リノール酸の内因性誘導体およびその安定な類似体は潜在的な痛みメディエーターである
ジョシュア・J・ウィーラー
アンソニー・F・ドメニケイリョ
Jennifer R. Jensen
ジョン・M・デイビス
クリストファー・E・ラムスデン
サントッシュ・K・ミシュラ
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オープンアクセス公開日:2022年12月25日DOI:https://doi.org/10.1016/j.xjidi.2022.100177
PlumX メトリクス

ABSTRACT
乾癬は強い掻痒感を特徴とし、乾癬患者のサブセットには熱過敏症が見られる。しかし、乾癬および他の皮膚疾患における熱過敏症の病態生理は、依然として謎に包まれている。リノール酸（LA）は皮膚に多く存在するオメガ6系脂肪酸であり、LAの酸化により複数の水酸基およびエポキシド官能基を持つ代謝物が生成し、皮膚バリア機能に関与することが明らかにされている。以前、我々は、乾癬病変部においてより濃縮されたいくつかのLA由来のメディエーターを同定したが、これらの脂質の乾癬における役割は不明であった。ここでは、そのような2つの化合物 9,10-epoxy-13-hydroxy-octadecenoate (9,13-EHL) および 9,10,13-trihydroxy-octadecenoate (9,10,13-THL) が遊離脂肪酸として存在し、ラットではなくマウスで侵害行為を誘発することを報告する。9,13-EHL と 9,10,13-THL をメチル基の付加により化学的に安定化させたところ、マウスで疼痛と過敏症が観察された。侵害受容反応は TRPA1 チャネルの関与を示唆し、これらのメディエーターによって引き起こされる知覚過敏反応は TRPA1 と TRPV1 チャネルの両方を必要とする可能性があることが示された。さらに、9,10,13-THL による感覚神経細胞のカルシウム過渡現象は、未同定の GPCR の Gβγサブユニットを介することが示された。本研究で得られた知見は、痛みや知覚過敏の治療のための潜在的な標的を開発するための指針になると思われる。
キーワード
痛み
オキシリピン
TRPA1
TRPV1
リノール酸
酸化リノール酸代謝産物
はじめに
酸化脂質（オキシリピン）は、皮膚を含む組織のエステル化された構造成分として重要な生理的役割を担っている（Chiba et al.） 遊離（非エステル化）オキシリピンは、エステル化（構造）対応物よりも不安定で生物活性が高い傾向があり、傷害後の免疫活性化を媒介するシグナル伝達分子として重要な役割を果たす（Osthues and Sisignano, 2019, Serhan, 2007, Serhan et al, 2015, Shapiro et al, 2016）。古典的には、オメガ6（n-6）アラキドン酸由来のオキシリピン（例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン）は、炎症および痛みの媒介への関与について十分に確立されている（Osthuesら、2020年、Shapiroら、2016年）。ごく最近、n-6リノール酸（LA）由来の別のクラスのオキシリピンが、前臨床モデルにおいて侵害受容に役割を果たすことが示されている（Alsalemら、2013、Patwardhanら、2010、Patwardhanら、2009、Ramsdenら、2017）。
つの酸化リノール酸代謝物、9-および13-ヒドロキシオクタデセノエート（HODE）は、前臨床モデルにおいて侵害受容反応に寄与することが実証されており（Alsalemら、2013、Osthuesら、2020、Patwardhanら、2010、Patwardhanら、2009）、健康皮膚と比較して乾癬病巣において著しく高い存在量で見出される（Sorokinら、2018、Tyrrellら、2021a）。Brashらは、LAのヒドロキシ-エポキシドおよびケト-エポキシド誘導体を皮膚中のエステル化脂質として同定し、これらのオキシリピンが皮膚水バリアの完全性を維持する構造的役割を提案した（Munoz-Garciaら、2014、Takeichiら、2020）。LAのヒドロキシエポキシドおよびケトエポキシド誘導体を合成する酵素、アラキドン酸リポキシゲナーゼ（ALOX12BおよびALOXE3）および短鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー9Cメンバー7（SDR9C7）などの脱水素酵素の機能喪失は、皮膚バリア形成に深刻な障害を引き起こすことが示されている（Takeichi et al.） また、Brashらは最近、いくつかのLA由来のオキシリピンがセラミドにエステル化されて表皮に存在し、乾癬患者の皮膚では健常対照者と比較してより豊富であることを明らかにした（Tyrrellら、2021b）。我々は、LAのヒドロキシ-エポキシドおよびケト-エポキシド誘導体が乾癬病変で上昇することを観察し、これらのオキシリピンの遊離酸形態が痛みやかゆみに寄与する可能性を示唆しました（Ramsden et al.、2017）。しかし、これらのLA誘導体が皮膚-神経軸を介して痛みに関連するメカニズムおよび経路は依然として不明である。
これらのギャップを解決するために、我々はまず、ヒトおよびラットの皮膚のフリーおよびトータルプール中の13-ヒドロキシ-9,10-エポキシオクタデセン酸（9,13-EHL）およびトリヒドロキシリノール酸誘導体の9,10,13-トリヒドロキシオクタデセン酸（9,10,13-THL）を液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）により定量化した。さらに、これらの内因性化合物の分解を防ぐために、特定の炭素にメチル基を付加することで修飾した。カルシウムイメージング、マウス遺伝学、行動学、薬理学などの複数のアプローチにより、これらの誘導体の侵害受容反応と痛み反応を伝達する受容体を検討した。本研究は、遊離型 9,10,13-THL およびその類縁体がマウスの疼痛メディエーターとなる可能性を示唆し、炎症性皮膚疾患と関連する疼痛および過敏症に関する理解を深めるものである。
結果
リノール酸由来のオキシリピンはヒト皮膚に存在する
オキシリピンは、多価不飽和脂肪酸から生成される酸素を含む誘導体の一種である。リノール酸由来のオキシリピンは、皮膚において水バリア形成の一部としてエステル化され（図1a）、加水分解により放出され（図1b）、シグナル伝達分子として作用することが報告されている（Zheng et al.、2011）。LC-MS/MSを用いて、我々はいくつかのオキシリピンを皮膚中の遊離酸として同定した。さらに、アルカリ加水分解により複合脂質にエステル化したオキシリピンを遊離させ、LC-MS/MSを用いて、各オキシリピンの総（遊離＋エステル化）プール濃度を推定した（図1h-k）。9,13-EHL (図 1d) は 9,10,13-THL (図 1e) よりも約 20-40 倍 (図 1h および i) 多く、9,13-EHL が 9,10,13-THL 合成の基質になりうることを示唆した (図 1c)．オキシリピンは、遊離のプールと比較して、全プールにおいて最大10倍も豊富であり、皮膚は大量のオキシリピンを遊離酸として貯蔵・放出し、シグナル伝達する可能性があることが示された（図1h-j）。注目すべきは、遊離脂肪酸プールにおいて、LA由来のオキシリピンは、古典的な痛みメディエーターであるPGE2よりも少なくとも2倍多く存在していたことである（図1k）。ヒト皮膚におけるこれらのLC-MS/MS測定結果は、LA由来のオキシリピンが皮膚におけるシグナル伝達に関与していることを示唆するものであった。
図 サムネイルgr1
図1リノール酸（LA）代謝産物は、ヒトの皮膚では脂肪酸の遊離プールと総プールの両方に存在する。ボックスは、a) LAまたはオキシリピン（すなわち。b) ホスホリパーゼなどの酵素による加水分解により、エステル化されたオキシリピンが遊離酸として膜から放出され、受容体に結合したり分子プロセスに関与したりする。c) 低 pH 環境下でのエポキシド加水分解やエポキシドヒドロラーゼによる 9,13-EHL から 9,10,13-THL への変換。 d, e) リン脂質二重層にエステル化した遊離酸オキシリピン。g) 9,13-EHL および 9,10,13-THL の安定なアナログを合成して、エステル化を防ぎ、ファーマコフォアの劣化を防ぐことができる。h) 9,13-EHL, i) 9,10,13-THL, j) 9-HODE, k) PGE2 のヒト皮膚におけるオキシリピンの濃度測定。パネル h ～ k のデータは平均値 ± 標準偏差 (SD) で示され、これらのデータに対して統計的検定は行われなかった。各データポイントは、1つの生物学的複製に対応し、n=3。
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9,13-EHLおよび9,10,13-THLの濃度は炎症によって変化する
炎症が皮膚中のオキシリピン濃度に及ぼす影響を評価するために、ラットにComplete Freund's Adjuvant（CFA）を皮内注射した。以前の報告と同様に、顕著な腫脹が観察された（Fehrenbacherら、2012）。しかし、我々は、コントロールから統計的に有意な侵害行動の変化を観察しなかった（図2a-c）。CFA注入は、LA由来のオキシリピン濃度の低下とPGE2濃度の上昇を誘発した（図2d-g）。これは、PGE2合成能を有する酵素をコードする遺伝子は炎症により誘導されるが、Alox12BとAloxe3は誘導されないことを示した遺伝子発現研究と一致する（Domenichielloら、2021年）。以前、LA由来のオキシリピンを合成するのに必要な酵素は、炎症の影響を受けないことが報告されたが、いくつかのホスホリパーゼの発現は、炎症に反応して増加した（Nevalainen et al, 2000）。炎症は組織に著しい浮腫を引き起こし、炎症はエステル化オキシリピンを遊離脂肪酸プールに放出するホスホリパーゼの発現を誘導することが証明されているので、我々は遊離脂肪酸プール中の各LA由来のオキシリピンの割合を計算し、浮腫による組織量の増加分を補正することにした。この補正により、遊離脂質プール中の9,10,13-THLと9-HODEの割合は、CFA注入により増加することが分かった（図2h）。これらの結果は、炎症がホスホリパーゼおよびプロスタグランジン合成酵素をコードする転写物の遺伝子発現の増加を誘発したラットにおける以前の報告（Domenichielloら、2021）と一致する。
図サムネイルgr2
図2皮膚中のオキシリピン濃度に対する炎症の影響。ラットに、一般的な実験的炎症刺激であるComplete Freund's Adjuvant（CFA）またはPBSを皮内注射した（1群あたりn=24）。注射後4時間、1日、4日目に、a) 同側拭き取り、b) 両側拭き取り、c) 注射部位の引っ掻き、を測定した（各群n = 24, 18, 10）。CFA誘発炎症に示されるメディエーターの存在量はPBS注射と比較した。d）9-hydroxyoctadecenoate（9-HODE）（**p < 0. 0001） e) プロスタグランジン E2 (PGE2) (**p = 0.0006, 1 day post-CFA and **p < 0.0001 for 4 days post-CFA) f) 13-hydroxy-9,10-epoxy octadecenoate (9,13-EHL) (***p < 0.0001 for 4 hours and 1 day post-CFA). 0001、CFA後4時間およびCFA後1日）、および（g）9，10，13-トリヒドロキシオクタデセノエート（9，10，13-THL）（＊p＝0.048、CFA後4時間） h） 9-HODE の割合（＊p＝0． 0220（CFA後1日）、9,13-EHL、および9,10,13-THL（CFA後4日）は、PBSと比較してCFA注入後4日と1日（s）で遊離酸として皮膚内に存在する割合を測定した。データはMean±SDで表示した。パネルA〜Cでは、多重比較のためのHolm-Šídák補正を行った一元配置分散分析により、有意差は見られなかった。Panels D - Hでは、多重比較のためのHolm-Šídák補正を伴う2元配置ANOVAを用いて有意差を決定した。各データポイントは、1つの生物学的複製、n≥6を指す。
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9,13-EHL、9,10,13-THLおよびその安定型アナログによる感覚神経細胞のin vitro活性化。
9,13-EHL、9,10,13-THL（天然化合物）それらの安定アナログおよび推定ファーマコフォアが感覚神経細胞におけるカルシウム流入を誘発するかどうかを調べるために、初代培養後根神経節（DRG）ニューロンに対してFura-2AMベースのカルシウムイメージングを使用した。オキシリピンに反応するニューロンの定量化を図3aに示した。9,10,13 THL用量反応曲線に基づいて、天然および安定な類似体の両方を1μM使用した（図3b）。その結果、約 7.0 ± 3.1% のニューロンが 9,13-EHL に反応し、約 8.0 ± 6.2% のニューロンが 9,10,13-THL に反応して活性化することがわかった。さらに、これらの天然化合物のメチル化アナログ（特定の修飾および調製については表1）をDRG感覚神経細胞で試験した（Keyesら、2021年）。これらのアナログは、オキシリピンがさらにエステル化および脱水素化されるのを防ぐことによって安定性を提供し、その結果、シグナルを効率的かつ効果的に誘導するために開発されたものである。予想通り、9,13-EHL のメチル化安定アナログに反応したニューロンは 8.0 ± 6.2 % であった： 2,2, methyl-13-hydroxy-9,10-epoxy octadecenoate (2,2M-9,13-EHL), 13 ± 3. 8％のニューロンが13-メチル、9,10-エポキシオクタデセノエート（13M-9,13-EHL）に反応し、23.8±6.8％のニューロンが2、2、13メチル-9、10-エポキシオクタデセノエート（2、2、13M-9、13-EHL）に対して活性化した。さらに、9,13-EHLの活性ファルマコフォアとして提唱されている2-ヒドロキシ-5,6-エポキシ-ヘプト-3(E)-エンに8.5±6.3%のニューロンを反応させた。同様に、9,10,13-THLのメチル化安定アナログにも反応することがわかった。2,2-メチル-9,10,13-ヒドロキシオクタデセン酸（2,2M-9,10,13-THL）に反応したニューロンは5.4 ± 5.6% 、 2,2,13-Methyl-9,10,13-hydroxy octadecenoate (2,2,13M-9,10,13-THL) に反応したニューロンは 6.6 ± 4.5% であった。最後に、9,10,13-THLの活性ファーマコフォアが提案されている2,5,6-トリヒドロキシ-ヘプト-3(E)-エンに暴露したニューロンの7.7 ± 0.7%であった。これらのオキシリピンおよびオキシリピン類似体に反応するニューロンの割合は、（図3a）に示すように、9-HODE（DRGニューロンの12.7 ± 4.2 %）およびPGE2（ニューロンの13.1 ± 3.8% ）などの既知の炎症性メディエーターに一致する。これらのデータを総合すると、天然化合物とその安定な類似体の両方が感覚神経を活性化することが示された。
図 サムネイル gr3
図3カルシウムイメージングを用いた感覚ニューロンの活性化／阻害。 a）ビヒクル（1X PBS {v/v}中の1％エタノール）、9HODE、PGE2、9，13EHL、9，10，13THL、9，13EHLおよび9，10，13THLの安定アナログ、ならびにそれらの低分子ファーマコフォーに対する初代培養DRG感覚ニューロンのカルシウムイメージング反応の定量化。すべての化合物は1μMの濃度で試験し、特に断りのない限り100mMのKCl反応に正規化した。 b) 内生メディエーター9,10,13-THLの用量反応曲線、各ドットは単一のカバースリップを表す、n=2。 c) 車両またはガレイン（100μM）とプレインキュベーションしたDRGニューロンは9,10,13-THLとカプサイシン（*p = 0.035）に曝露させた。 0339）。d）ビヒクルまたは百日咳毒素（PTX、1ng／mL）とプレインキュベーションし、9，10，13-THLおよびカプサイシンに暴露したDRGニューロン、2-tailed paired Studentのt-検定に基づきns＝有意ではない（not significant）。e) WT、TRPA1 KO、TRPV1 KOマウスの9,10,13-THL、AITC（100μM）、カプサイシンに反応する神経細胞は、カルシウムの過渡変化を測定することによって示した。有意性は2元配置ANOVAを用い、Holm-Šídák補正により多重比較した。9,10,13-THLの場合。**p = 0.0311 (WT vs TRPA1 KO) および **p = 0.002 (WT vs TRPV1 KO)。AITCについては、***p = 0.001 (WT vs TRPA1 KO)であった。カプサイシンについては、***p < 0.0001 (WT vs TRPV1 KO)。すべてのデータはMean ± SDで示した。各データポイントは、カバースリップ/マウスの平均を表し、n≧3である。
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表1本研究で使用した化合物の構造、名称、文中での略称。
構造 化学名 本文および図中の略称 Preparation
9,10-trans-epoxy-13-hydroxy-ocatdecenoic acid 9,13-EHL Cayman Chemical社製
2,2-dimethyl-9,10-trans-epoxy-13-hydroxy-ocatdecenoic acid 2,2M-9,13-EHL In house
9,10-トランス-エポキシ-13-ヒドロキシ-13-メチル-オクタデセン酸 13M-9,13-EHL インハウス
2,2,13-トリメチル-9,10-トランス-エポキシ-13-ヒドロキシ-オクタデセン酸 2,2,13M-9,13-EHL In house
9,10,13-トリヒドロキシオクタデセン酸 9,10,13-THL ケイマンケミカル社製
2,2-ジメチル-9,10,13-トリヒドロキシ-オクタデセン酸 2,2M-9,10,13-THL In house
9,10,13-トリヒドロキシ-13-メチルオクタデセン酸 13M-9,10,13-THL インハウス
2,2,13-トリメチル-9,10,13-トリヒドロキシ-オクタデセン酸 2,2,13M-9,10,13-THL In house
2-ヒドロキシ-5,6-エポキシ-ヘプト-3(E)-エン 2-Hydroxy-5,6-epoxy-hept-3(E)-en In house
2,5,6-トリヒドロキシ-ヘプト-3(E)-エン 2,5,6-trihydroxy-hept-3(E)-en In house
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9,10,13-THLがイオンチャネルとGタンパク質共役型受容体のどちらに結合するのかを知るために、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）のGβγサブユニットの解離を阻害するガレインとGαサブユニットの機能を阻害する百日咳毒素（PTX）を用いて、9,10,13-THLがどの経路でカルシウム過渡応答を引き起こすかを検討した。GPCRサブユニット阻害剤を用いたのは、他の侵害受容性脂肪酸代謝物がGPCRを介して働くことが報告されているからである（Batsshakeら、1995、Foordら、1996、Healyら、2018、Linら、2006、Meyerら、1997、Minamiら、2001、長久・奥村、2017、Nemotoら、1997）。その結果、9,10,13-THLは、細胞内Gβγ経路を介して侵害受容反応を引き起こすまだ知られていないGPCRに結合し、PTXを介したGα経路を介さないことが示された（図3cおよび3d、両側paired Studentのt検定により決定したp＝0.0339）。次に、これらの脂質メディエーターが、他の脂質メディエーターについて先に報告したように、これらのGPCRの下流で働くTRPチャネルを活性化するかどうかを検討した。TRPA1 (p = 0.0009) と TRPV1 KO マウス (p = 0.0026) では、他の脂質メディエーターと同様に 9,10,13-THL に反応するニューロンの割合が有意に減少することが確認された。TRPA1 KOマウスではAITCに、TRPV1 KOマウスではカプサイシンに反応するニューロンの割合が予想通り減少することがわかった（図3e）、2元配置分散分析を用いて有意差の判定を行ったところ、TRPV1 KOマウスではAITCに反応するニューロンの割合が減少した。この結果から、9,10,13-THL は、GPCR に結合してその Gβγサブユニットを活性化し、その後 TRPA1 や TRPV1 を活性化させることで作用を発揮することが示唆された。
生理活性脂質およびその類縁体は、マウスに急性の侵害受容反応を引き起こす。
これらの化合物は乾癬患者でより多く見出され、DRG感覚ニューロンへのカルシウム流入を誘導することができるため（Ramsdenら、2017）、次に、これらの化合物をマウスに注射［皮内（i.d.）］して、痛みまたはかゆみ行動が誘導されるかどうかを検討した。ここでは、痛みと痒みの行動を区別できる頬モデルを使用した（Shimada and LaMotte, 2008）。PGE2、9-HODE、9，13-EHL、または9，10，13-THLまたはそれらの安定アナログ（いずれも100μg／20μL i.d）（Ramsdenら、2017）に対する拭き取り反応を最初の5分間および合計30分間にわたり定量化した。最初の5分間で、9,10,13-THL（p = 0.0008）、2,2M-9,13-EHL（p = 0.0155）、13M-9,13-EHL（p = 0.0007）、2.2,13M-9,13-EHL（p ≦ 0.）について拭い打ち回数の著しい増加が確認されました。 0001）、および2,5,6-トリヒドロキシ-ヘプト-3（E）-エン（p = 0.0037）を車両注入と比較し（図4a）、クラスカル-ウォリス検定と多重比較のためのダン検定を用いて、有意性を決定した。残りの化合物は、ビヒクルと比較して、有意に異なる拭き取り回数を誘導しなかった。一方、9,13-EHLを除くすべての化合物では、30分間継続した場合、コントロールと比較して、ワイピングバウトの数が有意に増加することがわかった（図4b）。9,10,13-THLとPGE2、9-HODE、および9,13-EHLと9,10,13-THLの安定化アナログ間のワイピングバウトを比較すると、有意差は見られなかった。さらに、9,13-EHLと9,10,13-THLを9HODE、PGE2、およびそれぞれの安定化アナログと比較して、有意差があるかどうかを確認した（表2）。興味深いことに、13-EHL合成アナログのほとんどが、まだマウスに痛みを引き起こしていることがわかった。同側の指向性頬のひっかき行動は、車両注入と比較した場合、有意差はなかった（図4c）、多重比較のためのダンの検定によるクラスカル-ウォリス検定が、有意性を決定するために使用された。
図サムネイルgr4
図4コントロールマウスとノックアウトマウスにおけるオキシリピンに対する侵害受容反応 a) 最初の5分間、b) と30分間の頬の拭き取りを測定した。有意性は、多重比較のためのDunnの検定を用いたKruskal-Wallis検定で決定した; 9,13-EHL vs Vehicle, 9-HODE, and 2-hydroxy-5,6-epoxy-hept-3-(E)-ene は有意ではない; 9,13-EHL と比較した場合の他のp値は以下の通り： vs PGE2 **p = 0. 059、vs 2,2M-9,13-EHL *p = 0.0230、vs 13M-9,13-EHL **p = 0.0023、vs 2,2,13M-9,13-EHL *p = 0.023、vs 9,10,13-THL *p = 0.0282である。同じ統計テストを、9,10,13-THL vs Vehicle **p = 0.0033, vs 9-HODE は有意ではない, vs PGE2 は有意ではない, vs 2,2M-9,10,13-THL *p = 0. 0282、対 2,2,13M-9,10,13-THL は有意ではなく、対 2,5,6-trihydroxy-hept-3-(E)-ene は有意ではなかった。 c) ビヒクル（1X PBS {v/v}中の1%エタノール）および各種メディエーター（100 μg/ 20 μL i.d.）を注入後の同側指示頬掻き打ちの定量化。多重比較のためのダンの補正を用いた同じクラスカル・ワリス検定を使用して、同側の頬の指示された引っ掻き回数に有意差は見られなかった。 d) 5分以上の足底内注射後の肉球の指示された侵害受容行動反応に費やした時間の総計。有意性は、多重比較のためのDunnの検定を用いたKruskal-Wallis検定を用いて決定した：ビヒクル vs 9-HODE **p = 0.0090, ビヒクル vs PGE2 **p = 0.0013, ビヒクル vs 9,10,13-THL **p = 0.0029 e) WT, TRPA1 KO, TRPV1 KOマウスでビヒクルまたは100μg/ 20μL 9,10,13-THL (i.d.) に従って定量化した拭き取りの総数。有意性は、多重比較のためにHolm-Šídák補正を用いた1元配置ANOVAを用いて決定した：ビークル vs TRPA1 KOは有意ではなく、ビークル vs TRPV1 KO ***p = 0.0004, ビークル vs WT ****p < 0. 0001, TRPA1 KO vs WT ****p < 0. 0001。 0001, TRPA1 KO vs TRPV1 KO ****p < 0.0001, TRPA1 KO vs WT ***p = 0.0007, TRPV1 KO vs WT ***p = 0.0007. f) 9,10,13-THL 注入後の挙動の時間動態を 5 分間隔で示す。パネルeと同じパラメータを用いて有意性を判定した：5分ビンについて、ビヒクル処理マウスと9,10,13-THLで処理したTRPA1 KOマウスにおける同側の頬の指示拭きの数の間に有意差は認められなかった。同様に、9,10,13-THL投与TRPA1 KOマウスと9,10,13-THL投与TRPV1 KOマウスの間にも有意な差は見られなかった。その他の有意値は以下の通りである。Vehicle vs WT **p = 0.0040, Vehicle vs TRPV1 KO *p = 0.0104, WT vs TRPA1 KO **p = 0.0035, WT vs TRPV1 KO *p = 0.0104. データはMean ± SDで表示され、パネルa～eの各データポイントは1つの生物学的複製に対応し、n≧5である。
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表2図4bに関連する特定の比較のための計算されたp-値。有意性は、クラスカル・ワリス検定と多重比較のための無修正ダン検定を用いて決定された。行動結果のノンパラメトリックな性質のため、Kruskal-Wallis 検定が選択された。
化合物 対比 p -値
9,13-EHL ビークル 無意図
9-HODE 有意ではない
PGE2 **p = 0.0059
2,2M-9,13-EHL *p = 0.0230
13M-9,13-EHL **p = 0.0023
2,2,13M-9,13-EHL *p = 0.0230
9,10,13-THL *p = 0.282
2-ヒドロキシ-5,6-エポキシ-ヘプト-3(E)-エン 無意図
9,10,13-THL ビークル **p = 0.0033
9-HODE 有意ではない
PGE2 無意図
2,2M-9,10,13-THL *p = 0.0282
2,2,13M-9,10,13-THL 意図的でない
2,5,6-trihydroxy-hept-3(E)-ene 有意ではない
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次に、ビヒクル、PGE2、9-HODE、9,10,13-THLを足底に注射し、これらの化合物がDRGを介した痛み反応を引き起こすかどうかを検討した。この時点から、我々は9,10,13-THLに注目することにした。なぜなら、2つの天然リガンド（もう一つは9,13-EHL）のうち、9,10,13-THLは頬アッセイで著しく多くのワイピング反応を引き起こしたからである。我々は、3つのオキシリピンがすべて、ビヒクルと比較して有意に高い侵害受容（噛む/舐める、たじろぐ、ガードする、持ち上げる）反応を誘導することを見いだした（図4d）。PGE2 (p = 0.0011), 9-HODE (p = 0.0006), および 9,10,13-THL (p = 0.0002) であった。驚いたことに、ラットではどのオキシリピンも侵害受容反応を起こさなかった（図 5 a-d）。9,10,13-THL が痛みを引き起こす TRP チャネルを同定するために、TRPV1 および TRPA1 KO マウスでチークアッセイを行い、30 分間の行動を採点した（図 4e）。その結果、TRPA1 (p < 0.0001) とTRPV1 KO (p = 0.0015) のマウスでは、対照群に比べ同側の頬の拭き取り回数が有意に減少していることを確認した。TRPA1 KOマウスでは、同側の指向性頬拭いの数は、ビヒクル投与マウスと有意差はなかった。また、TRPV1 KOマウスでは、TRPA1 KOマウスと比較して同側の頬拭きの数が有意に増加した（p = 0.0005）、有意性の判定には、多重比較のためのダンの検定によるクラスカル・ワリス検定を用いた（図4d-f）。その結果、頬拭きの大部分は注射後最初の5分間に発生し（図4f、時間動態）、TRPA1およびTRPV1の欠損により、この最初の5分間の頬拭き回数が有意に減少することがわかった。
図サムネイルgr5
図5Vehicle、9,10,13-THL、PGE2注射後のラットの侵害反応。ビヒクル、9,10,13-THL、またはPGE2の注射後のa)同側の拭き取り回数、b)同側と反対側の拭き取り回数、c)パネルAとBからの拭き取り回数の合計、およびd)引っ掻き回数の数値。多重比較のためのHolm-Šídák補正を用いた一元配置分散分析では、有意差は見られなかった。データはMean ± SDで表示され、各データポイントは1つの生物学的複製に対応し、n=8である。
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9,10,13-THLによる熱感作にはTRPA1およびTRPV1が必要である。
9,10,13-THLは急性侵害受容行動を引き起こすことができるため、9,10,13-THLが熱（高温および低温）または機械的過敏症を引き起こすかどうかをさらに検討した。熱過敏症については、9,10,13-THL を移植した野生型マウスは、+50℃のホットプレート上に置いたとき、ビヒクル投与マウスと比較して有意に速い引き抜き時間を示した（図 6a）。この反応は、ビヒクルと9,10,13-THLを注射したTRPA1 KOマウスを比較すると消失し、TRPA1 KOマウスでは拭き取り反応が減少するという我々の急性行動の妥当性をさらに確認することができた。予想通り、TRPV1 KOマウスでは、車両と9,10,13-THLを注射したマウスとの間で行動反応に差は見られなかった。さらに、TRPA1/V1ダブルKOマウスでは、引き抜き潜時の有意差も見出せなかった。
図 サムネイル gr6
図6正常マウスおよびノックアウトマウスにおける9,10,13-THLによる末梢性感作 a) 9,10,13-THL (327 μM in 10 μL)を植物体内注入し5分培養した後のホットプレート上の引き出し遅延時間の変化。WT vehicle vs WT 9,10,13-THL **p = 0.0047, WT 9,10,13-THL vs その他 ****p < 0.0001. b) 9,10,13-THL (327 μM in 10 μL)を植物体内に注射し、5分間静置した後のコールドプレート上の引抜遅延の変化(p). WT vehicle vs WT 9,10,13-THL *p = 0.0498, WT 9,10,13-THL vs その他 ****p < 0.0001. c) 9,10,13-THL (10 μL中327 μM)を5分間植菌した後のメカニカルアッセイにおける引抜力の変化. 処置（ビヒクル vs 9,10,13-THL）を比較した場合、群内および株間で有意差は認められなかった。 d) 9,10,13-THL（10μL中327μM）植物体内注射の5分間インキュベーション後のドライアイスアッセイの引き出し待ち時間の変化。処理（ビヒクル vs 9,10,13-THL）を比較した場合、群内および系統間で有意差は認められなかった。データは平均値±SDで示し、各データポイントは単一の生物学的複製に対応し、n≧6である。有意性は、各遺伝子型内でビヒクル注入対9,10,13-THL注入の行動反応を比較することによって決定された。系統内で比較する場合は、Mann-Whitney U-testを使用して有意性を決定した。系統間および処理間の有意性を検定する場合は、Holm-Šídák補正を用いた2元配置のANOVAを用いた；ns = not significant.
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低温感受性を調べるために、5℃のコールドプレート（図6b）およびドライアイステスト（Brenner et al. ドライアイステストでは、ビヒクル注入と9,10,13-THL注入の野生型とそのKO同腹子（TRPA1 KO、TRPV1 KOまたはTRPA1/V1 DKOマウス）の間に有意差は見出せなかった。しかし、5℃のコールドプレート上では、9,10,13-THLを注射した野生型マウスとビヒクルとで、引き抜き潜時に有意差が見られた（p = 0.0357）。この引出し潜時の差は、ビヒクルと9,10,13-THLを注射したTRPA1 KO、TRPV1 KO、またはTRPA1/V1 DKOマウスを比較すると見られなかった（図6b）。機械的感受性については、ビヒクルと9,10,13-THLを注射した群のいずれにおいても、有意差は見られなかった（図6d）。系統内で比較する場合は、Mann-Whitney U-test。系統間および処理間の有意性を検定する場合は、多重比較のためのHolm-Šídák補正を用いた2元配置のANOVAを使用した。
考察
乾癬性皮膚病変では、熱および機械的感受性が報告されているが、その内因性メディエーターおよび機序は不明であった。我々は 9,13-EHL および 9,10,13-THL のヒトおよびラット皮膚における存在量と局在を明らかにし、これらの内因性脂 質、メチル化安定アナログ、およびそれらの推定ファーマコフォアが DRG ニューロンを感作し、疼痛関連行動を誘発する活性を検討し、3） 9,10,13-THL が GPCRβγ 依存的に作用することが明らかになった。TRPA1/TRPV1ノックアウトマウスを用いた熱感受性の低下は、これらのチャネルがこのGPCRの下流で作用していることを示唆している。9,13-EHL と 9,10,13-THL が遊離およびエステル化した皮膚脂質として存在することを確認し、遊離 9,10,13-THL がマウスの急性痛覚反応の介在に関与する内在性脂質オートコイドであることを 紹介した。
9,13-EHL および 9,10,13-THL の構造-機能相関と代謝
9,10,13-THL およびその関連化合物のマウスにおける効果は、最初の 5 分間に 80%以上の効果が観察され、迅速な発症と短い持続時間であった。マウスで観察されたこれらの急性/超急性期の疼痛関連反応は、遊離酸オキシリピンが生体内条件下では不安定であり、急速に不活性化されることを示唆している。急速な不活性化のメカニズムとして、脂質膜へのアシル化およびエステル化、デヒドロゲナーゼによる水酸基のケトン体への変換の2つが考えられている。これらの仮説的メカニズムは、カルシウムイメージングアッセイで9,10,13-THLと同数のニューロンを活性化したにもかかわらず、9,13-EHLがほとんど行動反応を起こさない理由も説明できるだろう。これらの不活性化経路は、カルシウムイメージングセットアップでは生体外に存在しないが、チークアッセイでは生体内に存在する。
9,10,13-THLが9,13-EHLよりも有意に多くの頬紅を誘発する理由を明らかにするために、我々は、3つのクラスの安定なアナログを設計するためのバイオテンプレートとして遊離9,13-EHLおよび9,10,13-THLを用いた標的合成化学アプローチを使用した。(1）再アシル化/エステル化を防ぐために2,2-ジメチル部分を付加し、脂質を遊離酸プールに効果的に捕捉する、2）ヒドロキシル部分の脱水素をブロックするためにメチル付加する、または3）その両方（Kees et al, 2021）. 我々のin vitroカルシウムイメージングと行動アッセイの結果は、アナログは一般に遊離酸の活性を維持し、安定なアナログのいくつかは、未修飾の遊離酸の対応物よりも強固な行動反応を誘発することを実証した。9,10,13-THLとその安定型アナログの間に生物活性の違いは観察されなかった。我々は、これらの知見を説明するために2つの異なる可能性を提案した。第一に、遊離の9,13-EHLは、脂質膜への脱水素および/または再エステル化によって急速に不活性化されることである。この仮説は、メチル化誘導体の行動応答が著しく増大したことからも支持される。第二の可能性は、9,13-EHL が 9,10,13-THL に変換され、それが侵害受容反応を媒介することである。
これらのLA誘導体は、2つのアラキドン酸誘導体と同様の官能基配置を持っている：エポキシとヒドロキシ部分を含むヘポキシリンB3（Pace-Asciak and Martin, 1984）、およびトリオキシリンBと呼ばれるそのトリオヒドロキシ誘導体である。さらに、これらの化合物は、乾癬病変内の細胞内のリン脂質膜にも取り込まれている。これらのLA誘導体とは異なり、ヘポキシリンB3は、脊髄で産生された場合にのみ、アルジェス反応を増強することが示されている（Gregusら、2012、Tardifら、2011）。ヘポキシリンB3は不安定で、すぐにトリヒドロキシ誘導体に変換されることから、9,13-EHLも同様の経路でトリヒドロキシ誘導体である9,10,13-THLに加水分解されると思われる。9,10,13-THL がトリオキシリン B3 と同じ経路で生成されるかどうかは、官能基が類似していることから、さらなる研究が必要である。
9,10,13-THL は、9,13-EHL と比較して、より活性の高い代謝物であることが、我々の in vitro カルシウムイメージングおよび行動学的知見から示唆された。哺乳類のエポキシドヒドロラーゼは、9,13-EHL を 9,10,13-THL に変換する能力を持つ皮膚中の酵素であり、痛みを与える生物活性を誘発するのに十分な量の 9,10,13-THL を生成すると考えられる (O'Neill et al., 1981)。我々の観察は、さらに2,2M-9,13-EHL、13M-9,13-EHL、および2,2,13M-9,13-EHLからの結果によって裏付けられており、9,13-EHLの修飾が、注射後に9,10,13-THLと同様の行動応答を誘発するために必要とされたことから、9,13-EHL単独がすぐに自由プールから持ち出されるということが示されている。今後、正常皮膚と乾癬皮膚におけるエポキシドヒドロラーゼの発現と機能的活性を明らかにする実験が必要である。
遊離型 9,10,13-THL は疼痛および過敏性反応のオートコイドメディエーターである
我々は、LA由来のオキシリピンがエステル化脂質として最も濃縮されていることを観察し、皮膚におけるその提案された構造的役割と一致した（Chibaら、2016、Tyrrellら、2021b）。しかし、生理活性オキシリピンは古典的に遊離酸に帰属し、我々はCFA注入後の皮膚で、遊離酸としての9, 10, 13-THLの割合が増加していることを観察した。以前、我々は、9,13-EHLがヒト乾癬皮膚病変の遊離プールで上昇し、遊離9,13-EHLが低pH環境でのみCGRP放出を喚起することを観察した（Ramsden et al.、2017）。したがって、9,13-EHLそのものではなく、リノール酸の酸由来トリヒドロキシ誘導体が、CGRP放出に対する観察された感作に関与している可能性があると推論した。この仮説と一致して、9,13-EHL ではなく、遊離の 9,10,13-THL をマウスに頬に注射すると、急性の侵害受容行動が誘発されたが、痒みは誘発されなかった。興味深いことに、9,10,13-THLの自発的侵害行動に対する効果は、痛みの古典的酸化脂質メディエーターであるPGE2（川端、2011、Yakshら、1999）およびリノール酸由来痛みメディエーターとして知られている9-HODE（Alsalemら、2013、Patwardhanら、2010、Patwardhanら、2009）と有意差はなかった。さらに、9,10,13-THLをマウス後肢に注射すると、PGE2や9-HODEと比較して、同数の自発的な侵害受容行動が誘発されることが確認された。これらの結果から、プレフォームされた 9,13-EHL および 9,10,13-THL は膜の構造脂質として作用するが、リパーゼによって遊離し、遊離酸を形成し、損傷や炎症後に感覚神経を活性化して急性疼痛反応に寄与する可能性があることが示唆された。しかしながら、これらのチークアッセイの結果の解釈には注意が必要であり、我々は、行動感作の変化を示すことが報告されている（Domenichiello et al., 2017）およそ3倍の濃度のPGE2を用いても、我々のマウスデータと比較して、ラットの侵害受容行動効果を見つけることができなかった。さらに、我々は、完全フロイントアジュバント（CFA）の注入が、ビヒクルと比較して、ラットの同側頬の指向性ワイプを有意に多く誘導しないことを見出した。Kleinらの報告（Klein et al., 2011）は、カプサイシンによる頬の拭き取り回数が、マウス（Shimada and LaMotte, 2008）で見られた回数より少ないことを実証している。これらの結果は、オキシリピンによる顔面の侵害受容に種特異的な違いがあることを示唆している。
9,10,13-THL が生体外で痛覚に関与するオキシリピンと同定されたことにより、我々はオキシリピンが侵害受容反応に影響を与える分子機構を探る生体内での取り組みに焦点を当てることができるようになった。我々は、9,10,13-THL が TRPA1 チャネルの活性化を介して自発的な侵害受容行動を誘発することを明らかにし た。興味深いことに、TRPA1は、プロスタグランジンやシステイン修飾剤を含む他の脂質自己共役に対する反応を媒介することが実証されている（Anderssonら、2008、Cruz-Orengoら、2008、Gregusら、2012、Materazziら、2008、MotterとAhern、2012、Sisignanoら、2012、Taylor-Clarkら、2009、Taylor-Clarkら、2008a、Taylor-Clarkら、2008b、Trevisaniら、2007）。さらに、9,10,13-THL は TRPA1 依存性の機序で有害熱や有害寒冷に対する過敏症を誘発するようであった。しかし、9,10,13-THL は Gβγ阻害剤である Gallein によってその作用が阻害されたことから、TRPA1 を介した直接のシグナルとは考えにくく、GPCR の活性化を介して 9,10,13-THL が疼痛に影響を与え、細胞内において TRPA1 が活性化される可能性が高いことが判明した。
我々は、9,10,13-THL が不快な熱や冷気に対して過敏な反応を誘導することを見出した。TRPA1は、侵害的な寒冷を媒介し（del Camino et al., 2010, Domenichiello et al., 2017, Karashima et al., 2009, Kwan et al., 2006, Obata et al., 2005）、TRPV1は侵害的な熱を媒介する（Caterina et al., 1997）。興味深いことに、我々の結果は、9,10,13-THLは、おそらく以前に痛みの過敏性に役割を果たすことが示されているヘテロマー複合体の形成を通じて、感作にTRPA1およびTRPV1の両方を必要とすることを示している（Caterinaら、1997、Fischerら、2014、Patilら、2020、Salasら、2009、Staruschenkoら、2010、Wengら、2015）。この仮説は、以下の証拠によって裏付けられている。1) TRPA1 KOマウスでは9,10,13-THLの行動とカルシウムイメージング反応が失われるが、TRPV1では失われない、2) TRPA1 KOマウスではTRPV1が無傷であっても、侵害熱に対する9,10,13-THL過敏性が失われていること。さらに、TRPV1 KOマウスではTRPA1が機能しているにもかかわらず、TRPA1およびTRPV1 KOマウスの両方で低温に対する感受性が失われることを見いだしました。この結果は予想外であり、9,10,13-THLはGPCR活性化の下流で働くTRPA1およびTRPV1の両方を用いて不快な温度応答を感作するという我々の仮説に拍車をかけるものであった。我々の結果に見られる全体的なパターンは、ブラジキニンやPGE2が有害な熱に対して過敏症を引き起こすメカニズムとして実証されているものと類似している（Patil et al. TRP チャネルの上流で働く GPCR の同定、TRP チャネル活性を制御し、急性痛の行動や過敏化を促進する細胞内メカニズムなど、今後解明すべき課題が残されています。
乾癬患者の約73％が乾癬プラークに灼熱感／熱感の不快感を感じ（Patruno et al.、2015）、約15％が乾癬プラークに不快な冷感を感じています（Patruno et al.、2015）。いずれの場合も、これらの感覚は外部刺激とは無関係であることが報告されています。今回の結果に基づき、我々は、これらの熱い感覚や冷たい感覚は、潜在的に脂質膜からの9,10,13-THLの放出に起因している可能性があると仮定している。これらの熱い／焼けるような／冷たい感覚は、痛みの質評価尺度（Patruno et al.、2015）を用いて高く評価されなかった。これらの感覚は、侵害的な痛みではないかもしれませんが、乾癬患者が経験する睡眠、気分、作業能力、および対人関係の著しい変化の一因となることが知られています（Ljosaaら、2010年）。したがって、これらの感覚をもたらす根本的なメカニズムを理解することは、乾癬患者のQOLを向上させるために有意義であり、今後の研究課題として取り組まれるべきです。
Galleinと百日咳毒素を用いた我々の結果は、9,10,13-THLがGPCRのGβγサブユニットを介して細胞内でTRPA1を活性化するが、Gαサブユニットには作用しないことを示した。GPCR-リガンド相互作用からの下流作用の偏った活性化が報告されている（Bologna et al., 2017, Ljosaa et al., 2010, Onfroy et al., 2017, Rankovic et al., 2016）ため、Gβγ媒介プロセスを通じて9,10,13-THLが感覚神経を優先的に活性化することはありえないことではない（訳注：Gβγ媒介プロセスは、感覚神経の活性化を促進するために、Gβγを介した活性化である）。DRGニューロンは、PTX感受性であり、（HoおよびWong、1998、2001）TRPV1系ニューロン（Goswamiら、2014）およびTRPA1を発現するDRG感覚ニューロンを含むいくつかの侵害受容DRGニューロン亜集団（Usoskinら、2015）で高いmRNA発現量を有するGzα GPCRサブユニット（Kelleherら、1998）の比較的高い発現量を有している。全体として、我々の結果は、9,10,13-THLがGβγサブユニットの解離を必要とし、PTX感受性Gαサブユニットを使用しないことを示す。今後、9,10,13-THL が結合して神経細胞の活性化を引き起こす GPCR と 9,10,13-THL の特定の立体異性体の同定が必要である。
TRPA1 チャンネルを持たないマウスでは、9,10,13-THL に応答してカルシウムの流入が抑制され、急性痛の行動が減少することが明らかになった。さらに、9,10,13-THL は TRPA1 と TRPV1 チャネルの両方を用いて、不快な熱や冷気に対する反応を感作することが示された。最後に、我々はこれらの化合物の活性領域を同定し、これらの内因性オキシリピンの受容体に対する新しいアンタゴニストの創製に利用できる可能性があることを確認した。今後は、TRPチャネルの上流に作用する受容体の同定を目指し、疼痛治療の新たな手がかりを得ることが期待されます。
材料と方法
ヒト皮膚におけるオキシリピンの測定
死後急性にヒト組織ドナーの腋窩、足底側面、腰背側面から全厚の皮膚を採取し、Ramsdenら（Ramsdenら、2017）によって先に記載された方法を用いて処理するまで直ちに-80℃で凍結した。その後、アリコートを固相抽出を用いて精製し、報告されているように、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いて、遊離および総（エステル化＋遊離）オキシリピンを測定した（Ramsdenら、2017年）。
動物について
ワシントン地域移植共同体（WRTC、バージニア州フォールズチャーチ）から提供された完全に非識別化された死後ドナー皮膚標本を入手し分析するために、NIH人対象研究・保護室（OHSRP）から承認を取得した。すべての動物実験は、North Carolina State University (IACUC # 19-167-B) および National Institutes of Health (IACUC # 1402-17) の Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認された。マウスとラットは、12/12時間の明暗サイクルで、餌と水に自由にアクセスできる標準的な環境で飼育した。TRPV1ノックアウト（KO）（ストック番号003770）、TRPA1 KO（ストック番号006401）およびC57Bl6/J（ストック番号000664）マウスをJackson Labから取り寄せた。TRPV1およびTRPA1ノックアウトマウスは、C57Bl6/Jバックグラウンドで維持された。
化学物質
すべての化合物はエタノール中で-80 ℃で保存した。エタノールは窒素気流下で蒸発させ、化合物は注入直前に1％エタノール（v/v）を含む1X PBSに再溶解させた。PGE2 (cat. # 14010); 9-HODE (cat. # 34800); 9,13-EHL および 9,10,13-THL は、Cayman Chemical から購入した。ラセミ9，13-EHLおよび9，10，13-THLの安定な類似体は、報告されたように合成した（Keyesら、2021）。
マウスの頬の行動
行動アッセイを行う際、すべての実験者は化合物の構造について盲検化した。各化合物は、滅菌インスリン針を用いて右頬に注入した（20μL中100μg）。マウスの侵害行動反応は、30分間記録した後、頬モデルを用いてアッセイした（Shimada and LaMotte, 2008）。このモデルでは、痛みを伴う侵害受容入力は前足で同側の頬を拭う行動を、侵害を伴う引っ掻き入力は後足で同側の頬を引っ掻く行動を誘発させる。
マウスの後肢の行動。
マウスは4インチ×4インチのプレキシグラスチャンバーに入れられ、カメラの上の透明なプレキシグラス板の上に置かれた。マウスは5分間記録された。記録後、マウスを以下の行動試験のいずれかに使用した。+50℃ホットプレート、粉砕ドライアイス（Brennerら、2012）、電子フォンフライ、又は＋5℃コールドプレート（Mishraら、2011）。
ラットCFA注射
体重250〜300gのSprague Dawleyラット（Charles River）を30cm×30cmのプラスチック製試験箱（上にカメラが取り付けられている）に1日1時間、3日間入れ、試験条件への慣らしを行った（n＝24）。その後、ラットはセボフルランを用いて麻酔し、50μlの完全フロイントアジュバント（CFA）またはPBSを頬に皮内注射した。ラットをホームケージに戻し、注射後最大4日間観察した。注射後4時間、1日、4日目にラットをテストボックスに入れ、30分間記録した。拭き取りとひっかきは報告されているように定量化した(Shimada and LaMotte, 2008)。各群から6匹、8匹、10匹のラットを、それぞれ4時間後、1日後、4日後に安楽死させた。注射部位の頬の皮膚の重量を測定し、-80℃にて保存した。皮膚中の遊離および総プールオキシリピン濃度は、ヒトの皮膚について上述したように測定した。
ラット脂肪酸代謝物メディエーター注射
オキシリピンによって誘発される侵害受容行動の理解を深めるために、雄のSprague Dawleyラット（Charles River）を用いて頬への注射実験を繰り返した。ラットは上記のように試験箱に馴化させた。ラットをタオルで拘束し、20μLの9，10，13-THL（100μg、n＝8）、PGE2（100μg、n＝8）またはビヒクル（生理食塩水中の1％エタノールv／v、n＝8）を皮内注射した。注射後、ラットは試験箱に入れられ、30分間記録された。拭き取りと引っ掻きは報告されているように定量化した(Shimada and LaMotte, 2008)。
DRGの調製とカルシウムイメージング。
DRGの単離、培養、カルシウムイメージング、および分析は、Wheelerら（Wheelerら、2022）によって先に記載されたように行った。すべての実験者は、カルシウムイメージングを行う際に、化合物の構造について盲検化した。図中、各データポイントは、単一の生物学的複製に相当する。
統計解析
統計解析は、GraphPad Prism（バージョン9.0以上）を用いて行った。データは、Shaprio-Wilk検定を用いて正規性の検定を行った。正規分布に含まれるデータセットについては、Studentのt検定、または多重比較のためのHolm-Šídák補正を用いた一元配置分散分析により有意性を検定した。正規分布に属さないデータセットは、Mann-Whitney U-testまたはKruskal-Wallis testと多重比較のためのDunn検定を用いて有意性の検定を行った。図2に示したラットの時間経過の研究では、多重比較のためのHolm-Šídák補正を伴う二元配置分散分析が使用された。サンプルは同程度の標準偏差を有すると仮定した。
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記事情報
発表履歴
受理されました。2022年10月19日
改訂版受理 2022年10月11日
受理：2022年10月11日 2022年7月26日
出版段階
In Press Accepted Manuscript
脚注
データ利用可能性

大きなデータセットはありません

利益相反

著者らは利益相反はないことを表明する

謝辞と資金源

この研究は、NC State, NIAMS/NIH (AR077692) からのスタートアップとJMDからSKMに提供されたギフトによって資金を得た。CER、AFD、JRJ、GSK、KMMは、National Institute on AgingおよびNational Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism, National Institutes of Healthの学内研究プログラムにより支援された。

開示事項 NIA（NIH）は、オキシリピンの安定なアナログに関連する知的財産（PCT/US2018/041086）を主張し、C.E.RとG.S.Kは発明者として名を連ねている。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。

著者貢献

概念化。SKM、CER、JMD；実験デザイン。実験デザイン：SKM, CER, JJW, & AFD; 監修と資金援助: 実験とデータ解析の実施。JJW, AFD, JRJ, GSK, KMM, CER, and SKM; Manuscript draft and Review: JJW, AFD & SKM.

身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.xjidi.2022.100177

著作権
© 2022 Elsevier Inc.発行
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図
図のサムネイルgr1
図1リノール酸（LA）代謝産物は、ヒトの皮膚では脂肪酸の遊離プールと総プールの両方に存在する。ボックスは、a) LAまたはオキシリピン（すなわち。b) ホスホリパーゼなどの酵素による加水分解により、エステル化されたオキシリピンが遊離酸として膜から放出され、受容体に結合したり分子プロセスに関与したりする。c) 低 pH 環境下でのエポキシド加水分解やエポキシドヒドロラーゼによる 9,13-EHL から 9,10,13-THL への変換。 d, e) リン脂質二重層にエステル化した遊離酸オキシリピン。g) 9,13-EHL および 9,10,13-THL の安定なアナログを合成して、エステル化を防ぎ、ファーマコフォアの劣化を防ぐことができる。h) 9,13-EHL, i) 9,10,13-THL, j) 9-HODE, k) PGE2 のヒト皮膚におけるオキシリピンの濃度測定。パネル h ～ k のデータは平均値 ± 標準偏差 (SD) で示され、これらのデータに対して統計的検定は行われなかった。各データポイントは、1つの生物学的複製、n=3に対応する。
図のサムネイル gr2
図2皮膚中のオキシリピン濃度に対する炎症の影響。ラットに実験的な炎症刺激であるComplete Freund's Adjuvant（CFA）またはPBSを皮内注射した（1グループあたりn=24）。注射後4時間、1日、4日目に、a) 同側拭き取り、b) 両側拭き取り、c) 注射部位の引っ掻き、を測定した（各群n = 24, 18, 10）。CFA誘発炎症に示されるメディエーターの存在量はPBS注射と比較した。d）9-hydroxyoctadecenoate（9-HODE）（**p < 0. 0001） e) プロスタグランジン E2 (PGE2) (**p = 0.0006, 1 day post-CFA and **p < 0.0001 for 4 days post-CFA) f) 13-hydroxy-9,10-epoxy octadecenoate (9,13-EHL) (***p < 0.0001 for 4 hours and 1 day post-CFA). 0001、CFA後4時間およびCFA後1日）、および（g）9，10，13-トリヒドロキシオクタデセノエート（9，10，13-THL）（＊p＝0.048、CFA後4時間） h） 9-HODE の割合（＊p＝0． 0220（CFA後1日）、9,13-EHL、および9,10,13-THL（CFA後4日）は、PBSと比較してCFA注入後4日と1日（s）で遊離酸として皮膚内に存在する割合を測定した。データはMean±SDで表示した。パネルA〜Cでは、多重比較のためのHolm-Šídák補正を行った一元配置分散分析により、有意差は見られなかった。Panels D - Hでは、多重比較のためのHolm-Šídák補正を伴う2元配置ANOVAを用いて有意差を決定した。各データポイントは、1つの生物学的複製、n≥6を指す。
図のサムネイル gr3
図3カルシウムイメージングを用いた感覚ニューロンの活性化／阻害。 a）初代培養DRG感覚ニューロンにおける、ビヒクル（1X PBS{v/v}中の1％エタノール）、9HODE、PGE2、9，13EHL、9，10，13THL、9，13EHLおよび9，10，13THLの安定アナログならびにそれらの小分子ファーマコフォアに対するカルシウムイメージング反応の定量化。すべての化合物は1μMの濃度で試験し、特に断りのない限り100mMのKCl反応に正規化した。 b) 内生メディエーター9,10,13-THLの用量反応曲線、各ドットは単一のカバースリップを表す、n=2。 c) 車両またはガレイン（100μM）とプレインキュベーションしたDRGニューロンは9,10,13-THLとカプサイシン（*p = 0.035）に曝露させた。 0339）。d）ビヒクルまたは百日咳毒素（PTX、1ng／mL）とプレインキュベーションし、9，10，13-THLおよびカプサイシンに暴露したDRGニューロン、2-tailed paired Studentのt-検定に基づきns＝有意ではない（not significant）。e) WT、TRPA1 KO、TRPV1 KOマウスの9,10,13-THL、AITC（100μM）、カプサイシンに反応する神経細胞は、カルシウムの過渡変化を測定することによって示した。有意性は2元配置ANOVAを用い、Holm-Šídák補正により多重比較した。9,10,13-THLの場合。**p = 0.0311 (WT vs TRPA1 KO) および **p = 0.002 (WT vs TRPV1 KO)。AITCについては、***p = 0.001 (WT vs TRPA1 KO)であった。カプサイシンについては、***p < 0.0001 (WT vs TRPV1 KO)。すべてのデータはMean ± SDで示した。各データポイントは、カバースリップ/マウスの平均を表し、n≧3である。
図サムネイルgr4
図4コントロールマウスとノックアウトマウスにおけるオキシリピンに対する侵害受容反応 a) 最初の5分間、b) と30分間で頬拭きを測定した。有意性は、多重比較のためのDunnの検定を用いたKruskal-Wallis検定で決定した; 9,13-EHL vs Vehicle, 9-HODE, and 2-hydroxy-5,6-epoxy-hept-3-(E)-ene は有意ではない; 9,13-EHL と比較した場合の他のp値は以下の通り： vs PGE2 **p = 0. 059、vs 2,2M-9,13-EHL *p = 0.0230、vs 13M-9,13-EHL **p = 0.0023、vs 2,2,13M-9,13-EHL *p = 0.023、vs 9,10,13-THL *p = 0.0282である。同じ統計テストを、9,10,13-THL vs Vehicle **p = 0.0033, vs 9-HODE は有意ではない, vs PGE2 は有意ではない, vs 2,2M-9,10,13-THL *p = 0. 0282、対 2,2,13M-9,10,13-THL は有意ではなく、対 2,5,6-trihydroxy-hept-3-(E)-ene は有意ではなかった。 c) ビヒクル（1X PBS {v/v}中の1%エタノール）および各種メディエーター（100 μg/ 20 μL i.d.）を注入後の同側指示頬掻き打ちの定量化。多重比較のためのダンの補正を用いた同じクラスカル・ワリス検定を使用して、同側の頬の指示された引っ掻き回数に有意差は見られなかった。 d) 5分以上の足底内注射後の肉球の指示された侵害受容行動反応に費やした時間の総計。有意性は、多重比較のためのDunnの検定を用いたKruskal-Wallis検定を用いて決定した：ビヒクル vs 9-HODE **p = 0.0090, ビヒクル vs PGE2 **p = 0.0013, ビヒクル vs 9,10,13-THL **p = 0.0029 e) WT, TRPA1 KO, TRPV1 KOマウスでビヒクルまたは100μg/ 20μL 9,10,13-THL (i.d.) に従って定量化した拭き取りの総数。有意性は、多重比較のためにHolm-Šídák補正を用いた1元配置ANOVAを用いて決定した：ビークル vs TRPA1 KOは有意ではなく、ビークル vs TRPV1 KO ***p = 0.0004, ビークル vs WT ****p < 0. 0001, TRPA1 KO vs WT ****p < 0. 0001。 0001, TRPA1 KO vs TRPV1 KO ****p < 0.0001, TRPA1 KO vs WT ***p = 0.0007, TRPV1 KO vs WT ***p = 0.0007. f) 9,10,13-THL 注入後の挙動の時間動態を 5 分間隔で示す。パネルeと同じパラメータを用いて有意性を判定した：5分ビンについて、ビヒクル処理マウスと9,10,13-THLで処理したTRPA1 KOマウスにおける同側の頬の指示拭きの数の間に有意差は認められなかった。同様に、9,10,13-THL投与TRPA1 KOマウスと9,10,13-THL投与TRPV1 KOマウスの間にも有意な差は見られなかった。その他の有意値は以下の通りである。Vehicle vs WT **p = 0.0040, Vehicle vs TRPV1 KO *p = 0.0104, WT vs TRPA1 KO **p = 0.0035, WT vs TRPV1 KO *p = 0.0104. データは平均値±SDで示され、パネルa〜eの各データポイントは1つの生物学的複製に対応し、n≧5である。
図5GR5
図5ビヒクル、9,10,13-THL、PGE2注射後のラットの侵害反応。ビヒクル、9,10,13-THL、またはPGE2の注射後のa)同側の拭き取り回数、b)同側および対側の拭き取り回数、c)パネルAおよびBからの拭き取りの合計回数、d)引っ掻き回数の推移を示す。多重比較のためのHolm-Šídák補正を用いた一元配置分散分析では、有意差は見られなかった。データは平均値±SDで示され、各データポイントは1つの生物学的複製に対応し、n=8である。
図のサムネイル gr6
図6正常マウスおよびノックアウトマウスにおける9,10,13-THLによる末梢神経感作 a) 9,10,13-THL (327 μM in 10 μL)を植物体内注射し、5分培養した後のホットプレート上での引き抜き潜時の変化。WT vehicle vs WT 9,10,13-THL **p = 0.0047, WT 9,10,13-THL vs その他 ****p < 0.0001. b) 9,10,13-THL (327 μM in 10 μL)を植物体内に注射し、5分間静置した後のコールドプレート上の引抜遅延の変化(p). WT vehicle vs WT 9,10,13-THL *p = 0.0498, WT 9,10,13-THL vs その他 ****p < 0.0001. c) 9,10,13-THL (10 μL中327 μM)を5分間植菌した後のメカニカルアッセイにおける引抜力の変化. 処置（ビヒクル vs 9,10,13-THL）を比較した場合、群内および株間で有意差は認められなかった。 d) 9,10,13-THL（10μL中327μM）植物体内注射の5分間インキュベーション後のドライアイスアッセイの引き出し待ち時間の変化。処理（ビヒクル vs 9,10,13-THL）を比較した場合、群内および系統間で有意差は認められなかった。データは平均値±SDで示し、各データポイントは単一の生物学的複製に対応し、n≧6である。有意性は、各遺伝子型内でビヒクル注入対9,10,13-THL注入の行動反応を比較することによって決定された。系統内で比較する場合は、Mann-Whitney U-testを使用して有意性を決定した。系統間および処理間の有意性を検定する場合は，Holm-Šídák補正を用いた2元配置ANOVAを使用した．
表
表1本研究で用いた化合物の構造，名称，文中での略称。
表 2 Figure 4b に関連する特定の比較の p - 値の計算。有意性は，クラスカル・ワリス検定と多重比較のための無補正ダン検定を用いて決定した。行動学的な結果がノンパラメトリックであるため、クラスカル・ワリス検定が選択された。
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