酪農環境における多剤耐性および病原性遺伝子保有大腸菌の出現：環境、動物、公衆衛生に対する脅威の高まり
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オリジナル研究論文
Front. 微生物学、2023年7月13日
システム微生物学
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1197579
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一人の健康と微生物叢の出会い：消化管微生物叢、宿主、環境の相互作用
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酪農環境における多剤耐性および病原性遺伝子保有大腸菌の出現：環境、動物、公衆衛生に対する脅威の高まり
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1197579/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit
ムハンマド・ショアイブ、何周林、曽庚、唐敏嘉、郝瑞晨、王神怡、商汝鳳、王雪紅、張宏娟、普万夏*。
甘粛省新動物薬物プロジェクト重点実験室／農業農村部獣医薬物開発重点実験室／中国蘭州市CAAS畜産薬学研究所
大腸菌は腸内細菌叢の一般的な常在菌であり、乳牛の乳房感染症やヒトの胃尿路感染症の原因となっている。我々は、中国新疆の酪農場環境から大腸菌株を分離し、その疫学的特徴、抗菌薬に対する表現型および遺伝子型耐性、病原性関連遺伝子、系統関係を調査した。209検体を異なる感染源（糞便，スラリー，水，牛乳，土壌）から採取し，示差寒天培地および選択寒天培地（MACおよびEMB）で培養した．推定同定はVITEK2システムで行い、PCRによる16S rRNA遺伝子増幅で確認した。抗菌薬感受性試験は微量希釈法で行い、ゲノムの特性解析は単純および多重ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で行った。141/209検体（67.5％）から合計338株の大腸菌が同定された。ほとんどの大腸菌がスルファメトキサゾール/トリメトプリム（62.43％）に耐性を示し，次いでセフォタキシム（44.08％），アンピシリン（33. 73％）、シプロフロキサシン（31.36％）、テトラサイクリン（28.99％）、そしてフロルフェニコール（7.99％）、ゲンタマイシン（4.44％）、アミカシン（1.77％）、ホスホマイシン（1.18％）と続いた。メロペネム，チゲサイクリン，硫酸コリスチンは全菌種が感受性であった．耐性株のうち44.4％は多剤耐性（MDR）であり，3種類以上の抗生物質のうち少なくとも1種類に耐性を示した．抗生物質耐性遺伝子（ARG）は20種類中18種類が検出され，sul2（67.3％），blaTEM（56.3％），gyrA（73.6％），tet（B）（70.4％），aph（3）-I（85.7％），floR（44.4％），fosA3（100％，1/1）が異なるクラスの抗生物質耐性遺伝子として優勢であった．病原性関連遺伝子（VAG）ではompAが86.69％と最も多く，次いでibeB（85.0％），traT（84.91％），ompT（73.96％），fyuA（23.1％），iroN（23.1％），irp2遺伝子（21.9％）であった．大腸菌の系統分類はB1群が75.45％と最も多く，次いでA群18.34％，C群2.96％，D群1.18％，E群1.18％，F群0.30％であった．本研究では、酪農環境から広く分布するARGおよびVAGを保有するMDR大腸菌株を同定した。この結果は、酪農場環境が動物の乳房炎原因病原体の供給源となり、汚染された牛乳や食肉、地表水、農作物を介して、抗生物質耐性や病原性遺伝子を持つ細菌株がヒトに水平移行する可能性を示唆した。
グラフィカル抄録
図解要旨
はじめに
大腸菌（Escherichia coli、E. coli）は、ヒトだけでなく動物の腸内細菌叢にも生息する日和見的で一般的な細菌である（He et al.） さらに、大腸菌は動物の乳房感染（Cheng et al., 2019）やヒトの血流感染（Jara et al., 2021）を引き起こす最も一般的な原因菌でもある。病気を予防し、成長期の動物の健康を促進するための抗生物質の使用は、依然として畜産に不可欠な要素である。全体的な健康状態を改善し、家畜の生産性を向上させるために、抗生物質添加飼料が家畜用に初めて承認されてから50年が経過した（Afemaら、2018年）。しかし、複数の抗生物質に対する耐性病原体の出現と蔓延は、獣医学と公衆衛生にとって深刻な問題となっている（Murray et al.） 抗菌薬耐性により、米国では年間550億ドルの経済的損失が生じていると推定されている（Dadgostar, 2019）。中国もまた、食用動物、特に酪農部門での抗生物質の消費量が多い。
抗菌薬耐性（AMR）の伝播は複数の方法で起こりうるが、ヒトや動物の糞便との接触が最も一般的な経路である（Graham et al.） 乳牛は、農場環境や牛乳や肉などの食品の汚染、動物との直接接触を通じて、抗生物質耐性菌や人獣共通感染症細菌株、特に志賀毒素産生大腸菌（STEC）の拡散源となる可能性がある（Amézquita-Lópezら、2018；Soburら、2019）。畜産、特に集約的畜産は、ヒト、動物、環境間のAMR伝播に大きな役割を果たしている（Manyi-Loh et al.） 畜産では抗菌薬が広く使用されているため、家畜ふん尿はAMR遺伝子の拡散と伝播のホットスポットと考えられている。家畜ふん尿中には遺伝的に多様な大腸菌株が存在し、さまざまな生態学的ニッチで生存する能力を有している（Beattie et al.） β-ラクタム系抗生物質に対する耐性を付与するblaCTX-MおよびblaCMY遺伝子を持つ大腸菌株は、家畜ふん尿から頻繁に検出される（Cookson et al.） したがって、家畜ふん尿は、大腸菌などの環境病原体による乳房感染を通じて動物に、汚染された食品を通じてヒトに、そしてふん尿を土壌や排水の肥料として使用することで環境に害を与えていると考えられる（Sarowska et al.） このため、抗生物質耐性遺伝子（ARG）が水平遺伝子伝達メカニズムによってヒトの腸内細菌叢に組み込まれる可能性が高まる（Lima et al.） 特に集約的な畜産が行われている地域では、AMRの伝播と拡散について理解を深めることが重要である。そこで本研究では、酪農場環境における大腸菌の有病率と薬剤耐性特性を調査した。また、病原性を担う病原性関連遺伝子（VAG）の多様性と、それらの系統群内での分布についても調査した。材料と方法
2.1. サンプルソースと収集戦略
2017年から2019年にかけて、中国新疆ウイグル自治区の大規模酪農場（牛群規模＝25,000頭）から合計209の環境サンプルを収集した。含まれる環境サンプルは、ランダムサンプリング手法に基づく糞便サンプル（n = 50）、貯蔵タンクからの糞尿スラリー（n = 36）、生乳（n = 90）、居住地域の水サンプル（n = 9）、土壌サンプル（n = 12）、作物畑土壌（n = 12）であった（図1）。糞尿サンプルは、5地点混合サンプリング法（Sharp et al. 生乳サンプル（10 mL）を採取し、National Mastitis Council（Hogan and Smith, 1992）のガイドラインに従って滅菌ファルコンチューブに移した。水サンプル（50 mL）は、住宅地から無作為に3つの異なる給水口を選び、滅菌水ボトルで採取した。ブランクおよび畑土壌サンプルは、それぞれ農場および飼料栽培畑の異なる場所から採取した。採取した試料はすべて4℃で保存し、24時間以内に実験室に移して処理した。
図1
図 1. 図1 異なる場所から採取したサンプルの分布
2.2. 大腸菌の分離と同定
糞便、糞尿、土壌の各サンプル25 gをまず225 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で混合し、可溶化した。混合後、液体1 mLを10 mL LBブロスチューブに移し、37℃で160 rpmで連続的に攪拌しながら培養し、細菌を濃縮した。各チューブから100μLの濃縮培養液をMacConkey（MAC）寒天培地に前述した培養条件で継代培養した。ただし、水と牛乳のサンプルはMacConkey寒天培地に直接スワブし、37℃で一晩培養した。コロニーの形と色から、大きくて滑らかなピンク色のコロニーを選び、さらにエオジン・メチレンブルー（EMB）寒天培地にストリークし、37℃で一晩培養した。EMB寒天培地上で、中心部が黒く、金属光沢のある緑色のコロニーが出現した場合、大腸菌の増殖を示唆した（Peng et al.） さらに、VITEK2システム（BioMerieux, France）により推定同定を行い（Alfinete et al.、2022）、既報のプライマーを用いたPCRによる16S rRNA遺伝子増幅により確認を行った（Liu et al.、2021）。PCR増幅産物はGelDoc XRシステム下で1％アガロースゲル上で可視化した（補足図S1）。確認された分離株は、-80℃で20％グリセロールに保存し、さらに解析を行った。
2.3. 病原性関連遺伝子の検出
16S rRNAで確認された大腸菌分離株は、既述の方法（Hu et al., 2022）により7つのVAGの同定に供した。ゲノムDNAはDNA抽出キット（Tiangen Biotech Beijing, Co., Ltd.）を用い、メーカーのガイドラインに従って抽出した。病原性遺伝子は、補足表S1に記載の標的遺伝子プライマーを用いたPCR増幅により同定した。PCR反応混合物（25μL）は、12.5μLのPreTaq Mix（Vazyme Biotech, China）、1μLのフォワードプライマー、1μLのリバースプライマー、1μLのゲノムDNA、および9. 5μLの脱イオン水を加え、以下の条件で行った；94℃で5分間の事前変性、94℃で30秒間の変性、Supplementary Table S1に記載の様々な温度で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の初期伸長、72℃で5分間の最終伸長のサイクルを35回繰り返した。増幅後、PCR産物を180 V/200 mAの1%アガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色で可視化し、GelDoc XRシステムで画像を撮影した（補足図S2）。
2.4. 抗菌薬感受性試験
ASTは、EUCASTガイドライン1に従い、ブロス微量希釈法で行った。簡単に説明すると、保存分離株を室温で解凍し、37℃で12時間、激しく攪拌（120 rpm）してLHブロスに再懸濁した。細胞密度を5×105 CFU/mLに調整し、細菌接種液を調製した。96ウェル丸底プレートをブロス希釈アッセイに使用し、100μLのミューラーヒントン（MH）ブロスをマイクロピペットで1ウェル目から12ウェル目まで添加した。次に、調製した菌体50μLを1ウェル目から11ウェル目まで添加し、12ウェル目を陰性対照とした。抗生物質は、トリメトプリム-スルファメトキサゾール（SXT）、アンピシリン（AMP）、セフォタキシム（CTX）、テトラサイクリン（TET）、シプロフロキサシン（CIP）、ゲンタマイシン（GEN）など、医療および獣医学的使用に基づいて選択した、 gentamicin（GEN）、amikacin（AMK）、colistin sulfate（CS）、florfenicol（FFC）、meropenem（MEM）、およびtigecycline（TIG）を1ウェル目から10ウェル目まで添加し、11ウェル目を陽性対照とした。品質管理には基準株であるE. coli ATCC 25922を用いた。ホスホマイシンのMIC（細菌の目に見える増殖を阻害する最小濃度）は、EUCASTが推奨する寒天希釈法で算出した。すべての抗生物質のMICは、プレートの底のウェルで増殖がスジ状のボタン／濁りとして可視化されることで評価された。MIC値は標準EUCAST MICブレイクポイントと比較した（補足表S2）。3クラス以上の抗生物質に対して少なくとも1つの耐性を示す菌株をMDRと分類した。
2.5. 抗生物質耐性遺伝子の検出
表現型耐性を示す大腸菌株は、以前に記載された方法（Yu et al., 2020）に従って、8種類の抗生物質クラスから20種類のARGを検出した（補足表S3）。DNA抽出キット（Tiangen Biotech Beijing, Co., Ltd.）を使用して細菌DNAを抽出し、20種類のARG（補足表S3に記載）のPCR増幅の鋳型として使用した。PCR反応混合物（25μL）は、12.5μLのPreTaq Mix（Vazyme Biotech、中国）、フォワードプライマーとリバースプライマー各1μL、細菌DNA1μL、脱イオン水9.5μLからなる。反応は以下の条件で行った：94℃で5分間の変性、94℃で30秒間の変性、様々な温度（補足表S3参照）で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を35サイクル行い、最後に72℃で5分間伸長する。増幅後、PCR産物を180 V/200 mAの1%アガロースゲルで分離し、GelDoc XRシステムを用いて臭化エチジウムで染色して可視化した。
2.6. 系統解析
大腸菌株の系統分類は、補足表S4に示すプライマーを用いた2セットのPCRによって行った。四重極PCR反応混合液（25μL）は、Premix Taq TM 12.5μL、フォワードおよびリバースプライマー（chuA, yjaA, tspE4C2）各1μL、arpAフォワードおよびリバースプライマー各2μL、DNA鋳型1.5μL、dd H2O 1μLからなる。PCRは以下の条件で行った；94℃で4分間の前変性、94℃で5秒間の変性、59℃で20秒間のアニーリング、72℃で5分間の伸長を30サイクル。E群およびC群同定のためのPCR反応は、Premix Taq TM 12.5μL、trpBAフォワードプライマーおよびリバースプライマー各0.6μL、各群特異的プライマー1μL（補足表S4）、DNA鋳型1.5μL、および2.8μL dd H2Oから構成された。PCR反応液には、内部コントロールとしてtrpBAプライマーを添加した。PCR増幅条件は、94℃で4分間の前変性、94℃で5秒間の変性、57℃（E群）または59℃（C群）で20秒間のアニーリング、72℃で5分間の最終伸長を30サイクル行った。PCR増幅後、PCR産物を1%アガロースゲル上で走らせ、GelDoc XRシステム下で可視化し（補足図S3）、結果を補足表S4と比較することで系統群を同定した。
2.7. データ解析
有病率はThrusfield（2018）に記載された式を用いて算出した。
有病率(%)=No. of positiveisolatesTotalalisolates×100������％=���������������������������������������. �������������������������������×100
抗菌薬感受性データは Microsoft Excel を用いて記述統計学的に解析した。さらに、有病率、AMR 率、病原性率に影響するサンプリング源やサンプリング年などの様々な要因のデータは、有意水準α = 5％（Zhao et al.、2021；Ma et al.、2022）を維持したままピアソンのカイ二乗検定を用いて分析した。データのグラフ表示は、GraphPad Prismバージョン8.2.1とMicrosoft Excelで行った。結果
3.1. 異なる供給源からの大腸菌の分離
糞便検体（n = 50）、貯蔵タンクからの糞尿スラリー（n = 36）、生乳（n = 90）、水検体（n = 9）、土壌検体（n = 12）、作物畑の土壌（n = 12）など、酪農環境の異なる場所から合計 209 検体を採取した。コロニーの特徴から、141/209検体（67.5%）から合計534株の大腸菌が分離された。その後、16S rRNA遺伝子の増幅により338株の大腸菌が確認された。分離率は年を追うごとに同程度であり、2017年は30.8％（104/338）、2018年は34.9％（118/338）、2019年は34.3％（116/338）であった（図2A）。全体として、大腸菌は糞尿スラリーから分離されたものが最も多く（39.3％、133/338）、次いで糞便サンプル（34.9％、118/338）、生乳（24.8％、84/338）、作物畑土壌（0.59％、2/338）、空白土壌からは最も少なかった（0.29％、1/338）。しかし、水試料からはいずれの大腸菌も分離されなかった（図2B）。2019年には、他のサンプリング年と比較して、糞便および牛乳サンプルからより多くの大腸菌株が分離されたが、2018年にはスラリーサンプルからより多くの大腸菌株が分離された。さらに、2017年にはブランクと作物畑の土壌サンプルからそれぞれ1株と2株のみが分離されたが、2018年と2019年には1株も分離されなかった（図2B）。
図2
図 2. サンプリング年およびサンプリング源の違いによる大腸菌の分離。(A）異なる年に分離された大腸菌の総数。(B）異なる年に異なる供給源から分離された大腸菌株の分布；**は有意差なし（p > 0.05）；*は該当なし；*は有意差あり（p < 0.05）。
3.2. 大腸菌の抗菌薬感受性
大腸菌338株のASTの結果、284/338株（84.0％）が少なくとも1種類の抗生物質に対して耐性を示し、54/338株（26.0％）が感受性株であった（図3A）。耐性株の多くはトリメトプリム／スルファメトキサゾール（62.43％、211/338株）であり、次いでセフォタキシム（44.08％、149/338株）、アンピシリン（33.73％、114/338株）、シプロフロキサシン（31. 36％、106/338株）、テトラサイクリン（28.99％、98/338株）、フロルフェニコール（7.99％、27/338株）、ゲンタマイシン（4.44％、15/338株）、アミカシン（1.77％、6/338株）、ホスホマイシン（1.18％、4/338株）に対しては少なかった。すべての大腸菌株はメロペネム、チゲサイクリン、硫酸コリスチンに感受性であった（図3B）。2017～2019年のすべての大腸菌株は、メロペネム、チゲサイクリン、および硫酸コリスチンに100％感受性であった。さらに、AMP（44.23％）、CIP（40.38％）、TET（44.23％）、GEN（4.81％）のAMR率は、2017年が他の採取年に比べて有意差（p＜0.05）をもって高く認められた。さらに、2018年の大腸菌はCTX（55.93％）、SXT（68.64％）、AMK（3.39％）に対して高いAMRを示し、有意差（p＜0.05）を示した。しかし、2017年と2019年の大腸菌株はいずれもAMKとFOSに対して耐性を示さなかった（図3C）。
図3
図3. 酪農環境から分離された大腸菌338株の抗菌薬感受性。(A) 大腸菌全体の耐性株（R）と感受性株（S）。(B）試験した個々の抗生物質に対する大腸菌338株の全体的な抗菌薬感受性。(C）異なるサンプリング年の大腸菌株の抗菌薬感受性の比較。AMP、アンピシリン；CTX、セフォタキシム；MEM、メロペネム；SXT、トリメトプリム-スルファメトキサゾール；CIP、シプロフロキサシン；AMK、アミカシン；GEN、ゲンタマイシン；TET、テトラサイクリン；TIG、チゲサイクリン；FFC、フルフェニコール；FOS、ホスホマイシン；CS、硫酸コリスチン；、有意差なし（p > 0. 05）；*は該当なし；*は有意差（p＜0.05）を示す。
3.3. 異なる感染源から分離された大腸菌のAMR特性
すべての検体から分離された大腸菌のほとんどは、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（SXT）に耐性であり、メロペネム（MEM）、チゲサイクリン（TIG）、硫酸コリスチン（CS）には100％感受性であった。さらに、糞便検体由来の大腸菌株は、2017年にアンピシリン（AMP）、シプロフロキサシン（CIP）、テトラサイクリン（TET）に対して、他の採取年に比べて高い耐性を示し、有意差が認められた（図4A）。同様の傾向は、牛乳および糞尿スラリーから分離された大腸菌株についても観察された（図4B,C）。さらに、2017年にブランクおよび作物畑土壌から分離された大腸菌株は、CTX、CIP、TET、およびSXTに対して100％の耐性を示したが、2018年および2019年に分離された株はいずれも耐性を示さなかった（図4D,E）。さらに、作物畑から分離された大腸菌は、AMPおよびフロフェニコール（FFC）に対して50％の耐性を示した。
図4
図 4. 異なる感染源から分離された大腸菌のAMR率。(A）糞便サンプル。(B）貯蔵タンクからの糞尿スラリー。(C）生乳。 D）空白の土壌。(E）畑の土壌。AMP、アンピシリン；CTX、セフォタキシム；MEM、メロペネム；CIP、シプロフロキサシン；AMK、アミカシン；GEN、ゲンタマイシン；TET、テトラサイクリン；TIG、チゲサイクリン；SXT、トリメトプリム／スルファメトキサゾール；FOS、ホスホマイシン；COL、コリスチン；FFC、フルフェニコール；、有意差なし（p > 0. 05）；*は該当なし；***は有意差（p＜0.05）を示す。
3.4. 薬剤耐性スペクトル
耐性株のうち、126/284株（44.4％）が多剤耐性（MDR）、158/284株（55.6％）が非MRであった（図5A）。耐性を示した抗生物質は2種類（63.38％）が最も多く，次いで3種類（50.0％），1種類（36.61％），4種類（30.28％），5種類および6種類（各7.75％），7種類（3.17％），8種類（0.70％）であった（図5B）。さらに、CTX＋AMP、CTX＋AMP＋SXT、CTX＋AMP＋SXT＋CIP、CTX＋TET＋SXT＋CIP、CTX＋AMP＋SXT＋CIP＋GEN、CTX＋AMP＋SXT＋CIP＋TET＋FFC、AMP＋CTX＋GEN＋TET＋SXT＋FFC＋FOS、AMP＋CTX＋CIP＋GEN＋TET＋SXT＋FFCなど、多様なAMRパターンが認められた。8種類の抗生物質に耐性を示したのは、AMP＋CTX＋CIP＋AMK＋GEN＋TET＋SXT＋FFCの1株のみであった（表1）。
図5
図5. 酪農環境から分離された大腸菌の薬剤耐性スペクトル。(A）MDR株と非MR株の割合。(B）大腸菌284株の1～8種類の抗生物質に対する耐性スペクトル。
表1
表1. 大腸菌の表現型薬剤耐性スペクトル。
3.5. ARGの検出および表現型耐性との相関性
遺伝子型解析は、8クラスの抗生物質（表1）の中から20のARGをターゲットとして行われた。その結果、sul2（67.3％、スルホンアミド系）、blaTEM（56.3％、β-ラクタム系）、gyrA（73.6％、キノロン系）、tet(B)（70.4％、テトラサイクリン系）、aph(3)-I（85.7％、アミノグリコシド系）、floR（44.4％、アンフェニコール系）、fosA3（100％、ホスホン系）が検出された。同定された他のARGの割合分布は以下の通り：スルホンアミド系（sul1、27.9％；sul3、18.1％）、β-ラクタム系（blaOXA、25.8％；blaCTX-M、22.4％）、アミノグリコシド系（aac(3)-IV、14. 3％；aac(3)-II、33.3％；aadA、0.00％；rmtB、4.76％）、キノロン系（qnrB、0.94％；qnrS、9.43％）、ポリミキシン系（pmrB、0.35％）、テトラサイクリン系（tet(A)、11.2％；tet(D)、0.00％）であった（図6）。
図6
図6. 大腸菌株間のARGの割合分布。
ARGの表現型耐性と遺伝子型検出の相関にはばらつきが認められた。例えば、表現型ではコリスチン硫酸塩に耐性を示す株はなかったが、遺伝子型解析では1株がARGを保有していた。また、スルホンアミド系、β-ラクタム系、アミノグリコシド系耐性株では表現型耐性に比べてARG保有株数が多く、キノロン系、テトラサイクリン系、アンフェニコール系耐性株ではその逆であった。しかし、ホスホマイシン耐性株では、表現型と遺伝子型の発現に100％の相関が認められた（表2）。
表2
表2. ARGを保有する耐性株の割合と表現型耐性との相関。
3.6. ウイルスローム遺伝子解析
VAGのうち、ompAが最も多く（86.69％）、次いでibeB（85.0％）、traT（84.91％）、ompT（73.96％）、fyuA（23.1％）、iroN（23.1％）、irp2（21.9％）の順であった（図7A）。fyaA遺伝子を持つ大腸菌株はすべてiroN遺伝子も持っていた。さらに、irp2を持つ大腸菌株の93.59%はfyuA遺伝子も持っていた。ompT、traT、iroN、ibeB、ompAなどのVAGはすべての由来大腸菌株から検出されたが、irp2およびfyuA遺伝子はそれぞれ糞尿スラリーおよび糞便サンプルからは観察されなかった。しかし、牛乳由来の菌株ではirp2とfyuA遺伝子の両方（36.9％、31/84）が同定された。総じて、糞便やスラリーに比べ、乳由来株ではVAGの割合が高いことが確認された（図7B）。
図7
図 7. 病原性関連遺伝子（VAG）を保有する大腸菌株。 A）VAGを保有する大腸菌株の全体的な割合と陽性株数。(B)異なる感染源から分離された大腸菌株におけるVAGの割合分布。
3.7. 系統群間におけるVAGの分布
大腸菌338株の系統解析の結果、ほとんどの株がB1群（75.45％、255/338株）に属し、次いでA群（18.34％、62/338株）、C群（2.96％、10/338株）、D群（1.18％、4/338株）、E群（1.18％、4/338株）、F群（0.30％、1/338株）の順であった。しかし，そのうち2株については系統群が同定されなかった。各系統群で最も多く検出されたVAGは、B1（ompA、87.4％）、A（ibeBおよびompA、88.7％）、C（traTおよびompA、90.0％）、D（traT、ibeBおよびompA、100％）、E（traT、100％）、F（traT、100％）であった。さらに、系統群間のその他のVAGの割合分布を表3に示す。
表3
表3. 異なる系統群におけるVAGの分布。考察
特に腸内細菌科における抗菌薬耐性は、世界の公衆衛生にとって大きな脅威である。本研究では酪農環境から大腸菌を分離した。酪農環境は細菌病原体およびARGの貯蔵庫として機能し、水平的遺伝子転移を介して細菌種間でARGが拡散し、飲料水や牛乳の糞便汚染を介してヒトに拡散する源となる。本研究における大腸菌の分離率は、乳牛および農場環境からの大腸菌の有病率を75％と報告したSoburら（2019）の知見と類似していることが判明した。Liら（2022）が実施した他の研究では、牛、鶏、豚の糞便サンプルから84.6％の大腸菌分離が報告され、Liuら（2021）は生乳サンプルから34.4％、生チーズから81.1％であった（Imre et al.） Beattieら（2020）もまた、米国における酪農糞尿からの大腸菌分離率を同様に報告している。また、酪農環境中の大腸菌の存在が乳牛の臨床的乳房炎の原因である可能性も報告されている (Su et al., 2016)。
抗菌薬感受性の結果は、SXTに対する耐性が高く、次いでCTX、AMP、CIP、TETの順であり、FFC、GEN、AMK、FOSに対する耐性は最も低かった。これらの結果は、SXT（80.38％）、AMP（92.86％）、TET（96.26％）に高い耐性を示す大腸菌を豚から分離したPengら（2022年）の知見と一致している。Beattieら（2020）が行った同様の研究では、糞尿から分離された大腸菌株はAMPおよびCTXに対して高い耐性を示したと報告している。しかし、Lu ら（2022）および Liu ら（2021）では、それぞれ AMK および GEN に対する耐性率が低いことが報告されている。我々は、大腸菌株がMEM、TIG、CSのような「最後の砦」となる抗菌薬に感受性であることを指摘したが、これはHuら（2019）がヒト環境で実施した研究の結果と一致している。さらに、Wangら（2021）、Zouら（2021）、およびMaら（2022）が動物環境で実施した他の研究でも、大腸菌株に対するMEMおよびTIGの100％感受性が報告されている。CSに対する耐性は認められなかったが、これは中国でCSが禁止されたため、動物およびヒトの環境においてコリスチン耐性が減少しているという以前の報告と一致している（Wangら、2020）。今回の研究ではMDR大腸菌の割合が44.4%と指摘されたが、これはSuら（2016年）による以前の報告（54.4%）と同程度であり、Yuら（2020年）による乳製品の牛乳での報告よりも低い。Salinasら（2019）が実施した別の研究では、小児および家畜由来から分離された大腸菌によるSXT、CIP、AMP、CTX、およびTETに対する高い耐性が報告されており、これも今回の知見と一致している。
我々は、異なるクラスの抗生物質に属する20のARGのうち18のARGを同定した。最も多く検出されたARGは、sul2（67.3％、スルホンアミド系）、blaTEM（56.3％、β-ラクタム系）、gyrA（73.6％、キノロン系）、tet（B）（70.4％、テトラサイクリン系）、aph（3）-I（85.7％、アミノグリコシド系）、floR（44.4％、アンフェニコール系）、fosA3（100％、ホスホマイシン系）であった。これまでの研究では、ヒトにおけるAMRは、環境汚染や残留薬剤のため、乳や食肉目的で飼育されている食用動物に関連していると報告されている（Bacanlı and Başaran, 2019; Pormohammad et al.） また、食用動物における抗菌薬の使用は、ヒトの微生物叢におけるMDR菌やARGの割合を増加させる（Maら、2022）。さらに、大腸菌は、種内および種間の水平遺伝子転移のドナー菌としての役割も果たすことが知られている（Oladeindeら、2019）。Limaら(2020)は、プラスミド、トランスポゾン、インテグロンなどの移動性遺伝要素を介した水平的遺伝子導入メカニズムにより、公衆衛生に潜在的な脅威をもたらす環境中の残留抗生物質、ARG、AMR菌の主要な供給源としての家畜ふん尿およびふん尿代替農地の重要性を強調している。Qianら（2018）は、鶏、牛、豚の新鮮な糞尿から、ヒトや動物の環境で広く使用されている抗生物質のクラスに対するAMRの原因となる109のARGを検出した。
分離された大腸菌の複数のVAGを調査したところ、調査されたVAGのほとんど（ompA、ibeB、traT、ompT、fyuA、iroN、irp2）がExPECに属し、ヒトの尿路感染症を引き起こす可能性があった。VAGは、接着、侵入、毒素産生、免疫回避など複数のメカニズムを通じて細菌の病原性に重要な役割を果たす病原性因子の産生を担う（Kudva et al.） ompAは外膜タンパク質A、ibeBは侵入タンパク質遺伝子、traTは補体抵抗性タンパク質、ompTは外膜プロテアーゼタンパク質、fyuAはヤルシニアバクチン受容体、iroNはエアロバクチン受容体、irp2は鉄応答性エレメント結合タンパク質2である。Zhangら（2021年）は、中国海南省の健康な水鳥から分離された大腸菌株における同様のVAGを調査した。Raimondiら（2019年）が実施した研究でも、イタリアの健康な個体の糞便から分離された大腸菌において同様のVAGが同定された。KhalifehとObaidat（2022）が実施した別の研究では、本研究と同様に、牛乳由来と糞便由来の大腸菌株でiroN遺伝子が同定された。本研究では、ほとんどの大腸菌株が系統群B1に分類され、Raimondiら（2019）の知見と一致した。これらの結果は、ARGおよびVAGの発生が抗菌薬の使用やその他の未知の要因によって異なる可能性を示唆している。本研究はまた、酪農場における抗菌剤使用の定期的なモニタリングと、廃棄前の適切な糞尿処理の確保を示唆している。結論
本研究により、酪農環境において様々な ARG および VAG を保有する多剤耐性大腸菌株が同定され、ヒト、動物、および環境の健康に潜在的な脅威をもたらす可能性がある。さらに、すべての大腸菌株はメロペネム、チゲサイクリン、硫酸コリスチンに感受性であった。これらの抗生物質は、ヒトおよび動物の環境において、治療目的の重要な抗生物質と考えられる。酪農環境にはAMRが広く分布していることから、酪農環境は様々な直接的・間接的な遺伝子伝達機構を介してARGs遺伝子をヒトに伝達する潜在的な貯蔵庫である。酪農場における抗生物質の慎重な使用、適切な糞尿処理、衛生管理の強化、特に牛乳の加工と輸送は、食品の安全性、公衆衛生、環境衛生に対するリスクを低減するために必要である。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著論文は、論文／補足資料に含まれている。
著者貢献
MS：執筆-原案。ZHとXG：データキュレーションと正式な分析。MTとRH：データのグラフ表示。SWとRS：レビューと編集。XWとHZ：プロジェクト管理。WP：構想、監督、プロジェクトの可視化、資金獲得。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は、国家重点研究開発プログラム（2016YFD0501305）および中国農業科学院農業科学技術革新プログラム（25-LZIHPS-03）の支援を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1197579/full#supplementary-material。
脚注^https://www.eucast.org
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キーワード：抗生物質耐性遺伝子（ARG）、抗菌薬耐性、多剤耐性、病原性関連遺伝子、大腸菌、酪農環境
引用 Shoaib M, He Z, Geng X, Tang M, Hao R, Wang S, Shang R, Wang X, Zhang H and Pu W (2023) The emergence of multi-drug resistant and virulence gene carrying Escherichia coli strains in the dairy environment: rising threat to the environment, animal, and public health. Front. Microbiol. 14:1197579.
受理された： 2023年3月31日；受理された： 受理：2023年3月31日；
発行：2023年7月13日
編集者
Xiaodan Huang, 蘭州大学, 中国
査読者
アドリアナ・モラール（ルーマニア、バナト農業科学獣医大学
マグダレナ・ザレフスカ（ポーランド、ワルシャワ大学
Copyright © 2023 Shoaib, He, Geng, Tang, Hao, Wang, Shang, Wang, Zhang and Pu. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められた慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責 Wanxia Pu, puwanxia@caas.cn
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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