ニジマスにおけるユニークなIg重鎖アイソタイプ(IgT)の発見。ニジマスにおけるユニークなIg重鎖アイソタイプ（IgT）の発見：テレスト魚類における特徴的なB細胞発生経路の意味するところ
ジョン・D・ハンセン、エリック・D・ランディス、ルース・B・フィリップス執筆者情報および所属機関
2005年4月29日
102 (19) 6919-6924
https://doi.org/10.1073/pnas.0500027102
5,206
344
指標
5,206
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458
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344
過去12ヶ月間
17
第102巻｜第19号
論文要旨
材料と方法
結果および考察
補足資料
備考
謝辞
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参考文献
概要
ニジマス（Oncorhynchus mykiss）のEST遺伝子を解析したところ、ユニークなIg heavy-chain (IgH) アイソタイプを見出した。このアイソタイプをコードするcDNAは、典型的なIgHリーダー配列とVDJ再配列セグメント、そして膜結合型または分泌型の4つのIg superfamily C-1ドメインから構成されている。我々は、この3つのcDNAアイソタイプを1匹のホモトラウト（OSU-142）から単離し、3つのアイソタイプがそれぞれ独立したものであることを確認した。バイオインフォマティクスおよび系統学的解析により、この未記載の分岐型アイソタイプは骨魚類に限定されることが示されたため、我々はこのアイソタイプを「IgT」（τ）と名付け、テレスト魚類に適用している。OSU-142細菌人工染色体（BAC）クローンのゲノム配列解析から、IgTは標準的なニジマスのVHファミリーを利用しているが、驚くべきことに、IgTアイソタイプは多様性を生み出すために独自のDHおよびJHエレメントのセットを有していることが判明した。IgTのDおよびJセグメントとτ定数（C）領域遺伝子は、IgMのDおよびJ要素の上流に位置しており、他の脊椎動物のクラスでは観察されないゲノムIgHアーキテクチャを表している。3つのアイソタイプはいずれも主に脾臓と前骨格（骨髄に相当）に発現し、発生途上の胚では孵化の4日前にIgTの発現が見られる。
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脊椎動物の適応免疫系の重要な特徴は、V(D)J組み換えのプロセスを通じてB細胞から抗原特異的な抗体を生成することである。この過程は、顎口類（顎のある脊椎動物）のみに限定されており、無顎類（ヤツメウナギやタガメ）では、抗体遺伝子断片やVDJ-組み換え装置の証拠は確認されていない（1, 2）。特異的なエフェクター機能（補体固定化、食細胞による認識、粘膜組織での分泌）は、アイソタイプコンスタント（C）領域の性質に依存する。哺乳類では、分泌性免疫に対して異なるエフェクター機能を有する5種類のIgアイソタイプが存在する。IgMは棘皮動物に普遍的に存在する唯一の抗体アイソタイプであり、1997年まで望遠魚（骨魚）はIgMのみを有すると考えられていたが、ナマズの研究（3）、後にアトランティックサーモンの研究（4）により、望遠魚にもIgDが存在する証拠が示された。テレオスタのデルタ遺伝子（δ）がμのすぐ下流に位置すること、哺乳類のδと適度な配列同一性があること、ナマズのB細胞株でIgMとIgDが共発現することなどが、テレオスタIgDが哺乳類のものと関係があることを強固にした。テレオストIgDの発現は、哺乳類のものと同様に、再配列されたVDJ遺伝子からCδ遺伝子への代替スプライシングによって達成されるが、テレオストIgDメッセージはCμ1の第1エキソンを保持するため、キメラ抗体アイソタイプが形成されるという例外がある。その後、細胞動物のIg重鎖（IgH）遺伝子（IgWとナースシャークの新抗原受容体（NAR））、さらにテレウォークのδ遺伝子が発見されて以来、研究者は抗体アイソタイプの始原的起源について絶えず推測してきた（5-7）。本稿では、ニジマスから分離したテレオストIgH（IgT）アイソタイプについて述べる。この遺伝子は、他の脊椎動物のIgHアイソタイプといくつかの特性を共有しているが、遺伝子自体はニジマスのIgH遺伝子座の中で、どのハ虫類でも報告されていない位置を占めている。
材料と方法
魚類 ニジマス [Oncorhynchus mykiss (Onmy), Clear Springs Foods, Buhl, ID] は標準的な生物ろ過システムを用いて12℃に維持した。OSU-142 およびホットクリークのホモ接合体トラウト (8) は Gary Thorgaard (Washington State University) から提供された。
プライマー 本研究で使用したPCRプライマーについては、PNASのウェブサイトにサポート情報として掲載されている表1を参照されたい。
cDNAおよび細菌性人工染色体（BAC）ライブラリーのスクリーニング。OSU-142脾臓ZAP Express (Stratagene cDNA library)を、表1に示すように特異的プローブで順次スクリーニングした（1.2 × 106 plaque-forming units）。陽性クローンを、最初に、Cμ，Cδ、およびCτイントロンスパンプライマーセットを用いたPCRによって分析し、その上で、陽性クローンを完全に配列決定した。OSU-142 4.5XゲノムBACライブラリー（9）を、Cμ4、Cδ7、およびCτ4に対する［32P］dCTP標識シングルエクソンプローブを用いて、ストリンジェントな条件下でスクリーニングを行った。BACクローンミニプレップは、OSU-142ゲノムDNA（100 ng）を陽性対照として、シングルエクソンプライマーセットを用いたPCRのテンプレートとして使用し、遺伝子含量を評価した。
BACの配列決定とアノテーション。OnmyBAC-IgH.1は、BAC DNAショットガンライブラリーの構築のために、Qiagen Large Construct kitを使用して処理した。BAC DNAを1-3kbpの断片に切断し、pBSK+にサブクローニングし、9倍のカバレッジで配列決定し、phred-phrapconsedソフトウェアパッケージ（10、11）を使用してアセンブルした。アセンブルには20以上のPhred値のみが使用された。BACクローンのアノテーションは、GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) と手動配列解析 (macvector, Accelrys, San Diego) を併用して行った。
トラウトIgH領域の物理的マッピング。In situ 染色体ハイブリダイゼーションおよび核型分析手順は、ref.9 に記載されている。9.
IgHアイソタイプの発現。RNA単離、RT-PCR、ノーザンブロッティングのプロトコルは、ref. 12. プローブは、cDNAライブラリーのスクリーニングに用いたものと同じものを用いた。ブロットを65℃で洗浄し、14時間（IgMおよびEfTU-1について）および7日間（IgDおよびIgTについて）曝露した。全RNA（1μg）を、ランダムヘキサマーを用いて第一鎖cDNAに逆転写した（Promega）。cDNA産物の10分の1を、30サイクルの以下の条件を用いたPCRによる発現の定性的評価に使用した。94℃ 15秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒、72℃ 10分。産物は真正性のために塩基配列を決定した。
塩基配列の決定と比較バイオインフォマティクス クローン化されたcDNAのDNA配列決定は、サイクルシーケンスケミストリー（Applied Biosystems）を用いて行った。アミノ酸配列は、blastp (Swiss Institute of Bioinformatics, Basel) 保存ドメイン分析および手動検査を用いて、個々のIgスーパーファミリーCドメインに分解された。個々のIg Cドメインは、clustalw (European Bioinformatics Institute, Cambridge, U.K.) を用いて、オープンギャップおよびギャップ拡張ペナルティをそれぞれ10および0.5に設定し、アラインメントを行った。ナースシャーク新抗原受容体（NAR）およびシロワニIgW（5、7）の個々のドメインは、個々のCτドメインと20％以上の同一性を示す場合にのみ含まれた。このアラインメントから、mega 2.1 (13) (random tie breaking) と Poisson distance correction (gaps ignored) を用いたneighbor-joining methodにより、根付かない系統樹を作成した。樹木は1,000回ブートストラップし、ブートストラップ値が50%以上の分岐部位のみを表示した。膜貫通領域はtmpred (www.chnet.org) を用いて同定し、N-結合型グリコシル化部位はnetnglyc 1.0 server (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)を用いて予測した。類似性検索は主に Blast プログラム (www.ncbi.nlm.nih.gov) と ensembl (www.ensembl.org) および Blat (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat) による配列抽出を併用し、利用可能なゼブラフィッシュのスキャフォールドを用いて行った。ゼブラフィッシュIgH遺伝子座には、以下のスーパーコンティグとBACクローンを用いた：ctg14038, ctg1404, ctg14057, BX649502, and BX510335.
結果および考察
ニジマスにおけるIgH遺伝子。National Center for Biotechnology Information and The Institute for Genomic Research (www.tigr.org/tdb/tgi/) にあるニジマスEST遺伝子インデックスを、トラウトTAPBPのIgスーパーファミリーCドメインをクエリーとしてtblastn (Netherlands Bioinformatics Centre, Nijmegen, The Netherlands) 解析したところ (9)、IgH Cドメインと高い同一性を示しながら、テレスト魚類の既知のすべてのIgH遺伝子と分岐する配列が発見された。そこで、脾臓cDNAから相同なプローブを増幅するPCRプライマーを開発し、単一のホモ接合体トラウトOSU-142から得た脾臓cDNAライブラリーをスクリーニングした(8)。これらのcDNAは魚類ではまだ報告されていないアイソタイプを表しているため、我々は同じライブラリーからIgMとIgDもクローニングし、新たに同定されたIgHアイソタイプが本当にトラウトの第3の発現IgHアイソタイプを表していることを確認した。スクリーニングの結果、IgM遺伝子は1つしか発現していなかったが、IgDとユニークなIgHアイソタイプは重複して同定された。バイオインフォマティクス解析の結果、このアイソタイプはテレスト魚類に限定されることが判明したため、テレスト特有のIgHアイソタイプを「IgT」（τ）（テレスト用）と命名した。
OSU-142 IgMとIgDの配列。私たちのグループや他の研究者（14, 15）は、ニジマスIgMの分泌型および膜結合型をコードするcDNAを以前に報告している。我々は、Cμ1および-2ドメインに対応するcDNAプローブを組み合わせて、ホモ接合体OSU-142の方向性脾臓cDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。アトランティックサーモンはハプロタイプあたり2つのμ遺伝子をコードしているが、ゲルろ過分析ではニジマスは同型変異体とともに1つのμ遺伝子のみを発現していると示唆された(16)。この問題を調べるために、35個の完全長および部分的なIgM陽性クローンを同定し、cDNAの5′末端から塩基配列を決定した。4つの独立したクローンが完全に配列決定された（GenBank accession nos.AY870256-AY870259）。これらのクローンはIgMの分泌型をコードしており、それぞれ異なるVDJ再配列を含み、4つのμCドメインすべてについて100％のヌクレオチド同一性を示し、マスがハプロタイプごとに単一のCμ遺伝子を発現するという所見を支持するものであった。
アトランティックサーモンでは、IgDのcDNAとゲノムクローンが同定されている（4）。ニジマスIgDの単離のために、tblastnを用いて、アトランティックサーモンδ7クエリーと96％以上のアミノ酸同一性を示すトラウトESTを同定した。この一致を利用して、δ7ニジマスcDNAプローブを増幅するための相同なPCRプライマーを設計した。ホモ接合体脾臓ライブラリーのcDNAライブラリースクリーニングの結果、IgDに対応する12の完全長および部分クローンが得られた。すべての魚類のIgDと同様に、トラウトIgDクローンは、代替スプライシングの結果、最初のCドメインがCμ1によってコードされているという点でキメラIgHであった。δ1配列には軽鎖結合のための残基がないため、この構成によってCμ1を介したIg軽鎖の結合が可能になると考えられている(3)。完全長のトラウトδクローンは、OSU-142 IgDクローン（μ1-δ1-δ2a-δ3a-δ4a-δ2b-δ7）の単一のIg Cドメイン組織を明らかにした。アトランティックサーモンの解析ではδ2-4の種内シス重複が確認されており（4）、したがってトラウトδ遺伝子のエキソン命名法は「a」および「b」である。しかし、IgDの重複型はスクリーニング中に同定され、9つの保存されたN-グリコシル化部位の存在を含め、Cδドメイン全体で94％のアミノ酸同一性を示した（図5参照、PNASウェブサイトのサポート情報として掲載されている）。チャネルキャットフィッシュでは、IgH遺伝子座は、IgDの膜結合型と分泌型の両方を表す2つの異なるδ遺伝子をコードしている（17）。トラウトIgDの分泌型を表すcDNAは見つかっていない。
IgTの特性評価 ホモ接合体cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、ニジマスIgTの完全長および部分クローンがいくつか得られた。IgTの完全長および切断型に相当する13個のクローンについて、完全な塩基配列を決定した。3つの完全長cDNAクローンは、リーダーペプチド、再配置されたVDJセグメント、およびC末端膜貫通ドメインまたは分泌尾のいずれかで終わる4つのIgスーパーファミリーCドメインで構成されていた（図1A）。ニジマスのVHファミリーとして記録されている11のファミリー（18）のうち、5つの異なるトラウトVHファミリーがIgT cDNAクローンの中で代表的であった。クローン8bb (GenBank accession no. AY870265; 2,326 bp)は600アミノ酸のORFを含み、一方、クローン2bb (GenBank accession no. AY870264; 2,019 bp) は551アミノ酸をコードしている。ライブラリースクリーニングの結果、IgTの重複型が全クローンの半数を占め、その重複型はCτドメイン全体で96%のアミノ酸同一性を有していた（図1 A）。クローン8bbの解析から、酸に富んだドメインが末端にあり、その後に膜貫通領域と正電荷を帯びた短い細胞質尾部が続いていることが明らかになった。IgTの膜結合型（8bb）と分泌型（2bb）の分子量は、リーダーを除いて、それぞれ63kDaと58kDaであり、第3および第4Cドメイン内にある2つのN結合型グリコシル化部位を考慮に入れていない。驚くべきことに、Cτ1-4の最初のblastx/p解析では、テレストフィッシュや哺乳類のIgM配列と最も高い同一性が示された。利用可能なフグ足場のゲノム解析（www.ensembl.org）により、フグμ遺伝子の約8.3kbp上流の足場3494にτ様遺伝子が存在することが判明した（19）。この領域はCτ1に類似したエクソン（Cτ1に対して33％の同一性）、Cτ4に類似したエクソン、そして最後にTM1ドメインをコードするエクソンをコードしている。これらの特定のエクソンを用いたblastx解析により、GenBankにあるふぐのIgHアイソタイプの膜結合型と分泌型（AB201354とAB201355）が明らかになり、scaffold 3494に従って、2つのCドメインからなるアイソタイプをコードしていることが判明した。しかし、最近のテトラオドンのアセンブリの分析では、μおよびδ遺伝子を収容する第3染色体（位置8.15Mbp）のGenScan分析を含めて、τ様遺伝子の存在について結論の出ない結果が得られた。しかし最近、IgTと59％のアミノ酸類似性を示す、ゼブラフィッシュのIgTオルソログ（IgZ、AY643750）がGenBankに寄託された（図1）。IgZの研究グループは、我々のIgTクローンに対して遠い対立遺伝子を示すトラウトEST配列（GenBankアクセッション番号：AY773715、アミノ酸類似度80%）も寄託している。AY773715はニジマスのKamloop（BC、カナダ）系統に由来するESTライブラリー（20）からのもので、OSU-142ホモニジマスはカリフォルニア州シャスタ湖の系統から開発されたので、無関係な系統を表している。
図1.

図1. 望遠魚類におけるIgTの比較解析。(A）ニジマス（Onmy）IgTとゼブラフィッシュ（Dare）IgZのCドメインのアミノ酸アライメント。C領域（CH）はニジマスのcDNAと生殖細胞系列の配列に基づいている。Igフォールドに典型的なシステインとトリプトファン残基は太字で表示されている。N-結合型グリコシル化の可能性のある部位には下線を引き、IgT重複配列間で異なる残基はIgT.1配列のすぐ下に示した。* は同一性を、-はギャップを示す。B細胞コアセプターCD79A/Bと結合する典型的な膜貫通領域に見られるS、T、Y残基は太字で示されている。(B）3つのIgT VDJ再編成のCDR3接合部。
Igフォールドに必要なシステインとトリプトファン残基（21）は4つのニジマスCτドメイン全てに見られるが、Cζ3ドメインは最初のシステインが通常トリプトファンが占める位置に見られる点で異なっている。IgTとIgZのCH1ドメイン内にある追加のシステイン（それぞれCys-13とCys-14）は、これらの分子が軽鎖と結合できることを示唆している。しかし、アミノ酸の同一性が最も高いのは、τおよびζ膜貫通領域で、80%であった。膜貫通領域には、CARTドメインと一致する疎水性残基や親水性残基、B細胞コアセプターCD79A/Bとの会合に必須であることが知られているThr, Ser, Tyr残基などのB細胞受容体に典型的な残基が含まれている（22)。IgTとIgZの短い分泌尾部には、1つのCys残基と数個の酸性アミノ酸が含まれている。粘膜免疫による病原体の中和は、脊椎動物の生体防御の第一線として不可欠なものである。この中和は、高分子のIgAアイソタイプによって行われ、比較分析により、PX3NXS/TL/VX4E/DX4CYモチーフが多量体の重合に通常必要であり、N結合型グリコシル化部位（下線）と最後から1番目のシステインがJ鎖の会合に重要であることが判明した（23, 24）。IgTはCH4末端付近にN-結合型グリコシル化部位を持ち、分泌尾部にCys残基を持つが、全体としてこの領域はJ鎖の会合に必要なモチーフとほとんど類似性を持たない。さらに、IgTはIgAに典型的なヒンジの特徴を欠くが、興味深いことに、CH1と-2の接合部付近に5つのPro残基があり、この領域が柔軟である可能性が示唆されている。Xenopusの第3のアイソタイプであるIgXは、IgX形質細胞が腸内の全Ig産生リンパ球の約50％を占め、IgXはIgMと同じ大きさのポリマーを形成するが、IgTと同様に、IgXの分泌ドメインは、Cys-Tyrで終わることを除けばJ鎖モチーフとの類似性はほとんど認められないのでIgAアナログであると考えられている（25、26). 生化学的な解析によってのみ、IgTの機能と重合能が決定されるであろう。
τ遺伝子の系統的評価。IgT（tblastn）を用いてGenBankを解析したところ、ゼブラフィッシュとアトランティックサーモンにオルソログが存在することが判明した。C領域のblastpドメインごとの比較により、τ系統の興味深い特徴が示された。有意な一致（アミノ酸同一性）は以下の通りであった。CH1サケμ（52％）、CH2ゼブラフィッシュζ（34％）、驚くべきことに脊椎動物Ig軽鎖（33％）、CH3サメおよびNAR CH2および-4（28％）、ゼブラフィッシュζ（27％）、CH4 Xenopus μおよび豚γ1（32％）およびゼブラフィッシュζ（36％）である。抗体のアイソタイプは2〜7個の様々な数のIg Cドメインを含むため（テレスターδに見られるような種内重複ドメインは含まない）、個々のIg Cドメインの系統的解析を行い、τ系統との関係の可能性を明らかにした（Fig.2）。図2 Aに示すように、軽鎖結合に必要なドメインであるCH1の系統解析の結果、高いブートストラップ値で支持されるように、ニジマスτCH1はテレオストμ系統と緊密なクレードを形成していることが示された。この知見を支持するものとして、トラウトのμおよびτCH1ドメインは51%のアミノ酸同一性を有しており、サケ科のμ系統と密接な関係を有していることを示唆している。ゼブラフィッシュのζ CH1ドメインは、より大きなμクレード内にあるが、このブランチのブートストラップ値が50％未満であったため、その関係を解決することは困難である。CH2解析（図6参照、PNASのウェブサイトにサポート情報として掲載されている）では、τとζの両方が弾性ブランチのμ CH2にクラスター化することから、τ系統とμ系統の関係を確認した。 τとζはサメとスケートのμ CH2と34％の同一性と平均25％の同一性を示している。CH3およびCH4の解析では、系統解析の解像度を上げるために、アトランティックサーモンIgT ESTを部分的に加えたが、これはこれらのドメインがblastp解析で最も高い分岐度を示したためである。興味深いことに、τおよびζ CH3遺伝子は、NAR CH2およびサメIgW CH3ドメインに隣接する明確なクレードを形成した（図2B）。一方、トラウトτ CH3配列は、これら二つの弾性体遺伝子と約26%の同一性と約40%のアミノ酸類似性を示す。τ/ζクレードの中で、トラウトとサケのτは85%の同一性を示したが、τとζのCH3は27%しか同一性がなかった。最後に、脊椎動物のIgH CH4ドメインの系統関係から、τ/ζクレードはユニークであり、最も近い隣接クレードであるテレオスIgMと両生類IgY（IgGアナログ）（27）はかなりの遺伝的距離を隔てていることがわかった（図7参照、PNAS webサイトのサポート情報として掲載されている）。これらの結果を総合すると、τ系統はテレオストμ系統といくらかの相同性を示すが、テレオストでは別個のIgH系統である可能性が最も高いことが示唆される。
図2.

個々のIgH Cドメインはclustalwを用いて整列し、近傍結合法を用いて木を作成し、遺伝的距離はポアソン補正によって求めた（木の下のスケールバー）。(A)CH1ドメイン。(B)CH3ドメイン。GenBank accession nos.に従う。IgA：アヒル、U27222、ニワトリ、S40610、ヒト、BAC85198、ウサギ、X82116。IgE：ラット、AAA41365；ヒツジ、M84356；およびウマ、U15150。IgG：ウサギ、K00752；ヒツジ、X69797；およびマウス、J00453。IgY： axolotl, X69492；および Xenopus, X15114. NARおよびIgW：ナースシャークNAR, U18701およびサンドバーシャークIgW, U40560. IgX: Xenopus, X13779. IgM：スケート、M35185；サメ、Y00840；ゼノパス、J03631；アトランティックサーモン、S48652；ナマズ、M27230；トラウト、AY870256；およびゼブラフィッシュ、CAI11475。IgT/Z：ニジマス、AY870265；アトランティックサーモン、TC29571；およびゼブラフィッシュ、AY643750。
IgT VDJ領域の特徴。全長IgTクローンの解析から、ニジマスIgHアイソタイプは3つとも標準的な11のVHファミリーを使用していることが明らかであった。我々の最初の解析では、2つの異なるVH遺伝子（VH8と-11から）（18）が、単一のホモ接合体トラウトから得られたcDNAライブラリー内のIgMとIgTクローンの両方で使用されていることが示された。IgTの他の完全長および部分クローンは、トラウトからさらに3つのVHファミリーを代表しており、IgT VHの多様性に関するこの最初の調査では、合計5つのVHファミリーが代表されたことになる。VDJ組み換えにより、抗原認識に重要な機能を持つことが知られている第3相補性決定領域(CDR3)が生成される。トラウトのIgHアイソタイプは同じVHファミリーを使用しているが、IgTは異なるDおよびJセグメントを使用してIgT CDR3を生成している。トラウトIgMのCDR3はコンパクトで、VDJ組み換えとPおよびNヌクレオチド付加の両方によって生成された平均サイズ4-5 aaである（28）。一方、我々の最初の検査では、IgTの3つのクローンが、IgH.1遺伝子座由来の3つのクローンをもとに5-10 aaのCDR3範囲を示していることがわかった（Fig. 1B）。さらに、比較モデリングにより、IgTクローン8のCDR3ループは、NARに関連する大きなCDR3ループ（29）を彷彿とさせる拡張型であることが示唆された（データは示されていない）。IgT CDR3の幅広いサイズの保持と使用は、多様なエピトープが認識され得るので、分泌免疫反応にとって有益であると思われる。
ニジマスにおけるIgH.1遺伝子座。マウスのIgH遺伝子座は、5種類のIgアイソタイプをコードしており、そのゲノム構成は以下の通りである。Vn-Dn-J4-(S)Cμ-Cδ-(S)Cγ3-(S)Cγ1-(S)Cγ2b-(S)Cγ2a-(S)Cε-(S)Cα. Cμ、Cδ遺伝子はRNAプロセッシングにより結合したVDJ遺伝子と結合するが、さらに下流にある遺伝子は、各CH鎖領域の上流にある反復スイッチDNAの領域に着目した染色体内欠失型組み換えと呼ばれるプロセスにより、機能的VDJセグメントと結合する(30)。脊椎動物のIgH遺伝子は、VDJとCHが結合したブロックと結合していないブロックが繰り返され、マルチクラスター配列（VDJ-C）nと呼ばれているため、哺乳類の構成とはかなり異なっている。一方、Ig軽鎖遺伝子はマルチクラスター型であるため、骨魚類のH鎖とL鎖遺伝子はキメラ型である(2)。
トラウトのIgHゲノム構造を調べるために、OSU-142 BACライブラリーをμ-, δ-, τ-エクソン特異的プローブの混合物を用いてスクリーニングした。13個のIgH+ BACクローンがPCR解析により同定され、1個のμシングル陽性、6個のμ/δダブル陽性、3個のμ/τダブル陽性、2個のτシングル陽性、1個のトリプル陽性のクローンからなることが判明した。この後者のクローン、OnmyBAC-IgH.1は完全に配列決定され、107kbpと14kbpの2つの主要なコンティグが得られた。OnmyBAC-IgH.1の物理地図（図3上）は、5′末端から始まり、近位のVH遺伝子、レトロポゾン要素、VH偽遺伝子が、3つのIgH D要素と2つのJ要素、IgT Cドメインをコードする4つのエキソンに続いて構成されている。これらの特定のDおよびJ要素は、完全なIgT遺伝子を構築するために用いられるものであり、標準的な組換えシグナル配列（RSS）を持っている。前述したように、CDR3領域はIgTの方がIgMより大きい。この違いを説明する1つの要因は、最初のDτエレメントが37bpの長さ（3つのリーディングフレームすべてで開いている）であり、そのうち27bpがIgTクローン8内で使われていることである（Fig. 1B）。DHエレメントは通常12-16ヌクレオチド長である。第2および第3のDτ遺伝子は典型的な大きさである（DH2、13bpおよびDH3、15bp）。IgT cDNAクローンの30％以上は、IgTクローン15（GenBankアクセッション番号AY870266）のような無菌転写物（JCτ1Cτ2Cτ3Cτ4sec）として表されている。クローン15はDτ3とJτ1の間で始まり、ORFはτJH1のRSS内のメチオニンコドンから始まっている。無菌転写物は、トラウトIgD (GenBank accession no. AY870262)でも見つかり、トラウトIgLでも指摘されている(31)。膜結合型は、TMセグメントをμエキソン3の末端にスプライシングすることで生成されるテレオストIgMとは異なり、膜結合型はτエキソン4の末端付近のスプライシングにより生成され、両生類、鳥類、哺乳類のIgMと同様に、分泌型、膜結合型ともに4つのIg Cドメインすべてを保持している(2)。τTMエクソンと2つのVH遺伝子の間には、genscan解析によりpiggyBacクラスの無傷のトランスポゾンが検出された（図3上）。他のレトロポゾン様短点核要素（SINE）や反復要素と相まって、これらの要素はニジマスIgH遺伝子座の構築に寄与している可能性がある。第2および第3のVH遺伝子の位置は、それらがIgMによって利用されていることを示唆しており、第2のVH遺伝子の逆向きを考えると、逆転機構によって利用されている可能性が高い。最後に、トラウトIgH.1遺伝子座の最後の部分は、μおよびδ遺伝子によって使われる6つのDHおよび5つのJH要素（すべて標準的なRSSを持つ）をコードしている。
図3.

ニジマスとゼブラフィッシュのIgH遺伝子座のゲノム構成。トラウトIgH.1遺伝子座では2つの主要な配列コンティグ（107および14kbp）が生じ、これらはδ遺伝子内の1つのコンティグに統合された。3つのトラウトVH遺伝子は、それぞれVH2、-8、-5ファミリーのメンバーである(18)。ゼブラフィッシュの遺伝子座（約75kbp）は、semblのスーパーコンティグctg14038、ctg1404、ctg14057とBAC配列BX649502およびBX510335に基づく。ψは偽遺伝子、Rは繰り返し領域、→は転写の方向性。
TATAACAGTAGCGAGGC27のコアモチーフを持ち、δ2B（主要コンティグの末端）とδ3Bエキソンの間に位置する反復要素（≒900bp）の存在のため、OnmyBAC-IgH.1を単一のコンティグに完全に結合することが出来なかった。第2コンティグにはδ3B、δ4B、δ2C（アトランティックサーモンには存在しない）、δ7Cドメインと、IgDの2つの膜貫通ドメインがコードされているが、すべてのショットガンクローン（2，600個以上）のリモートblastn/x分析では、テレウォートのδ5またはδ6に似たエクソンを否定している。ユニークな繰り返し要素の位置と、δ2Cとδ7の間にいくつかの繰り返し要素（SINEとTc1要素）が存在することから、δ5とδ6はこの遺伝子座から削除されたと思われる。全体として、トラウトとゼブラフィッシュのIgH遺伝子座（図3上）は、サイズ、内容、構成が非常に似ており、したがって、τとζがおそらく直交遺伝子であるという推測を支持するものとなっている。
AID遺伝子は、Ig遺伝子のクラススイッチ組換えと体細胞超変異に必須である(30)。ナマズでAIDのホモログが報告されていることから（32）、トラウトのIgアイソタイプのクラススイッチ組み換えが可能かどうか疑問視されたが、バイオインフォーマティックおよびマニュアル配列解析では両生類、鳥類、哺乳類のスイッチ領域（27、33）のような明らかな反復領域は見いだせなかった。cDNAクローンの解析から、1匹のホモ接合体マスからτおよびδ遺伝子が重複して検出されたことから、マスのIgH遺伝子座の少なくとも一部が重複していることが示唆された。この仮説を正式に検証するために、OnyBAC-IgH.1を含む4つのIgH陽性BACクローンを、トラウトの染色体スプレッド上でin situハイブリダイゼーション法を用いて物理的にマッピングした。すべてのBACクローンは、1番染色体の短腕と12番染色体の長腕にそれぞれハイブリダイゼーションした（図8参照、PNASウェブサイトのサポート情報として公開されている）。このことから、マスは2つのIgH遺伝子座を持っているという仮説が支持された。
ナイーブ組織におけるIgHアイソタイプの発現。3種類のIgHアイソタイプの組織分布をノーザンブロットとRT-PCR解析で調べた。トラウトでは、胸腺と前葉はVDJ組み換えに関与する重要なマーカー、すなわちRagとTdTを発現しているため、一次リンパ組織である(34)。マスの脾臓は、抗原処理に関与する主要な二次リンパ器官組織であり、B細胞とMHCクラスII発現の主要な供給源である(35)。ノーザンブロット解析（図 4A）によると、ニジマスのμ、δ、τ遺伝子は主に脾臓、前腎、中腎で発現し、長期間の暴露後は胸腺と心臓で弱い発現が認められた。全体として、IgMが最も高いレベルで発現し、IgDとIgTがそれに続く。IgMでは単一の高発現転写産物が存在するが、トラウトIgDでは2つのmRNA転写産物が観察される。IgDの短い転写物（3 kb）は、3.8 kbの転写物と比較して高レベルで発現し、トラウトの完全長IgDクローン1および17のサイズと一致する。IgTについても2つの転写産物が存在し、膜結合型（2.1kb）および分泌型（2.4kb）のIgTのサイズに相当する。IgTについては、2つの異なるクローン系統のトラウトに由来する脾臓サンプルについて、同様の発現パターンが観察された。
図4.

ナイーブニジマスにおけるIgM、IgDおよびIgTの組織特異的発現。(A) 1歳児ニジマス（Clear Springs系統）のRNAを用いたノーザンブロット解析（12μg）。Th、胸腺；Pn、前肺；Mn、中肺；Sp、脾臓；Lv、肝臓；Int、腸；Mu、筋肉；H、心臓；Ts、精巣。OSU-142 (OSU) とホットクリーク (HC) の脾臓サンプル。(B) 選択した組織におけるIgMおよびIgTのRT-PCR分析。Hrt、心臓；Ms、中隔膜；E1、12日目胚；E2、22日目胚；YS、卵黄嚢稚魚；Pbl、末梢血リンパ球。
より高感度な解析のために、次にRT-PCRによるIgMおよびIgTの発現を調べた（図4B）。個体発生的に、Rag1と-2の発現はトラウトの受精後約10日に始まり、最初のsIgM+（表面IgM）B細胞は孵化後4日に前葉に発生する(34)。通常、トラウトの受精から孵化までの胚期間は、12℃で25-26日である。B細胞の発生における主要なイベントは、IgL鎖の再配列と発現の前に、前駆細胞から前B細胞段階への移行におけるIgHの再配列と発現である。本研究では、12日目の胚ではIgMおよびIgT C領域は発現していないが、孵化4日前の胚と孵化後3日の卵嚢稚魚では、前骨にsIgM+B細胞が存在する前に、異なるレベルではあるが、両者が発現していることを証明する。このように、両方のアイソタイプがマスの発生初期から発生を通じて発現している。両遺伝子は胸腺、腸、心臓でも発現しているが、筋肉は陰性である。腸での両遺伝子の発現は比較的弱いが、我々の解析はナイーブなトラウトで行われたため、免疫反応時には発現が異なる可能性がある。最後に、フィコールで精製した末梢血リンパ球はIgMメッセージを高度に発現し、IgT mRNAは控えめであることから、心臓での発現は循環B細胞によるものと思われる。サケの血液は白血球の豊富な供給源であり（1-2×107/ml以上）、FACS分析によりリンパ門の25-35％がsIgM+ B細胞で構成されていることが示されている（データは示されていない）。したがって、血中の全リンパ球の量とIgTの発現を考えると、IgT+ B細胞は小さいながらも重要なB細胞プールであると思われる。
以上のように、我々は、IgTと名付けたユニークなIgHアイソタイプに関する情報を、魚類に提供した。系統解析の結果、τのC領域遺伝子は魚類のμ系統と関係がある可能性が示唆されたが、τは分岐したIgHアイソタイプであり、マスの免疫反応におけるその役割はさらなる調査が待たれることは明らかである。この解析の第二の特徴は、τ遺伝子座が独自のDおよびJエレメントのセットを持ち、これらのエレメントの位置とμの上流のτ遺伝子とが、他の脊椎動物に見られないIgHゲノム構造を提供していることを発見したことである。さらに、1匹のホモ接合体トラウトの解析により、ニジマスではIgDとIgT遺伝子が重複していることを決定的に示したが、これはすべてのサケ科魚類の祖先が4倍体であるためと思われる特徴である。最後に、トラウトとゼブラフィッシュのIgH遺伝子座の構造、およびトラウトには明らかなスイッチ領域がないことから、前駆B細胞はエピジェニックな因子を通じて、B細胞の発生過程でIgTまたはIgMのいずれかの系統に、T細胞系統の関与と同様のプロセスでコミットする可能性があると仮定した。
補足資料
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注釈
著者の貢献 J.D.H.は研究を計画し、J.D.H.、E.D.L.、R.B.P.は研究を行い、J.D.H.はデータを分析し、J.D.H.は論文を執筆した。
本論文は、PNAS事務局に直接投稿（Track II）された。
略語。BAC, 細菌人工染色体; IgH, 免疫グロブリン重鎖; Onmy, Oncorhynchus mykiss; NAR, 新規抗原受容体.
データ寄託：この論文で報告されたcDNAとBACの配列はGenBankデータベースに寄託されている（アクセッション番号：AY870256-AY870268およびAY872256-AY872257）。
注 この論文がPNASで査読されている間に、Danilovaら（36）は、ゼブラフィッシュにおけるアイソタイプ、IgZの解析を報告した。ここで示された知見と同様に、ゼブラフィッシュのIgZとIgMはDおよびJ要素を共有しておらず、IgTとIgZはIgMと比較して異なるB細胞受容体であることを示唆している。しかし、成体のゼブラフィッシュでは、IgZは一次リンパ組織に限定されているのに対し、IgTは様々なトラウト組織で発現しており、IgTとIgZのアイソタイプの間の機能的差異が示唆されている。最後に、系統解析の結果、IgZとIgTはオーソログの関係にあるが、本当に機能的なオーソログであるかどうかは、今後の実験が待たれるところである。
謝辞
Nil Ratan SahaとLouis Du Pasquierのコメント、Li LiとSara Ho (Lark Technologies, Houston)のBAC組み立ての協力に感謝する。この研究は、米国農務省 National Research Initiative Competitive Grants Program (NRICGP) Grant 2004-05635 および National Science Foundation Grant MCB-0453924 (to J.D.H.) により一部支援されたものである。
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