TRAF3の抑制はB細胞の動員を促し、卵巣癌を持つ微生物感染マウスの生存を延長させる

Jonathan Zorea, Yair Motro, Roei D. Mazor, Yifat Koren Carmi, and 4 more

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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2555950/v1

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ステータス
査読中

実験と臨床の癌研究ジャーナル

第1版
2023年2月14日掲載

3

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要旨
背景

卵巣癌は、婦人科系癌の中で最も死亡率の高い癌であることが証明されている。卵巣癌患者を対象とした免疫療法の臨床試験では、期待はずれの結果が得られており、この癌の治療における新たな免疫調節標的の同定が必要であることが強調されている。

研究方法

BRAC1およびTP53欠損マウスID8 OC細胞株（ITB1と命名）において腫瘍由来の免疫逃避メカニズムを同定するために、免疫不全（NSG）および免疫不活性野生型（WT）C57/BL6マウスのインビボCRISPRスクリーニングを実施した。ITB1細胞における遺伝子発現とシグナル伝達経路の活性化を確認するために、ウエスタンブロット、qPCR、免疫蛍光染色、フローサイトメトリーを採用した。また、ITB1保有マウスの腹膜に存在する免疫細胞集団を特定するためにフローサイトメトリーを用いた。ITB1搭載マウスの腹膜およびOC患者の腹水中のIgA被覆細菌の存在を明らかにするために、16S配列決定を採用した。差の検定は、Deseq2検定および二元配置分散分析検定を用いて行われた。配列変異（ASV）はQiime2で作成し、microecoおよびphyloseq Rパッケージで解析した。

結果

ITB1細胞において、腫瘍由来の免疫抑制メディエーターとしてtumor necrosis factor receptor-associated factor 3 (TRAF3)を同定した。TRAF3のノックアウト（TRAF3KO）は、I型インターフェロン経路を活性化し、MHC-Iの発現を増加させた。TRAF3KO腫瘍は、WTマウス対NSGマウスで増殖遅延を示し、ITB1腫瘍と比較してB細胞の浸潤および活性化の増加と相関していた。B細胞はTRAF3KO腫瘍の進行に関与しており、B細胞表面結合型および分泌型IgAレベルは、ITB1腫瘍と比較してTRAF3KO腫瘍の腹水中で有意に高かったことが判明した。B細胞の活性化およびWTマウスにおけるTRAF3KO腫瘍の進行遅延には、常在細菌の存在が必要であった。最後に、OC担癌マウスの腹水やOC患者の腹水において、IgA被覆細菌のユニークなプロフィールを観察した。

結論

TRAF3は、B細胞の浸潤と活性化に影響を与える腫瘍由来の免疫抑制性モジュレーターであり、腫瘍における抗腫瘍B細胞応答を増強するターゲットとなり得る。

TRAF3

B細胞

BRAC1変異卵巣がん

IgA

マイクロバイオーム

図

図1
図1

図2
図2

図3
図3

図4
図4

図5
図5

背景
何十年もの間、卵巣癌（OC）は、世界中の女性に最も多く発生し、死亡率の高い癌の10位以内に常にランクインしています[1]。卵巣癌の大部分は高悪性度の漿液性癌に分類され、その約50％は相同組換え（HR）修復遺伝子に変化を生じている[2]。ほとんどのOC患者がステージIII（51％）またはIV（29％）で診断されるため［3］、手術、化学療法、標的治療（VEGFおよびPARP阻害剤、FRα抗体薬物複合体）などの現在承認されている治療法は、無増悪生存期間の改善に寄与していますが、全生存期間に大きな影響を及ぼしていません［4］。また、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、そのリガンドであるPD-L1、または細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）を阻害する薬剤などの免疫療法に対する奏効率もOC患者では低い（5.9～12.3%）［5, 6］．したがって、OC患者の治療のための新たな免疫標的を明確にすることが緊急に必要とされています。

OCにおけるT細胞の役割に焦点を当てた臨床研究が期待はずれの結果をもたらす一方で、OC腫瘍微小環境（TME）におけるB細胞の役割は、ますます注目されています[7]。OC患者の腹水への制御性インターロイキン（IL）-10産生B細胞の浸潤は、全生存率の低下と相関しており [8]、一方、免疫グロブリン産生プラズマ細胞（IgGs [9, 10] および IgAs [11] ）の浸潤は患者生存率の向上と正の相関が認められた。このように、腫瘍におけるB細胞の重要性は認識されつつあるが、様々な要因が腫瘍内における特定のB細胞集団の浸潤および活性化にどのように影響するかは、まだ十分に理解されていない。

B細胞は、抗原刺激およびコスティミュレーションシグナルに応答してIgAを発現し、主にウイルスおよび細菌に対して機能することが知られている[12]。そのため、細菌-細胞相互作用は様々な疾患において広く研究されており（[13]に総説あり）、乳癌の研究では、粘膜IgAで被覆された細菌がエストロゲン値と有意に関連していることが判明している[14]。OCにおいては、BRCA1変異OC患者において、特定の細菌種が腫瘍の進行に関連するといういくつかの研究があるが[15, 16]、その具体的なメカニズムは依然として不明である。

本研究では、TP53 および BRCA1 遺伝子の機能を欠損させた ID8 マウス腫瘍細胞株モデル（ここでは ITB1 と呼ぶ）を用いて、腫瘍由来の新たな免疫抑制メディエータ、腫瘍壊死因子受容体関連因子 3 （TRAF3）を同定した。偏りのない標的遺伝子スクリーニングにより、TRAF3が免疫調節因子として働き、B細胞の抗腫瘍活性を抑制することで免疫逃避を促進することを明らかにしました。また、B細胞の抗腫瘍活性が腸内細菌叢と密接に関連していることを明らかにした。

研究方法
細胞株

ID8マウス卵巣表面上皮細胞株の改良型、ID8-gTRP53-gBRCA1（ITB1）は、Iain A. McNeish博士［17］からMTA契約のもとで入手した。この細胞株は、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％l-グルタミン、200mM、およびペニシリンとストレプトマイシン各100単位を補充したDMEM培地を用いて、5％CO2の加湿雰囲気中、37℃で維持された。マイコプラズマの感染は定期的にモニターし、必要に応じて抗生物質（De-Plasma、TOKU-E、D022）を培養液に添加した。

gRNAプールライブラリーの作製

マウスID8-gTRP53-gBRCA1-Cas9細胞株は、レンチウイルスCas9-Blastベクター（Addgene #52962）をパッケージングプラスミドpCMV-dR8.91およびpCMV-VSV-G（Addgene #8454）とHEK293T細胞へ共導入することにより生成された。48時間のトランスフェクションの後、ウイルスを採取し、その力価を測定した。その後、Cas9-Blastレンチウイルスは、ID8-gTRP53-gBRCA1細胞の一晩感染に使用するまで-80℃で保存した。日後に5μg／mLのブラストサイジンを用いたセレクションを行った。Cas9活性の高いクローンを獲得するために、ID8-gTRP53-gBRCA1-Cas9細胞に対して、96ウェルプレートへのシングルセルソーティングを行った。その後、CD274とmCherryに特異的なgRNAを発現させたレンチウイルスを複数のクローンに感染させた。感染後10日目に、各クローンを10ng/mLのインターフェロン（IFN）gで24時間刺激し、抗CD274抗体を用いてFACSによりPD-L1の発現を測定した。Cas9編集の効率は、形質導入された集団におけるPD-L1陰性細胞の割合を測定することによって決定された。

79,637のgRNAからなるマウスCRISPRブリーレンチウイルスプールライブラリーを、パッケージングプラスミドpsPAX2 #12260およびpCMVSV-G #8454と共導入してHEK293T細胞へ導入した。 トランスフェクションの6時間後に、培地をウイルス産生をサポートする培地（20％のFBSを添加したDMEM）に交換した。48時間後、レンチウイルス培地を採取し、-80℃で保存した。インビボ実験に使用する前に、ID8-gTRP53-gBRCA1-Cas9細胞は、以下の「インビボ実験」のセクションに記載するように、0.06の感染倍率（MOI）でブリーレンチウイルスに感染し、注入前に少なくとも10日間ピューロマイシンにより選択された。

ノックアウト細胞株の作製

ノックアウト株を作製するために、ゲノムスケールCRISPR-Cas9ノックアウト（GeCKO）プロトコルに従った[19]。オリゴは、gRNAライブラリープールで提供されたものと同じ配列を用いて設計し（「gRNAプールライブラリーの作製」に記載）、T4 PNKリガーゼでリン酸化してアニーリングさせた。レンチウイルスCRISPRプラスミドを、BsmBI制限酵素を用いて消化および脱リン酸化し、アニールされたオリゴをレンチCRISPRv2ベクターにライゲーションさせた。このプラスミドをstbl2細菌に形質転換し、アンピシリン選択（100 µg/mL）を用いて陽性コロニーを選択した。陽性コロニーを拡大し、QIAGEN® Plasmid Plus Midi Kitを使用してプラスミドDNAを単離した。このプラスミドDNAを用いてレンチウイルスを作成し、ITB1細胞株に感染させ、目的の遺伝子改変を発現する新しい株を作製した。この目的のために、2つのTRAF3ガイド、5-CAGGTTCACGTGCTGTACCG-3と5-CGGTACAGCACGTGAACCTG-3を使用して、2つの安定したITB1 TRAF3ノックアウト（KO）クローンを作成し、それぞれTRAF3KO1およびTRAF3KO2と命名した。

ウェスタンブロット解析

すべての細胞をセルスクレイパーで採取し、氷冷PBSで洗浄した。ホスファターゼ阻害剤カクテル（BioTools、B15001A/B）とプロテアーゼ阻害剤（Millipore Sigma、P2714-1BTL）を添加した溶解バッファーを用いて細胞を溶解し、氷上に30分間置いた後、3分間の超音波による細胞破砕を行った。溶解した細胞を14,000rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清を回収した。Bradford assay（Bio-Rad, Protein Assay, cat# 500-0006）を用いてタンパク質濃度を測定し、各サンプルから1μg/μLの全細胞タンパク質を用いてPAGEを行い、PVDF膜（Bio-Rad、1704157）上にトランスファーした。メンブレンを5% BSA (AMRESCO, 0332-TAM) in TBS-T [Tris-buffered saline (TBS)-Tween 20 (0.1%)] のブロッキング溶液に1時間浸し、5% BSA と 0.1% Tween で希釈した一次抗体と一晩ハイブリダイズさせた。翌日、ブロッキング液で希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体（1:20,000、Jackson）と共にメンブレンをインキュベートした。強化化学発光（ECL）（Westar Nova 2.0 Cyanagen XLS071.0250）を用いて化学発光反応を発現させ、Azure Biosystemsカメラシステムで画像を取り込んだ。核および細胞質分離のために、Rockland Nuclear & Cytoplasmic Extract Protocol [18]に従った。簡単に言えば、細胞を低塩溶解バッファーで溶解し、核タンパク質を無傷のまま、細胞質タンパク質を溶解させた。次に、高塩分の溶解バッファーを用いて、核膜と核タンパク質を溶解させた。核画分にのみ存在するはずのヒストンH3に対する抗体を用いて、分離の質を確認した。

RNAの単離とリアルタイム定量PCR

total RNAの単離とcDNAへの変換は、それぞれISOLATE II RNA Mini Kit (Bioline, BIO-52073) とqScript cDNA synthesis kit (Quanta Bioscience, 95047-100) を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって実施した。cDNAとFast SYBR qPCR Master mix (BioGate, EZ60)をIDTのカスタムプライマーセットとともに混合し、Roche light cycler 480 IIマシンでqPCR分析を行った。

フローサイトメトリー

単離した細胞を抗CD16/32（抗FcγIII/II受容体、クローン2.4G2）で4℃、10分間ブロッキングした。その後、ゾンビ・アクア™固定化生存率色素を用いて、室温で15分間インキュベートすることにより、死細胞を同定した。次に、細胞を目的の抗体と一緒に4℃で20-30分間インキュベートすることにより、表面マーカーを染色した。染色された細胞はCytoFLEXフローサイトメーターを用いて解析し、結果はCytExpertソフトウェアを用いて分析した。

細胞内サイトカイン染色では、まず細胞をPMA（25 ng/mL）、イオノマイシン（1 μM）、ブレフェルジンA（5 μg/mL）で5～6時間培養し、細胞内サイトカイン染色シグナルを増加させた。その後、表面マーカーを染色し、4％パラホルムアルデヒドを用いて室温で20分間細胞を固定した。細胞を透過化バッファー（1´）（eBioscience、00-8333-56）を用いて透過化し、細胞を20分間インキュベートすることにより細胞内染色を実施した。その後、CytoFLEXフローサイトメーターで細胞を解析した。

インビボ実験

6〜8週齢のNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, Jackson labs）および野生型（WT）C57/BL/6マウス（Envigo, Huntingdon, UK）を用いてin-vivo実験を実施した。マウスは、空気でろ過された層流キャビネットに収容し、餌と水を自由に摂取させた。動物実験は、動物の福祉を確保し、不快感を最小限に抑えるために、Ben-Gurion University of the NegevのInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）が定めたプロトコルに準拠して実施された。本研究で使用した動物倫理クリアランスプロトコル番号はIL-23-05-2020(E)である。

結果のセクションに記載されているように、WTおよびNSGマウスを用いて2つの異なる実験を行った。ITB1生成疾患の進行における抗腫瘍免疫の役割を調べるように設計された実験では、WTおよびNSGマウスに、それぞれ400万〜500万個のITB1細胞を腹腔内（i.p.）に注射した。ITB1細胞における潜在的な免疫調節因子を同定するための別の実験では、WTマウスとNSGマウスに、gRNAライブラリーを発現するITB1細胞400万〜500万個を注射し、その結果、WTマウスとNSGマウスの両方が、ITB1細胞における免疫調節因子を同定した。

2つの実験は、WTマウスのみで行われた。1つ目は、OCにおけるマイクロバイオームの関与を調べるために、WTマウスの1群を抗生物質カクテル（ABX）で2週間前処理し、TRAF3KO細胞注入前に全マクロバイオームを枯渇させることを目的とした。これは、アンピシリン（1 g/mL）、バンコマイシン（0.5 g/mL）、硫酸ネオマイシン（1 g/mL）、メトロニダゾール（1 g/mL）を飲料水に加え、2日ごとに水を交換することで達成された[20]。飲料水へのABXの補充は、全実験を通して継続した。他の2群のWTマウスには、ITB1またはTRAF3KO細胞を注入し、全実験を通じて通常の飲料水（ビヒクル）を与えた。FACS実験のために、WTマウスは注射の2週間後に犠牲にし、腹腔をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、内容物を回収した。

すべての生存実験において、マウスの体重を1週間に1回モニターし、体重が20％増加した時点でマウスを犠牲にし、腹水の発生を示唆した。腹水は細菌や腫瘍細胞を分離するために採取された。また、消化器官および生殖器官を採取し、組織学的解析を行った。

細菌DNAの抽出

細菌 DNA は、腹水または PBS 洗浄液から、修正フェノール-クロロホルムプロトコルを用いて単離した [21]。簡単に言えば、サンプルをフェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコール（IAA）を含む溶解バッファで溶解し、次に細菌破壊ビーズ（RPI、9833）で1分ずつ2サイクル、ビーズビートすることによってホモジナイズした。水相とフェノール相を遠心分離により分離し、水相を滅菌チューブ中のIAAに再懸濁させた。その後、イソプロパノール沈殿とエタノール洗浄を用いて、細菌DNAを濃縮・単離した。汚染を最小限に抑えるため、無菌状態で使用し、環境のサンプリングや道具の収集により陰性対照をとった。

IgA+菌とIgA-菌のソーティング

同居マウスから上記のPBS洗浄液を採取した後、8,000 ´ g、4℃で5分間遠心分離した。その後、ペレットを20％正常ラット血清を含むブロッキングバッファー100μLに再懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。その後、フィコエリスリン（PE）標識抗マウスIgA（1：12.5；eBioscience clone mA-6E1）を含む100μLの染色バッファーを用いて、氷上で30分間染色した。この後、1mLの染色バッファーで3回洗浄した。次に、抗IgAで染色した細菌を、50μLの抗PE磁気活性化セルソーティング（MACSÒ）ビーズ（Miltenyi Biotec）を含む1mLの染色バッファで4℃、15分間インキュベートした。最後に、1 mLの染色バッファーを用いて8,000 ´ g、4℃で5分間、2回洗浄し、MACSを用いてソーティングを行った。IgA陽性サンプルとIgA陰性サンプルは、将来の使用のために-80℃で保存した。

塩基配列の決定と塩基配列の解析

ゲノムスケールCRISPR-Cas9ライブラリーは、250bpペアエンドチップを用いてIllumina MiSeqプラットフォームで配列決定された。配列はcaRpools R-package[22]の修正版を用いてマッピングされた。正規化されたgRNAカウントテーブルをDeseq2にロードし、平均log2 fold changeと偽発見率（FDR）に基づいて上位の差分遺伝子を決定することにより、差分発現ガイドが同定された。スクリーニングで濃縮または枯渇した有意な経路を同定するため、ReactomePA [23] Rパッケージを使用して、log2 fold change <(-1) の閾値を持つ遺伝子を含む遺伝子セット濃縮解析を実施した。

マウスの腹水から分離した細菌DNAのV3-V4領域を増幅するために、Holmら[24]が発表した2段階PCRベースのプロトコルに従った。その後、アンプリコンをIllumina MiSeqプラットフォーム（MiSeq Reagent Kit v2、250-bp paired-end）を用いて塩基配列を決定した。FastQC (Version 0.11.8) [25] および MultiQC (Version v1.7) [26]を用いて、脱多重化したシーケンシングリードの品質チェックを実施した。アダプター、プライマー、低品質リードは、Fastp (Version 0.2, defaults parameters) [27]を用いて除去しました。Qiime2 version 2021.11 [28]を用いて配列をノイズ除去し、SILVAデータベース version 138, 99% NR [29]を用いて分類表を作成し、amplicon sequence variant (ASV) tableを作成した。汚染配列は、decontam パッケージ (Version 1.12) [30] と squeegee ツール (Version 0.1.3) [31] を用いて、コントロールサンプルと配列の普及率に基づいて特定および削除されました。ASV表のさらなる解析は、R（バージョン4.1.1）のMicroEcoパッケージ（バージョン0.11）［32］とphyloseqパッケージ（バージョン1.38）［33］を用いて行われた。

OCの女性からの腹水についても同様の概念実証分析が行われた（「結果のセクション」参照）。

統計解析

in-vitro 実験は最低 2～3 回繰り返し、代表的なデータ/画像を「結果」の項に示した。In-vivo 実験では、1 群あたり最低 5 匹のマウスを使用した。統計解析はGraphPad Prism 9 ソフトウェアを用いて行い、結果は平均値±SEMで示した。2群以上の実験では、Tukeyの多重比較検定を伴う二元配置分散分析が用いられた。0.05、0.01、0.001、または0.0001のp値の有意水準を算出し、それぞれ*、、、または****で図に示した。

結果
CRISPRスクリーニングにより、TRAF3がBRCA1変異OCの免疫調節因子として同定された。

ITB1が生成する疾患のin vivoでの進行における抗腫瘍免疫の役割を調べるため、免疫不全のNSGマウスと免疫不全のWTマウスの両方にITB1細胞をi.p.注入し、これらの腫瘍担持マウスの生存をモニターした（図1A）。ITB1細胞は単一の腫瘍塊を形成せず、むしろ腹膜に広がる疾患を引き起こし（免疫組織化学染色で確認できる）、腹水の著しい蓄積も生じた（図S1A）。WTマウスとNSGマウスの悪性疾患の発症率には有意差があったが、生存期間中央値はわずか8日の差しかなかった（生存期間中央値41日 vs. 49日）。したがって、ITB1細胞は、WTマウスの抗腫瘍活性を抑制する内在性免疫逃避機構を持ち、迅速な腫瘍の進行を可能にすると結論づけた。

このような免疫逃避の原因となるITB1細胞の潜在的な免疫調節因子を同定するために、既知の免疫調節因子の標的ガイドRNAライブラリー[34]を用いて免疫関連遺伝子パネルをノックアウトし、WTおよびNSGマウスでインビボスクリーニングを行った（Fig.1B）。具体的には、免疫担当のWTマウスでは腫瘍細胞の排除を促進するが、NSGマウスでは促進しない遺伝子を同定することを目指した。この目的のために、まず、ITB1細胞にCas9を発現するレンチウイルスベクターを導入し、Cas9編集効率が95％以上のクローンを同定する目的で、単細胞クローンを作製した。編集効率を調べるために、IFNg刺激後にPDL1を標的とするgRNAを過剰発現する単一クローンをPDL1用に染色した（図S1B）。96.5%の効率で同定されたクローン8を拡大し、完全なgRNAライブラリで形質転換した。このITB1ライブラリ発現クローンから産生されたアンプリコンを配列決定することにより、ライブラリの分布を確認した。免疫関連遺伝子313個を標的とする1878個のガイド（1遺伝子あたり6個のガイド）とコントロールとしての2000個のガイドからなる3878個のガイドのうち、4回以下のシークエンスだったのは500個のガイドのみであった。大半のガイドが10回以上配列決定されたことを確認した後（図S1C）、gRNAライブラリーを導入したITB1細胞をNSGマウスとWTマウスにi.p.注入した。腹水の生成によりマウスの体重が20%増加した時点で、腹水を排出し、細胞を回収し、gRNAの配列決定と解析のために全DNAを単離した（Fig. 1B）。NSGマウスとWTマウスで増殖した腫瘍細胞におけるgRNAの発現を比較したところ、NSGマウスではWTマウスと比較して有意に発現が異なる6つの遺伝子を見いだした。このうち、NF1とNF2の2つの遺伝子はWTマウスで、ARID4A、GM46125、OPRK1、TRAF3の4つの遺伝子はNSGマウスで有意に増加した（図1C）。注目すべきは、（ライブラリに表現されている6つのうち）2つ以上のガイドで表現されている遺伝子のみを対象としたことである。

マウスの抗腫瘍免疫に対してITB1細胞を感作しうる新しい腫瘍由来標的の探索を考慮し、WTマウスと比較してNSGマウスで増加しているgRNAとそのシグナル伝達経路に注目した。そこで、log2 fold changeの絶対値が1以上であるすべての遺伝子について、Reactomeパスウェイ解析を行った。その結果、Fig. 1Dに示した8つの濃縮パスウェイのうち6つにTRAF3が関与していることが判明した。TRAF3は最も発現量の差が大きく、主要組織適合性複合体クラスI（MHC-I）タンパク質の負の制御因子として、また免疫チェックポイント遮断に対する反応性の低さと関連していることが確認されているので［35］、ITB1-OCモデルにおいて免疫逃避の仲介におけるその役割をさらに検討することにした。

TRAF3の枯渇は、I型インターフェロン経路とMHC-Iの発現を活性化し、ITB1腫瘍の免疫原性を向上させる。

腫瘍由来のTRAF3が免疫逃避に及ぼす影響を明らかにするために、TRAF3KO1およびTRAF3KO2と名付けた2つの安定したITB1 TRAF3ノックアウト（KO）株を作成した（図2A）。まず、ITB1細胞とTRAF3KO1/2細胞のin vitroでの増殖および遊走能力を比較したところ、TRAF3KO1/2細胞の増殖率はわずかに低下していたが、創傷治癒アッセイで傷を塞ぐ能力には差が認められなかった（図2BおよびC）。TRAF3はNF-κB経路を制御することが知られているので[36]、ITB1細胞とTRAF3KO1/2細胞でp65とRelBの核タンパク質レベル、p100とp52の総レベル、IkBa、IL6、RelBのmRNAレベルを比較検討した。TRAF3KO1/2細胞では、Relbの発現で示される非正規NF-κB経路の最小限の活性化を除き、NF-κB経路の顕著な活性化は観察されなかった（図S2A）。TRAF3はI型IFNシグナルを媒介することも知られているので[36]、ITB1とTRAF3KO1/2細胞株でいくつかのIFN刺激遺伝子のmRNAレベルを比較したところ、IFN-β、ISG15、IRF7というI型IFN経路の主要3遺伝子のレベルが2つのTRAF3KO細胞株では著しく上昇していた (図2D). また、ウエスタンブロット解析によるTBK1とSTINGの核レベル（図2Eおよび図S2C）および免疫蛍光解析によるSTINGの核レベル（図2Fおよび図S2D）から、I型IFNの発現上昇はインターフェロン遺伝子刺激経路（STING）の活性化に関連していることが判明した。TRAF3KO1/2細胞株におけるI型IFNの強い活性化、およびMHC-I発現と腫瘍免疫の活性化に対するTRAF3の既知の関連は、腫瘍細胞の表面におけるMHC-I発現のレベルを調べることを促した。実際、TRAF3KO1/2細胞はITB1細胞と比較して高いレベルのMHC-Iを発現し、TRAF3KO1/2細胞の表面上のMHC-Iの発現は、IFN刺激ITB1細胞のそれとほぼ同じであった（図2G）。

次に、NSGマウスとWTマウスにTRAF3KO1（以降、TRAF3KO）細胞とITB1細胞を注射し、腹水の発生とマウスの生存を観察することで、腫瘍免疫抑制メディエーターとしてのTRAF3の役割の可能性を検証した。NSGマウスでは、TRAF3KO（33日）またはITB1（29日）を装着した腫瘍の成長遅延に有意差はなく、免疫系が活性化していない状態では同程度の速度で腫瘍が発生することが示されました。一方、WTマウスでは、ITB1腫瘍を持つマウスの生存期間中央値は38日であったのに対し、TRAF3KO腫瘍を持つマウスはほぼ3倍の期間、中央値で98日生存した（図2H）。NSGではなくWTマウスにおけるこのような生存率の違いは、TRAF3がITB1 OC細胞において、おそらくI型IFNのレベルを制御することによって免疫抑制的な調節因子として働くという仮説をさらに支持するものである。

OC細胞におけるTRAF3の抑制は、IgAを介したB細胞免疫応答を誘発する

免疫細胞がTRAF3KO腫瘍を排除あるいは増殖を抑える潜在的なメカニズムを調べるために、WTマウスにITB1あるいはTRAF3KO細胞をi.p.注入し、注入後2週間で腹腔を洗浄し、洗浄液中の免疫集団の特徴をフローサイトメトリーにより解析した。CD45+CD11b+の発現で決定される骨髄系集団の解析は、ITB1腫瘍に比べTRAF3KO腫瘍を持つマウスで減少を示した。F4/80、CD11c、LY6C/Gで染色した骨髄系サブセットの分類では、マクロファージ（CD45+CD11b+F4/80+）の割合がTRAF3KO腫瘍で著しく低く、一方で他の集団の割合が高いことが示された。樹状細胞（CD45+CD11b+CD11c+MHC-II+）、単球系細胞（CD45+CD11b+Ly6C+Ly6G-）、多形核細胞（CD45+CD11b+Ly6C-Ly6G+）骨髄由来抑制細胞（MDSCs）などの他の集団は2群のマウス間で大きな違いはなかった（Fig. 3A). リンパ球集団では、CD3+、CD8+ T細胞、およびNK細胞の割合に差はなかった。しかし、CD19+ B細胞とCD4+ T細胞の増加は観察された(Fig. 3B)。

TRAF3KO腫瘍を持つマウスにおけるB細胞集団をよりよく特徴づけるために、CD19をIgM、IgA、IgDの表面形態と共染色することによりB細胞の成熟を比較した。これら3つの免疫グロブリンサブクラスにおいて、TRAF3KO腫瘍を持つマウスの腹水では、ITB1腫瘍を持つマウスと比較して、B細胞上のIgAの表面発現が著しく高かった（図3C）。注目すべきは、コスティミュレーションタンパク質CD40の発現や、IL-10の細胞内発現によって決定される制御性B細胞の割合に有意差がなかったことである（Fig. S3A）。TRAF3KO腫瘍を持つマウスにおけるCD19+IgA+細胞の発現増加を確認するために、免疫グロブリンアイソタイピングアレイを用いて、ITB1またはTRAF3KO細胞を注射したマウスの腹膜における7種類の免疫グロブリンレベルを比較した。7種類の免疫グロブリンのうち3種類は、ITB1細胞投与マウスよりもTRAF3KO細胞投与マウスの腹腔内に多く存在し、IgAが最も有意に発現していた（図3D、図S3BおよびC）。

今回得られた知見が結核患者における臨床的意義があるかどうかを調べるため、Cancer Genome Atlas (TCGA) ポータルから380例の高グレード漿液性結核の遺伝子発現プロファイルと臨床データを調査した。これらのプロファイルは、28の異なる免疫細胞タイプからなる免疫遺伝子セットに対して、単一サンプル遺伝子セット濃縮解析を行った[37]。この解析では、TCGAサンプルと異なるデータセットとの関連を可視化し、k-meansクラスタリングによってサンプルを分割し、2つの異なるクラスタを作成した（図3Eおよび図S3D）。2つのクラスター間で最も大きく異なる要因はB細胞シグネチャーであり（図S3E）、B細胞シグネチャーの主要遺伝子の1つが、IgAの単量体型と分泌型二量体IgA複合体の両方の一部である免疫グロブリンヘビーコンスタントα1（IGHA1）であることに注目した[38]。B細胞シグネチャースコアに基づく患者の生存確率を比較すると、スコアが高い患者の生存期間中央値は、スコアが低い患者のそれより有意に長く（図S3F）、IGHA1の発現レベルで患者を区別すると、より長くなることが示された（図3F）。これらの結果は、TMEがB細胞と分泌型IgAに富んでいることは、抗腫瘍免疫応答が全体的に強化され、それがOC患者の生存期間を延長させるという仮説をさらに裏付けるものであった。

IgAを介したB細胞免疫応答は、常在菌の微生物相に影響される

IgAを分泌するB細胞は、宿主の免疫系と常在細菌の間の共生関係を維持する上で重要な役割を担っている [39]。この共生関係、ひいては細菌とB細胞の相互作用の破綻は、一部のがんを含むいくつかの疾患に関与しているとされている[40,41]。抗腫瘍B細胞反応に対する細菌の影響を調べるために、方法のセクションに記載されているように、4種類の抗生物質のカクテル（ABX）でWTマウスを処理することによってマイクロバイオームを枯渇させた。盲腸の大きさの変化[42,43]と、血液寒天培地プレート上で処理マウスと未処理マウスの糞便から分離したコロニーの成長をモニターすることにより、マイクロバイオームの枯渇を確認した（図S4AおよびB）。次に、ABX処理したマウスにTRAF3KO細胞を注入し、ITB1またはTRAF3KO細胞を注入した未処理マウスと比較して、生存率をモニターした。ABX処理により、TRAF3KO注入マウスの生存期間中央値は35日に短縮したのに対し、未処理のTRAF3KO注入マウスは92日であった（図4A）。ABX処理に対する免疫系の反応を調べるため、ABX処理したTRAF3KO注射マウスの腹腔から免疫細胞を採取し、ITB1またはTRAF3KO注射した未処理マウスの腹腔からのものと比較し、プロファイリングを行った。 TRAF3KOを注射したマウスでは、比較の結果、未処理マウスでは全CD19+細胞、特にCD19+MHC-II+細胞の過剰発現が見られたが、ABX処理マウスでは見られなかった（Fig. 4B）。次に、IgA被覆細菌の存在量とTRAF3の発現量との関連を検討した。この目的のため、既報の通り、TRAF3KO注入マウスとITB1注入マウスの両方の腹腔洗浄液からIgA被覆細菌を分離・精製した[44]。次に、16S シークエンスを適用して、各マウス群の分類学的な被覆細菌を特徴付けた。その結果、ITB1群ではIgA被覆細菌の2属（FlavobacteriumとNovosphingobium）が、TRAF3KO群では1属（Sphingobium）がより多く存在した（図4Cと図S4C）。最後に、TCGAマイクロバイオームデータベース[45]を用いて、IGHA1発現に関するヒトでの同様の関連性を探した。その結果、IGHA1発現と正の相関を示す細菌属が2つ、負の相関を示す細菌属が2つ見つかりました（図4D）。

全体として、これらの結果は、抗腫瘍B細胞応答の増強（またはそれ以外）に対するTME内の細菌の寄与を強調するものである。

腹水のIgA-seqは、卵巣がん患者を区別することができる

ヒトOCにおける微生物群集とIgAとの関連を評価するために、我々は概念実証として、OC患者の腹水11サンプルと肝硬変患者の腹水4サンプルについて検討した。まず、各サンプルから全細菌DNAを分離し、16S rRNAの増幅と塩基配列を決定した。方法」の項で述べたように、コンタミネーションを除外した後、得られたシークエンスデータを解析し、各グループの微生物群集の多様性と存在量を推定した。Chao1モデルを使用すると、OC患者と肝硬変患者の間のα-多様性に有意差は見られなかった（Fig. 5A）。Bray-Curtis非類似度（β-diversity）に基づく順序プロットでは、OCと肝硬変患者の間で異なる微生物組成が部分的に明らかになった（Fig. 5B）。OCと肝硬変の腹水マイクロバイオームで異なる豊富な分類群を検索するために（図5C）、Deseq2法を使用して濃縮解析を実行した。腹水サンプルはバイオマス量が少ないサンプルと考えられ、アンプリコンシークエンスバリアント（ASV）の中には1つのサンプルでしか見つからないものもあったため、1つ以上のサンプルで発現しているASVを用いた場合とサンプルの閾値を設けずに1回エンリッチメント解析を実行した。前者の濃縮解析では、1属のReyranellaが肝硬変に、1属のBrevundimonasがOCに濃縮され、log2 fold changeが1.2以上となり、属レベルで有意差が認められた（図5D）。閾値なしの解析では、肝硬変とOCでそれぞれ3つ、5つの有意なASVが認められた（図S5A）。

TRAF3KO細胞を注射したマウスでは、IgAの増加とB細胞の浸潤が認められたので、以前に述べたように[44]、OCと肝硬変患者の粗脂肪からIgA被覆細菌を分離し、16S rRNAを増幅して配列決定も行った。ASVを解析した結果、肝硬変と比較してOCでは、門レベルでの分類群の相対的存在度が完全にシフトしていた（Fig. 5E）。濃縮解析では、1属のAcidovoraxが肝硬変で濃縮され、2属のEnhydrobacterとAsinibacteriumが肝硬変で濃縮されており、属レベルで有意差が見られた（Fig. 5F）。閾値を設定しない場合、肝硬変に有意に濃縮されるASVは6種類、OCに有意に濃縮されるASVは5種類であった（図S5B）。これらの結果は、腹水にはIgAで被覆された細菌が存在することを示し、肝硬変とOCのIgA被覆細菌の違いは、疾患の進行を制御するB細胞とIgAの役割の可能性を示唆している。

考察
本研究では、TRAF3が癌細胞における免疫調節因子であることを明らかにした。HPV陽性の頭頸部がんのコホートで見つかったように、ほとんどの証拠がTRAF3を腫瘍抑制因子として同定している一方で[47]、TRAF3は最近、免疫抑制の役割を持ち、メラノーマにおける免疫チェックポイント遮断に対する反応を制限することが見出された[35]。固形がんにおいて、TRAF3の欠損は主に正規および非正規NF-κB経路の活性化につながるというこれまでの知見とは対照的に[35, 47]、ITB1細胞株でTRAF3をノックアウトしてもNF-κB経路の活性化には影響せず、むしろI型IFN経路を過活性化することが示されました。これらの対照的な結果は、TRAF3が細胞種によって異なる機能を持ち、特にI型IFNの活性を媒介する場合に、その機能が異なるという概念を強調するものである[48]。さらに、タイプ-I IFNの過活性化とTRAF3との関連は、BRCA1の不活性化など、他の要因によって規定され得る。BRCA1/2変異によるDNA修復の欠陥は、cGAS/STING/type-I IFN経路を介した免疫シグナル伝達を誘発する[49]。TRAF3の不活性化は、BRCA1変異モデルにおいてSTINGおよびI型IFN経路の活性化を高めるが、BRCA1野生型モデルにおいてはそれ自体では十分でない可能性がある。

I型IFNは、腫瘍細胞の増殖、アポトーシスなどの機能に直接影響を与え、またMHC-Iの発現を増加させることによって間接的にこれらの機能に影響を与えることが示されている[50]。我々の研究では、IFNで培養したTRAF3KO細胞とITB1細胞はMHC-Iを過剰発現しており、他の研究の結果と一致していた[35]。MHC-Iが高発現すると、抗原の発現が高まり、抗原提示細胞（APC）による抗原の認識と細胞傷害性T細胞への抗原提示が増加します[51]。細胞傷害性 CD8+ T 細胞のレベルの変化は観察されなかったが、TRAF3KO 腫瘍を持つマウスでは、マクロファージと B 細胞のレベルの変化が観察された。マクロファージは、腫瘍の転移を促進し、血管新生や化学療法抵抗性を高め、OC患者の予後不良に関係していることが以前から知られている[52]。同様に、OC患者の予後改善としばしば関連する血漿およびメモリーB細胞の存在は、ITB1腫瘍を有するマウスと比較してTRAF3KO腫瘍を有するマウスで増加した[11, 53, 54]。

抗腫瘍 B 細胞応答は、腫瘍抗原を標的とする腫瘍特異的免疫グロブリンの産生によって主に達成され、APC の募集とプライミングを促進して免疫細胞傷害性応答につながる [11, 55]。我々のモデルでは、TRAF3KO腫瘍を持つマウスでIgAの過剰な産生と分泌が観察され、B細胞の抗腫瘍の役割がさらに強調された。B細胞の活性化および分化は、T依存的またはT非依存的なメカニズムによって引き起こされることがある。どちらの場合も、活性化カスケードを開始する最初のシグナルは、T依存性活性化ではB細胞受容体を介して、T非依存性活性化ではToll様受容体を介して、抗原の認識に依存する [56]。これらの抗原は通常、ウイルス、真菌、細菌由来の外来タンパク質、多糖類、代謝産物に由来している[57]。したがって、我々の研究では、IgAの発現と機能、細菌属、およびOC患者の生存率との間の相関関係を調査することを目指した。その結果、ある種の細菌属の存在は、結核患者における IGHA1 の発現と相関があることを見出した。抗生物質がB細胞を介したTRAF3KO OC細胞の増殖遅延を防ぐことをマウスで実験的に証明した。

TMEにおける微生物叢の存在は、多くの悪性腫瘍において、直接的に、あるいは分泌される代謝産物を介して間接的に、役割を果たすことが示されてきた。この関連性は、主に便のサンプルを用いた大腸癌の文脈で研究されてきたが（[58]でレビュー）、いくつかの研究では、いくつかの細菌属がヒト[15、16、59]とマウスでOCと関連している[60]。我々の患者コホートは小規模であったが、我々はOC腹水中に有意に豊富な3つの属-Brevundimonas、Enhydrobacter、Asinibacterium-を見いだした。これらの属は腹水や腹膜炎でも検出されたことがあり[61-63]、OC患者の腹水中に存在する可能性が高いと考えられる。

また、細菌とIgAの相互作用は、いくつかの点で抗腫瘍免疫応答に大きな影響を与えることが知られているので、これらの細菌上のIgAコーティングのレベルも特徴付けた。第一に、微生物叢由来のMHC-I制限ペプチドは免疫反応を刺激し、癌抗原と交差反応する可能性がある[64]。第二に、微生物由来の短鎖脂肪酸は、B細胞の分化および抗体反応に影響を与える重要な因子の発現を調節することができる [65]。常在菌に対するこれらの特異的な免疫グロブリン応答は、血清メタボロームやサイトカインレパートリーを変化させることで間接的に腫瘍増殖に影響を与えるか [66, 67] 、腫瘍細胞のFcR依存抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を介して骨髄系細胞に直接関与する [11] かもしれない。したがって、分泌されたIgAおよび常在細菌の変化がどのように腫瘍細胞に直接的または間接的に影響を与えるかをよりよく理解するためには、異なるFcRおよびサイトカインのレベルを調べることが有用であろう。

結論
我々の研究により、腫瘍細胞におけるTRAF3は、MHCクラスIとIFN-Iシグナルをダウンレギュレートし、B細胞の活性化を制限し、B細胞の抗腫瘍免疫を低下させる免疫抑制性モジュレーターであることが明らかになった。さらに、抗腫瘍B細胞の効果的な反応には、無傷の常在細菌の存在が必要であることを示す。

略語

宣言文

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