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ORIGINAL RESEARCHの記事
フロント Cell. Infect. マイクロビオール、2023年5月1日
第2章 分子生物学的病原体学
第13巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1181315
デスルホビブリオ菌がパーキンソン病モデルにおけるα-シヌクレインの凝集を促進させる

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1181315/full

Vy A. Huynh1、Timo M. Takala1、Kari E. Murros2、Bidhi Diwedi1,3、Per E. J. Saris1*。
1ヘルシンキ大学農林学部微生物学科、ヘルシンキ、フィンランド
2東フィンランド大学クオピオ校神経内科非常勤教授、フィンランド
3パドバ大学（イタリア・パドバ市
はじめに 神経細胞タンパク質であるα-シヌクレイン（α-syn）の凝集は、パーキンソン病（PD）の病態において重要な特徴である。α-synの凝集は、PDとの関連が指摘されているDesulfovibrio菌などの病原性腸内微生物によって腸内細胞で誘導されることが示唆されている。本研究では、Desulfovibrio菌がα-syn凝集を誘導するかどうかを検討することを目的とした。
方法は以下の通り： PD患者10名とその健常配偶者の糞便サンプルを採取し、Desulfovibrio属の分子検出を行い、その後、細菌を分離した。分離されたDesulfovibrio株は、黄色蛍光タンパク質と融合したヒトα-synを過剰発現させた線虫の飼料として使用された。動物モデルでα-synの凝集を促進することが示されているcurli産生Escherichia coli MC4100を対照細菌株として、curliを産生できないE. coli LSR11を別の対照株として使用しました。ワームの頭部切片は共焦点顕微鏡で画像化した。また、線虫の生存に及ぼすDesulfovibrio菌の影響を調べるため、生存アッセイを行った。
結果および考察 統計解析の結果、PD患者由来のDesulfovibrio菌を与えた線虫は、健常者由来のDesulfovibrio菌を与えた線虫や大腸菌を与えた線虫に比べて、有意に多くの（P<0.001、クラスカル・ウォリスおよびマン・ホイットニーU検定）α-syn凝集塊を保有し（P<0.001）、より大きかった。また、同様の経過観察期間中に、PD患者由来のDesulfovibrio株を与えたワームは、大腸菌LSR11株を与えたワームよりも有意に高い量で死亡しました（P<0.01）。これらの結果は、デスルホビブリオ菌がα-synの凝集を誘導することでPDの発症に寄与していることを示唆している。
1 はじめに
パーキンソン病（PD）は、加齢に伴う神経変性疾患であり、主に動作に支障をきたします。200年以上にわたる研究にもかかわらず、パーキンソン病の本質的な病因メカニズムは謎に包まれたままである。遺伝的、環境的、生活習慣的な要因が疾患発症に何らかの役割を果たしていることは明らかであり（Jankovic and Tan, 2020）、細菌やウイルスがPDの発症に関与している可能性も高い（Murros et al, 2021; Smeyne et al, 2021; Murros, 2022）. レビー小体やレビー神経突起の形でα-シヌクレイン（α-syn）タンパク質が蓄積することは、パーキンソン病の神経病理学的特徴である。PDの神経病理に関する死後の解析では、脳だけでなく、脊髄、自律神経、腸管神経系の末梢神経叢、皮膚、顎下腺、心筋組織の神経にもα-synの沈着が見られる（Wakabayashi et al、 1988; Braak et al., 1999; Braak et al., 2007; Beach et al., 2010; Gelpi et al., 2014; Borghammer et al., 2021; Isonaka et al., 2022). 重要なことに、α-synの凝集は、結腸（Visanji et al., 2015; Chung et al., 2016）、胃粘膜（Sánchez-Ferro et al., 2015）などのヒト消化管でも発見されています。PD患者および健常者のα-syn病理を調べる十二指腸生検標本に関する最近の、最終的に最初のin vivo研究では、PD患者のすべての研究標本で凝集したα-synに対する顕著な免疫反応性が示されたが、対応する免疫反応性は対照ではないか、ほとんど検出できなかった（Emi et al, 2023）. 神経病理学的な観察と分析により、腸内の病原体がα-synの凝集を誘発し、それが迷走神経を介して脳の中枢神経系に広がるという仮説が正当化された（Braak et al.、2006）。アルファシンは、小腸に最も高い頻度で存在するニューロン様細胞である腸内分泌細胞で発現し（Sjölund et al., 1983）、腸管アルファシン含有神経とつながっています（Chandra et al., 2017）。この知見に基づき、Chandraらは、α-syn凝集は腸管病原体の作用により腸内分泌細胞で開始される可能性が高く、α-syn凝集体はその後プリオン様様式で腸から神経回路を経由して脳に広がることを提案しています（Chandra et al.、2017）。
さまざまな動物モデルでの研究の積み重ねにより、PD病態における腸内細菌の潜在的な役割について、さらなる知見が得られています。ヒトのα-syn過剰発現ラットおよびマウスにおいて、経口経路でクルリ（細胞外アミロイド繊維）を産生する大腸菌を導入すると、α-syn凝集が加速し、腸および運動障害が生じた（Chenら、2016；Sampsonら、2020）。α-syn凝集の増加は、ヒトα-synを発現する線虫モデルにおいて、curli産生大腸菌への曝露後にも観察された（Chen et al.、2016）。グラム陰性菌が産生する内毒素であるリポポリサッカライドの経鼻曝露は、マウスの嗅球や黒質でのα-syn凝集を促進し、炎症反応やPD様行動問題を誘発した（Niu et al.、2020）。curli産生大腸菌とPDとの関連は推測の域を出ないが、これらの観察結果は、腸内微生物の代謝物、成分、あるいは産物が、α-syn病理を促進することによって、実際にPDに関与している可能性を示唆する。いずれにせよ、PDの発症を開始する病因の特定はまだ不完全である。
我々は最近、硫酸還元性デスルホビブリオ菌（DSV）とPDの関連について研究した（Murros et al.、2021）。この細菌は、健常者に比べてPD患者、特に重症の患者においてより多く存在し、量も豊富であった（Murros et al.、2021）。しかし、これらのグラム陰性菌がPDの発症、特にα-syn病態に関してどのように寄与しているかは、これまで調べられていませんでした。DSV菌は特殊な性質を持つため、このような研究が必要です。具体的には、硫化水素（H2S）を産生し（Kushkevych et al., 2019）、少なくとも一部の株はマグネタイト（Fe3O4）を合成できる（Lovley et al., 1993）。腸内細菌が産生するH2Sは、ミトコンドリアシトクロムcの放出を促進し、鉄レベルを高め、活性酸素の形成を促進し、最終的にα-synの凝集を引き起こすことによって、ヒト細胞に対して有害な影響を与える可能性があります（Murros、2022）。DSVで生成されたFe3O4は、Fe3O4ナノ粒子が活性酸素の形成を促進し（Könczöl et al., 2011）、α-synの凝集を促進する（Joshi et al., 2015）ことから、凝集に関与する可能性もある。
本研究では、黄色蛍光タンパク質（van Ham et al., 2008）と融合したヒトα-synを発現する線虫モデルを用いて、PD患者および健常者から分離したDSV菌がα-syn凝集に寄与するかどうかを検討しました。その結果、DSV菌、特に患者株は、ワムシにおけるα-synの凝集を促進することが明らかになりました。
2 材料と方法
2.1 研究対象、サンプル収集、倫理的許可
本研究は、パーキンソン病（PD）における糞便サンプルの磁気特性に焦点を当てた現在進行中の研究のサブスタディであった。本研究では、20名の参加者（PD患者10名、健常者10名）を対象としました。患者は、フィンランドのヘルシンキにあるTerveystalo Healthcareの神経学外来クリニックから募集された。健康な人は、患者の配偶者である。参加者の募集と糞便サンプルの取り扱いに関する基準は、以前に記載したものと同様であった（Murros et al.、2021）。研究承認は、ヘルシンキおよびウシマー保健地区の倫理委員会（No.2510/2020）により行われた。すべての手順において関連する規制が遵守された。参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントが提供された。
2.2 デスルホビブリオ菌の単離
以下の手順および細菌の培養は、嫌気性ワークステーション（Don Whitley Scientific, West Yorkshire, UK）で実施した。1グラムの糞を5mlのポストゲートブロス（DSMZ培地63）中でホモジナイズした。この懸濁液を37℃で嫌気的に3〜4日間、細菌増殖の兆候が現れるまで培養した（懸濁液の黒化で示される）。細菌増殖は、ポストゲートブロスでの追加のサブカルチャーによって濃縮された。次に、この細菌懸濁液をポストゲート寒天培地プレート上でストリークし、37℃で3～4日間インキュベートした。純粋なシングルコロニーが得られるまで、黒いシングルコロニーを繰り返し摘み取り、ストリーキングした。純粋な培養物を位相差顕微鏡で分析した。Desulfovibrio（DSV）様細胞形態を有する分離株は、以下に記載する分子技術により同定した。DSV分離株は、17%グリセロールを含むポストゲートブロス（VWR Chemicals, Leuven, Belgium）中で-75℃にて冷凍保存した。
2.3 分子生物学的手法
2.3.1 DNAの抽出
Desulfovibrio菌の検出には、Stool DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada)を用いて糞便サンプルからDNAを抽出した。DSV分離株の同定には、MagAttract HMW DNA Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いて細菌DNAを抽出した。抽出したDNAは-20℃で保存した。
2.3.2 プライマーとPCR条件
細菌16S rRNA領域は、ユニバーサルプライマーpAおよびpE'を用いて増幅し、DSV分離株の同定、または糞便からのDNA抽出成功の指標として使用された。DSV菌の特異的な検出は、D. desulfuricans、D. piger、D. fairfieldensis、D. vulgarisの16S rRNA領域を標的とする種特異的プライマーを用いて行われた。また、ほぼ全てのDSV菌に存在する[FeFe]-ヒドロゲナーゼ遺伝子（hydA）を標的とするプライマーペアを用いて、他のDSV菌の存在を検出した。使用したプライマーをすべて表1に示す。
表1
表1 本研究で使用したプライマー
1回の50μlのPCR反応は、1×Phusion Green HF buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 0.2 mM dNTP mix (Thermo Fisher Scientific), 0.5 μM of each primer, 1 U of Phusion High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific) and approximately 15-25 ng of DNAからなる。熱プロファイルは、98℃で30秒の後、98℃で10秒の変性、プライマーに応じて55℃または61℃で10秒のアニーリング、72℃で20秒の伸長を30サイクル行い、72℃で5分、4℃で5分で終了した。精製したPCR産物を、0.1μg/mlの臭化エチジウムを含む0.9%または1.5%アガロースゲルでゲル電気泳動して調べ、配列決定前に紫外線で可視化した（ヘルシンキ大学生命工学研究所、フィンランド）。配列は、NCBI GenBankデータベースと比較することで解析した。
2.4 細菌株と飼料調製
線虫の維持に用いられるEscherichia coli OP50は、Caenorhabditis Genetics Center (CGC)から入手しました。この菌はLB培地で37℃で一晩培養した後、NGMプレートに播種した。
ポジティブコントロールとして、野生型curliタンパク質産生大腸菌MC4100株を使用した。また、curliを産生できない変異株（LSR11）をネガティブコントロールとした。両菌株はMatthew Chapman教授（University of Michigan, USA）のご厚意によりご提供いただきました。Curli産生大腸菌は、PDの線虫モデルにおいてα-syn凝集を誘導することが示されているため、ポジティブコントロールとして使用した（Chen et al.、2016）。Curli産生は、Congo Red-YESCA（CR-YESCA）プレート上で28℃、48時間培養することにより確認した。虫食い実験では、YESCAブロスで28℃、48時間、菌株を培養した。次に、200μlの細菌培養物をNGMプレートに播種し、その後28℃で48時間インキュベートした。このプレートは、虫の栄養として使用できるように準備されていた。
PD患者から分離した3つのDSV sp.（D.desulfuricans、D.fairfieldensis、D.piger）および健常者から分離した3つのDSV sp.（D. fairfieldensisおよびD. desulfuricansの2株）をミミズ食害実験に使用しました。菌はポストゲートブロスで37℃、4日間嫌気的に培養した。その後、菌体懸濁液5mlを685×gで3分間遠心分離し、ほとんどの沈殿物を除去した。さらに7000×gで10分間遠心分離し、新鮮なポストゲートブロス1mlに再懸濁することにより、細菌細胞を回収した。これらのステップの後の細菌濃度は、約106cfu/mlであった。最後に、調製したDSV懸濁液300μlをNGMプレートの中央に播種し、虫を入れる準備をした。
2.5 線虫の生育条件
黄色蛍光タンパク質と融合したヒトα-synを産生する線虫NL5901株（van Ham et al.、2008）をCGCから入手した。このワームは、大腸菌OP50を播種したNGMプレート上で20℃にて増殖させた。年齢同期は次亜塩素酸漂白法（Stiernagle, 2006）を用いて行った。卵は、M9培地中、室温で50rpmで穏やかに攪拌しながら一晩孵化させた。その後、L1幼虫を大腸菌OP50を播種したNGMプレートに移し、20℃でL4幼虫期まで増殖させた。L4期において、陰性対照の大腸菌LSR11、陽性対照の大腸菌MC4100、PD患者から分離した3つのDSV株、および健常者から分離した3つのDSV株を含む8つの調製飼料に、ワムシを導入した。その後、ワームを4日目の成虫まで成長させた。ワームは2日ごとに新鮮なプレートに移した。
2.6 共焦点顕微鏡検査
各食餌条件ごとに20匹のワームを無作為に選択し、3%アガロースパッド上に置いた50 mMレバミソール塩酸塩（MP Biomedicals, Solon, OH, USA）10μl中で麻酔した（パッドあたり5匹）。1分後、カバースリップで覆い、CoverGrip™ Coverslip Sealant (Biotium, Fremont, CA, USA)で密封してサンプルの乾燥を防止しました。ライカDM6正立顕微鏡（Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）を用いて、口先から咽頭終球のすぐ後ろまであるワームの頭部領域のZスタック画像を高倍率（63x対物）で撮影した。各ワームのモザイク画像は合成され、後に画像解析に用いられた。
2.7 画像解析
Imarisソフトウェアバージョン9.7による画像解析に先立ち、得られた画像をImaris File Converterソフトウェアで読み取り可能なファイルに変換した。ワームの頭部領域における蛍光凝集体は、自動スポット検出機能を用いて定量化・測定した。この機能により、アルゴリズムが蛍光凝集体を覆うスポットを作成した。この生成されたスポットを定量・計測することで、蛍光凝集体の量や体積を把握することができる。スポット検出機能のアルゴリズムは、選択した領域（虫の頭）だけに解析を限定する「Segment only a region of interest」と、「Different spot sizes (Region growing)」を選択することで設定しました。次に、Slicesタブで測定されたいくつかの蛍光凝集体の推定サイズに基づいて、スポットのXYZ直径が入力された。使用したアルゴリズムで蛍光凝集体が検出されると、すべての蛍光凝集体を最適にカバーするように量の閾値が調整された。サイズの決定には、ローカルコントラストオプションが選択されました。コントラスト面積の閾値は、スポットのサイズに最も合うように調整された。最後に、アルゴリズムによって誤って選択された背景ノイズを手動で削除した。統計データはエクセルにエクスポートされた。
2.8 生存時間アッセイ
成虫を同調させ、孵化したL1幼虫に、上記のように20℃でL4幼虫期まで大腸菌OP50を摂取させた。その後、L4期のワーム100匹を8種類の調製飼料に導入した。新鮮な餌に移し、4日目の成虫ステージまで2日ごとに生存率を評価した。生存した線虫と死亡した線虫の数を記録した。優しく触ったり摘んだりしても反応しない虫は死んだとみなし、取り除いた。プレートから欠落した線虫は計算から除外した。実験は二重で行った。
2.9 統計分析
統計解析は、IBM SPSS Statistics version 28.0を用いて行った。個々の細菌株（表S1）および細菌群（表S2）のα-syn凝集体の数量および体積についてShapiro-Wilk正規性検定を実施した。虫群間（陰性対照、陽性対照、患者DSV株を与えた虫、健康DSV株を与えた虫）および異なる細菌株を与えた虫間のα-syn凝集体の量および体積の比較には、Kruskal-Wallis検定を使用した。さらに一対の比較は、Mann-Whitney U 検定を用いて実施した。また、Kruskal-Wallis検定を用いて、細菌飼料を与えて4日後に死亡したワムシの数を飼育群間で比較した。P値＜0.05を統計的に有意とみなした。すべての検定は両側であった。
3 結果
3.1 糞便サンプル中のDesulfovibrio菌の検出について
本研究では、パーキンソン病患者10名と健常者10名から糞便サンプルを採取しました。どの糞便サンプルにDSV菌が含まれているかを知るために、種特異的なプライマーと、ほぼすべてのDSV菌に存在する[FeFe]-ヒドロゲナーゼ遺伝子（hydA）を検出するプライマーを用いた通常のPCRを実施した。その結果、PD患者のすべての糞便サンプルと健常者の8つの糞便サンプルでDSV菌が陽性であった（表2）。D. fairfieldensisは、両グループで検出された最も一般的なDSV菌種であった。
表2
表2 PD患者および健常者の糞便中のDesulfovibrio菌のPCR検出結果。
3.2 デスルホビブリオ菌の単離
DSV菌が検出された糞便サンプルは、細菌の分離に使用した。その後、DSVの分離株を線虫の餌として使用し、α-synの凝集を評価した。その結果、3人のPD患者の糞便から3つのDSV株（D. desulfuricans、D. fairfieldensis、D. piger）が、3人の健常者の糞便から3つのDSV株（D. desulfuricans, D. desulfuricans, D. fairfieldensis）が単離された。一部のDSV陽性サンプルの細菌は、使用した条件下で増殖しなかった。また、一部の菌株は純粋培養ができず、本試験に使用することができなかった。
3.3 線虫モデルにおけるα-syn凝集体の定量化
様々なDSV細菌株のα-syn凝集誘導能を評価するために、黄色蛍光タンパク質と融合したヒトα-synを産生する線虫モデルを使用しました。このワームに、PD患者および健常者の糞便から分離したDesulfovibrio株、またはコントロールとして大腸菌株（ポジティブコントロール：curli産生大腸菌MC4100、ネガティブコントロール：非curli産生大腸菌LSR11）のいずれかを投与した。α-synの凝集は共焦点顕微鏡で調べた。
PD患者由来のDSV菌を与えたワームは、健常者由来のDSV菌や大腸菌を与えたワーム（76.5 vs. 12 or 3 or 22.5）（P<0.001, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U test）よりも有意に多くのα-syn凝集塊を有していた（図1、図2）。一方、健常者のDSV菌を与えたワムシは、陽性コントロールとほぼ同数の凝集体（12対22.5）（P>0.05）、陰性コントロール（12対3）（P<0.001）よりも統計的に多くの凝集体を有していました。PD患者由来のDSV菌を与えたワームのグループ内では、D. desulfuricans、D. fairfieldensis、D. pigerを与えたワームの間で、α-syn凝集体の量に有意差は見られなかった（図2A）。
図1
図1 パーキンソン病患者および健常者由来の大腸菌コントロールおよびDesulfovibrio菌を与えた線虫の頭部断面図。ワームに（A）大腸菌LSR11（ネガティブコントロール）、（B）大腸菌MC4100（ポジティブコントロール）、（C）PD患者由来のD. desulfuricans株、（D）健常者由来のD. desulfuricans株を摂取させた。矢印はα-syn凝集体の一部を示す。PD患者由来のDSV菌を与えたワムシの凝集体は、コントロールに比べて明るく、大きく、豊富であった。
図2
図2 異なる細菌を摂取させた成虫期4日目の線虫の頭部領域におけるα-syn凝集体の数を、個別に（A）またはグループとして（B）示した。NC： 大腸菌LSR11（ネガティブコントロール）、PC： E. coli MC4100（ポジティブコントロール）、PD患者： パーキンソン病患者由来DSV株、HLT個体： 健常者由来のDSV株。1菌種につき20匹のワムシを分析した。ドットは解析したワーム（A）または外れ値（B）を示す。箱は第1四分位値（下端）と第3四分位値（上端）、中央値（箱内の水平線）を表す。
3.4 α-syn凝集体のサイズ決定
量に加えて、ワームの頭部領域に蓄積されたα-syn凝集体の体積（μm3）も記録された。統計解析の結果、PD患者のDSV菌を与えたワームのα-syn凝集体の体積は、健常者のDSV菌を与えたワーム（16.38 vs 1.12）、陽性コントロール（16.38 vs 4.27） または陰性コントロール （16.38 vs 0.76） に比べて有意に大きかった（P <0.001, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U test）（図 3）。健康な個体から採取したDSV菌を与えたワムシは、かなりの量のα-syn凝集体を保有していたが、凝集体の体積は陰性対照のもの（1.12 vs. 0.76）（P>0.05） と差がなく、陽性対照のもの （1.12 vs. 4.27）（P<0.001） より明らかに小さかった。PD患者由来のDSV細菌を与えたワームのグループ内では、D. desulfuricansおよびD. fairfieldensisを与えたワームは、D. pigerを与えたワームよりも統計的に有意に大きなα-syn凝集体を保有していた（27.67および21.79 vs. 6.76）（P<0.001）（ 図 3A）。最も大きなサイズのα-syn凝集体は、D. desulfuricansを与えたワームで見られた。
図3
図3 異なる細菌を与えた4日目成虫期の線虫の頭部領域におけるα-syn凝集体の体積を、個別に（A）またはグループとして（B）示した。NC： 大腸菌LSR11（ネガティブコントロール）、PC： E. coli MC4100（ポジティブコントロール）、PD患者： PD患者：PD患者からのDSV株、HLT個体：HLT個体からのDSV株： 健常者由来のDSV株。1菌種につき20匹のワムシを解析した。ドットは解析したワーム（A）または外れ値（B）を表す。箱は第1四分位値（下辺）と第3四分位値（上辺）、中央値（箱内の水平線）を表す。
3.5 生存率アッセイ
DSV菌が線虫の生存率に与える影響を評価するため、給餌2日後と4日後に生虫数をカウントした。飼料に導入されて2日後、ポジティブコントロールとDSVを与えた群では、ネガティブコントロールよりも生きたワムシの数が減少していた（図4）。しかし、ポジティブコントロール群ではそれ以上の有意な減少は見られず、DSV菌を与えたワームは死に続けた。4日後、統計解析の結果、PD患者由来のDSV菌を与えたワームは、ネガティブコントロール群のワームよりも有意に多く死亡した（24±10 vs. 3±1）（P<0.01、Kruskal-Wallis test）。
図4
図4 異なる細菌を2日間および4日間摂食した後に生存した虫の数を、個々（A）またはグループ（B）として示した。NC： 大腸菌LSR11（ネガティブコントロール）、PC： E. coli MC4100（ポジティブコントロール）、PD患者： PD患者：PD患者からのDSV株、HLT個体：HLT個体からのDSV株： 健常者由来のDSV株。データは平均値±SDで示した。
4 ディスカッション
α-synucleinの凝集は、curli産生大腸菌の曝露により、線虫の頭部領域や高齢ラットの腸や脳で増加することがこれまでに報告されています（Chen et al.、2016）。これに対応して、α-synを過剰発現しているマウスにcurli産生大腸菌を経口投与すると、運動障害が生じ、腸や脳でもα-synの凝集が促進された（Sampson et al.、2020）。ここでは、DSV株、特にPD患者由来の株は、curli産生大腸菌よりも、より大きく、より豊富なα-syn凝集体の蓄積を刺激する能力が高いことが示された。また、DSV菌、特に患者株を与えたワームでは致死率の上昇が観察されたが、これは蓄積されたα-syn凝集体の量が耐え難いほど多く、細菌の毒性が異なるためと思われる。健常者由来のDSV菌もcurli産生大腸菌と同様にα-synの凝集を誘導したことから、DSV菌が由来とは無関係にα-synの凝集を誘導する可能性を否定するものではない。α-synの凝集がPDの特徴であることを考慮すると、本研究で示されたように、DSV菌が大量の数とサイズでα-syn凝集を誘導できることは、以前に示唆されたように、PDにおけるDSV菌の病原性の役割を示すさらなる証拠となる（Murros et al., 2021）。
本質的な発見として、試験したすべてのDSV菌が、線虫の頭部領域でα-syn凝集を誘導した。さらに興味深いことに、PD患者の糞便サンプルから分離されたDSV菌は、健常者のサンプルから分離されたDSV菌よりもα-syn凝集を誘導する能力が高いことが判明した。さらに、患者のDSV菌は、線虫の致死率を有意に増加させた。これらの結果は、すべての株に存在する共通の特徴の他に、PD患者のDSV株は、より強い毒性を持ち、より多くのα-syn凝集を引き起こすことができる、より高い病原性を持っていると思われることを示唆する。このような病原性因子は不明であるが、いくつかの仮説、特にH2S産生能に関する仮説が考えられている。H2Sは、ヒト細胞のミトコンドリアから細胞質へのチトクロームcの放出を促進することが報告されている（Baskar et al., 2007; Calenic et al., 2010）。さらに、シトクロムcは活性酸素の存在下でα-synの凝集を潜在的に誘発します（Hashimoto et al., 1999; Kumar et al., 2016）。これらの知見は、DSV菌のようなH2S産生菌の増加量がPDの発症に関与しているという見解を支持している（Murros et al., 2021; Murros, 2022）。DSV菌は、H2Sを産生する効果について、互いに多かれ少なかれ違いがある可能性がある。H2Sは、カタラーゼを介したプロセスで硫黄含有化合物から生産することができる（Olson et al.、2017）。しかし、すべてのDSV株がカタラーゼを負っているわけではなく（Loubinoux et al., 2000）、現在のところ、DSV菌の機能におけるこの酵素の役割は推測にとどまっている。注目すべきは、[FeFe]型と[NiFe]型の両方の複数の酵素からなるDSV菌のヒドロゲナーゼ系が、菌種によってかなり異なることである（Baffert et al.、2019）。ヒドロゲナーゼは、異化型硫酸還元酵素からなるH2S産生酵素複合体に電子を供与する中心的な役割を果たすため（Singh and Lin, 2015）、ヒドロゲナーゼ系の明確な違いは、最終的に異なるDSV菌株間のH2S産生の違いとして現れる可能性があります。
さらに、α-synの凝集に至るプロセスは、異なるDSV株による消化管細胞との相互作用能力の違いに依存している可能性がある。様々なDSV株が上皮細胞表面に付着し、細胞質内に侵入し、細胞内で複製することが示されている（Bisson-Boutelliez et al.、2010）。興味深いことに、DSV菌が属する硫酸還元菌（SRB）は、潰瘍性大腸炎患者由来のSRB濃縮液ではヒト大腸上皮細胞のアポトーシスを誘導するが、健康人由来のSRB濃縮液ではこの反応は起きないことが示されている（Coutinho et al.、2017）。これら2つの研究を考慮すると、病原性DSV株は腸管バリアの完全性と機能を損傷し、損なわせると推定するのが妥当である。これにより、第一に、ヒトの腸にDSVがさらに定着し、腸内分泌細胞などの周囲の細胞との相互作用が可能になり、DSV-PD発症モデル（Murros et al., 2021）で提案されているようにα-syn凝集が増加することになります。第二に、腸管バリアが損傷し機能不全に陥ると、最終的に腸管炎症が引き起こされることになる。腸内炎症は、腸内細菌異常、免疫応答、α-syn病理との関係に関与するため、PD発症を促進する根本的なメカニズムとなり得る（Houser and Tansey, 2017）。興味深いことに、腸の炎症はH2S不活性化システムの能力を低下させ（Flannigan et al., 2013）、DSV産生H2Sを蓄積させ、α-syn凝集を促進させる。最後に、DSV菌を含むグラム陰性菌の外膜に存在することが知られているリポポリサッカライドは、さらなる病原性因子となる可能性があります。リポ多糖は、α-syn凝集を調節し（Bhattacharyya et al., 2019）、マウスの血漿H2S濃度を高めることが示されている（Li et al., 2005）。さらに興味深いことに、異なるDSV株のリポ多糖は構造が多様である（Zhang-Sun et al.、2015）。この多様性は、最終的に多様な内毒性とα-syn凝集を誘導する異なる能力をもたらす可能性があります。
線虫のPDモデルを用いて、DSV菌がα-synの凝集をサイズと量の両面で促進することを確認しました。また、PD患者と健常者から分離したDSV株は、α-synの凝集を誘導する能力や毒性が有意に異なることが確認された。この結果は、DSV株には様々な性質があり、特定の病原性形質を持つ株は、α-syn凝集を誘導または促進することにより、PDの病態に関与する可能性があることを示しています。今後、これらの形質が疾患発症に果たす役割をさらに評価するための研究が必要である。DSV菌はPDと関連し、α-syn凝集を誘導することができるため、DSV菌を根絶する、あるいはその濃度を低レベルに保つことはPDの予防戦略となり得る。PD患者と健常者から分離されたDSV株は異なる形質を持っていると思われるが、本研究で示された以外の鑑別方法はまだ知られていない。したがって、PD患者DSV株から遺伝的な違いや病原性遺伝子を特定するために、比較ゲノム解析を行う必要がある。
データの利用可能性に関する記述
本研究で発表されたオリジナルの貢献は論文に含まれており、さらなる問い合わせは対応する著者に向けられる。
倫理に関する声明
ヒト参加者を含む研究は、ヘルシンキの倫理委員会およびUusimaa Health District（No.2510/2020）の審査および承認を受けた。患者/参加者は、この研究に参加するために、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
著者による寄稿
概念化する： VH、TT、KM、PS。方法論： VH、TT、PS。調査： VH、BD。形式的な分析： VH。リソース KM。資金獲得： PS. プロジェクト管理： PS. 監修： BDはVHとPSが、VHはTTとPSが監修した。執筆 - 原案： VH。執筆-レビューと編集： VH、KM、TT、PS。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
VHはOskar Öflunds FoundationとUniversity of Helsinkiからの財政的支援に感謝する。BDは、エラスムス学生交換プログラムによる奨学金を謝辞とする。本研究は、Magnus Ehrnrooth財団、Jane and Aatos Erkko財団の支援を受けています。
謝辞
大腸菌MC4100株およびLSR11株をご寄付いただいたミシガン大学のMatthew Chapman教授に感謝いたします。顕微鏡の選択、操作、画像解析について助言と指示をいただいた Light Microscope Unit (University of Helsinki)に感謝します。Leena A. RäsänenとXiaodan Ouyang (University of Helsinki)には、原稿を批判的に読み、改善するためのコメントをいただきました。また、ヘルシンキ大学の微生物学・バイオテクノロジー博士課程にも感謝する。
利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1181315/full#supplementary-material。
参考文献
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キーワードは パーキンソン病、腸内デスルホビブリオ菌、α-シヌクレイン（α-syn）、線虫、硫化水素、リポポリサッカライド、キュリ産生大腸菌、マグネタイト
引用元 Huynh VA, Takala TM, Murros KE, Diwedi B and Saris PEJ (2023) Desulfovibrio bacteria enhances alpha-synuclein aggregation in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease. Front. Cell. Infect. Microbiol. 13:1181315. doi: 10.3389/fcimb.2023.1181315
受理された： 2023 年 3 月 07 日; 受理された： 2023 年 4 月 19 日；
発行：2023年5月1日
編集者
フェルナンド・ナバロ・ガルシア、メキシコ国立工科大学（CINVESTAV）、メキシコ
レビューした人
メキシコ国立工科大学（CINVESTAV）Claudia Perez-Cruz (メキシコ)
Eng Guan Chua（西オーストラリア大学、オーストラリア
Copyright © 2023 Huynh, Takala, Murros, Diwedi and Saris. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Per E. J. Saris, per.saris@helsinki.fi
免責事項：本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
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