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酪酸とプロピオン酸は、TLR刺激の存在下でヒトマクロファージのNLRP3-炎症酵素を活性化する微生物の危険信号である

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.26.586782v1.full

Wei Wang、Alesya Dernst、Bianca Martin、Lucia Lorenzi、Maria Cadefau、Kshiti Phulphagar、Antonia Wagener、Christina Budden、Neil Stair、Theresa Wagner、Harald Färber、Andreas Jaensch、Rainer Stahl、Fraser Duthie、Susanne V. Schmidt、Rebecca C. Coll、Felix Meissner、Sergi Cuartero、Matthew S.J. Mangan、Eicke Latz
doi: https://doi.org/10.1101/2024.03.26.586782
この論文はプレプリントであり、査読認証を受けていません。
00010024
要約全文情報/履歴メトリクスプレビューPDF
要旨
短鎖脂肪酸（SCFA）は、食物繊維の発酵によってマイクロバイオームが産生する免疫調節化合物である。一般に、短鎖脂肪酸は腸の健康に有益であると考えられているが、炎症性腸疾患（IBD）を患う患者では、食物繊維が豊富な食事に対する耐容性が低いことが示されており、SCFAは炎症状態において相反する効果を示す可能性が示唆されている。このことを調べるため、我々はtoll様受容体アゴニスト存在下で、ヒトマクロファージに対するSCFAの効果を調べた。定常状態におけるSCFAの抗炎症作用とは対照的に、SCFAの酪酸エステルおよびプロピオン酸エステルは、TLRアゴニストと一緒に添加すると、NLRP3インフラムソームの活性化を引き起こすことが観察された。メカニズム的には、酪酸とプロピオン酸はHDAC1-3および10を阻害することによってNLRP3を活性化し、ヒストンの過剰アセチル化が不均一に分布するようになり、その結果、トランスクリプトームが変化した。特に、CFLARとIL10遺伝子の遺伝子座では、NLRP3インフラムソーム活性化の2つの重要な阻害因子の過剰アセチル化が欠如していた。cFLIPとIL-10の転写とタンパク質発現の同時消失は、カスパーゼ-8依存的なNLRP3-インフラムソームの活性化を可能にした。SCFAによるNLRP3の活性化は、カリウムの流出を必要とせず、細胞死をもたらさず、むしろ過活性化とIL-1β放出を引き起こした。この結果は、酪酸とプロピオン酸が、炎症反応のエピジェネティックな調節を通じてNLRP3インフラムソームの活性化を制御する、細菌由来の生存率依存的危険シグナル（vita-PAMPs）であることを示している。

要約 炎症条件下において、SCFAsは細菌由来の生存能力依存的な危険シグナルであり、HDAC阻害とエピジェネティック修飾を介して、抗細胞死遺伝子cFLIPの発現を阻害し、NLRP3インフラムソームの活性化を引き起こす。

はじめに
酢酸、プロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸（SCFA）は、食物繊維の発酵を通じて微生物叢によって高濃度に生成される1。これは主に腸で起こり、回腸と下行結腸では、酢酸：プロピオン酸：酪酸が3：1：1の割合で、濃度は10～90mMになる。さらに、SCFAは口腔内の歯周ポケットでも産生される1,2。定常状態では、SCFAは腸の恒常性維持に重要な役割を果たしている。SCFAは、腸管上皮バリアの完全性を維持し、免疫細胞の機能を調節することで、このバランスに貢献している。SCFAは、遊離脂肪酸、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、嗅覚受容体に対する細胞表面受容体を活性化することにより、これらの作用を媒介する。さらに、SCFAは細胞内に拡散し、そこでヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性を阻害したり、燃料源として機能したりする3-5。このようなメカニズムにより、SCFAは免疫系を制御し、炎症を抑制し、免疫を促進する。顕著な例としては、腸管マクロファージに対する作用があり、酪酸はエピジェネティックな修飾を介して単球からマクロファージへの分化を誘発し、抗炎症性、抗微生物性の転写プログラムを転写する6。

免疫調節物質としての作用から、SCFAは炎症性腸疾患（IBD）を含む腸の炎症性疾患に対する潜在的な治療法として研究されている7。IBDは、腸管上皮細胞のバリアが破壊され、その下にある免疫細胞が微生物産物にさらされることを特徴とする。IBDは、免疫機能障害に加え、遺伝的・環境的要因の組み合わせによって発症する7。IBDの発症が複雑であることから、治療は主に炎症反応を抑えることで症状を緩和することに重点が置かれてきた。IBDの治療法の一つとして、繊維由来のSCFAが提案されている。しかし、SCFA産生を可能にする食物繊維は、IBD患者にとって耐容性が低い場合があるため、期待されているにもかかわらず、SCFAがIBDにとって有益か有害かは依然として不明である8,9。この不耐性は部分的には摂取する繊維の種類に起因しているが10、重要なことはSCFAを増加させる食事が必ずしも有益な効果をもたらすとは限らないということである11。このことから、食物繊維、ひいてはSCFAsは、それらが生成される状況によって異なる作用を持つ可能性が示唆される。

IBDにおける炎症の役割から、IBDの病態生理に関与する炎症性サイトカインを標的とする薬剤が治療の可能性を持つことが示唆されている。しかし、これまでのところ、TNFα、IL-12、IL-6を標的とする薬剤では、IBDの表現型を完全に戻すことはできなかった12-14。その後、IL-1βとIL-18の分泌を誘発するNLRP3インフラマソームが、IBD治療の新たなターゲットとして浮上してきた。特筆すべきは、NLRP3が過剰に活性化された変異を持つ人は、潰瘍性大腸炎やIBDのリスクが高いということである15,16。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)あるいは2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)という2つのマウス大腸炎モデルでは、NLRP3がこの疾患において有害あるいは保護的であることが示唆されている17-20。さらに、カスパーゼ-1の切除は、IL-10欠損マウスモデルで起こる自然発症の大腸炎を救済した21。これらの結果は、IBDの複雑な病因や、遺伝的背景、飼育環境、微生物叢組成の違いから生じる差異を反映していると思われる。おそらく最も重要な結果は、CP-456,773（CRID3またはMCC950とも呼ばれる）が、同じ遺伝的背景を持つ同腹仔コントロールのDSS大腸炎を軽減したことであろう17。

本研究では、ヒトGM-CSF由来マクロファージにおいて、LPSを介した炎症反応に対するSCFAの効果を調べることで、炎症反応におけるSCFAの基本的なメカニズムを理解する。驚くべきことに、SCFAは、LPSを介したサイトカイン転写を減少させるだけでなく、TLRアゴニストと組み合わせると、NLRP3インフラムソームを活性化することが観察された。酪酸とプロピオン酸の両方が、ゲノム全体でHDAC阻害に依存したヒストンの過剰アセチル化を引き起こし、HAT依存的に遺伝子転写を変化させた。特に、HDAC阻害は、NLRP3インフラムソーム活性化の2つの重要な制御因子であるCFLARとIL10の遺伝子座をハイパーアセチル化しない結果となり、cFLIPとIL-10の発現を消失させた。そして、これら両タンパク質の同時発現消失により、カスパーゼ-8依存性のNLRP3インフラムソーム活性化が可能となった。

結果
酪酸とプロピオン酸はLPSによるサイトカイン応答を抑制するが、IL-1β放出を誘発する。
ヒトマクロファージの炎症反応に対するSCFAの影響を調べるため、GM-CSFで分化させたヒト単球由来マクロファージ（hMDM）を、SCFAである酪酸塩、プロピオン酸塩、酢酸塩の存在下または非存在下でLPSとインキュベートした。広範囲のサイトカインビーズアレイを用いて、16時間培養後の上清からのサイトカイン分泌を測定した。 IL-10、IL-12p40、IL-6およびTNFαである（図1A）。3種類のSCFAの中で、酪酸エステルは最も強い効果を示し、1 mMですでに顕著であった。一方、プロピオン酸エステルは中程度の効果を示し、酢酸エステルはほとんど効果がなかった。注目すべきは、評価したサイトカインの大部分とは対照的に、酪酸塩とプロピオン酸塩はLPS存在下で、主要な炎症性サイトカインであるIL-1βの放出を引き起こしたことである（図1A）。多くのサイトカインとは異なり、IL-1βの放出は翻訳後に起こるため、特に興味深い現象である。この現象をさらに特徴づけるために、IL-1β放出を経時的に評価したところ、酪酸とLPSの組み合わせは、早ければ6時間でIL-1β放出を引き起こし、18時間まで増加することがわかった（図1B）。IL-1βの最大分泌は4mMの酪酸で生じたが、実質的なIL-1β放出は1mMですでに観察された（図S1A）。酪酸もLPSも単独ではIL-1β放出を誘発しなかった（図1B）。炎症マソームの活性化が焦性細胞死につながる可能性があることを考慮し、LDHの放出を測定することでこれを評価した。興味深いことに、LDHは培地中には放出されず（図1C）、酪酸は溶解性細胞死を引き起こさないことが示された。

図1.
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図1.
SCFAはLPS誘発性サイトカイン分泌を減少させるが、NLRP3-インフラムソーム依存性IL-1β放出を誘発する
(A) hMDMをLPS（1ng/ml）存在下、NaCl、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩（いずれも0.1-10mM）のいずれかで16時間処理した。LPS（1ng/ml）+/-酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩による刺激に応答して、細胞遊離上清から測定したサイトカインのヒートマップを、LPSとNaClで処理した細胞からの分泌量に対して正規化した。6人の異なるドナーの平均値を対数スケールで示した。

(B）LPS（1ng/ml）、酪酸塩（1mM）またはその組み合わせで処理したhMDMの無細胞上清から測定したIL-1βまたは（C）LDH放出。酪酸塩（10 mM）単独またはLPS（1 ng/ml）で16時間処理した、あるいはLPS（1 ng/ml、3時間）でプライミングし、ニゲリシン（10 μM 1.5時間）で刺激したhMDMの無細胞上清から測定したIL-1β放出。データは、3回（B、C、D下段）または5回（D上段）の独立した実験結果である。

(E）NLRP3またはスクランブルsiRNAでエレクトロポレーションしたhMDMを、酪酸（10 mM）単独またはLPS（1 ng/ml）で16時間、TSA（0.5 μM）とLPS（1 ng/ml）で16時間、またはニゲリシン（10 μM 1.5時間）で処理した後のIL-1β放出。

(F）酪酸（10 mM）単独、またはLPS（1 ng/ml）、Pam3CSK4（10 ng/ml）、フラジェリン（50 ng/ml）またはR848（250 ng/ml）で16時間処理したhMDMの細胞遊離上清または全細胞溶解液（WCL）のイムノブロット。

(G）VX-765（40μM）存在下、LPSと酪酸（10mM、16時間）またはLPSとニゲリシン（10μM、1.5時間）で処理したLPSプライミングhMDMのASC（赤）および核（青）染色像。各条件につき4枚の画像についてASC斑の定量を示した。

(H) (D)と同様に処理し、ICP-MSで分析したhMDMのカリウム濃度。データは4回の独立した実験を示す。

データは、特に指示のない限り、平均＋/-SEMで表され、各ドットはすべてのケースで1ドナーの代表である。

酪酸を介したIL-1β放出はhMDMのNLRP3インフラマソームに依存している。
IL-1β放出を促進する重要なメカニズムは、インフラマソーム複合体の活性化である。これらの複合体の中でも、NLRP3は最も注目すべきもので、様々な細胞ストレスに応答して、インフラマソームの形成とカスパーゼ-1の活性化を引き起こす22。炎症反応に対する酪酸とプロピオン酸の効果を考慮し、まずNLRP3とプロIL-1βの発現が酪酸とのインキュベーションによって変化しないことを確認した（図S1B）。NLRP3が酪酸塩を介したIL-1β放出に必要であるかどうかを調べるため、hMDMにカスパーゼ-1阻害剤（VX-765）またはNLRP3阻害剤（CP-456,773、MCC950またはCRID3としても知られる）を加えてインキュベートした。酪酸塩に加えて、汎HDAC阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）でもhMDMを刺激した。酪酸塩とプロピオン酸塩はHDAC阻害活性を有するが、酢酸塩はHDAC阻害活性を有さないからである23。酪酸塩とTSAの両方がIL-1βの放出を引き起こし、このことから、インフラマソームの活性化がHDAC阻害によって媒介されている可能性が高いことが示された23。VX-765とCP-456,773はともに、TSAと酪酸を介したIL-1β放出（図1D）と酪酸を介したIL-1β切断（図S1C）を阻害することがわかり、酪酸によるIL-1β放出がNLRP3インフラマソームに依存していることが示された。酪酸塩とTSAは、IL-1βよりもはるかに低いレベルではあるが、IL-18の放出も媒介し、これは両阻害剤によって阻害された（図1D）が、これは有意ではなかった。NLRP3インフラマソームの活性化因子として知られるニゲリシンも、同様に両化合物によって阻害され、IL-1βとIL-18の両方の放出を阻止した（図1D）。NLRP3の役割を確認するため、NLRP3またはスクランブル対照のいずれかを標的とするsiRNAをhMDMにトランスフェクトした。NLRP3を標的とするsiRNAは、NLRP3の発現を低下させ（図S1D）、酪酸、TSA、ニゲリシンに対するIL-1β放出を阻止した（図1E）。対照的に、NLRP3標的siRNAはTNFα分泌には影響を及ぼさなかった（図S1E）。これはTLR4の活性化に限ったことではなく、Pam3CSK4（TLR2）、フラジェリン（TLR5）、R848（TLR7/8）でhMDMを刺激すると、IL-1βの切断と放出も刺激された（図1F、S1F）。

もう一つの特徴は、ASCスペックまたはパイロプトソームと呼ばれるインフラマソームアダプターASCの凝集である。hMDMをVX-765存在下、酪酸で、LPSで、またはLPSなしで処理し、コントロールとしてLPSとニゲリシンを用いてASCスペックの形成を評価した。驚くべきことに、LPSと酪酸で処理したhMDMは、わずかな数のASC斑形成しか引き起こさず（図1G）、これらは酪酸が駆動するNLRP3反応には必要ないことを示唆した。これはニゲリシンとは対照的で、ニゲリシンでは強固なASC斑形成が見られた（図1G）。

ASCの斑点形成が見られないことは、ヒト単球がLPSに長時間暴露された場合に観察される活性化の代替経路を彷彿とさせる24。NLRP3活性化因子の大部分とは異なり、代替NLRP3活性化はカリウム流出を引き起こさない。このことがLPSと酪酸によるNLRP3活性化にも当てはまるかどうかを調べるため、LPS、LPSと酪酸、またはLPSとニゲリシン（カリウム流出を誘発する活性化因子）で刺激した後のhMDMで、誘導結合プラズマ質量分析法（ICPMS）を用いてカリウム濃度を測定した。その結果、LPSと酪酸は、LPS単独で処理したhMDMと比較して細胞内カリウム濃度の低下を引き起こさなかったが（図1H）、ニゲリシンに対しては顕著な低下が見られた（図1H）。このことは、酪酸によるNLRP3の活性化にはカリウムの排出は必要ないことを示している。

HDAC1-3および10の阻害は、NLRP3依存性のIL-1β放出を引き起こすのに十分である。
SCFAは、その機能の多くをHDAC活性の阻害を通して媒介する25。NLRP3を活性化する傾向は、それぞれのSCFAがHDAC活性を阻害する効果と相関している。さらに、汎HDAC阻害剤であるTSAは、NLRP3依存性のIL-1β放出も引き起こした。このことは、HDAC阻害がNLRP3非依存性のIL-1β放出を引き起こしたという以前の研究と対照的である26。我々は、HDAC阻害が酪酸の効果を再現するのに十分かどうかを、hMDMをLPSと様々な特異性を持つHDAC阻害剤とインキュベートすることで検証した（図2A）。汎HDAC阻害剤（酪酸と特異性が重複する）もまた、NLRP3の活性化を引き起こした（図2B）。注目すべきことに、HDAC1-3および10の組み合わせを標的とした阻害剤は、LPS存在下でIL-1βの放出をすべて媒介することができたが（図2B）、TNFαの分泌は阻害されなかった（図2C）。このことは、HDAC活性の阻害が、炎症条件下で自発的なNLRP3インフラムソームの活性化を可能にすることを示している。

図2.
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図2.
HDAC1-3および10の阻害は、TLR刺激に応答したNLRP3の活性化を可能にする。
(A）使用したHDAC阻害剤の濃度とその特異性。

(B）HDAC阻害剤単独またはLPS（1ng/ml）で16時間処理したhMDMの無細胞上清から測定したIL-1β放出または（C）TNFα分泌。使用した濃度は、酪酸（10 mM）、Pan（1 μM）、Vor（1 μM）、Quis（0.2 μM）、Fimep（0.1 μM）、Abex（0.1 μM）、SR4370（4 μM）、TMP（0.3 μM）、LMK（20 nM）、Tuba（50 nM）およびSIS-17（1 μM）である。すべての場合において、各ドットは1人のドナーを表し、平均値とSEMを示した。

酪酸とプロピオン酸はLPSによる遺伝子発現プロファイルを調節する
酪酸およびプロピオン酸によるNLRP3の活性化にはHDAC活性の阻害が必要であり、これは比較的長いインキュベーション期間とともに、転写の変化を通して起こっていることを示唆した。LPSが介在するhMDMのトランスクリプトームに対するSCFAの効果を評価するため、LPS存在下で酪酸塩、プロピオン酸塩、酢酸塩で16時間処理したhMDMのRNA-seqを行った。

主成分分析の結果、LPSが処理群間の最大の差異を占めることが示された（図3A）。酪酸塩とTSAは共にクラスター化し、酪酸塩による変化のほとんどがHDAC阻害活性化によるものであることが示唆された（図3A）。実際、酪酸塩とTSAによって変化した遺伝子を比較すると、ほとんど重複した遺伝子シグネチャーが見られた（図S2A）。注目すべきは、LPSに依存しない効果に加えて、両者ともLPSの効果を部分的に逆転させたことである。多くの場合、酪酸塩とTSAはLPSの影響を逆転させ、LPSによって減少した遺伝子の発現を増加させるか、あるいはその逆であった（図3B）。プロピオン酸は、酪酸やTSAと比較して、効果は似ているが弱く（図3A）、酪酸と重複するシグネチャーも示したが（図S2B）、酢酸の効果は最小限であった（図3A）。ヒストンアセチル化は一般に遺伝子転写と正の相関があるにもかかわらず、酪酸、TSA、プロピオン酸は、同程度の数の遺伝子のアップレギュレーションとダウンレギュレーションを引き起こした（図3C）。このことをさらに調べるために、異なる処理によって変化した遺伝子について、ホールマーク遺伝子セットを用いた遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を行った。注目すべきことに、酪酸塩とTSA、そしてより少ない程度ではプロピオン酸塩のGSEAは、炎症性サイトカイン応答、インターフェロン応答、TNFα経路など、ダウンレギュレートされた遺伝子に関連するほとんど同じ用語で濃縮された（図3D）。対照的に、アップレギュレートされた遺伝子に有意に濃縮されたいくつかの用語は、3つの処理間で一貫して同定されなかったことから、SCFAによって活性化された特定の経路はないことが示された（図3D）。SCFAとTSAで濃縮されたパスウェイ間の相関から、LPS駆動遺伝子シグネチャーに対するSCFAの主な効果はHDAC阻害によるものであることが示唆された。

図3.
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図3.
SCFAはHDAC阻害を介してLPSを介したトランスクリプトームを変化させ、ヒストンのハイパーアセチル化を引き起こす。
LPS（1ng/ml）存在下、NaCl、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩（すべて10mM）、TSA（0.5μM）のいずれかで処理したhMDM、または16時間未処理のまま放置したhMDMのRNA-seq解析（A）サンプル間の関係を可視化した多次元尺度（MDS）プロット、n＝3または4。

(B）LPS＋酪酸塩とLPS＋NaClの比較で有意に変化した転写産物の相対発現値を行ごとにスケーリングしたヒートマップ。

(C）SCFAまたはTSAとのインキュベーションによって変化した遺伝子のボルケーノプロット。有意にアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子（調整p値<0.05、絶対log2(fold change)>1）をそれぞれ赤と青で示す。

(D）遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、Molecular Signatures Database（MSigDB）に基づいて、ホールマーク遺伝子セットを用いて行った。プロットは上位10個のホールマーク遺伝子セットを示す。バーは平均log2(FC)で色分けされている。棒グラフの幅はそれぞれの遺伝子セットに含まれる遺伝子数を表す。破線は調整p値閾値を示す。

(E) 「酪酸＋LPS」サンプルと「LPS単独」サンプルを比較した、プロモーターにおけるH3K27acシグナルの差のfold-change（ChIP-seq）と遺伝子発現の差のfold-change（RNA-seq）の相関。相関はスピアマン相関係数（R）で検定した。

(F) プロモーターにおけるH3K27ac ChIP-seqシグナルの増加が10%低い遺伝子と10%高い遺伝子について、「酪酸塩+LPS」対「LPS単独」のRNA-seq fold-changeの分布。

(G) 「LPS+酪酸塩」対「LPS単独」の比較における、RNA-seqまたはH3K27ac ChIP-seqシグナルのいずれかを用いたホールマーク遺伝子セットのGSEAからの正規化濃縮スコア（NES）。両方のデータセットで有意であった遺伝子セット（FDR q-val<0.05）のみを示す。

(H)（GSEAによって）負に濃縮された遺伝子セットに属する遺伝子と正に濃縮された遺伝子セットに属する遺伝子のプロモーターにおけるH3K27acシグナルのフォールド変化（それぞれ青色と赤色）。灰色は全遺伝子の値。

(I)「酪酸＋LPS」と「LPS単独」を比較した、ダウンレギュレート遺伝子（RNA-seq）およびH3K27acの増加が最も少ないプロモーター10％（ChIP-seq）のモチーフ濃縮解析。*p<0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001（ウィルコクソンの検定による）。

これらの所見から、SCFAを介したHDAC阻害が、炎症性およびインターフェロン関連遺伝子の転写を変化させる可能性が示唆された。酪酸塩とプロピオン酸塩がHDAC阻害剤として知られていることから、酪酸塩がヒストンのアセチル化をどのように変化させるかを調べた。まず、酪酸塩が、エンハンサーやプロモーターにおける活発な転写の特徴である、ヒストンH3上のアセチル化リジン27（H3K27ac）の総量を増加させることを明らかにした（図S2C）。次いで、クロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seq）を行い、H3K27acの増加のゲノム分布を明らかにした。ChIP-seqは、グローバルなアセチル化の増加を考慮し、スパイクインクロマチンで正規化した。イムノブロットで観察されたアセチル化亢進と一致して、酪酸は総アセチル化ピーク数を約4倍増加させ（図S2D）、WBで観察されたアセチル化亢進と一致して、プロモーターと遺伝子間ピークの両方でH3K27acの全般的な増加を引き起こした（図S2E）。しかし、遺伝子プロモーターにおけるH3K27acの増加は不均一に分布し、酪酸による遺伝子発現の変化と有意な相関が見られた（図3E）。アセチル化の増加が最も少ない遺伝子は転写が減少する傾向があり、逆もまた同様であった（図3F）。同様に、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）では、発現低下遺伝子の中で濃縮されたパスウェイが、アセチル化度の低い遺伝子の中でも有意に濃縮されていることが示され、「インターフェロン」、「炎症反応」、「NF-kB」などのパスウェイが含まれていた（図3G）。これらのパスウェイに属する遺伝子は、全遺伝子の平均やアセチル化が高い特定のサブセットよりもアセチル化の増加が少なかった（図3H）。RNA-seqでダウンレギュレートされた遺伝子プロモーター（But + LPS vs. LPS）およびH3K27acの増加が最も少なかった遺伝子の10％（But + LPS vs. LPS）の転写因子（TF）結合モチーフの濃縮は、インターフェロン関連転写因子の有意な濃縮を示した（図3I）。対照的に、アップレギュレートされた遺伝子またはH3K27acが最も増加した遺伝子からのTF結合モチーフの濃縮は、一般的なプロモーター結合TFを示し、一貫したパスウェイは見られなかった（図S2F）。

RNAレベルで見られた変化が、タンパク質レベルの変化に引き継がれるかどうかを調べるため、LPS+/-酪酸またはTSAとインキュベートしたhMDMのプロテオミクスを行った。RNA-seqの結果と比べて、制御されたタンパク質の数はかなり少なかったが（図S2G）、多次元尺度プロット（図S2H）と階層的クラスタリング（図S2I）によって、酪酸塩とTSAは依然としてクラスタリングされた。GSEAでは、RNA-seqと同様の経路が変化していることが示され、RNA-seqデータで観察された変化がタンパク質レベルでも起こっていることが示された（図S2J）。

SCFAはcFLIPとXIAPの発現を減少させる
炎症反応に関与する遺伝子の酪酸およびTSA依存的な減少は、特に興味深いものであった。これまでの研究で、TLRの関与に続いてNF-kBシグナル伝達経路が阻害されると、カスパーゼ-8が活性化され27,28、場合によってはNLRP3インフラムソーム29の活性化につながることが示されている。

我々は、カスパーゼ-8の活性化を制御することが知られているタンパク質の発現の変化についてRNA-seqデータセットを分析し、LPSとの関連において、酪酸とTSAがカスパーゼ-8の2つの重要な制御因子であるcFLIP（CFLAR）とXIAPの発現を減少させることを見出した（図4A）。酪酸によって誘導された遺伝子発現とH3K27ac変化との間のグローバルな相関と一致して、CFLARとXIAP遺伝子はともにプロモーターアセチル化の増加が最も少ない10％の中に入っていた（図4B）。発現の減少をqPCRで確認したところ、酪酸とTSAはLPSの前処理にかかわらず、両遺伝子の転写産物を減少させた（図4C）。

図4.
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図4.
酪酸によるcFLIP発現低下はNLRP3インフラマソームの活性化に必要である。
(A）LPS＋酪酸塩とLPS＋NaClの比較で有意に変化した転写産物の細胞死関連遺伝子の発現値の相対的サブセットの発現をヒートマップで描き、行ごとにスケーリングした（n=3）。

(B）LPS＋酪酸塩処理サンプルにおけるH3K27acシグナルの倍数変化で並べた全遺伝子のランキング。

(C) qPCRで評価したCFLARとXIAP発現。LPS（1ng/ml）、またはLPSと酪酸（10mM）で記載した時間処理したhMDMと、(C) cFLIPLまたはXIAPをWESで評価し（D）、(E)で定量した。(B)と(C)は6回の独立した実験の代表であり、(D)のブロットは4回の独立した実験の代表である。

(F）（D）の無細胞上清から測定したIL-1β放出。

(G）cFLIPLまたはベクター単独で形質転換し、LPS（1ng/ml）および／または酪酸（5mM、16時間）または針状アメーバ（1μg/mlの針状アメーバ、1μg/mlのPA、1.5時間）で刺激したhMDMからのIL-1β放出測定。

(H）（G）のhMDMのイムノブロット、3つの独立した実験の代表。データは、特に断りのない限り、平均値+/- SEMで表され、各ドットはすべてのケースで1人のドナーを代表する。*p<0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001は、トルコを用いた一元配置分散分析（C）またはSLJídákの多重比較検定を用いた二元配置分散分析（F）のいずれかによって求めた。

cFLIPは複数のアイソフォーム、長いアイソフォーム（cFLIPL）または2つの短いアイソフォーム（cFLIPRまたはcFLIPS）で転写される30。LPSおよび／または酪酸塩処理によってcFLIPが減少するかどうかをイムノブロットで評価したところ、RNAレベルでの変化と一致して、cFLIPの長アイソフォームと短アイソフォームの両方の発現が酪酸塩存在下で減少することがわかった（図S3A）。次に、cFLIPとXIAPの発現とIL-1β放出の経時的な相関を調べたところ、cFLIPLは4時間後にはほとんど見られなくなり、次いで8時間後に一時的に増加し、その後完全に消失した（図4D, 4E）。cFLIPの消失は、最初のIL-1β放出を観察した時間と相関していた（図4F）。一方、XIAPは時間経過とともに減少したが、12-16時間までは完全に消失しなかった（図4D, 4E）。cFLIPの消失が遺伝子発現の変化によるものであることを確認するために、cFLIPの分解を評価した。しかし、プロテアソームの阻害剤は、この時間枠ではcFLIPタンパク質レベルに影響を与えなかった（図S3B）。

NLRP3インフラマソームの活性化には、酪酸依存的なcFLIP発現の抑制が必要である。
IL-1β放出とcFLIP発現消失との相関から、cFLIPがNLRP3の活性化を制御していることが示唆された。cFLIPの欠損がSCFAを介したNLRP3活性化の原因であるかどうかを調べるため、hMDMにcFLIPL-T2A-mCitrineまたはmCitrine単独をコードするレンチウイルスを導入し、酪酸とLPSで刺激した。導入効率を100％に近づけるため、ウェルあたりの細胞数を減らした。cFLIPの外因性発現は、LPSおよび酪酸を介したIL-1β放出を阻止し（図4G）、cFLIPがNLRP3の活性化を阻害するのに十分であることを示した。cFLIPは、酪酸非存在下でも内因性発現と同程度のレベルで発現しており（図4H）、この効果は過剰発現によるものではないことが確認された。

酪酸を介したNLRP3の活性化はカスパーゼ-8に依存している
cFLIPの発現消失がNLRP3の活性化に必要であることから、カスパーゼ-8の活性化がNLRP3の活性化に必要であることが示唆され、HDAC阻害がカスパーゼ-8の活性化を誘発することが以前に証明されている26。そこで、LPS、酪酸またはその組み合わせで刺激したhMDMのカスパーゼ-8活性を評価したところ、酪酸はLPS非存在下でも存在下でもカスパーゼ-8活性を上昇させることがわかった（図5A）。カスパーゼ-8がNLRP3の活性化に必要であるかどうかを調べるため、LPSと酪酸塩で刺激する前に、hMDMをカスパーゼ-8阻害剤であるz-IETD-fmkでプレインキュベートしたところ、カスパーゼ-8阻害はNLRP3依存性のIL-1β放出（図5B）と切断（図5C）、およびカスパーゼ-1切断（図5D）を確かに有意に減少させた。この結果を、カスパーゼ-8に対するsiRNAを用いて確認したところ、カスパーゼ-8の発現が部分的に消失した（図5E）。カスパーゼ-8の部分的欠損も同様に、酪酸介在性のNLRP3活性化を減少させた（図5F）。注目すべきことに、我々の実験で用いた濃度のVX-765はカスパーゼ-8活性を阻害しなかったことから、カスパーゼ-8がNLRP3-インフラムソーム活性化の上流にあることが確認された（図S4A）。

図5.
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図5.
酪酸を介したNLRP3-インフラムソームの活性化はカスパーゼ-8に依存し、RIPK1によって抑制される
(A) hMDMを培地、酪酸（10 mM）またはLPS（1 ng/ml）の単独または組み合わせで16時間処理し、細胞内カスパーゼ-8の活性をCaspase-Glo® assayキットを用いて評価した（発光はカスパーゼ-8活性に比例する）。発光はカスパーゼ-8活性に比例する。

(B）活性化因子で処理する30分前にZ-IETD-FMK（5μΜ）の存在下または非存在下で、hMDMの無細胞上清中のIL-1βを培地、LPS（1ng/ml）または酪酸（10mM）の単独または組み合わせで16時間処理した。3回の独立した実験を示す。

(C）活性化因子で処理する0.5時間前にCP- 456,773（2μΜ）、VX-765（40μΜ）またはZ-IETD-FMK（5μΜ）の存在下または非存在下で（B）と同様に処理したhMDMのイムノブロット。Supは沈殿上清、全細胞溶解液（WCL）。2回の独立した実験の代表。

(D）（C）と同様に処理したhMDMをカスパーゼ-1についてブロットしたイムノブロット。Supは沈殿上清、全細胞溶解液（WCL）。2回の独立した実験の代表。

(E）培地、LPS（1ng/ml）またはLPS（1ng/ml）＋酪酸（10mM）で16時間刺激する前に、スクランブルsiRNA、RIPK1 siRNAまたはカスパーゼ-8 siRNAのいずれかでエレクトロポレーションしたhMDMからのWCLのイムノブロット。

(F) スクランブルsiRNAまたはカスパーゼ-8 siRNAでエレクトロポレーションしたhMDMの無細胞上清から、培地、LPS（1 ng/ml）またはLPS（1 ng/ml）＋酪酸（10 mM）で16時間刺激したときのIL-1β放出。hMDMの無細胞上清からのIL-1β放出は、ネクロスタチン-1（1μΜ）の存在下または非存在下で、培地、LPS（1ng/ml）または酪酸（10mM）の単独または組み合わせで16時間処理した。

(G）、またはスクランブルコントロール（scr.ctl）またはRIPK1（H）に対するsiRNAでエレクトロポレーションした。

データは5回（FとH）または3回（G）の独立した実験を示す。データは、特に断りのない限り、平均 +/- SEMで表され、各ドットはすべてのケースで1ドナーの代表である。*p<0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001は、トルコを用いた一元配置分散分析（AおよびB）またはSLJídákの多重比較検定を用いた二元配置分散分析（F、GおよびH）のいずれかによって求めた。

酪酸を介したNLRP3の活性化はRIPK3とは独立しているが、RIPK1によって抑制されている。
カスパーゼ-8は、活性化されたRIPK1またはTRADDのデスドメインが関与すると、足場となるアダプタータンパク質FADDと結合することによって促進されるオリゴマー化によって活性化される。RIPK1にはキナーゼ依存的な機能と独立した機能の両方があるため、まずRIPK1阻害剤Necrostatin-1（Nec1）とsiRNAによるノックダウンの両方を用いて、RIPK1が必要かどうかを調べた31。Nec1を用いてRIPK1キナーゼ活性を阻害すると、LPSと酪酸によるNLRP3の活性化はわずかで有意ではなかった（図5G）。RIPK1が酵素的に独立した機能を持っているかどうかを調べるため、siRNAを用いてRIPK1をノックダウンした。RIPK1をノックダウンすると、RIPK1の発現が効果的に減少した（図5E）。驚くべきことに、RIPK1をノックダウンすると、LPSと酪酸依存性のIL-1β放出が大幅に増加し、LPS単独に応答したIL-1β放出が可能になった（図5F）。この効果はIL-1βに限られ、TNF-αはRIPK1の阻害でもノックダウンでも変化しなかった（図S4B）。この結果は驚くべきことであり、RIPK1がhMDMにおける酪酸と自発的NLRP3活性化の両方の負の制御因子であることを示している。次に、RIPK3をsiRNAでノックダウンして調べたところ、標的を欠損させても（図S4C）、酪酸を介したNLRP3の活性化には影響を及ぼさなかった（図S4D）。

酪酸によるNLRP3インフラムソーム活性化にはIL-10分泌の喪失が必要である。
IL-1β放出の増加とともに、酪酸はIL-6、IL-10、IL-12p40を含む他のサイトカインの分泌を減少させた（図1A）。特にIL-10は腸の恒常性維持に重要であり、これは部分的にNLRP3インフラムソームの活性化を阻害することによってもたらされる32。我々のシークエンシングとサイトカインビーズアレイのデータに従って、IL-10の分泌は、LPSと酪酸との共培養によって、IL-1β放出の引き金となるのに必要な濃度と同程度の1mMという低濃度でも、完全にブロックされることがわかった（図6A）。このことは、様々なTLRリガンドにおいても一貫していた（図S5A）。CFLARとXIAPと同様に、IL-10遺伝子座は、酪酸とLPSの後に、他の発現遺伝子と比較してアセチル化がほとんど増加しなかった（図6B）。そこで、IL-10の消失がHDAC阻害にも起因するかどうかを調べ、クラス1 HDACの阻害（図6C）がIL-10の発現と分泌を阻害するのに十分であることを突き止めた。IL-10分泌の喪失がNLRP3活性化の必要条件であるかどうかを調べるため、組換えIL-10の存在下または非存在下で、細胞をLPSと酪酸で処理した。IL-10を予めインキュベートしておくと、LPSと酪酸によるNLRP3の活性化が完全に消失したことから（図6D）、酪酸を介したNLRP3の活性化には、IL-10または同じシグナル伝達経路を活性化する他のサイトカインの消失が必要であることが示された。

図6.
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図6.
STAT3を活性化するサイトカインの欠損は、酪酸によるNLRP3インフラムソームの活性化に必要である。
(A）hMDMを酪酸塩（10mM）またはLPS（1ng/ml）の単独または併用で、示した期間処理した無細胞上清からIL-10を測定した。データは3回の独立した実験を示す。

(B）LPS＋酪酸で処理したサンプルにおけるH3K27acシグナルの倍数変化で並べた全遺伝子のランキング。

(C) LPS +/- HDAC阻害剤で処理したhMDMの無細胞上清から測定したIL-10。データは5回の独立した実験を示す。

(D）LPS（1ng/ml）および酪酸（10mM）でインキュベートしたhMDMからのIL-1β放出。データは3回の独立した実験を示す。

(E) rhIL-6（100ng/ml、0.5時間）またはrhIL-10（100ng/ml、0.5時間）で前処理したhMDMを、培地、LPS（1ng/ml）または酪酸（10mM）の単独または組み合わせで16時間処理した後の、リン酸化STAT3（Y705）、総STAT3およびβ-チューブリンのイムノブロット。

(F）IL-10Rαブロッキング抗体で30分間プレインキュベートした後、LPS（1ng/ml）またはLPS（1ng/ml）＋酪酸（10mM）で16時間培養したhMDMからのIL-1β放出。

(G)培地、LPS(1 ng/ml)または酪酸(10 mM)の単独または組み合わせで16時間処理する前にrhIL-10(100 ng/ml、0.5時間)で処理したhMDMのリン酸化cFLIPL、cFLIPSおよびβ-アクチンのイムノブロット。

データは、特に断りのない限り、平均 +/- SEMで表され、各ドットはすべてのケースで1ドナーの代表である。

IL-10は以前、大腸炎モデルにおいてSTAT3の活性化を通じてNLRP3を阻害することが示された21。そこで、腸におけるNLRP3の制御因子として知られるSTAT3が、酪酸とLPSによる前処理によっても不活性化されるかどうかを評価した。その結果、LPSはSTAT3のTyr705でのリン酸化を引き起こし、このリン酸化は酪酸の添加によって消失した（図6E）。これは、他のTLRの活性化にも応答して観察された（図S6B）。注目すべきことに、IL-10はTyr705におけるSTAT3のリン酸化を回復させ（図6E）、酪酸がサイトカイン転写の阻害を通してSTAT3の活性化を阻害することを示した。

IL-10シグナルの消失がNLRP3を活性化するのに十分であるかどうかを調べるため、刺激の前に、IL-10レセプターを阻害する抗体（IL10Rα ab）またはIL-10を中和する抗体（Neu. いずれの方法でもIL-10シグナルを阻害すると、LPSと酪酸の存在下でIL-1β放出が増加した（図6E、S5D）。しかし決定的なことは、どちらもLPS単独存在下でのIL-1β放出を可能にしなかったことである（図6E, S5D）。これはIL-1β放出に特異的で、どちらの抗体も、LPS単独で処理したhMDMの最高濃度を除き、いずれの条件でもTNFα分泌を変化させなかった（図S5C, D）。次に、STAT3の切除が、siRNAを介したノックダウンによってhMDMのNLRP3を活性化するのに十分であるかどうかを決定した。STAT3を標的とするsiRNAは、いずれもSTAT3発現を効果的に消失させた（図S5E）。しかし、STAT3ノックダウンにより、LPSと酪酸存在下でのIL-1β放出は増加したが、LPS単独でのIL-1β放出は有意には増加しなかった。対照的に、TNFα分泌はSTAT3ノックダウンによって変化しなかった（図S5F）。これらの結果は、IL-10シグナルやSTAT3シグナルを阻害しても、NLRP3を活性化するには不十分であることを示している。

他の文脈では、IL-10シグナルはSTAT3の活性化を通してcFLIPの発現を増加させるので、cFLIPの発現を回復させることによって酪酸介在性NLRP3の活性化を阻害しているのかもしれない。これが事実かどうかを調べるため、酪酸塩非存在下または存在下で、組み換えIL- 10をLPSとともにhMDMに添加し、cFLIPの発現を評価した。しかし、IL-10はいずれのcFLIPの発現も増加させなかったことから（図6F）、IL-10による酪酸介在性NLRP3活性化の阻害は、cFLIPの制御とは無関係であることが示された。

酪酸介在性NLRP3活性化は細胞死を引き起こさないが、ガスダミンD非依存性IL-1β分泌を促進する。
酪酸塩がNLRP3を活性化する経路を確立したので、次に酪酸塩を介したNLRP3活性化が細胞に及ぼす影響を調べた。我々の以前のデータでは、hMDMはLPSと酪酸に反応してIL-1βを容易に放出したが、LDHは放出しなかった（図1C）。このことをさらに明らかにするため、LPS、酪酸、あるいは両者の組み合わせで16時間以上処理したhMDMで、排除色素を用いて細胞膜の完全性を評価した。LDH放出の欠如と一致して、LPSと酪酸で処理したhMDMは色素の取り込みや形態の変化を示さず（図7A）、細胞死を起こさないことが示唆された。このことは、LPSとニゲリシンで処理したhMDMでは、処理後の早い段階で色素の取り込みが起こったことと対照的であった（図7A）。この結果は意外であったので、次にパイロプトーシスの主要なエフェクターであるガスダーミンD（gsdmD）がLPSと酪酸に反応して切断されるかどうかを評価した。しかし、LPSとニゲリシンで処理したhMDMには存在していた活性型p30 c末端フラグメントは検出されなかった。代わりに、不活性なp43フラグメントが検出された（図7B）。gsdmDの機能的な必要性を評価するために、siRNAを使ってノックダウンしたが（図7C）、これもLPSと酪酸を介したIL-1β分泌には効果がなく（図7D）、gsdmDの独立性が確認された。

図7.
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図7.
酪酸を介したNLRP3活性化は、ガスダミンDおよび細胞死とは無関係にIL-1β分泌を誘発する
(A）hMDMを、培地、LPS（1 ng/ml）または酪酸塩（10 mM）の単独または組み合わせで24時間、あるいはLPS（10 ng/ml、3時間）とニゲリシン（10 μM）で処理する前に、生細胞イメージング色素Diyo-1（1:10,000）でインキュベートした。細胞死解析はIncuCyteバイオイメージング・プラットフォームを用い、1ウェルあたり4枚の画像を1～2枚おきに24時間撮影した。（A）の上段に示した代表的な画像は24時間後のもので、（A）の下段に示した24時間後の蛍光色素Diyo-1カウント/画像は4枚/ウェルの平均値である。これを用いて平均細胞数/画像/ウェルを算出し、膜透過化細胞を示した。n = 4のうち代表的な1つの実験（技術的重複あり）を示す。

(B）hMDMを培地、LPS（1ng/ml）またはLPS（1ng/ml）＋酪酸（10mM）で16時間処理、あるいはLPS（1ng/ml、3時間）でプライミングした後、NLRP3インフラマソーム活性化因子ニゲリシン（10μM、1.5時間）を投与した。全長、切断型gsdmDおよびローディングコントロールとしてのβ-アクチンのレベルをウェスタンブロットで評価した。ブロットは3つの独立した実験の代表である。

(C）スクランブルsiRNAまたはgsdmD siRNAでエレクトロポレーションしたhMDMを、培地、LPS（1ng/ml）またはLPS（1ng/ml）＋酪酸（10mM）で16時間刺激したときのイムノブロット。

(D）（C）と同様に処理したhMDMの無細胞上清からのIL-1β。（B）と同様に処理したhMDMであるが、代わりに免疫ブロット法で切断型カスパーゼ-3または切断型カスパーゼ-7（E）またはgsdmE（F）について分析した。

いずれの場合も3-5人のドナーの平均値とSEMを示し、各ドットは1人のドナーを表す。イムノブロットは2つの独立した実験を代表する。

gsdmDのp43断片は、gsdmDを不活性化するカスパーゼ-3によって切断されると形成される。そこで、LPSと酪酸とのインキュベーション後、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7の切断を評価したところ、両者の活性型、切断型がhMDM中に存在することがわかった（図7E）。注目すべきことに、カスパーゼ-3および-7の活性化は、酪酸塩を介したカスパーゼ-8の活性化と同様に、LPSとのプレインキュベーションとは無関係であり、複数のカスパーゼが酪酸塩によって活性化されることが示された。ガスダーミンD以外のガスダーミンも細胞死とIL-1β放出の両方に関与しており、ガスダーミンE（gsdmE）はカスパーゼ-3によって切断され活性化される34。これらの細胞ではカスパーゼ-3も活性であったので、gsdmEが活性型に切断されるかどうかを評価したが、LPS条件と酪酸単独、あるいはLPSと酪酸のいずれでも切断に差は見られなかった（図7E）ことから、gsdmEもIL-1β放出には必要ないことが示された。

考察
SCFAは、定常状態では上皮バリアの維持と免疫細胞のプログラミングの両方に寄与している35,36。しかし、腸管バリアが透過性になった条件下で、SCFAが免疫反応においてどのような役割を果たすかは不明である。私たちの発見は、SCFAの作用が、それらが感知される状況によって異なることを示している。定常状態ではSCFAがマクロファージにもたらす抗菌プログラムとは対照的に、酪酸とプロピオン酸は、病原体や危険に関連した分子パターンが存在すると、炎症促進プログラムを引き起こすことが示された。これは主に、NLRP3インフラマソームの活性化と、それに続くIL-1βの放出によって媒介される。NLRP3は、TLRの刺激と同時に酪酸またはプロピオン酸に暴露されることで活性化され、病原体由来の分子がその存在下でIL-1β放出の引き金となるのに十分であることを示した。同時に、酪酸塩とプロピオン酸塩は、抗炎症分子IL-10とIL-1RAを含む多くのLPS誘導性サイトカインの発現と分泌を減少させ、NLRP3依存性IL-1β放出の効果を増幅させた。重要なことは、酪酸とプロピオン酸は生菌によってのみ産生され、マクロファージによって危険信号として感知されることである。したがって、炎症条件下では、酪酸とプロピオン酸はvita-PAMPsと呼ばれる、細菌の生存を知らせる微生物由来の産物である37。SCFAsの継続的な合成が必要であることは、これまでに特徴づけられた他の2つのvita-PAMPs、環状-ジ-アデノシン-一リン酸（c-di-AMP）および原核生物のメッセンジャーRNA（mRNA）と一致しており、どちらも生きた細菌によって活発に合成される必要がある38。危険シグナルとしての酪酸とプロピオン酸の作用は、重要なIL-1調節機構であるIL-1RAを阻害することによってさらに証明され、IL-1βを介した炎症反応が確実に伝播して炎症を引き起こす。

酪酸とプロピオン酸のVita-PAMP活性は、HDACを阻害する能力によって媒介されていると考えられる。HDAC、特にHDAC1-3と10を阻害すると、酪酸とプロピオン酸の作用、すなわちNLRP3の活性化とLPSを介したサイトカイン応答の調節の両方が再現された。このことは、免疫受容体によって直接検出される、先に述べた2つのvita-PAMPsとは異なる。注目すべきは、酪酸またはTSAによるHDAC阻害は、トランスクリプトームに重大な変化を引き起こし、特にNLRP3インフラムソームの活性化を防ぐのに必要な2つの重要遺伝子、CFLARとIL10の転写が失われたことである。このことは、酪酸とプロピオン酸がNLRP3インフラムソーム活性化の多面的プログラムに関与していることを示している。興味深いことに、ゲノム全体でH3K27acが増加しているにもかかわらず、CFLARとIL10の発現が失われた。このことは、HDAC阻害によってヒストンのアセチル化パターンが変化し、ヒストンのハイパーアセチル化が引き起こされることを示唆している。この現象は、酪酸や他のHDAC阻害剤がISGの発現低下を引き起こすという、ISGに関して以前に観察されている39。この研究では、HDAC1/2阻害によるヒストンの過剰アセチル化によって、エピジェネティックリーダーであるBrd4と伸長因子P-TEFbが他のヒストンに再局在化し、ISG遺伝子座から遠ざかり、ISGの発現が失われることが示された。cFLIPとXIAPの発現消失と、アセチル化の増加が見られないことの間に相関があることから、これらの遺伝子の発現も同じメカニズムで制御されている可能性が示唆される。病原体に対する反応に重要なISGとインターフェロン関連遺伝子の発現が、細胞死防止に不可欠な遺伝子と結合しているのは、ISGの発現が阻害された場合に細胞が確実に死ぬためのメカニズムかもしれない。このことは、HDAC阻害剤が潜在的な治療法として提案されているインターフェロン異常症の治療に大いに関係している。ヒストンアセチル化の変化と細胞死との関連を探る研究がさらに進めば、病原体が介在する細胞死と、自己炎症性疾患や免疫疾患の治療薬としてのHDAC阻害剤の両方において、エピジェネティックな調節をよりよく理解することにつながる可能性がある。

cFLIPの発現抑制に加えて、酪酸によるNLRP3活性化にはIL-10の発現と分泌の低下も必要であった。この作用は、HDAC阻害とそれに続くIL-10遺伝子座の転写装置の消失によって媒介される可能性が高い。IL-10はSTAT3の活性化を制御することによってNLRP3の活性化を制御していた。hMDMでSTAT3を欠損させると、LPSとのインキュベーション後に自然にNLRP3が活性化されたからである。興味深いことに、IL-10によるNLRP3の阻害は、cFLIPの制御とは無関係であり、IL-10/STAT3軸がカスパーゼ-8活性とは無関係にNLRP3の活性化を制御していることを示唆している。このことは、IL-10の存在が、細胞死を制御するのではなく、カスパーゼ-8に依存した細胞死が炎症性かそうでないかを決定することを示唆している。それは、免疫学的にサイレントな死であるアポトーシスを活性化するか、IL-1βの放出を継続させるかに基づいている。また、SCFAによるNLRP3の活性化には、LPS-トランスクリプトームに対する複数の異なる摂動が必要であることも示している。

cFLIP発現の消失は、カスパーゼ-8の活性化を可能にし、この活性化はNLRP3インフラムソームのトリガーとして必要であった。カスパーゼ-8の活性化は、病原体によるNF-kBを介した炎症反応の阻害を防御するための重要な細胞防御機構である40。実際、NF-kBシグナル伝達経路に不可欠なキナーゼであるTAK1を阻害するだけで、cFLIPの発現が失われ、カスパーゼ-8依存性の細胞死が引き起こされる41。しかし、このシグナル伝達カスケードの阻害以外に、炎症性遺伝子の発現を阻害する他のメカニズムが、どのようにしてカスパーゼ-8の活性化を引き起こすのかは不明である。ここでわれわれは、エピジェネティクスを介したcFLIPの消失が、この現象が起こる新しい経路であることを示した。病原体が介在する転写と翻訳の損失、あるいはcFLIPに特異的な損失に焦点を当てたさらなる研究が、細胞死と免疫の促進につながる可能性がある。

酪酸を介したNLRP3活性化に伴うカリウム流出、ASC斑形成、細胞死がないことは意外であった。このことは、単球のLPSによって引き起こされるNLRP3活性化の代替経路24や、ox-PAPCに反応するNLRP3亢進42を彷彿とさせる。実際、酪酸によってカスパーゼ-1、-3、-7が活性化されたにもかかわらず、IL-1βの放出はgsdmDとgsdmEとは無関係であり、細胞が排除色素に対して透過性にならなかったことと一致することから、IL-1βの放出には孔形成タンパク質は関与していないことが示唆された。酪酸に反応してIL-1βがどのように放出されるかは不明であるが、1つの可能性として、オートファジー系に依存する非古典的分泌経路があり、他の文脈でIL-1βを放出することが示されている43。あるいは、最近、切断されたIL-1βはゴルジ体に移動し、正規の分泌経路を通って分泌されることが示された44。正確なメカニズムや、活性型カスパーゼが複数あるにもかかわらずhMDMが生き残るメカニズムについては、さらなる研究が必要であろう。

IBD患者やマウスの大腸炎モデルにおいて、腸の健康に有益な効果と有害な効果の両方が示唆されている11。彼らは、SCFAが生成されるタイミングが、抗炎症として機能するか、炎症促進として機能するかに影響することを示唆している。腸管上皮バリアが破られ、TLRリガンドやTNFαを含む炎症性サイトカインが存在するようになると、SCFAが生成され、NLRP3インフラムマソームが活性化されるため、IBDの発症を抑制するのではなく、むしろ助長することになる。これは、SCFAによって他のサイトカイン、特にIL-10が減少し、STAT3が活性化されないことによって悪化する。IBDの様々な病期における食物繊維の役割を検討するさらなる研究は、どのような状況において食物繊維が有益で、どのような場合に有害となるかを解明するのに役立つであろう。

材料と方法
実験モデルと被験者の詳細
健康なドナーのバッフィーコートを、ボン大学の施設審査委員会（local ethics votes Lfd. Nr. 075/14）が認めたプロトコルに従って入手した。

初代ヒトマクロファージの単離と培養
ヒトPBMCは、Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）で密度勾配遠心してバフィーコートから得た。PBMCは、モノクローナル抗ヒトCD14 Abs（Miltenyi Biotec）を結合させた磁性マイクロビーズと4℃でインキュベートし、製造者の指示に従ってポジティブ磁気選択により単離した（Miltenyi Biotec）。初代ヒトマクロファージは、10％FBS（Thermo Fisher社製）、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1×GlutaMAX、1×ピルビン酸ナトリウム（いずれもLife Technologies社製）を含むRPMI1640培地（Life Technologies社製）中で、500U／mLの組み換えヒトGM-CSF（ImmunoTools社製）を用いてCD14＋単球を3日間分化させることにより作製した。ヒト単球由来マクロファージ（hMDM）は、10％FBS（Thermo Fisher社製）、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1×GlutaMAX、1×ピルビン酸ナトリウムを含むRPMI1640培地（Life Technologies社製）で培養した。

インフラムマソーム刺激
炎症酵素刺激アッセイでは、hMDMを採取前にLPS（1 ng/ml）およびSCFAs（0.1-10 mM）と16時間インキュベートした。ニゲリシンおよび針毒刺激 hMDMをLPS（1ng/ml）でO/N刺激した後、翌日、試料採取前にニゲリシン（8uM）または針毒（Lfn-PrgI 10ng/ml、PA 10ng/ml）で1.5時間刺激した。

サイトカイン分泌の測定
96ウェルプレートに1 x 105 hMDM/ウェルを100μlずつ播種した。50μlのLPSおよび/またはSCFA（0.1～10mM）を同時に添加し、hMDMを16時間インキュベートした。サイトカイン濃度は、HTRF または ELISA により、製造業者の説明書に従って測定した。一部の測定にはBio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assayキットを使用した。

カスパーゼ-8活性測定
1.5 x 105 hMDM/ウェルを白色96ウェルプレートに100μlずつ播種した。100μlの標記刺激を細胞に添加した。細胞を16時間培養した。その後、プレートを340 x gで5分間遠心し、サイトカイン測定用に上清を回収した。細胞をPBSで1回洗浄した。その後、MG-312を含む25μlのカスパーゼ-8 Gloアッセイバッファーを直ちに細胞に添加した。暗所で30～60分間インキュベートした後、SpectraMax i3システムで470 nmの発光シグナルを測定した。

乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイ
LPSと酪酸による処理に対するhMDMの細胞生存率を測定するため、細胞死の指標として上清中の放出LDH活性を測定し、定量した。1×105個のhMDMを、0.1％FCSを含む100μlのRPMI1640培地に96ウェルプレートに播種した。さらに100μlの指示刺激を細胞に添加し、16時間培養した後、プレートを340 x gで5分間遠心し、上清から非付着細胞を除去した。一方、キット付属の1×溶解バッファー（Pierce LDH cytotoxicity Assay）200μlを用い、陽性対照としてコントロール細胞を溶解した。その後、25μlの上清と25μlのLDHアッセイバッファーを透明な384ウェルプレートに移して混合し、暗所で30分間インキュベートした。その後、吸光度をSpectraMax i3システムで490 nmと680 nmで測定した。

初代ヒトマクロファージにおける小干渉RNA（siRNA）エレクトロポレーション
初代ヒトマクロファージにおけるsiRNAを介したノックダウン実験はすべて、Neon Transfection System (MPK5000; Invitrogen)を用いたエレクトロポレーションによって行った。各反応には1.2～1.5 x 106 hMDMを用い、これを10μlのバッファーRと75pmol（1.5μl）のsiRNAと混合した。その後、10μlのNeon Pipette Tipを用いてサンプルを取り出し、以下のプロトコールでエレクトロポレーションした： 1400V、20ms、2パルス。エレクトロポレーションされた細胞は、抗生物質を含まない10％FCS RPMI培地で3日間培養した。ノックダウン効率の低いsiRNAでは、最初のエレクトロポレーションから3日目に再度エレクトロポレーションを行い、抗生物質を含まない10%FCS RPMI培地でさらに2日間培養する必要がある。0.5～1×106個の細胞を、cOmpleteTM EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む30μlのRIPAバッファーで溶解し、ウェスタンブロットまたはWESによるsiRNAを介したノックダウン効率の検証用のサンプルを調製した。

クローニング
CFLAR WTは、addgeneプラスミド#82936からPCRによりクローニングした後、制限酵素消化とライゲーションにより、マウスホスホグリセレートキナーゼ1（PGK）プロモーター、C末端T2A、mCherry、Puromycin選択カセットを含むレンチウイルスベクターに挿入した。

初代ヒトマクロファージのレンチウイルス導入
ウイルス含有上清を産生するために、7x106個のHEK293T細胞を10cmディッシュの完全DMEM中にプレーティングした。16-24時間後、HEK293T細胞に、目的の遺伝子をコードするレンチウイルス構築物（1ウェルあたり2μg）、またはVpx-Vpr制限因子をコードするベクター45とpPAX2（1μgウェル）、pMD2.G（100ng/ウェル）プラスミドをPEI MAX（Polyscience, 24765-100）を用いてトランスフェクトした。細胞を37℃、5％CO2で約12時間培養した後、培地を30％HI-FBSを含むRPMIに交換し、細胞をさらに36時間培養した。36時間後、18Gの鈍針を取り付けた10mLルアーロックシリンジを用いてウイルス上清を回収し、0.45mmフィルターユニットを用いて50mLファルコンに濾過した。製造元の指示に従ってLentiX-concentratorを添加し、上清を4℃で一晩インキュベートした。遠心分離（1500xg、50分、4℃）によりウイルスを回収し、完全RPMIに再懸濁した。Vpx-Vprウイルスを目的の遺伝子を含むウイルスと1:1の割合で混合し、8μg/mlのポリブレンを加え、完全RPMIで1:7に希釈した。 hMDMを形質導入前日に96ウェルプレートに0.4x105細胞/ウェルで形質導入用に播種し、一晩接着させた。ウイルスを含む培地をhMDMに加え、37℃、5％CO2で約14時間培養した。培養後、細胞を遠心分離で回収し、ウイルス含有培地を除去して完全なRPMIに置き換えた。実験は導入後24時間行った。

細胞カリウム定量
処理後、hMDMから上清を除去し、カリウムフリー平衡塩溶液（125mM NaCl、5mM N-メチル-グルカミン塩化物、2mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM グルコース、10mM HEPES pH7.4.）で3回洗浄し、1mlのddH2Oで溶解した。細胞を3回凍結融解して溶解し、上清を採取して遠心分離で清澄化した。清澄化した上清からICP-MSでカリウムを測定した。

免疫ブロッティング
PhosSTOPと完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）を添加したRIPAバッファー（20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 0.1% SDS and 0.5% deoxycholate）を用いて、最大1×106個の細胞を溶解した。細胞溶解液は10,000 x g、10分間の遠心分離で清澄化し、BCAアッセイでタンパク質濃度を定量した。NuPAGE LDSサンプルバッファーと還元剤に等量のイムノブ ロット用サンプルを入れ、85℃で10分間インキュベートした後、4-12%ま たは10%のNuPAGE Bis-Trisゲルにロードした。サイズマーカーとして、3μlのPageRulerTM Plusプレステインドタンパク質ラダーを各ゲルにロードした。サンプルは、MOPSまたはMESバッファー中、150Vの変性および還元電気泳動条件下で分離した。分離されたタンパク質は、ゲルからImmobilon-FLポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに1-1.5時間、32 Vで移動させた。メンブレンへの非特異的抗体結合は、メンブレンをブロッキングバッファーで少なくとも1時間、RTでインキュベートすることによりブロックした。結合バッファーで希釈した抗体を、ブロックしたメンブレンと4℃で一晩インキュベートした。メンブレンをTBSTで3回洗浄し、結合バッファー中で2次抗体と1時間インキュベートした。その後、メンブレンをTBSTで2回洗浄し、最後にTBSで1回洗浄した後、Odyssey Scanner（LI-COR）で現像した。

WesTMでの簡易ウエスタンアッセイ
いくつかの実験では、Simple Western size assayとWesモジュールを用いて、全細胞ライセートを分離・分析した。各サンプルのタンパク質濃度は、BCAアッセイを用いて1-2μg/μlに正規化した。ライセート4部を、蛍光標識したスタンダード、DTT、Sample Bufferを含む5x Fluorescent Master Mix1部と合わせ、95℃で5分間インキュベートして変性させた。サンプル、ビオチン化ラダー、一次抗体、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、二次抗体、化学発光基質、洗浄バッファーが、メーカーの指示に従い、Split Running Buffer、Wash Buffer、10x Sample Bufferであらかじめ満たされたマイクロプレートにロードされた。分離マトリックスのロード時間 200 秒、スタッキングマトリックスのロード時間 15 秒、サンプルのロード時間 9 秒、375 V でのサンプルの分離時間 25 分、一次抗体とのインキュベーション時間 90 分、二次抗体とのインキュベーション時間 30 分。結果はCompass for Simple Westernソフトウェアで解析した。

細胞死解析のためのライブセルイメージング
ライブセルイメージングによる細胞生存率の測定にはhMDMを用いた。rhGM-CSF（3.1μl/ml）を含むRPMI1640培地中で、3.5 x 104 cells /wellを96ウェルプレートに播種した。ライブセルイメージング色素であるDiyo-1（1:10,000）も加えた。化合物を添加する前に、細胞を4時間再接着させた。細胞死解析は、高湿度、37℃、5％CO2インキュベーター内に設置されたIncuCyteバイオイメージングプラットフォームを用いて、LPS（1 ng/ml）と酪酸（10 mM）を単独または組み合わせて細胞に刺激を与えた後に行った。陽性対照としてニゲリシン（10 µM）を添加する3時間前にLPS（10 ng/ml）を添加した。適切な蛍光チャンネルと位相差で、1ウェルにつき4枚の画像を1～2時間おきに24時間撮影した。これらの画像はIncuCyte解析ソフトウェアを用いて解析した。蛍光カウント/画像は、4つの画像/ウェル間で平均した。これを用いて平均細胞数/画像/ウェルを算出し、Diyo-1の場合は膜透過細胞を示した。各条件は、各ドナーについて技術的に重複して測定した。

ASC斑点イメージングと定量
ウェル当たり1 x106/ml hMDM 200μlを8ウェルibidiスライドに播種した。この細胞を、培地、LPS（1 ng/ml）または酪酸（10 mM）の単独または併用で16時間処理するか、NLRP3インフ ラマソーム活性化因子ニゲリシン（10 μM、1.5時間）の添加前にLPS（10 ng/ml、3時間）でプライムした。その後、室温で30分間インキュベートした後、PBS中4％ホルムアルデヒド200μlで細胞を固定し、200μlのPBSで2回洗浄した。10μlのヒトFcRブロッキング試薬と90μlの透過化バッファーとを含む100μlの混合液を、細胞と一緒に37℃で10分間インキュベートした。その後、細胞を4μlの直接標識抗ASC-647（1:25）で染色し、暗所4℃で一晩インキュベートした。余分な抗体を洗い流すために、細胞を200μlの透過化バッファーで2回洗浄した。その後、PBS（1:3000）で希釈した100μlのDNA色素Hoechstを暗所、室温で10分間細胞とインキュベートし、その後200μlのPBSで2回洗浄して残ったHoechst溶液を除去した。最後に、細胞を200μlのPBSで満たし、Observer Z1落射蛍光顕微鏡（ZEISS）で撮像した。ASC斑点の解析は、ASC647シグナルと同様に核マーカーとしてHoechstを用いて細胞数をカウントし、最終的に細胞あたりのASC斑点数を算出することで処理した。この解析は、画像解析ソフトウェアCell profiler 3.0を用いて行った。

定量的PCR（qPCR）による遺伝子発現解析
1 x 106 hMDMを12ウェルプレートに播種し、指示した刺激で16時間インキュベートした後、1%(v/v)β-メルカプトエタノールを含む350μlのRLT溶解バッファーで細胞を室温で溶解した。RNAは製造元の説明書に従って単離した（RNeasy Mini Kit, Qiagen）。各サンプルから等量のRNA（500～1000 ng）を、SuperScript III Reverse TranscriptaseとオリゴdT(18)プライマーを用いてcDNAに逆転写した。qPCRはQuantStudio 6 Flex real time-PCRシステムで行い、標的mRNAの相対発現はHPRTを参照mRNAとしてΔΔCT法で解析した。プライマー配列は表S1を参照。

RNA配列決定
1×106個のGM-MDMを、LPS（1ng/ml）の存在下または非存在下で、NaCl（10mM）、SCFA（酢酸塩、プロピオン酸塩または酪酸塩；10mM）またはTSA（0.5μM）で16時間処理し、その後TRIZOL（Invitrogen）で溶解し、製造業者のプロトコールに従ってRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて全RNAを抽出した。RNAはRNaseフリーの水で溶出した。RNAの品質は、Nanodrop 2000 Spectrometer（Thermo Scientific）を用いて260 nmと280 nmの吸光度の比を測定し、Tapestation 2200（Agilent）で28Sと18Sのバンドの完全性を可視化することで評価した。全RNAは、Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2を用いて、ハイスループットシーケンス用の鋳型として二本鎖cDNA分子のライブラリーに変換した。 簡単に言うと、mRNAは、ポリTオリゴ付着磁気ビーズを用いて100～500 ngの全RNAから精製した。フラグメンテーションは、イルミナ独自のフラグメンテーションバッファー中、高温下で二価陽イオンを用いて行った。第一鎖cDNAはランダムオリゴヌクレオチドとSuperScript IIを用いて合成した。残りのオーバーハングはエキソヌクレアーゼ/ポリメラーゼ活性により鈍端に変換し、酵素を除去した。DNA断片の3末端をアデニル化した後、イルミナアダプターオリゴヌクレオチドをライゲーションしてハイブリダイゼーションの準備をした。ライゲーションしたアダプター分子を持つDNA断片を、15サイクルのPCR反応でイルミナPCRプライマーを用いて選択的に濃縮した。SPRIBeads（Beckman-Coulter）を用いて、挿入長200bpのcDNA断片のサイズ選択と精製を行った。cDNA ライブラリーのサイズ分布は、Tapestation 2200 (Agilent) 上で Agilent high sensitivity DNA assay を用いて測定した。cDNA ライブラリーは、KAPA Library Quantification Kits (Kapa Biosystems) を用いて定量した。cBotでクラスターを生成した後、HiSeq1500で75bpシングルリードシーケンスを行い、CASAVA v1.8.2を用いてデマルチプレックスを行った。

RNAシーケンス解析
RNA-Seqデータの前処理は、Dockerシステム（Dockerイメージはdocker hub, limesbonn/hisat2から入手可能）に基づいた標準化された再現性のあるパイプラインで行った。簡単に説明すると、UCSCのヒト参照ゲノムhg19へのアライメントは、標準的な設定を用いてHisat2（Hisat2, 2.0.6）（Kim et al. オリジナルのEnsembl遺伝子IDと一致する外部遺伝子名とEntrez遺伝子IDは、The biomaRt package (v2.38.0) (Kinsella et al., 2011)を用いて取得し、DGEListオブジェクトはedgeR package (v3.24.0) (Robinson et al., 2009)を用いて生カウントと遺伝子アノテーションを用いて作成した。カウント数が非常に少ない遺伝子は有用ではないため、デザインマトリックスで決定されたサンプル数で少なくとも10リードを持つ遺伝子のみを保持した。さらに、各保持遺伝子は、すべてのサンプルで少なくとも15リードを持つ必要がある。フィルタリングはfilterByExpr関数を用いて行った。その後、カウントを正規化した。正規化の目的は、データ中に発生する系統的な技術的影響を除去し、技術的バイアスが結果に最小限の影響を与えるようにすることである。正規化は、TMM法（Robinson and Oshlack, 2010）（M値の重み付きトリム平均）を用いて、edgeR calcNormFactors関数を適用することで行われた。他の手法では、各遺伝子のリードの割合がリードの総数に対して計算され、全サンプルで比較されるのとは対照的に、ここでは、異なる実験条件では多様なRNAレパートリーを発現する可能性があり、そのため直接比較できる割合にならない可能性があることを考慮している。簡単に言うと、正規化とは、大多数の遺伝子が同じレベルで発現していると仮定して、サンプル間の遺伝子発現値の中央値を平準化することである。データの正規化後、edgeRパッケージv3.24.0を用いて、estimateDispを用いて共通分散とタグ単位の分散を推定し、線形モデリングのためにデータを変換した。サンプル間の関係を可視化する多次元尺度法（MDS）プロットは、全ドナーに従ってバッチ補正されたデータで表示された。各比較について、偽発見率（FDR）調整p値＜0.05で差次的発現遺伝子（DEG）が同定された。DESeq（v.1.34.0）46を用いて差次的発現解析も行い、ロバスト性を確保し、ChIP-seqの結果と比較した。遺伝子セット濃縮解析は、Molecular Signatures Database v5.2 (Liberzon et al., 2015; Subramanian et al., 2005)のホールマーク遺伝子セットコレクションを用いて、limmaパッケージv3.38 (Wu and Smyth, 2012)のカメラ機能を用いて行った。

ChIP-seq
10 x 106 GM-MDMをLPS（1 ng/ml）の存在下または非存在下で酪酸（10 mM）で6時間処理した。1％ホルムアルデヒドで架橋し、1％Triton、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％SDS、0.2M NaCl、10mM Tris、pH7.5、10mM EDTA、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche 11836170001）中で溶解、超音波処理した。超音波処理は、Covaris M220（75%PIP、200CPB、7℃、10%DF）を用い、0.5%SDSを含む溶解バッファー中で15分間行った。溶解液を4μgのH3K27ac抗体（Abcam ab4729）と4℃で一晩インキュベートした。標準化のために、50 ngのショウジョウバエスパイクインクロマチン（53083, Active Motif）と2 µgのスパイクイン抗体（61686, Active Motif）を加えた。抗体結合クロマチンをプロテインG Dynabeads (Invitrogen 10003D)でプルダウンした。DNAはChIP DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo)を用いて精製した。ライブラリーはNEBNext Ultra DNA Library Prep kit (E7645, New England Biolabs)を用いて調製した。

ChIP-seqデータ処理
ChIP-seqライブラリーは、入力ライブラリーとともにペアエンド150bpリードとして配列決定した。Bowtie2バージョン2.4.4を用い、'--very-sensitive'フラグを設定し、最小フラグメント長（-Xフラグ）を1000bp47に設定し、他のすべてのパラメータをデフォルトに設定して、リードをヒトゲノムhg38およびミバエゲノムdm6にアライメントした。スパイクインクロマチンに基づく正規化は、各生物学的複製内で以下のように行った：スケーリング係数は、ショウジョウバエのカウント数が最も少ないサンプルのカウント数に対する、ショウジョウバエに一意にアライメントされたカウント数の合計の比率として各サンプルについて計算し、この比率に従ってリードをダウンサンプリングした。ChIP-Seqライブラリーの品質はChIPQCを用いて評価した。重複リードはPicard MarkDuplicatesを用いて同定し、ダウンストリーム解析から除外した。DeepToolsのbamCoverage（v.3.3.1）48を用いて、bigwig形式のゲノムワイドカバレッジトラックを作成した。ChIP-Seqピークは、入力ライブラリーを対照としてMACS2（v. 2.2.5）48で同定した。TSSおよび遺伝子間ピーク（最も近い遺伝子から5 kb以上）周辺の平均ChIP-seqシグナルを計算し、bigwigファイルを入力としてdeepToolsでプロットした（それぞれv. 3.3.1、computeMatrixおよびplotProfile）。プロモーターにおけるH3K27acシグナルを定量化するために、RNA-seqで解析済みの全遺伝子のプロモーター（転写開始部位から+500 bp）でChIP-seqリードを定量化した。サンプル間のChIPシグナルの差はDESeq2（v. 1.34.0）46を用いて解析し、ChIP-seqシグナルはすでにスパイクインクロマチンによって正規化されているため、デフォルトの正規化は省略した。

GSEA
RNA-seq発現（DESeq2結果からのwald統計）およびChIP-seqシグナル（遺伝子プロモーターにおけるChIP-seqカウントのlog2FC）に基づいてランク付けした遺伝子リストを用いてGSEAを実施した。GSEAソフトウェアv.4.2.2は'classic'スコアリングスキームとMSigDB遺伝子セット49で使用した。

モチーフ濃縮
既知の転写因子モチーフの濃縮解析は、RNA-seqでアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子のプロモーター、およびH3K27acの増加が最も多いプロモーターと最も少ないプロモーターの10%で行った。HomerのfindMotifsGenome.plプログラム50が利用され、それぞれのケースで他の全てのプロモーターをバックグラウンドとして、領域サイズは400bp、他の全てのパラメーターはデフォルトに設定された。

質量分析ベースのプロテオミクス（MS）
1.5×106個のGM-MDMを1mlのRPMI1640培地中、12ウェルプレートで培養し、16時間指定刺激にチャレンジした。細胞をPBSで2回洗浄した後、新たにDTTを加えた200μlのSDS溶解バッファーで細胞を溶解した。細胞溶解液を新しいエッペンドルフチューブに集め、10分間煮沸した。あらかじめ冷却したアセトン800μlをサンプルと混合し、-20℃で一晩インキュベートした。その後、遠心分離（19,000×g、20分、4℃）後、サンプルを80%アセトンで2回洗浄した。チューブの底のペレットを室温で15分間乾燥させ、-80℃で保存した。

凍結したサンプルを、1% SDC、10 mM TCEP、55 mM CAA、25 mM Tris (pH = 8)を含む50□μlの消化バッファーに再懸濁し、10□分間煮沸してタンパク質を変性させた。Bioruptor (Diagenode)を用いて超音波処理した後、BCAアッセイでタンパク質濃度を測定した。50ugのタンパク質を1ugのLys-Cとトリプシンで37℃、1500rpmで一晩消化した。ペプチドをSDB-RPSのディスク2枚を用いて脱塩精製し、LC-MS用に2%アセトニトリル/0.1%TFAに再懸濁した。

ペプチドの逆相クロマトグラフィー分離は、約50cmのHPLCカラム（内径75μm；ReproSil-Pur C18-AQ 1. 9-µm silica beads; Dr Maisch GmbH, Germany)とEASYnLC 1200超高圧システムを連結し、0.1%ギ酸(バッファーA)と0.1%ギ酸中80%アセトニトリル(バッファーB)からなるバッファー系で、110□分で5から30%Bまでの直線グラジエントを用いてペプチドを分離した。カラム温度は60℃に設定した。

LCは、ナノエレクトロスプレーイオン源を介して四重極オービトラップ質量分析計（Q Exactive HFX, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA）に連結した。質量分析計はデータ依存収集モードで操作し、自動ゲインコントロール（AGC）ターゲット3E6、最大イオン注入時間20□msでMS1スペクトル（分解能60,000、300～1650□m/z範囲）を収集した。MS1スキャンから最も強度の高い上位15イオンを1.4□m/zの分離幅で分離した。正規化衝突エネルギー(NCE)27%の高エネルギー衝突解離(HCD)の後、AGCターゲット5E4、最大イオン注入時間28□msでMS2スペクトル(15,000分解能)を収集した。ダイナミックプリカーサー排除は30□sで行った。

MSデータの処理と解析
MaxQuantバージョン1.5.5.2を用いて、2019年のUniprotマウスデータベースに対して、ペプチドおよびタンパク質レベルで1%のFDRでマススペクトルを検索した。ペプチドは、カルバミドメチル化を固定修飾として、N末端アセチル化とメチオニン酸化を可変修飾として、7アミノ酸以上の長さを必要とした。酵素特異性は、プロテアーゼとしてトリプシンを用い、アルギニンとリジンのC末端とし、データベース検索では最大2回のミス切断を許容した。プリカーサーイオンとフラグメントイオンの最大質量許容範囲は、それぞれ4.5ppmと20ppmでした。Match between runs'は、リテンションタイムのアライメント後、0.7分のウィンドウで個々の測定間でペプチド同定を転送するために有効でした。ラベルフリーの定量は、MaxLFQアルゴリズムで最小比カウント2を用いて行った。タンパク質の同定は、逆データベースへのマッチ、部位によってのみ同定されたマッチ、および一般的なコンタミを除去することによってフィルタリングした。データフィルタリングと統計解析は、Perseus v1.5.5.5、GraphPad Prism v7.03、Microsoft Excel、R Studio v3.4.0を用いて行った。データは、1つの細胞タイプのすべてのレプリケートで同定されたタンパク質のみが保持されるように、さらにフィルタリングされた。欠損値は、質量分析計の検出限界における強度値の正規分布からインプットした。統計解析は、図中の凡例に示したように、一定の並べ替えに基づくFDR補正を5%で行った。

統計解析と定量
データ解析と統計分析はRとGraphPad Prismで行った。すべての統計解析は、正規性検定に先立ち、推奨されるパラメトリック検定またはノンパラメトリック検定を行った。特に記載がない場合、P値はTukey'sまたはSidak'sまたはBonferroni'sを用いた二元配置分散分析により決定した。 p < 0.05の値を統計的に有意とみなした。*p<0.05、***p<0.01、***p<0.0002、***p<0.0001。エラーバーは特に断りのない限りSEMを示す。

主要リソース表
インラインで見る

データの利用可能性
本研究のために作成されたRNA-seqおよびChIP-seqデータは、Gene Expression Omnibus (GEO)にアクセッション番号GSE248579で寄託されている（査読者トークン：unclakymjrgpxsh）。

著者貢献
E.L.、M.M.、B.M.およびW.W.が研究を考案し、W.W.、A.D.、M.M.およびE.L.が実験を計画した。W.W、A.D、B.M、M.C、K.P、A.W、N.S、T.W、H.F、A.J、R.S、F.D、S.C、M.Mが実験を行った。L.L,K.P,C.B,S.S,S.CがRNAseqとChIPseqデータの解析と可視化を行った。W.W.、A.D.、B.M.、N.S.、M.M.が解析と可視化を行った。E.L.、M.M.、S.C.、R.C.およびF.M.が研究を監督した。M.M.は全著者の意見を取り入れながら原稿を執筆した。

競合利益宣言
E.L.は、IFM Therapeutics社、Odyssey Therapeutics社、DiosCure Therapeutics社、Stealth Biotech社の共同設立者である。R.C.C.は、Inflazome Ltd.にライセンスされているNLRP3阻害剤の特許出願の共同発明者であり、BioAge Labsのコンサルタントである。他の著者は競合する利害関係はないと宣言している。

謝辞
Maximillian RotheとRomina Kaiserの技術サポート、Felix D. WeissとDaniel Simpsonに感謝する。pDONR223_CFLAR_WT_V5は、Jesse Boehm、Matthew Meyerson、David Rootから贈られた（Addgene plasmid #82936 ; http://n2t.net/addgene:82936; RRID:Addgene_82936）。本研究の一部は、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究革新プログラム（助成金契約番号848146（To_Aition））（E.L. E.L.へ）、ドイツのエクセレンス戦略（EXC2151 - 390873048）に基づくドイツ研究振興財団（DFG）、DFG SFB1454 - 432325352（E.L.へ）、SFB1402 - 414786233（E.L.へ）、TRR237 - 369799452（E.L.へ）、GRK2168 - 272482170（E.L.へ）。S.C.とM.C.は、「La Caixa Foundation」、スペイン科学イノベーション省、NextGeneration-EU（PID2020-117950RA-I00およびRYC2021-033018-I）の支援を受けた。L.L.は、EUのHorizon Europe Marie Skłodowska-Curie助成金No.101068212の支援を受けた。さらに、本研究はHelmholtz-Gemeinschaft, Zukunftsthema 'Immunology and Inflammation' (ZT-0027)の支援を受けた。RCCはBiotechnology and Biological Sciences Research Council New Investigator Research Grant（BB/V016741/1）の支援を受けた。

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2024年3月29日掲載
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