘍免疫におけるエフェクター免疫細胞の主要な集団の一つであるT細胞は、肝細胞癌の進行中、諸刃の剣として考えられてきた。CD4+、CD3+、CD8+、制御性T細胞（Tregs）を含む様々なT細胞サブセットが、癌の発生に広範な影響を及ぼしている（Yanら、2023年）。中でもCD8+ T細胞は、抗腫瘍免疫における主要なドライバーとして働く。CD4＋ Tヘルパー細胞は、細胞傷害性CD8＋ CTLの抗腫瘍免疫応答を制御する上で重要な役割を果たしている（St & Ohashi, 2020）。これらの細胞は、インターフェロン-γ（IFN-γ）や腫瘍壊死因子-α（TNF-α）を含む細胞傷害性分子やサイトカインの放出を介して、がん細胞を特異的に認識し死滅させることができる(Cao et al., 2023)。IFN-γは、CD8+ CTLが免疫寛容を克服できるようにすることで、CD8+ CTLの抗腫瘍免疫を増強する(Dubrot et al., 2022)。Tregは、腫瘍における抗腫瘍免疫応答を阻害することにより、T細胞の恒常性を負に維持するために本質的に必要である（Delgoffeら、2013）。その結果、免疫チェックポイント阻害（ICB）は、単独療法として、あるいは細胞傷害性薬剤との併用療法として、肝臓がんを含む様々ながんに対する最も有望な治療戦略となっている。

腸と肝臓の相互作用は門脈を介して行われ、栄養素だけでなく微生物代謝産物や微生物成分など、腸由来の産物が肝臓に移行する（Aliら、2023）。その後、これらの成分は胆管に入り、肝臓から腸に戻る。この腸肝循環により、肝臓は腸由来の因子に絶えずさらされている（Lunz, Specht, Murase, Isse, & Demetris, 2007）。さらに、このような腸と肝臓の関係は「腸肝軸」と呼ばれ、肝臓のホメオスタシスや疾患の発症に関して、その重要性がますます注目されるようになっている。例えば、腸管透過性の亢進は、隣接する腸管上皮細胞間のタイトジャンクションの障害と関連しており、これは一連の肝疾患で一貫して観察されることから、腸由来の因子が肝機能に影響を与えていることが示唆される（Moonwiriyakitら、2023）。近年、腫瘍の進行や免疫調節における腸内細菌叢の役割を考慮し、PD-1阻害薬治療における腸内細菌叢の影響に注目した研究が増えている。常在細菌叢が自発的な抗腫瘍免疫やPD-1/PD-L1を標的とする抗体の免疫療法効果に影響を与えることが報告されている（Sivanら、2015年、Zhaoら、2022年）。その後、PD-1阻害剤治療に対する腸内細菌叢の効果は、多くの臨床試験でさらに多様化した（Goenkaら、2023年、Routyら、2023年）。腸内細菌叢の調節が、PD-1阻害剤に基づく抗腫瘍戦略を促進するための新規かつ重要な戦略であることは明らかである。さらに、腸内細菌叢はがん関連免疫細胞、特にTregに影響を与え、炎症反応や腫瘍感受性に影響を与える可能性がある（Fathiら、2021年）。興味深いことに、ある種のヒト腸内細菌は、CD8+T細胞によるIFN-γ産生とマウスにおける抗腫瘍免疫を促進することができる（Tanoue et al.） これらの免疫調節活性が最終的にどのようにHCC感受性に寄与するかは、まだ完全には解明されていない。そのほか、腸内細菌異常症が腸粘膜バリアの損傷を引き起こし、腸透過性を亢進させることで、病原性細菌とその代謝産物（リポ多糖（LPS）など）が腸-肝軸を介して血漿中に移行し、肝細胞癌を悪化させるという新たな研究も示唆されている（Beharyら、2021年）。

多くの研究が、食事ががんと密接に関係していることを示している（Febbraio and Karin, 2021, Hess et al.） 全がんの3分の1は食事と関連していると推定されており、その中でも食事性脂質が重要な役割を担っていることが明らかになっている（Yangら、2022年）。エネルギー源および細胞膜成分として、脂質は、エフェクターT細胞、ナチュラルキラーT細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびT細胞の活性化を含む免疫細胞の活性化のために潜在的に免疫調節を行う（Linら、2017、Songら、2016）。実験的研究では、食事脂肪と乳がん（Al-Jawadiら、2018）、大腸がん（Moら、2018）、前立腺がん（Bauer、Van Blarigan、Stampfer、Chan、& Kenfield、2018）との関係が確立されている。オメガ6多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、動物モデルにおいて乳がん、大腸がん、前立腺がんに対する刺激効果を示しているが、長鎖n-3 PUFAは腫瘍抑制効果を有する（Mazzocchi, Leone, Agostoni, & Pali-Scholl, 2019）。α-リノレン酸（ALA）は、n-3系PUFAの最も重要な植物由来供給源であり、そのよく知られた抗炎症作用に加えて、様々なメカニズムを通じて、乳がん（Liuら、2018）、大腸がん（Kato、Okada、Eshak、Iso、& Tamakoshi、2023）、および食道がん細胞株（Huら、2022）の増殖をダウンレギュレートすることが報告されている。亜麻仁油（FO）は、植物由来のn-3系PUFA、主にα-リノレン酸（ALA、18:3 ω-3）の豊富な供給源であり、アテローム性動脈硬化症（AS）（Li et al、 2022）、アルコール性肝疾患（ALD）（Zhangら、2017）、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）（Wangら、2020）、2型糖尿病（T2DM）（Zhuら、2020a）などである。しかしながら、肝細胞癌におけるALAの役割についてはほとんど知られていない。

ALAと抗PD-1抗体はともに免疫応答の活性化を促進することが可能であることから、ALAと抗PD-1抗体の併用は相乗的な抗腫瘍効果をもたらす可能性があると考えられた。そこで本研究では、ALAを豊富に含む食品と抗PD-1抗体との併用療法の有効性を肝臓がんモデルマウスを用いて検討し、肝臓がん、免疫療法（T細胞）、腸内細菌叢の複雑なメカニズムのさらなる理解に貢献する可能性を検討した。

1. 材料と方法
   2.1. 実験動物および細胞
   すべての実験は寧夏医科大学倫理委員会（IACUC-2023-006）の承認を得た。30匹の特定病原体フリー（SPF）雌性BALB/cマウス（5～6週齢、体重18±2g、HFK Bio-Technology、北京、中国）に餌と水を自由摂取させた。マウスは実験前に検疫環境で環境に慣らした。マウスH22肝がん細胞（H22）は、Procell Life Science社（武漢、中国）から購入した。

2.2. 動物の処置と実験デザイン
1週間の順化期間後、動物を無作為に5群（n = 6）に分け、以下のように30日間処置した： Sham、MODEL、ALA、PD-1、ALA + PD-1。Sham群、MODEL群およびPD-1群にはコーン油を経口投与した。ALA 群および ALA + PD-1 群のマウスには、ALA を豊富に含む FO（Liupanzhenfang ecological agricultural technology Co. FOの脂肪酸組成は補足資料を参照されたい。腫瘍モデルは実験10日目に樹立した。手術はすべて、10%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による全身麻酔で行った。動物は麻酔後、仰臥位で実験台に固定した。除毛器を用いてマウスの腹部の毛を除去した。剣状突起下に1cmの縦切開を加え、70％アルコールで消毒した。左肝葉を滅菌綿棒で腹腔から注意深く引き抜いた。腫瘍細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。細胞懸濁液（50μL、1×106個）を1ml注入器を用いて左肝葉に注入した。PD-1群およびPD-1 + ALA群のマウスは、実験の17日目、20日目、23日目にPD-1抗体（200μg）（BioXcell社、BE0146、米国）で処理した。投与30日後、マウスを12時間絶食させた後、安楽死させ、最後に固形腫瘍、肝臓、脾臓、小腸、大腸を含む多様なサンプルを採取し、調査した。血液サンプルは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む抗凝固チューブに採取し、遠心分離（1500×g、15分間）し、血漿サンプルを採取した。すべての血漿サンプルは、さらなる分析のために-80℃で保存された。実験計画を図1Aに示す。

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図1. ALA-rich FOと抗PD-1抗体との組み合わせ療法がマウス同所性肝細胞癌モデルの病理学的病変と日常的パラメータに及ぼす影響。(A)実験デザインの概略時間図。(B）BWs： 体重。(C）各群のマウスの腫瘍の形態学的変化の組織学的検査と代表的な腫瘍画像。腫瘍組織はH&Eで染色した（200×）。(D）腫瘍重量。(E）腫瘍体積。各群には6匹のマウスを含む。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

2.3. ヘマトキシリン・エオジン染色
マウスを安楽死させた後、腫瘍および小腸組織を4 %パラホルムアルデヒドで固定化した。組織はまず、段階的エタノールとキシレンで脱水し、パラフィンに包埋した。切片の厚さは5μmであった。ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E）を用いて、光学顕微鏡で病理組織を観察した。

2.4. 末梢血と脾臓からの単核球の分離
血液サンプルは、EDTAを含む抗凝固チューブに採取し、遠心分離（1500×g、15分間）し、血漿サンプルを採取した。すべての血漿サンプルは、さらなる分析のために-80℃で保存した。赤血球溶解液とともに氷上で5分間インキュベートし、遠心分離（500×g、5分間）して単核球を得た。

脾臓組織は、200メッシュのフィルター膜で穏やかに濾過した。400×g、5分間の遠心後、細胞を回収した。赤血球溶解液を用いた細胞懸濁液の調製 赤血球を溶解し、RPMI1640で洗浄してリンパ球懸濁液を得た。

2.5. フローサイトメトリー
フローサイトメトリー（FCM）により細胞を選別した。リンパ球は蛍光標識モノクローナル抗体で以下のように染色した： PE-anti-mouse CD3 (BD Biosciences, 8176542, United States), FITC-anti-mouse CD4 (BD Biosciences, 8256846, United States), APC-A700-anti-mouse CD8 (BD Pharmingen,557654, United States)、 APC-anti-mouse PD-1、PB450-anti-mouse CD25（eBioscience社、2055195、米国）、PE-anti-mouse Foxp3（eBioscience社、2176028、米国）を、製造元の指示に従って使用した。さらに、Foxp3フローサイトメトリー抗体で細胞を染色する前に、Transcription Factor Buffer Set (BD Biosciences, 562574, United States)を用いて細胞の固定化と透過化を行った。最後に、サンプルをCyto FLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter, 米国）で検出した。

2.6. 免疫組織化学染色
ALA リッチ FO と抗 PD-1 の併用療法後の HCC における CD4＋ T 細胞、CD8＋ T 細胞、PD-1＋ 細胞の役割を決定するため、免疫組織化学染色を用いて腫瘍組織を分析した。スライドはキシレンおよびアルコール（100 %,95 %,90 %,85 %,80 %,70 %）で脱脂・再水和した。その後、スライドをクエン酸ナトリウム溶液中で15分間インキュベートし、中火で電子レンジにかけ、抗原をアンマスクした。その後の抗体のインキュベーションの範囲を最小にし、抗体を効果的にインキュベートするために、組織化学用オイルペンで組織に丸をつけた。その後、スライドを3 % H2O2で30分間インキュベートし、3 % BSAを含むPBSでブロックした。スライドをウサギ抗CD8抗体（1:500希釈）（Bioss, bs-0648R、中国）、ウサギ抗CD4抗体（1:500希釈）（Bioss, bs-0647R、中国）、ウサギ抗PD-1抗体（1:1500希釈）（Proteintech, 66220-1-lg、中国）とそれぞれ4℃で12時間インキュベートした。基質発色剤と5分間反応させた後、引き続きヘマトキシリン染色で核を観察した。画像はオリンパスBX51顕微鏡（青森オリンパス、日本）で撮影した。

2.7. 定量的リアルタイムPCR
製造業者のプロトコールに従い、RNA Extraction kit（Omega、米国）を用いて凍結腫瘍組織から全リボ核酸（RNA）を抽出した。その後、逆転写酵素キット（UEIris RT mix with DNase、中国）を用いて逆転写し、cDNAを得た。その後、SYBR Green RT-qPCR システム（UEIris 2X SYBR Green qPCR MAster Mix）を用いて RT-qPCR を行った。標的遺伝子の発現はGAPDHで標準化した。すべての実験は3連で行った。qPCRプライマーの配列は以下の通りである。

CD4-F：5′-GATGTGGAAGGCAGAGATC-3′。

CD4-R：5′-AGGTTGAGTGGAGCGTTTC-3′。

CD8-F：5′-CGCCGAACTTGTCCAGAGG-3′。

CD8-R：5′-TGAAGCCATAGACAACGAAGGTG-3′-TGAAGCCATAGACAACGAAGGTG-3

PD-1-R：5′-GGCGTTCCAGTTCAGCATAAG-3′。

PD-L1-F：5′-AGCCTCAGCACAGCAACTTCAG-3′。

PD-L1-R：5′-cttgtagtccgcaccaccgtag-3′。

CTLA-4-F：5′-GGCAACGGACGCAGATTATG-3′。

CTLA-4-R：5′-aaagaaacagcagtgaccaggaaac-3′。

gapdh-f：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′。

gapdh-R：5′-tggtccagggtttcttactcc-3′。

2.8. 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
さらに、血漿中のサイトカイン濃度を検出した。マウスの血液を、まず室温で1500rpmで15分間遠心分離し、次いで血清を採取し、TNF-αおよびインターロイキン-10（IL-10）のレベルを、ELISAキットの手順（Proteintech,Wuhan,China）に従って測定した。腫瘍サイトカイン測定では、腫瘍組織を機械的にホモジナイズし、12000×g、4℃で10分間遠心した。上清を回収し、BCA protein assay kitを用いてタンパク質濃度を測定した。その後、メーカーの指示に従い、TNF-α、IFN-γ、トランスフォーミング増殖因子-β1（TGF-β1）およびIL-10の濃度をそれぞれELISAキット（Proteintech, Wuhan, China）で測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Thermo Scientific、米国）を用いて450 nmで読み取り、サンプル濃度は標準曲線に計算した。

2.9. 免疫蛍光
治療後のHCCにおける腸粘膜バリアの完全性の影響を調べるため、免疫組織化学を用いて腸組織を分析した。スライドはキシレン、アルコール下降系列で脱脂、再水和した。その後、スライドをクエン酸ナトリウム溶液で15分間インキュベートし、中火で電子レンジにかけ、抗原をアンマスクした。PBSに10分間浸した後、切片をウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma, A7906,米国）の2％アルブミンで1時間ブロックした。その後、ウサギ抗マウスClaudin-4抗体（1:500希釈）（Santa Cruz、sc-376643、米国）またはラット抗マウスZonula occludens-1（ZO-1）抗体（1:500希釈）（Santa Cruz、sc-33725、米国）と4℃で12時間インキュベートした。その後、4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含むマウンティングタブレット（Solarbio, Beijing, China）を加えた。画像はオリンパスBX51顕微鏡（青森オリンパス株式会社、日本）で撮影した。

2.10. 血漿中のスーパーオキシドジムターゼ（SOD）とマロンジアルデヒド（MDA）の測定
血漿中のSODおよびMDA濃度は、SODおよびMDA検出キット（南京建成生物工学研究所、南京、中国）を用いて、製造者の指示に従って測定した。

2.11. 肝LPSの測定
製造元の指示に従い、肝臓 LPS 濃度を limulus amebocyte lysate kit (Xiamen Bioendo Technology Co., Ltd, Xiamen, China) を用いて測定した。

2.12. 腸内細菌叢解析
各群5匹のマウスを無菌ケージに入れ、新鮮な糞便を採取し、採取後直ちに液体窒素で凍結し、DNA抽出まで-80℃で保存した。

MagAtrract PowerSoil Pro DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用い、製造者の指示に従って糞便サンプルから全微生物ゲノムDNAを抽出した。DNAの質と濃度は、1.0 %アガロースゲル電気泳動とNanoDrop® ND-2000 spectrophotometer（Thermo Scientific Inc. 細菌16S rRNA遺伝子の超可変領域V3-V4は、プライマー対338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を用いて、ABI GeneAmp® 9700 PCRサーモサイクラー（ABI社、米国カリフォルニア州）で増幅した。PCR反応液は、4μLの5×Fast Pfuバッファー、2μLの2.5mM dNTPs、0.8μLのフォワードプライマー（5μM）、0.8μLのリバースプライマー（5μM）、0.4μLのFastPfuポリメラーゼ、0.2μLのBSA、10ngの鋳型DNA、およびddH2Oを含み、最終容量は20μLであった。PCR増幅サイクリング条件は、95℃で3分間の初期変性、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で45秒間の伸長を30サイクル繰り返した後、72℃で10分間伸長し、10℃で終了した。全てのサンプルは3連で増幅した。PCR産物は2 %アガロースゲルから抽出し精製した後、Quantus™ Fluorometer (Promega, USA)を用いて定量した。精製したアンプリコンを等モル量でプールし、Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（中国、上海）の標準プロトコールに従った。(Ltd.（中国、上海）の標準プロトコールに従って行った。生シーケンスリードはNCBI Sequence Read Archive (SRA) データベースに登録された（アクセッション番号：PRJNA1032841）。

2.13. ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）による糞便中 SCFAs の定量分析
HP-5MSカラム（0.25×30mm、粒子径0.25μm）（Suzhou Bionovogene Co., Ltd）を装備したAgilent 7890A、Agilent 5975C質量分析検出器（Agilent Technologies、米国）結合ガスクロマトグラフィーを用いて、前述（Zhu et al.） ヘリウムをキャリアーガスとして1 ml/分の一定流量で使用した。オーブン温度は60℃で5分間保持した後、10℃/分の速度で250℃まで昇温し、最終的にこの温度で5分間保持した。フロントインレット、トランスファーライン、電子衝撃（EI）イオン源の温度は、それぞれ280、250、230℃とした。データ処理は、AgilentのMSD ChemStation (E.02.00.493, Agilent Technologies, Inc., United States)を用いて行った。

2.14. 2.14.GC-MSによる腫瘍組織の脂肪酸組成の検出
タンデム質量分析（UHPLC-MS/MS）システム（ExionLC™ AD UHPLC-QTRAP 6500+, AB SCIEX Corp. (Ltd.（中国、北京）で行った。分離はWaters ACQUITY UPLC BEH C18カラム（2.1×100mm、1.7μm）で行い、50℃に保った。移動相は、水中0.05 %ギ酸（溶媒A）とイソプロパノール/アセトニトリル（1:1）（溶媒B）からなり、0.30 ml/分の流速で供給した。溶媒勾配は次のように設定した：初期30 % B, 1分；30-65 % B, 2分；65-100 % B, 11分；100 % B, 13.5分；100-30 % B, 14分；30 % B, 15分。

質量分析計は負の多重反応モード（MRM）モードで操作した。パラメータは以下の通り： IonSpray Voltage (-4500 V)、Curtain Gas (35 psi)、Ion Source Temp (550 °C)、Ion Source Gas of 1 and 2 (60 psi)。

2.15. 統計分析
データはPrism 8.01（GraphPad Software Inc.） データは平均値±SEMで表した。2元配置分散分析（2-way ANOVA）を用いて多重比較間の差を求めた。正規分布に従い、2群間の差はStudentのt検定（両側検定）で分析した。相関分析はスピアマン法を用いて行った。P < 0.05を統計的に有意とみなした。

1. 結果
   3.1. ALA リッチ FO と抗 PD-1 の併用は肝細胞癌マウスの腫瘍増殖を効果的に抑制し、腫瘍組織の脂肪酸 組成を変化させた。
   肝細胞癌の治療における ALA リッチ FO、抗 PD-1 単剤および併用療法の効果を観察するため、BALB/c マウス同所性肝細胞癌モデルマウスを作製し、ランダムに群分けして投薬治療を行った。実験終了時、SHAM群とMODEL群に比べ、介入はマウスの体重にほとんど影響を与えなかった（図1B）。ALAリッチFOまたは抗PD-1単剤療法、およびALAリッチFOと抗PD-1の併用療法は、マウスの腫瘍に対して抑制効果を示した（図1C）。そして、他の3つのグループと比較して、併用療法グループはマウスの腫瘍重量と体積の最も有意な減少を示した（すべてP < 0.01、Fig. 1D,E）。腫瘍の組織学的形態については、H&E染色によりALAリッチFO群、抗PD-1単剤群、併用療法群の腫瘍に壊死が認められ、特に併用療法群ではより多くの壊死組織が認められた（図1C）。ALAが腫瘍細胞の細胞膜に影響を与える脂質として作用することを考慮し、腫瘍の脂肪酸組成を検出したところ、ALA介入後、ALA、cis-11,14、 17-Eicosatrienoic acid、cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid (EPA)、cis-7,10,13,16,19-Docosapentaenoic acid (DHA)が増加し、Linoelaidic acid は減少した（補足資料）。

3.2. ALAリッチFOと抗PD-1併用療法の抗腫瘍効果は、末梢血と脾臓におけるT細胞、特にCD4+T細胞とCD8+T細胞の高レベル維持と関連していた
腫瘍免疫におけるT細胞の割合が高いことは、予後の改善と密接に関連している。ALAと抗PD-1のT細胞に対する制御機能を調べるため、フローサイトメトリーを用いて末梢血と脾臓のCD3+ T細胞の割合を検出した。Fig.2に示した結果から、末梢血と脾臓におけるCD3+ T細胞の割合は、PD-1群と比較して、併用療法群で有意に増加した（すべてP < 0.05）ことが明らかになった（Fig.2A）。興味深いことに、MODEL群と比較して、ALA治療単独では脾臓におけるT細胞の割合が増加した（P < 0.01、Fig.2A）。CD8+細胞傷害性Tリンパ球とCD4+ヘルパーT細胞を含む2つの主要なT細胞サブセットが存在した。これら2種類の細胞は、互いに協力して抗腫瘍効果を発揮する。CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の割合が変化しているかどうかを調べるため、同じ方法でマウスの末梢血と脾臓におけるCD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の発現を測定した。MODEL群と比較して、ALAリッチFO単独療法は末梢血と脾臓のCD4+T細胞とCD8+T細胞にほとんど影響を与えなかった。さらに、併用療法群は有意な利点を示した。抗PD-1抗体治療群とは対照的に、併用療法群では末梢血と脾臓においてCD4＋T細胞の割合が有意に増加した（すべてP＜0.05、図2B）。ヘルパーCD4 + T細胞（Th）の増加と一致して、併用療法群ではCD8 + T細胞の割合が脾臓と末梢血で有意に増加した（すべてP < 0.05、図2C）。

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図2. 併用療法により、末梢血と脾臓のT細胞レベルは高く維持され、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の割合は増加し、PD-1+CD8+ T細胞とTregの割合は減少した。(A）多様な群のマウスの末梢血と脾臓におけるT細胞（CD3+）レベル。(B）各群の末梢血と脾臓におけるCD4+T細胞（CD3+CD4+）レベル。(C）末梢血と脾臓におけるCD8+T細胞（CD3+CD8+）レベル。(D）末梢血および脾臓におけるPD-1+CD8+T細胞（CD3+CD8+PD-1+）レベル。(E）末梢血と脾臓におけるTreg（CD4＋CD25＋Foxp3＋）レベル。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

3.3. AlaリッチFOと抗PD-1併用療法は、末梢血と脾臓におけるPD-1+CD8+ T細胞の割合を減少させた。
CD8+ T細胞は抗腫瘍効果を発揮する免疫系の主要なエフェクター細胞である。しかし、PD-1を発現しているCD8+ T細胞の中には、PD-L1+腫瘍細胞と接触し、抗腫瘍効果を奪われてしまうものがある。マウスの末梢血と脾臓におけるPD-1+CD8+T細胞の割合をフローサイトメトリーで検出した。その結果、併用療法群では脾臓におけるPD-1+CD8+ T細胞の割合が減少していた（P < 0.05、図2D）。血液中のPD-1+CD8+ T細胞の割合も減少傾向を示した（図2D）。

3.4. AlaリッチFOと抗PD-1併用療法は、抑制性免疫細胞の割合を負に制御した
免疫系に対する負の制御機能であるTregは、HCC患者において有意に増加しており（Fu et al.、2007）、そのアップレギュレーションは、エフェクターCD8+ T細胞の減少と患者の予後悪化に関連している。そこで、ALAリッチFOまたは抗PD-1が、マウスの末梢血中および脾臓中のTregの割合に影響を及ぼすかどうかをさらに調べたところ、併用療法は末梢血中および脾臓中のTreg細胞の割合を有意に減少させることがわかった（いずれもP＜0.05）。一方、ALAリッチFO単独投与群のTreg細胞も減少傾向を示した（図2E）。

3.5. ALAリッチFOと抗PD-1併用療法は、腫瘍組織においてCD4＋T細胞とCD8＋T細胞の割合を増加させたが、PD-1＋T細胞の産生は減少させた
各群のマウスの末梢血と脾臓におけるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の割合を観察した。そして、腫瘍組織におけるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の分布を免疫組織化学的に観察した（図3A）。その結果、併用療法群では他の群に比べ、腫瘍組織におけるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の浸潤が亢進していた（すべてP < 0.01、図3B,C）。さらに、腫瘍組織におけるCD4とCD8の転写発現レベルを測定した。同様に、CD4とCD8の発現は併用療法群で有意に増加した（すべてP < 0.05、図3E,F）。腫瘍組織におけるPD-1+ T細胞の浸潤についても試験した。腫瘍組織におけるPD-1の浸潤は、抗PD-1単独療法群よりも併用療法群で有意に減少し（P＜0.05、図3D）、PD-1の転写発現レベルも併用療法群で減少した（P＜0.05、図3G）。また、RT-qPCRの結果からも、ALAリッチFO治療単独では、MODEL群と比較して腫瘍組織におけるPD-1の発現が低下することが示された（P＜0.05、図3G）。さらに、腫瘍組織におけるPD-L1と細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）のmRNA発現も検出した。その結果、併用療法群のPD-L1のmRNA発現はMODEL群よりも高かった（P＜0.001、図3H）。そして、CTLA-4の発現には有意な変化はなかった（P > 0.05、図3I）。

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図3. 併用療法は腫瘍組織におけるCD4とCD8の発現を増加させ、PD-1の数を減少させた。(A）腫瘍組織におけるCD4+T細胞、CD8+T細胞、PD-1+T細胞の代表的なIHCプロファイルを200倍の倍率で示す。(腫瘍組織におけるCD4（E）、CD8（F）、PD-1（G）、PD-L1（H）、CTLA-4（I）のmRNAレベル。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

3.6. AlaリッチFOと抗PD-1併用療法は、血中および腫瘍における抗腫瘍サイトカインの発現を改善した
ALAと抗PD-1抗体の全身および腫瘍免疫に対する効果をさらに解析するため、次にELISAを用いてサイトカインレベルをモニターした。併用療法は、腫瘍と血液の両方において、サイトカインTNF-α（図4A,F）とIFN-γ（図4C,H）の濃度を有意に増加させる一方、IL-10濃度（図4B,G）を減少させた（すべてP < 0.05）。ALA リッチ FO 療法単独では前述のサイトカインに統計学的に有意な改善は認められなかったものの、ALA リッチ FO 療法単独では MODEL 群に対して一定の優位性が認められた。加えて、ALA投与は腫瘍中のTGF-β1レベルを有意に低下させ、さらにその低下は併用療法群で観察された。(すべてP < 0.05）（図4D）。これらの結果は、ALAリッチFOと抗PD-1抗体による治療が肝細胞癌の腫瘍微小環境の改善に寄与することを示した。

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図4. サイトカイン、肝臓リポ多糖（LPS）レベル、SODおよびMDAに対する併用療法の効果。腫瘍中のTNF-α（A）、IL-10（B）、IFN-γ（C）、TGF-β1（D）のレベル、および血漿中のTNF-α（F）、IL-10（G）、IFN-γ（H）のレベル。(E）肝臓のLPSレベル。血漿中のSOD（I）とMDA（J）のレベル。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

3.7. ALA を多く含むサプリメントとの併用により、血漿中の SOD と MDA のレベルが変化した。
高濃度の活性酸素種は細胞膜や細胞小器官を損傷し、アポトーシスやオートファジーの形で細胞死を誘導する。そこで、各群のマウスの血漿中MDAおよびSOD濃度を検出したが、併用療法も単独治療も血漿中MDAに有意な変化は見られなかった（P＞0.05、図4I）。これは、各群のマウスで有意な酸化的損傷は生じなかったことを意味する。しかしながら、併用療法はマウス血漿中のSOD濃度を有意に増加させた(P < 0.05, Fig. 4J)ことから、ALAの抗酸化能が関係していると考えられる。

3.8. ALA を豊富に含む飼料との併用投与は肝 LPS レベルを低下させた。
腸内グラム陰性菌由来のLPSは、主に肝炎を誘発し、腸から肝臓に移行することによって肝細胞癌の発症を悪化させる（Roderburg & Luedde, 2014）。そこでさらに、ALAを豊富に含むFOの介入が肝細胞癌の肝臓LPSに及ぼす影響を調べた。肝臓のLPSは腫瘍移植後に有意に増加した。しかし、ALAリッチFO介入後、LPSレベルはALA群と併用療法群で有意に減少した（すべてP＜0.001、図4E）。以上の結果から、ALAリッチFOは抗PD-1薬との併用、非併用にかかわらず、LPSの腸管から肝臓への移行を抑制することが示された。

3.9. 肝細胞癌マウスにおいて、ALA を豊富に含む飼料を併用することにより、腸の完全性と透過性が 改善された。
肝 LPS の減少という結果に基づき、我々は ALA リッチ FO 療法または併用が肝細胞癌マウスの腸粘膜の完全性と透過性を 維持する可能性があると推測した。そこで、HE染色を用いてマウスの大腸粘膜バリアを評価した（図5A）。SHAM群では大腸粘膜構造は無傷で、腸絨毛は欠損なく整然と配列していた。逆に、MODEL群とPD-1群では炎症細胞の浸潤と陰窩細胞の損傷が観察された。重要なことは、これらの病理学的変化がALA群と併用療法群で改善したことである。

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図5. ALAリッチFOは肝細胞癌マウスの大腸においてZO-1とClaudin-4の発現を有意に変化させた。(A）大腸組織形態をHE染色で観察した。HCCマウスの大腸におけるZO-1（B）とクローディン-4（D）の発現を免疫蛍光染色で測定した。ZO-1（C）とクローディン-4（E）の相対レベルをデンシトメトリー解析により半定量的に解析した。データは平均値±SDで表した。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, bar = 100 µm。

次に、免疫蛍光法を用いて、結腸組織におけるタイトジャンクションタンパク質（TJP）ZO-1とクローディン-4のタンパク質レベルを検出した（図5B,D）。クローディン-4とZO-1タンパクのレベルは、MODEL群とPD-1治療群で有意に低下した。しかし、ALA群と併用療法群では、これらのタンパク質のレベルは著しく増加した（すべてP < 0.01、図5C,E）。このように、ALAを多く含むFOの食事療法は、炎症を抑制し、腸絨毛構造を回復させ、腸粘膜バリアーを改善することができるようである。

3.10. 食餌性 ALA リッチサプリメントとの併用療法は肝細胞癌マウスの腸内細菌叢を再構築した。
腫瘍免疫療法と腸内細菌叢には密接な相関があることから、さらに各群のマウスの腸内細菌叢の変化を調べた。糞便サンプルは16S rRNAハイスループットシークエンシングを用いて評価した。微生物群集の多様性と存在量は、α多様性を解析することで評価した。その結果、各群のマウスの糞便サンプルのACE指数には違いがみられ、腸内細菌叢の種の豊富さが腫瘍の発生や治療中に変化していることが示された（図6A）。腸内細菌叢のβ多様性をPCoAおよびNMDSで解析したところ（図6B,C）、ALA群およびALA＋PD-1群の腸内細菌叢の微生物群集構造は、他の群とは劇的に異なっていた。さらに、多様な群のマウスの腸内細菌組成を解析した。まず、ベン図（図6D）によると、各群で45種の中核種が観察され、SHAM群、MODEL群、ALA群、PD-1群、ALA＋PD-1群における特定種の数は、それぞれ1、5、3、3、4であった。門レベルでは、SHAM群に比べてMODEL群では、ファーミキューテス属とシアノバクテリア属の割合が有意に減少（いずれもP＜0.05）したが、プロテオバクテリア属の割合が増加（P＜0.05）した（図6G）。一方、ALA群ではMODEL群に比べてProteobacteriaの割合が有意に減少した（P＜0.05）（図6H）。次に、MODEL群と併用療法群における腸内細菌組成を解析したところ、併用療法はProteobacteriaの存在量を減少させた（P＜0.05）（図6I）。PD-1群と比較すると、併用療法群では、ファーミキューテス類の割合が有意に増加したが、アクチノバクテリオータは有意に減少した（すべてP＜0.05、図6J）。

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図6. ALAリッチFOと抗PD-1抗体はHCCマウスの腸内細菌叢の組成を調節した。(A）各群のAce指数。(B）PCoA解析。(C）NDMS解析。(D）ベン図。(E）門レベルでの微生物種の相対存在量。(F）属レベルでの微生物種の相対的存在量。門レベルでの細菌の違い。SHAM群とMODEL群の比較（G）、MODEL群とALA群の比較（H）、MODEL群とALA＋PD-1群の比較（I）、PD-1群とALA＋PD-1群の比較（J）。属レベルで有意に多い細菌。SHAM群 vs. MODEL群（K）、MOEDL群 vs. ALA群（L）、MODEL群 vs. ALA + PD-1群（M）、PD-1群 vs. ALA + PD-1群（N）。データは平均値±SDで表した。

微生物群集の属レベルに対するALAリッチFOの栄養補給の効果をさらに評価するために、我々はWilcoxon順位和検定を用いて、上位18の異なる細菌属を同定した（図6F）。SHAM群と比較すると、Escherichia-ShigellaおよびOscillibacterの存在量が有意に増加し（すべてP < 0.05）、MODEL群ではnorank_f_norank_o_Clostridia UCG-014、Monoglobusおよびnorank_f_norank_o_Gastranaerophilalesの存在量が有意に減少した（すべてP < 0.05、図6K）。また、同じ方法でMODEL群とALA介入群との間で異なる豊富な細菌属を検出した（図6K）。MODEL群に比べ、ALA群ではEscherichia Shigellaの菌量が有意に減少した（P＜0.05、図6L）。さらに、MODEL群と併用療法群との間で異なる菌属数を解析した結果、norank_f_norank_o_Clostridia UCG-014とnorank_f_norank_Clostridia_vadinBB60_groupは併用療法群で増加し、Escherichia-Shigellaは有意に減少した（すべてP＜0.05、図6M）。重要なことは、PD-1群と併用療法群で異なる菌属数を解析した結果、併用療法はPD-1群と比較して、Enterorhabdus属、Lactococcus属の菌数を著しく減少させ（すべてP < 0.05）、Turicibacter属を増加させることが明らかになったことである。(P < 0.05、図6N）。

3.11. 食餌性 ALA リッチサプリメントとの併用投与はマウスの腸内代謝における SCFA を増加させた。
腸内代謝産物SCFAsは腸管バリア機能に大きな影響を与え、肝細胞癌の発生や進展に負の関連性さえ持つことが報告されている。そこで、GC-MSを用いてマウス糞便中のSCFAを検出したところ、主に酢酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸、プロピオン酸、イソ吉草酸が検出された。TICクロマトグラムは、各 種のSCFAを明確に区別でき、明確なピーク形状を示したことから、本手 法とデータが信頼できるものであることが示された（図7A）。クラスターヒートマップは、多様なグループ間のSCFA含量の違いを示した（図7B）。その結果、ALA群では酢酸、酪酸、吉草酸の量がMODEL群に比べて有意に増加していた（いずれもP＜0.05）（図7C-E）。さらに、酢酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸およびイソ吉草酸の併用療法群における割合は、PD-1群またはMODEL群における割合と比較して、顕著に増加した（すべてP＜0.05）（図7C-H）。

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図7. ALAリッチFOはHCCにおいて酢酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸の腸内含量を増加させた。(A）糞便サンプルのクロマトグラム。(B）ヒートマップクラスタリング。(C）酢酸。(D）酪酸。(E）吉草酸。(F）イソ酪酸。(G）プロピオン酸。(H）イソ吉草酸。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

3.12. 腸内細菌叢、腫瘍免疫、腸内代謝産物間の相関分析
さらに、Spearmanの相関を用いて、細菌、腫瘍免疫、腸内代謝産物間の相関を解析した、 norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcus、Monoglobus、unclassified c BacteroidiaはCD4+T細胞およびCD8+T細胞と正の相関を示し、Escherichia-ShigellaおよびEubacterium_brachy_groupは負の相関を示した。Enterorhabdus、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group、MonoglobusはPD-1+ Tリンパ球と負の相関を示した。さらに、Enterorhabdus、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、Turicibacter、norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcus、Monoglobus、unclassified_c_Bacteroidiaは、TNF-αおよびIFN-γと正の相関を示したが、IL-10およびTGF-β1とは負の相関を示した（図8A）。腸内細菌叢と腸内代謝産物の相関分析では、差次的SCFAはそれぞれEubacterium brachy_groupおよびLactococcusと負の相関を示した。ルミノコッカスはZO-1と正の相関があった。Escherichia-ShigellaはCloudin-4と負の相関を示した。また、パラバクテロイデス（Parabacteroides）は吉草酸（valeric acid）と負の相関があった（図8B）。以上の結果から、ALAが豊富なFOは腸内細菌叢を介した経路で抗PD-1の治療効果を増強する能力があることが示唆された。

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図8. 腸内細菌叢、Tリンパ球および腸内代謝産物間の相関解析。(A）多様なグループにおけるTリンパ球およびサイトカインと腸内細菌叢の相関。(B）多様なグループにおける腸内細菌叢と腸内代謝産物との相関。データは平均値±SDで表した。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。赤は正の相関、青は負の相関を表す。(この図の凡例における色の言及の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)

1. 考察
   多くの種類の悪性腫瘍に有効であることが証明されているPD-1阻害剤の使用は、臨床応用におけるがんの主要な治療戦略となっているが、その奏効率は依然として改善される必要がある。そのため、PD-1阻害剤の奏効効率向上を目的とした併用療法が試みられている。最近の臨床的および実験的研究において、ω-3 PUFAの摂取はがんの制御において多面的な利点を示している（Liebigら、2019、Yangら、2013）。植物由来のω-3 PUFAsの供給源である食事性ALAリッチFOは、乳がん（Godazandeh, Ala, Motlaq, Sahebnasagh, & Bazi, 2021）、大腸がん（Salim, Abou-Shafey, Masoud, & Elgendy, 2011）などの抗がんアプローチとして広く用いられており、食事性FOの信頼性が確認されている。そこで本研究では、新たな複合介入法であるALAリッチFOと抗PD-1療法を組み合わせた食事療法の改善効果を主に肝細胞がんモデルマウスで評価し、T細胞の表現型やサイトカインの分泌について機構学的に詳細に観察した。その結果、ALAを豊富に含むFOと抗PD-1療法の併用は、免疫療法、腸内細菌叢及びその代謝産物を調節することにより、肝腫瘍の発生を優先的に抑制することが示唆された。

本研究により、ALAリッチFOと抗PD-1療法を併用した場合、BALB/cマウスの肝細胞癌モデルにおいて、ALAリッチFOは腫瘍重量と腫瘍体積を減少させ、抗PD-1療法は腫瘍増殖を抑制することが明らかになったが、ALA群では有意な発現低下は認められなかった。ALAリッチFOを抗PD-1療法と同時に投与した場合、抗PD-1単独療法と比較して、腫瘍体積および腫瘍重量の減少が有意に増強されたことから、ALAリッチFOの食餌投与が肝細胞癌における抗PD-1療法の効果を促進する可能性が示唆された。興味深いことに、ALAが豊富なFOは、HER2過剰発現乳がんに対するトラスツズマブの治療効果を高めることが以前に報告されている（Mason, Fu, Chen, & Thompson, 2015）。さらに、ALAはMCF-7乳がん細胞においてシスプラチン誘導酸化毒性およびアポトーシスを刺激することが報告されている（Deshpande et al.） したがって、ALAは子宮頸がん患者の治療効果を高めるために化学療法の補助薬として示唆される可能性がある。しかしながら、ALAリッチFOが肝細胞癌におけるPD-1効力を増強する具体的なメカニズムについては、さらに検討する必要がある。さらに、起こりうる副作用を評価するため、体重を測定したが、ALAリッチFOを投与したマウスと併用療法を行ったマウスの間に有意差は認められなかった。

CD8+ CTLとCD4+ Th1細胞は、T細胞免疫効果の重要な構成要素として確立されている。優勢な適応細胞性免疫エフェクター細胞に関するCD8+ T細胞は、腫瘍細胞に対する防御免疫において重要な役割を果たしている（Tedeschiら、2022）。CD8+ CTL細胞は、パーフォリン、グランザイムおよび他の殺傷メディエーターを分泌することによる細胞傷害性によって腫瘍細胞を直接殺傷することができ、これは殺傷効果の主なメカニズムの1つであるが、CD4+ Th1細胞は、細胞傷害性を媒介するIFN-γ、TNF-αおよびIL-2サイトカインの相乗的分泌によって免疫的役割を果たす可能性がある(Cremonesi et al., 2018)。Tregsのような一部の免疫抑制細胞は、免疫抑制サイトカインTGF-β1およびIL-10を分泌することにより、CD8+CTLの抗腫瘍活性を損なう(Zhao, Korangy, & Greten, 2012)。本研究では、フローサイトメトリーにより、ALAリッチFOと抗PD-1療法を併用することで、HCCマウスにおいて全T細胞のCD3+、Tヘルパー細胞のCD4+、CTLサブセットのCD8+の割合が有意に増加することが明らかになった。同時に、免疫組織化学的およびqPCRの結果から、腫瘍CD4＋およびCD8＋T細胞の発現は併用介入後に増加し、PD-1は有意に減少したことが示された。われわれの予想に反して、併用療法は腫瘍組織におけるPD-L1の発現を増加させた。これは腫瘍の免疫抑制に関係するが、PD-L1の高発現はCD8+T細胞の増加と関連し、HCCにおけるより良好な病勢コントロール率と関連することが研究で示されている（Moritaら、2021）。さらに、ALAリッチFOと抗PD-1療法の併用は、血中のCD4+CD25+ Treg細胞を減少させた。さらに重要なことに、この併用療法は、IL-10とTGF-β1の免疫抑制レベルを同時にダウンレギュレートし、腫瘍組織におけるTNF-αとIFN-γの発現をアップレギュレートする能力を示した。これらの結果から、ALAリッチFOと抗PD-1療法の併用は、肝細胞癌マウスの全身および局所における抗腫瘍免疫応答を促進することが示された。ROS（活性酸素種）は酸素代謝の産物であり、化学的に活性な物質の一群を発揮する。活性酸素はさまざまな経路を活性化して腫瘍細胞死を媒介し、腫瘍の支持と血液供給を行う間質細胞にも影響を与える（Cheung & Vousden, 2022）。しかし、活性酸素の抗腫瘍効果には一定の濃度依存性があり、高濃度の活性酸素は腫瘍細胞死を誘発する。逆に、低濃度の活性酸素は腫瘍細胞の増殖を促進する可能性がある（Weinbergら、2010）。われわれの研究では、MDA値に有意な変化はみられず、脂質過酸化過程が有意に生じていないことが示された。しかし、細胞の抗酸化酵素の代表であるSOD値は、併用療法群で有意に上昇した。そして、抗酸化効果が併用療法群で観察されたことは、おそらくALA補充に起因すると考えられる（Zhu et al.）

ALAリッチFOと抗PD-1療法の併用が、肝細胞癌の有意な改善と腫瘍局所微小環境および全身循環における免疫応答の増強に有益な効果を示すことを確認した後、併用療法が腸内細菌叢に及ぼすメカニズム的影響をさらに検討した。ALAを豊富に含む食事は、腸内細菌叢の恒常性を回復させ、腸内細菌叢の異常を是正することが、我々の研究室を含め、これまで実証されてきた。さらに、多くの研究により、腸内細菌叢が肝細胞癌の発生と発症、およびその免疫反応に密接に関係していることが明らかにされている（Huら、2023年、Leeら、2022年）。Eleonora(Cremonesiら、2018年)は、CRC細胞において、予後に有利な意義を持つT細胞集団をリクルートする走化性因子の産生を誘導する腸内細菌叢の能力を発見した。Yuら(Yu et al., 2020)は、腸内細菌叢異常症が、炎症性CD8+ IFN-γ+ T細胞の誘導を介して、炎症に関連した結腸腫瘍形成に対する感受性の亢進につながり、腫瘍微小環境内でのT細胞消耗の亢進につながる可能性があることを示している。本研究では、Bacteriodetes属とFirmicutes属が多様なグループにおいて優勢であることを見いだしたが、これは先行研究（Gomes et al.） PD-1群におけるFirmicutesの減少は、ALAリッチFOと抗PD-1投与との併用により是正され、同時にActinobacteriotaも減少したことから、ALAリッチ食餌投与との併用療法は、門レベルで優勢なFirmicutesとActinobacteriotaを増加させることにより、腸内細菌叢を顕著に調節できることが示唆された。

特に、属レベルでは、ALAリッチFOと抗PD-1投与との組み合わせは、PD-1群と比較して、既知の有益な属（Turicibacter）の相対的な存在量を有意に増加させ、病原性とされる属（EnterorhabdusおよびLactococcus）の存在量を有意に減少させることにより、腸内細菌叢を形成した。Enterorhabdusは自然大腸炎モデルマウスから分離されたコリオバクテリア科の細菌である(Clavel et al., 2010)。さらに、肝線維症や慢性肝障害のマウスでは、エンテロラブダス菌の存在量が有意に高く、炎症と腸粘膜バリアーの損傷に寄与している(Liu et al., 2023)。過去20年間に、ラクトコッカス・ラクティスによる感染症が数例報告されている（Denholm et al.） このグラム陽性球菌はヒトに対しては非病原性と考えられている。しかし、まれに肝膿瘍や心内膜炎(El et al., 2021, Lahlou et al., 2023)、腹膜炎、腹腔内感染などの重篤な感染症を引き起こすことがある(Kim et al., 2010)。ツリシバクターは広くプロバイオティクスとみなされており、ツリシバクター属に属する細菌は消化管内の炎症を制御するのに役立っている(Amoah et al., 2023)。さらに、ツリシバクターはタイトジャンクション遺伝子を増加させ、腸管構造能力を著しく高めることが指摘されている（Flint et al.） さらに本研究では、Turicibacterの増加レベルはCD3+ T細胞およびCD8+ T細胞と正の相関があり、プロバイオティクスの抗腫瘍候補として作用する可能性がある。

報告されているように、腸内細菌異常症はしばしば腸管透過性の亢進を招き、粘液関連防御機能を弱めるため、腸の局所環境だけでなく、遠隔臓器、特に肝臓でも病気にかかりやすくなる（Ohtani & Hara, 2021）。腸内細菌異常症における病原性細菌由来のLPSは、腸内細菌叢と免疫反応に密接に関係している（Abdelhamidら、2023）。研究では、肝臓LPSの蓄積がHCCの病態を悪化させることが示されている（Laiら、2016、Orciら、2018）。われわれのデータは、ALAリッチFOと抗PD-1療法の併用により肝臓のLPSが顕著に減少したことを明らかにし、この併用介入は腸透過性を改善し、腸バリアを強化し、LPSの産生と肝臓への移行を減少させる可能性があることを間接的に示した。TJPのアップレギュレーションは、腸内の有益な細菌であるTuricibacterが著しく増加したことに起因すると考えられる。これらの細菌はこれらの遺伝子のアップレギュレーションを引き起こす能力を示すと報告されているからである（Flint et al.） これまでの研究で、LPSは重要な病原性因子および防御抗原として、様々な病態において細菌が腸管粘膜バリアを突破して血液に入り、門脈系に侵入するのに同伴することが示されている、 腸-肝軸」代謝経路を通じて肝細胞の自然免疫および適応免疫応答に関与し、様々な病的微小環境における免疫炎症損傷機構を通じて肝硬変の進行および肝細胞癌の形成を促進する（Ohtani & Hara, 2021）が、正確なエビデンスについてはさらなる研究が必要である。

本研究では、「腸-肝軸」を介した腸内細菌因子と肝臓の相互作用に注目した。腸内細菌叢代謝産物の重要な一種であるSCFAは、微生物叢と宿主のホメオスタシスをつなぐものとして、免疫反応と腸管バリア機能の調節に重要な役割を果たしている（Saleriら、2022）。SCFAはGタンパク質共役型受容体であるGPR43およびGPR109A（HCAR2）に様々な親和性で結合し、代謝における細胞効果や免疫機能の変化を促進することができる。しかしながら、ALAを多く含むFOと抗PD-1療法の併用が肝細胞癌におけるSCFAsに及ぼす影響については、これまでほとんど知られていなかった。本研究では、併用介入後に酢酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸の濃度が有意に上昇した。これらの結果は、ALAリッチFOと抗PD-1療法の併用により、SCFAが肝細胞癌の改善にプラスの役割を果たすことを示していた。さらに、SCFAの免疫調節作用は、特異的細胞受容体GPR41、GPR43および主要腸管受容体GPR109aの活性化によるものかもしれない（Xiaら、2020）。さらに、SCFAの細胞内標的は樹状細胞のヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性を阻害してTregの分化を誘導するか、GPR43依存的にCD41 T細胞に直接作用してTregの分化を促進することができる（Tan, Macia, & Mackay, 2023）。そのほか、SCFAは、モノカルボン酸トランスポーター-1（MCT-1）とナトリウム共役モノカルボン酸トランスポーター-1（SMCT-1）の腸粘膜受容体を介して腸管TJPの増加を促進し、LPSの肝臓循環への移行を阻害し、最終的に肝臓がんを抑制する（Wangら、2023）。以前の研究では、SCFA代謝の調節は免疫療法の効果を高める可能性があるとされている（Houら、2022年）。しかし、どのSCFA代謝産物が肝細胞癌に関与しているのか、またその可能性のある制御機構を正確に特定するためには、さらなる研究が必要である。

研究助成
本研究は、中国国家自然科学基金（助成金第82260800号、第82160691号）、中国寧夏重点研究開発計画（助成金第2021BEG03058号、第2023BEG02011号）、中国寧夏腸内恒常性・慢性疾患予防治療科学技術革新チーム（助成金第2022BSB03112号）、中国寧夏自然科学基金（助成金第2022AAC03523号）の助成を受けた。

施設審査委員会の声明

動物実験は寧夏医科大学動物倫理委員会（IACUC-2023-006）の承認を得た。

倫理声明
動物実験は寧夏医科大学動物倫理委員会（IACUC-2023-006）の承認を得た。

CRediT著者貢献声明
Jian Liu: 執筆 - 査読と編集, 執筆 - 原案, バリデーション, ソフトウェア, 方法論, データキュレーション, 概念化. Yiwei Li: 原稿執筆、ソフトウェア、方法論、データキュレーション。Wenke Shen: 方法論。ティン・ワン 方法論。Yuanyuan Liu: 方法論。Junbai Ma: 方法論、ソフトウェア。張暁秀： 概念化、資金獲得、監修、検証。ティン・リー：資金獲得。田文燕： 方法論。Xiaolong Ma：方法論。リナ・チャン：方法論： 方法論。Ke Li：方法論。李明：資金獲得。張暁霞： 概念化、資金獲得、監修、検証。Qing Liu：概念化、資金獲得、検証。ハオ・ワン Hao Wang：概念化、資金獲得、プロジェクト管理、監督、検証、執筆-原案、執筆-査読・編集。

利益相反宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる既知の競合する金銭的利益や個人的関係がないことを宣言する。

付録A. 補足資料
以下は本論文の補足資料である：
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これらの著者は本研究に等しく貢献した。

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