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出版：2023年6月20日
腸内細菌叢Turicibacter株は胆汁酸と宿主脂質を異なる形で修飾する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39403-7

ジョナサン・B・リンチ
エリカ・L・ゴンザレス
...
エレイン・Y・シャオ
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：3669（2023） この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
Turicibacter属の細菌は哺乳類の腸内細菌叢の重要なメンバーであり、食事脂肪や体重の変化と相関している。この知識のギャップを解決するために、マウスおよびヒト由来の多様なTuricibacter単離株の特徴を明らかにし、特定の胆汁酸の変換において異なるクレードにグループ分けされることを見出した。また、胆汁酸の脱共役化において系統特異的な違いをもたらすTuricibacter胆汁酸塩加水分解酵素を同定した。雌雄同腹仔マウスを用いて、個々のTuricibacter株をコロニー形成させると、宿主の胆汁酸プロファイルが変化することを見いだした。さらに、ツリシバクター株の胆汁修飾遺伝子を外来的に発現させた別の細菌をマウスにコロニー形成させると、血清コレステロール、トリグリセリド、脂肪組織量が減少した。このことから、ツリシバクター属細菌が宿主の胆汁酸や脂質代謝を改変する遺伝子が同定され、ツリシバクター属細菌は宿主の脂肪生物学の調節因子として位置づけられる。
はじめに
腸内細菌叢は宿主生物と複雑な関係を形成し、代謝1,2や神経生物学3,4を含む宿主の生理学の広範な側面を調節している。多くの場合、腸内細菌叢と宿主の生理学との関連は、微生物群集の大部分における存在／非存在を通して解明するのが最も簡単である（文献5,6,7にその例がある）が、場合によっては、特定の微生物の特徴や分類群が宿主の生物学において重要な役割を果たしていることもある8,9,10。
ツリシバクター属の中で最も研究が進んでいるのはツリシバクター・サングイニス（Turicibacter sanguinis）という細菌で、ヒト11、マウス7、ウシ12、ブタ13、ニワトリ14など、いくつかの動物の腸内細菌叢に広く存在している。ツリシバクターは、げっ歯類の小腸15では20％以上、ヒトの糞便微生物叢16,17では0.5％の相対量に達する。1126組の双生児を対象とした研究から、ツリシバクターはヒトの糞便微生物叢において遺伝性の高い分類群であることが判明し18、Diversity Outbredマウスコレクション19,20,21で発見されたツリシバクターの存在量と宿主遺伝との関連を裏付けている。この分類群とヒトとの間の長年にわたる共進化的なつながりは、古代のヒトおよび非産業ヒトの腸内細菌叢で測定されたTuricibacterの高濃度配列によって示唆されている17,22,23,24。
哺乳類の腸内細菌叢は長い間肥満と関連してきた25,26が、研究ではこれらの関係のメカニズム的な決定要因よりもむしろ強い相関関係が示されることが多く、微生物叢と宿主の脂肪との関連について根本的な検討がさらに必要であることを示している27。数多くの微生物叢プロファイリング研究から、Turicibacterと宿主の脂肪代謝の特徴（脂肪率や食事脂質など）との相関関係が明らかにされているが28,29,30,31,32,33、これらの相関関係の性質は様々である34,35。我々は最近、T. sanguinisのタイプ株であるMOL36136,37が、マウスにおいて血清トリグリセリドを減少させる一方で、宿主の血清リピドームを広範に変化させることを観察した38。この菌株はまた、in vitroで脱共役化および脱水素化を通じて胆汁種を変化させることが報告されており21、Turicibacterが宿主の脂質状態に影響を及ぼす少なくとも一つの潜在的手段を示唆している。これらの知見に基づき、我々は、宿主の胆汁と脂質の生物学的性質の違いを説明するために、ツリシバクター株の機能的活性にバリエーションがあり、この分類群と宿主の生理学的側面を結びつけるメカニズムがあるのではないかと考えた。
本研究では、多様なツリシバクター属細菌の分離株が、脂質や胆汁酸を含む宿主の代謝産物に影響を及ぼすことを示す。これらの分離株はそれぞれ、化学的特異性は異なるものの、試験管内で胆汁の形質転換を行う。我々は、これらの分離株から胆汁修飾遺伝子を同定し、宿主の生理学に対するそれらの影響を測定した。これらの遺伝子は、宿主の脂質とコレステロールの状態を広範囲に変化させるのに十分であることがわかり、Turicibacter属の細菌が多様な宿主の生物学を調節する手段を提示している。
研究結果
ツリシバクター分離株は遺伝的に区別可能な株に分離する
Turicibacter属内の多様性をよりよく理解するために、マウスとヒトの糞便微生物叢から、16S rRNA遺伝子配列に基づいてT. sanguinisと同定された9つの分離株を集めた（全長16S rRNA遺伝子配列の類似度97%カットオフ、補足データ4）。これらの分離株のうち2株は以前に同定されており（ヒト由来のタイプ株MOL361とH121、これは汚染された無菌マウス由来である36,39）、5株は分離されていたが発表されていなかった（ヒト分離株18F6、T46、T129、マウス分離株1E2、TA25）、そして2株はこの研究のために特別にヒトの糞便サンプルからアレイベースの分離培養プラットフォームを用いて分離された（GALT-E2とGALT-G1）（Methodsを参照）。ショットガンショートリードシークエンシングを行い、各単離株ゲノムのドラフトアセンブリを作成した。16S rRNA遺伝子の系統樹（図1a）、一般的なゲノムの特徴（図1b）、または特定のゲノム配列（図1c、d）を比較した結果、このかなり小さなサンプルでも、16S rRNA遺伝子に基づく「T. sanguinis "種を指定する場合、少なくとも3つの異なるサブグループが存在することがわかった。ヒト由来の2つ（模範株MOL361とH121、全長16S rRNA遺伝子の類似度は99.3％）と、マウス由来の1つ（模範株1E2、MOL361とH121の16S rRNA遺伝子の類似度はそれぞれ97.5％と97.8％）である。ゲノムのアラインメントから、同じサブグループのメンバー内で相当量のDNA配列が共有されていることが示され（グループ内の平均塩基同一性[ANI]はすべて98.3％以上）、残りの遺伝的変異は関連分離株間の遺伝的差異が小さいことを示していた。これらのサブグループ内共有配列は、他の2つのサブグループのメンバーとは異なっていた（グループ間ANI：MOL361-H121＝76.80％、MOL361-1E2＝74.95％、H121-1E2＝77.43％）。H121グループのゲノムは、現在この属から唯一命名されている、新しく記載された種Turicibacter bilis13（ANI98.8%）に似ていることに注目することは重要である。全体として、これらのゲノムの違いは、少なくとも部分的には宿主の起源に対応する明確な進化の歴史を示唆している。
図1：ゲノムの比較から、Turicibacterの異なるサブグループが明らかになった。
図1：ゲノム比較から明らかになったTuricibacterのサブグループ。b aから得られたTuricibacter分離株のショットガン組み立てゲノムについて、グアニン-シトシン％（GC％）と計算されたゲノムサイズ（メガベース（Mb））の関連。予測される胆汁修飾遺伝子ホモログの位置はリングの外側に記し、遺伝子名の色はその遺伝子が見出されるゲノムファミリーを示す。d 指摘したTuricibacterゲノム間の平均ヌクレオチド同一性（ANI）。数字はANIを表し、白緑青のスケールは100%-75%のANIスケールを表す。
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Turicibacterの分離株は、宿主の脂肪生物学と循環メタボロームへの影響が異なる
これまでの研究で、T. sanguinis MOL361をマウスに単コロニー化すると、宿主の脂肪組織と循環脂質が変化することが明らかになった38。Turicibacterの菌株間にはゲノム上の変異が大きいため、宿主の脂質生物学に及ぼす影響も異なるだろうと予測した。系統的に異なるサブグループ（MOL361、H121、T129、1E2）からそれぞれ代表的な分離株を選び、無菌マウス（GF）および従来型マウス（完全な微生物叢を摂取させたCONV）と比較して、単コロコロナイズマウスにおける循環代謝産物および脂肪組織への影響を測定した。GFマウスと比較して、CONVマウスは、いくつかのジカルボン酸脂肪酸、長鎖脂肪酸、および長鎖アシルカルニチンレベルが減少し、短鎖および中鎖アシルカルニチンが広く増加した（図2a）。以前の報告38と一致して、個々のTuricibacter株によるコロニー形成は、宿主の血清脂質にも広範な変化を引き起こし、宿主の脂質変化にはいくつかの株レベルの違いが見られた（図2a、補足データ5）。GF対照と比較して、MOL361株は長鎖アシルカルニチンのサブセットを増加させ、多くの長鎖飽和脂肪酸を減少させた。さらに、MOL361によるコロニー形成は、宿主コレステロールをGFで見られたレベル以下まで減少させる傾向が見られた（図2b）。GFと比較して、H121のコロニー形成は、いくつかの中鎖脂肪酸、ジカルボン酸、および短鎖、中鎖、長鎖アシルカルニチンの血清レベルを有意に増加させた。1E2のコロニー形成は、宿主脂質に対する全体的な影響は小さかったが、いくつかのジカルボン酸脂肪酸の減少をもたらした（図2a）。GFまたはCONVマウスとツリシバクター・モノコロニー化動物との間の違いに加えて、宿主脂質にも系統依存性を示す変化がみられ、ジカルボン酸脂肪酸には傾向的な相違が、長鎖飽和脂肪酸には有意な相違がみられた（Fig. 組織レベルでは、4つのTuricibacter株のうち2つの株は、GF対照と比較して、精巣上体／性腺白色脂肪組織（e/gWAT）の質量を統計的に有意に増加させた。対照的に、H121株はe/gWAT量に顕著な影響を与えず（図2c、補足データ6）、他のTuricibacter株と区別された。これと一致して、H121株は脂肪パッド内のe/gWAT脂肪細胞サイズが最も小さかった（補足図1a-f）。これは、小腸と大腸の両方でH121株のコロニー形成が少なかったためと考えられる（補足図1g, h）。特定のTuricibacter株が血清脂質、コレステロール、脂肪量に及ぼす影響から、これらの生体分子をつなぐ可能性のある分子、すなわち胆汁酸について調べることになった。
図2：異なるTuricibacter株によるコロニー形成は宿主の脂質を変化させる。
a ヒートマップは、注目すべきTuricibacter株で単コロニー化されたgnotobioticマウスの血清脂質の相対量を示している。ヒートマップ値（Zスコア）は、ラベル化した脂質カテゴリーから検出された各脂質種の平均存在量を、その個々の脂質種のすべての平均値でスケーリングしたものである。黒（p < 0.05）および灰色（0.05 < p < 0.15）の長方形は、左はGFおよびMOL361モノコロナイズマウス間、中央はCONVおよびMOL361モノコロナイズマウス間、右はMOL361、1E2およびH121モノコロナイズマウス間におけるその代謝物の統計的有意差を示す。b 指定されたTuricibacter株でコロニー形成されたマウスの血清コレステロール量。 c 指定されたTuricibacter株でモノコロニー形成されたマウスの性および産仔を一致させた相対的な下垂体外/性腺白色脂肪組織量（e/g WAT）。点線バーは線より下のグループのANOVA統計量、a.u.=任意単位。WAT解析n： GF = 26、MOL361 = 24、1E2 = 14、H121 = 23、T129 = 10、CONV = 6。その他の分析n： すべてのパネルにおいて、MOL361-GFおよびMOL361-CONVの比較はMann-Whitney検定、Turicibacter内の比較はKruskal-Wallis、多重比較はŠidák補正86。エラーバーは平均±SEM、*p < 0.05、2cのGF-MOL361：p = 0.0108。データはソースデータファイルとして提供される。
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胆汁酸は、脂肪の消化と全身のホルモンシグナル伝達を変化させることにより、宿主の循環脂質に影響を与える40。胆汁酸は宿主によって産生され、小腸に放出され、ミセル形成を促進することで脂肪の消化を促進し、ファルネソイドX受容体（FXR）40やGPBAR1/TGR541のような受容体を介して作用することもある。腸内細菌は、主に脱共役のような変換を通じて、胆汁酸を修飾することができる。以前の報告では、MOL361株はin vitroで胆汁酸を広く修飾できることが判明している21。そこで、このような能力によってMOL361株や他のTuricibacter株がin vivoで宿主の胆汁酸を修飾できるかどうかを調べるため、Turicibacter-monocolon化マウスの血清とセカルの胆汁酸をプロファイリングした。各菌株は宿主の血清代謝産物にいくつかの特異的な影響を与えたが、GFまたはCONV対照マウスと比較して、モノコロナイズマウスの胆汁酸には一貫したパターンが認められた。(注：アミノ酸共役体を持つ胆汁種は一般的に「胆汁酸塩」と呼ばれるが、簡便のため、本明細書では共役および非共役胆汁種の両方を「胆汁酸」と呼ぶことにする）。すべてのTuricibacter株をコロニー形成させると、コール酸（CA）、チェノデオキシコール酸（CDCA）、β-ムリコール酸（βMCA）などの非共役一次胆汁酸の血清中濃度が全般的に上昇し（図3a-d）、非共役二次胆汁酸である3-デヒドロコール酸および7-ケトデオキシコール酸も同様に上昇した（図3e、f）。これらの反応は、T129株のコロニー形成の場合、非常にばらつきがあったため、以後の実験ではこの株を重視しないことにした。MOL361、1E2、またはH121によるコロニー形成に応答して、盲腸内のいくつかの非共役胆汁酸も同様に増加した（補足図S2）。これらの結果から、これらのツリシバクター属細菌は、腸内で胆汁酸を脱共役することによって、宿主の胆汁酸に影響を与える可能性があることが示唆された。
図3：Turicibacterのコロニー形成は、宿主の循環胆汁酸を株特異的に変化させる。
a-dは一次非共役胆汁酸、e、fは二次非共役胆汁酸、g-lは一次共役胆汁酸の血清中の存在量。点は個々のマウスの対数変換値を示し、形と色は図1に一致、エラーバーは平均±SEM、a.u.=任意単位。a-fはGFに対するDunnの多重比較で、すべてのコロニー形成についてKruskal-Wallis検定。g-lについては、指摘されたTuricibacter菌株間のKruskal-Wallis検定とH121との多重比較。g-lのGFとMOL361の比較にはMann-Whitney検定を用い、p値はGFのデータポイントの上に記した： GF＝9、MOL361＝9、1E2＝7、H121＝10、T129＝7、CONV＝6。点線バーは、線より下のグループのANOVA統計量を表す。エラーバーは平均±SEM、*p < 0.05、**p < 0.005。補正p値（ANOVA/GF-MOL361/GF-1E2/GF-H121/GF-T129/GF-CONV）： 2a＝（0.0204/0.1785/0.0141/0.0049/0.999/0.999）；2b＝（0.0116/0.5123/0.0919/0.0059/0.9256/0.999）；2c＝（0.0208/0.999/0.5425/0.5306/0.999/0. 4158); 2d = (0.0216/0.4850/0.1029/0.0201/0.8856/0.999); 2e = (0.0121/0.3585/0.0299/0.0405/0.7612/0.999); 2f = (0.2203/0.6556/0.6645/0.0580/0.999/0.4012). 補正p値（ANOVA/H121-MOL361/H121-1E2/GF-MOL361）： 2g＝（0.0798/0.0564/0.3171/0.1135）；2h＝（0.1047/0.0963/0.2315/0.400）；2i＝（0.0528/0.0351/0.2726/0. 0907); 2j = (0.0407/0.0508/0.0806/0.2973); 2k = (0.3988/0.3757/0.7675/0.0226); 2l = (0.0769/0.0610/0.2393/0.7176).
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非抱合型胆汁酸の増加の可能性を検討したところ、抱合型胆汁酸の血清中濃度が、異なるTuricibacter株にコロニー形成された動物間で異なっていることに気づいた。MOL361株と1E2株にコロニー形成された動物は、H121株にコロニー形成された動物に比べ、一般にタウリン抱合型一級胆汁酸のレベルが低かった（図3g-j）。一方、H121株にコロニー形成されると、グリコβ-ムリコール酸（GβMCA）が増加した（図3k）。循環中の胆汁種、脂質、コレステロールにおいて、ツリシバクターに関連した最も顕著な変化を示したのは雌マウスであり、ツリシバクターのコロニー形成に対する反応が性差に依存することを示している（補足図3）。この性差はT. sanguinis MOL361を単コロニー化したC57BL/6マウスでも報告されているが、脂肪細胞サイズの変化の方向性は異なっていた38。注目すべきは盲腸において、共役胆汁酸における菌株特異的な違いはあまり見られなかったことで、我々が調査した3つのTuricibacter菌株のいずれにコロニー形成されても、タウリン共役胆汁酸は減少した（補足図S2）。株依存性を示したセカル胆汁酸は二次胆汁酸のリトコール酸であった（補足図S2、下）。また、血清および糞便内容物の両方で検出された低レベルのグリシン抱合胆汁酸（特にグリココール酸）は、ツリシバクターのコロニー形成によってわずかに増加した（図3k、l；補足図S2c）。全体として、これらのデータは、ツリシバクターによるコロニー形成が血清胆汁酸、脂質、コレステロール、および宿主の脂肪量を変化させることを示している。さらに、非共役胆汁酸の増加のようないくつかの変化はTuricibacterのコロニー形成によって保存されていたが、特定の共役胆汁酸のレベルはTuricibacter株によって異なり、MOL361と1E2はH121のコロニー形成よりもタウリン共役胆汁酸のレベルが低かった。
Turicibacter株は宿主の胆汁酸を修飾する能力が異なる
Turicibacter株間の遺伝的変異の大きさ（図1）、および異なる分離株によるコロニー形成に応答して見られる血清脂質および胆汁酸プロファイルの側面の違い（図3）に基づき、Turicibacter株は胆汁酸を修飾する能力が異なると仮定した。これを検証するため、5種類の胆汁酸21（コール酸、チェノデオキシコール酸、デオキシコール酸（DCA）、タウロコール酸（TCA）、グリコチェノデオキシコール酸（GCDCA））を亜阻害濃度まで添加したリッチ培地で、9つの分離株をそれぞれ定常期まで増殖させた。次に、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を用いて、各菌株が行った胆汁変換の特徴を調べた（図4a）。その結果、各菌株は胆汁の種類を変化させる能力が異なるだけでなく、ゲノムの比較で確認されたグループ分けと概ね一致していることがわかった（図4b）。MOL361、18F6、GALT-E2は、タウロ胆汁酸とグリコ胆汁酸の両方を脱共役し、CAとCDCAも脱水素した（図4b）。1E2とTA25はタウロ胆汁酸を脱共役したが、グリコ胆汁酸の脱共役や脱水素は検出されなかった（図4b）。H121とT129はグリコ胆汁酸を脱共役したが、タウロ胆汁酸は容易に脱共役せず、検出可能な脱水素も行わなかった（図4b）。T46とGALT-G1は、遺伝的系統性を反映した胆汁修飾能を持たなかった。T46はゲノム的にはMOL361グループに似ているが、H121グループに類似した修飾（すなわち、糖鎖は脱共役するが、タウロ胆汁酸は脱共役せず、脱水素は最小限）を行ったのに対し、GALT-G1はゲノム的にはH121グループに似ているが、よりMOL361に類似した変換（すなわち、 図1、4b、補足データ1）。全体として、各菌株は3つの胆汁変換のうち少なくとも1つを行い、3つすべての変換能を示すものもあった（図4b、補足データ1）。
図4：ツリシバクター（Turicibacter）分離株は、胆汁修飾能力が異なる。
a：分離されたTuricibacter属細菌が行うことが判明した胆汁形質転換のタイプの模式図。タウロコール酸（TCA）、コール酸（CA）、グリコチェノデオキシコール酸（GCDCA）、チェノデオキシコール酸（CDCA）、デオキシコール酸（DCA）の5種類の胆汁酸を亜阻害濃度の培地で24時間培養したTuricibacter単離株の液体クロマトグラム。c 注記したTuricibacter分離株で24回増殖させた後の共役胆汁酸（TCA、タウロヘノデオキシコール酸[TCDCA]、グリココール酸[GCA]、GCDCA）の残存率（時間=0の培養と比較）。黄色＝グリシン共役胆汁酸、オレンジ色＝タウリン共役胆汁酸。示されていない値は、0.1%未満であった。統計解析は1標本t検定で行い、凡例の注釈は各胆汁酸について残存率100%から有意差のある株を示す。各胆汁酸のp値（MOL361/1E2/H121）： TCA = (< 0.0001/ < 0.0001/0.6327); TCDCA = (< 0.0001/ < 0.0001/0.5410); GCA = (0.0002/0.6348/ < 0.0001); GCDCA = (< 0.0001/0.8803/ < 0.0001). データはソースデータファイルとして提供される。
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これらのグループ内の区別を確認するために、それぞれのサブグループ（MOL361、H121、1E2）から1つずつ分離株を選び、4つの一次共役胆汁酸（TCA、タウロヘノデオキシコール酸（TCDCA）、グリココール酸（GCA）、GCDCA）の存在下で増殖させた。MOL361は両方のグループの胆汁酸を脱共役し、1E2はタウロ共役酸を優先的に脱共役し、H121はグリコ共役酸を優先的に脱共役した（図4c）。MOL361と1E2は、タウロ抱合体の幅広い脱共役を示し、少なくとも6種類のタウリン抱合胆汁酸を処理できた（補足図4）。これらのデータから、試験した菌株はすべて胆汁酸を効率的に分解することが明らかになったが、その特異的な分解は菌株に依存して異なっており、宿主の脂質生物学に及ぼす影響の違いに影響を及ぼす機能を反映している可能性がある。
Turicibacterゲノムは胆汁酸塩加水分解酵素のレパートリーが異なる
菌株のサブグループ間で胆汁修飾能力が異なることから、それぞれが胆汁修飾遺伝子のユニークなレパートリーを持つことが示唆された。腸内細菌叢のある種の細菌は、胆汁酸のステロイドコアからヒドロキシル基を脱水素し42、胆汁酸の極性を高め、宿主の胆汁酸レセプターに対する親和性を調節する43。我々は、Clostridium absolum44由来の7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（7α-HSDH21）のホモログをTuricibacterゲノムから検索した。その結果、MOL361、18F6、T46、GALT-E2では57％のアミノ酸同一性を持つ遺伝子が、H121とT129では59％のアミノ酸同一性を持つホモログが見つかった（補足図5a）。H121由来の推定ホモログは、MOL361由来のホモログよりも全体的な配列同一性は高かったが、この反応に触媒的に重要な類似のAsp38など、デヒドロゲナーゼ活性に重要であると予測される特定の特徴を欠いていた44。in vitro実験では、MOL361グループからの単離株のみが胆汁脱水素を行うことが示されたので、我々はMOL361由来の推定7α-HSDHホモログを大腸菌C41-pLysにクローニングし、脱水素可能な個々の非共役胆汁酸でこの細胞を培養した： CA、CDCA、DCAである。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、CAから2つの水素に相当する質量を除去した（補足図5b, c）。大腸菌によるバックグラウンド形質転換は、この推定7α-HSDHホモログによるCDCAの脱水素の明確な証拠を妨げたが（補足図5d）、このホモログはDCAには作用せず（補足図5e）、7α-HSDHとしての注釈を支持した。
共役は胆汁酸の溶解度と乳化能を増加させるが45、脱共役はこれらの効果を逆転させ、食事からの脂質吸収を減少させる。胆汁脱共役における菌株特異的な違いの原因となるTuricibacterの胆汁酸塩ヒドロラーゼ（bsh）遺伝子を同定するため、まず、これらの遺伝子を含む広義のカテゴリーである「コロイルグリシンヒドロラーゼ」のアノテーションがないか、私たちがアセンブルしたゲノムを検索した。これらの注釈付き遺伝子のうち、相同配列の8つのグループを同定し、各Turicibacter株が8つのグループのうち少なくとも2つのグループの推定コロイルグリシンヒドロラーゼをコードしていることを見出した（図5a, b）。同じ系統および表現型のサブグループ内の分離株は、ほぼ同様の配列を共有していた（図5a, b）。株特異的な推定bsh遺伝子の機能をアッセイするために、8つの推定コロイルグリシンヒドロラーゼ群からそれぞれ代表的な1つの配列をクローニングし、大腸菌C41-pLysで個別に発現させ、これらの人工細菌が、本来のTuricibacterで観察された脱共役を行う能力を測定した。個々の大腸菌株を、2種類のタウロ胆汁酸（TCA、TCDCA）またはグリコ胆汁酸（GCA、GCDCA）存在下で定常期まで培養した後、これらの胆汁酸プールを脱共役する能力を測定した。その結果、8つの推定bsh遺伝子群のうち4つを発現する大腸菌が、少なくとも1つの胆汁酸に対して脱共役活性を示した（図5c-e）。MOL361から、1つのBSH（グループIV）はタウロ特異的であり、1つ（グループI）はグリコおよびタウロの両方のコンジュゲートを脱共役する（図5c, d）。1E2はタウロ特異的BSHをMOL361（IV群）と共有し、TCDCAに中程度の活性を持つ別のBSH（III群）を持つ（図5c, d）。H121は、TCDCAとGCDCAに活性を示すBSH（グループII）を持つが（図5c, d）、これは4つの胆汁酸を組み合わせて提示すると鈍くなる（図5e）。これらの結果を総合すると、Turicibacter株には、異なる胆汁酸に対して脱共役を選好する様々な胆汁酸加水分解酵素が存在することが明らかになった。
図5：Turicibacterの分離株は、胆汁酸を修飾する遺伝的能力が異なる。
a：ツリシバクター（Turicibacter）分離株から予測された胆汁酸ヒドロラーゼ（BSH）配列のアミノ酸配列の系統樹。b.Turicibacter単離株における潜在的BSH活性を持つ配列ホモログの存在（+）または非存在。 c.各配列グループからの個々の予測BSH遺伝子を発現し、TCAおよびTCDCAで培養した大腸菌の24時間培養後の培地の液体クロマトグラム。コントロールは、同じ発現ベクターを持つが、非胆汁修飾遺伝子を発現する大腸菌である。 d cと同じであるが、タウロ胆汁酸の代わりにGCAとGCDCAを用いた。n = 3つの独立した培養、凡例中の注釈は、*p < 0.05、**p < 0.005、***p < 0.0005を示し、残存率100%との1標本のt検定による比較。大腸菌で発現した各胆汁酸（WT/BSHI-MOL361/BSHII-H121/BSHIII-1E2/BSHIV-MOL361）のp値： TCA = (0.6778/0.8401/0.1597/0.5261/0.4015); TCDCA = (0.9252/ < 0.0001/0.6322/0.2703/0.0002); GCA = (0.7814/0.1447/0.6873/0.1938/0.0474); GCDCA = (0.9706/ < 0.0001/0.2851/0.1405/0.9125). BSH命名法は、ホモロググループ（例：III）と由来分離株（例：MOL361）を示す。データはソースデータファイルとして提供される。
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Turicibacter由来の菌株および基質特異的胆汁酸ヒドロラーゼは、宿主の脂質組成を異なる形で変化させる
Turicibacterのコロニー形成が宿主の脂質および胆汁プールを広範囲に変化させること（図2）、また胆汁の形質転換が宿主の脂質を変化させることが以前に示されていることから46, 47、Turicibacterのコロニー形成とは関係なくTuricibacterの胆汁修飾遺伝子を発現させれば、宿主の脂質生物学に影響を与えるのに十分であると予測した。これらの胆汁酸形質転換の個々の効果を測定するために、我々は一般的な腸内細菌であるバクテロイデス・テタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）において、ゲノム的に統合された高発現ベクター48からTuricibacter bsh遺伝子を発現させた。この細菌が選ばれた理由は、マウスの腸内に安定に定着し、大腸菌C41-pLysとは異なり、T. sanguinis MOL36149,50と同様の7α-HSDHのホモログを持つため、Turicibacterの胆汁形質転換をより完全に模倣することができたからである。このB. thetaiotaomicron株は以前、ある程度のBSH活性を持つことが報告されているので46、我々はこれらの実験の比較ベースラインとして、非胆汁修飾緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する親株を採用することにした（Bt-WTと命名）。これらのB. thetaiotaomicron遺伝子組換え株は、TCDCA形質転換を優先的に行うなど、大腸菌でのBSHの特徴から予測されるように、一般的にタウロおよび糖結合型胆汁酸を形質転換し、Turicibacterのような胆汁形質転換が可能であることを示した（図6a、補足データ2）。しかしながら、1E2株由来のbsh（group III）を発現するB. thetaiotaomicron株は、H121株由来のbsh（group II）を発現する株よりも、糖結合型胆汁酸をより完全に形質転換しており、大腸菌で得られた知見とは逆の結果であった。このことから、bsh（group II）発現株は今後使用しないことにした。さらに、操作したB. thetaiotaomicron株ではin vitroでの顕著な増殖不良は認められなかったが（補足図6）、MOL361由来のbsh（group I）発現B. thetaiotaomicronでは胆汁形質転換の遅延が観察され、増殖期間を延長することでこれを補うことができた（図6b）。
図6：Turicibacter bshの発現は、宿主のリピドームと健康に関連する脂質マーカーを変化させるのに十分である。
a 注記したbsh遺伝子を発現するBacteroides thetaiotaomicron株で24時間増殖させた後の、指摘した胆汁酸の残存率。 b aと同じだが、指摘したB. thetaiotaomicron株で48時間増殖させた場合。c bshを発現するB. thetaiotaomicronでコロニー形成させたマウスのタウリン結合した糞便胆汁酸（BA）の定量。統計解析はKruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定で行った。 d B. thetaiotaomicronの少なくとも1つのTuricibacter bshの発現によって有意に変化した循環脂質種のヒートマップ。ヒートマップのZスコア値は、ラベル付けされた脂質カテゴリーから検出された各脂質種の平均存在量を、その個々の脂質種の全平均値でスケーリングしたものである。e-i bsh発現B. tatatiotaomicronで単コロニー化したマウスの(e)トリグリセリド(TG)、(f)コレステロールエステル(CE)、(g)ジアシルグリセリド(DG)、(h)ホスホチジルグリシン(PG)、(i)ホスホチジルセリン(PS)の相対的複合循環濃度。j bsh発現B. thetatiotaomicronをモノクローナル投与したマウスの相対白色脂肪組織重量。d-iの各条件のn： WT＝5（3M、2F）；BSHI-MOL361＝4（2M、2F）；BSHIII-1E2＝4（3M、1F）；BSHIV-MOL361＝6（3M、3F）。jのn：WT＝17；BSHI-MOL361＝14；BSHIII-1E2＝7；BSHIV-MOL361＝18。(e-j)では、すべての値は性別を一致させた同腹子に対して正規化し、統計解析はBt-WTに対するダネットの多重比較を用いたウェルチのANOVAによって行った： Bt-WT＝5、Bt-BSH-MOL361-I＝4、Bt-BSH-1E2-III＝4、Bt-BSH-MOL361-IV＝6： Bt-WT＝17、Bt-BSH-MOL361-I＝14、Bt-BSH-1E2-III＝7、Bt-BSH-MOL361-IV＝18。エラーバーは平均 +/- SEM, *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005. 図6各胆汁酸でBSHを発現するB. thetaiotaomicronのap値（WT/BSHI-MOL361/BSHII-H121/BSHIII-1E2/BSHIV-MOL361）： TCA = (0.3020/0.9811/0.0286/0.1074/ < 0.0001); TCDCA = (0.3686/0.6211/ < 0.0001/ < 0.0001/ < 0.0001); GCA = (0.1703/0.8672/0.0028/ < 0.0001/0.3291); GCDCA = (0.0007/0.0035/0.0833/ < 0.0001/ < 0.0001). 図6bp値（WT/BSHIV-MOL361）： TCA = (0.0748/0.0148); TCDCA = (0.5295/ < 0.0001); GCA = (0.4168/0.0023); GCDCA = (0.1323/ < 0.0001). 図6c、e-jp値（ANOVA/BSHI-MOL361/BSHIII-1E2/BSHIV-MOL361）： 6c＝（0.0051/0.0825/0.5337/0.0016）；6e＝（0.0222/0.0722/0.5767/0.0669）；6f＝（0.0377/0.0780/0.2933/0.4864）；6g＝（0.0142/0. 5490/0.9599/0.0072); 6h = (0.1047/0.0760/0.999/0.4879); 6i = (0.0076/0.0147/0.9449/0.9344); 6j = (0.0042/0.0457/0.8987/ < 0.0001). データはソースデータファイルとして提供される。
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bsh発現B. thetaiotaomicron株をマウスに単コロニー化し、循環脂質プロファイルと腹部WAT量を評価した。BSH-III-1E2株は盲腸でのコロニー形成がやや良好であった（補足図7）。また、個々のTuricibacter bsh遺伝子をB. thetaiotaomicron バックグランドで個々のTuricibacter bsh遺伝子を発現させると、宿主の盲腸胆汁レベル（図6c、補足図S8）と数百種の循環脂質の絶対量（図6d、補足データ7）を有意に変化させるのに十分であった。特に、グループIまたはグループIVのbshを発現させると、トリグリセリドが減少した（図6d、e）。MOL361由来のタウロ特異的bsh（IV群）を発現させると、ジアシルグリセリドも減少した（図6g）。MOL361由来の広範な特異性を持つbsh（グループI）を発現させると、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルセリン、コレステロールも減少した（図6d-f, h, i）。幅広い形質転換能を有するにもかかわらず、1E2由来のbsh（group III）を発現するB. thetaiotaomicronは、宿主の脂質プロファイルを他の株ほど変化させなかった（図6d-i）。組織レベルでは、bsh発現はコロニー形成マウスのWAT蓄積量も変化させ、広範なタウロ脱共役BSH（グループIおよびIV）はWAT量を有意に減少させた（図6j）。Turicibacterの単コロニー化で得られた知見と同様に、BSH反応にも性差が観察され、雄マウスではMOL361由来のタウロ特異的BSHに対してより一貫したトリグリセリドの減少を示し、雌マウスでは広範な脱共役BSHに対してより一貫したトリグリセリド反応を示した（補足図10）。全体として、これらのBSH関連脂質および脂肪組織の結果は、C57Bl/6マウスモデルにおけるMOL361コロニー形成に関する以前の知見38と一致していたが、我々のスイス・ウェブスターマウスにおけるMOL361コロニー形成とは異なっていた（図2c、補足図S11）。
Turicibacterのコロニー形成とbsh発現に反応してコレステロールとWATの変化を促進する可能性のある因子をさらに探索するために、胆汁酸の主要な核内受容体であるファルネソイドX受容体（Fxr）の肝臓転写レベルを測定した； コレステロールから胆汁酸への変換の律速酵素であるチトクロームP450ファミリーAサブファミリーAメンバー1/コレステロール7α水酸化酵素（Cyp7a1）、および糖新生の主要酵素であるグルコース-6-ホスファターゼ（G6pase）の転写レベルを測定した。Fxr転写産物レベルには、生来型と人工細菌のコロニー形成条件のいずれにおいても違いはなかった（補足図12a）。しかし、Cyp7a1の発現量の増加（補足図12b）とG6paseの発現量の減少（補足図12c）は、Turicibacterとbshのコロニー形成の間で同様であった。これらの所見は、ツリシバクターの胆汁修飾活性が、胆汁のシグナル伝達および応答要素の肝臓での発現を下流で変化させることを示唆している。以上の結果から、Turicibacterの株特異的bsh遺伝子、特にマウス腸内に豊富に存在するタウリン結合胆汁酸を処理できるbsh遺伝子を発現させるだけで、宿主のコレステロール、胆汁、脂質の生物学的性質が変化することが明らかになった。
考察
本研究の結果から、哺乳類の腸内細菌叢に存在するいくつかのツリシバクター属細菌株が、宿主の胆汁および脂質組成を調節することが示された。また、個々のbsh遺伝子の発現が、宿主の脂質プロファイルを広範かつ差次的に変化させるのに十分であることを明らかにした。ヒトの腸内胆汁酸はタウリン結合型とグリシン結合型が混在しているのに対し、ネズミの胆汁酸は主にタウリン結合型であり51, 52、それぞれの消化管から分離されたTuricibacter株によって優先的に処理される胆汁環境が異なっている。宿主特異的な胆汁組成と細菌の修飾との間にこのような密接な関係があるのは、MOL361が以前に示した胆汁感受性、および／またはツリシバクターが小腸に多く存在することにより、これらの細菌が他の胆汁修飾性腸内細菌21,53,54,55,56,57よりも胆汁再吸収および内腔胆汁レベルに関する宿主遺伝子とより強く関連することが一因かもしれない。
この研究により、特定の腸内細菌によるコロニー形成が代謝に及ぼす影響が示され、特定の分類群（この場合は菌株レベル）と宿主の生理機能との関連についての理解が深まった。げっ歯類およびヒトを対象とした研究において、Turicibacterの相対量は、しばしば食事性脂肪29,31,58,59,60,61,62および宿主の脂肪率28,33,34と負の相関を示すが、逆の関係を示した研究もある30,63,64。これは、今回同定されたツリシバクター（Turicibacter）分離株の表現型の多様性の結果である可能性があり、宿主は特定のツリシバクター（Turicibacter）株によって異なる脂質の結果を経験するかもしれないが、宿主の遺伝学的特徴や性別21,38など他の特徴によっても異なる可能性がある（補足図3, 9, 10）。重要なことは、Turicibacterのコロニー形成の影響は、個体の微生物叢の生物地理学的構成にも影響される可能性があるということである。特定の分類群に加えて、小腸と大腸におけるTuricibacterの位置づけが、腸管のいずれかのセクションの胆汁プールを変化させることによって、それぞれの胆汁修飾による宿主の結果に影響を与える可能性がある。MOL361株とH121株は、ゲノムや局在の違いにもかかわらず、脂肪酸酸化の亢進を示す脂質代謝産物の変化を誘導することから、これらの菌株は少なくとも宿主の脂肪酸代謝を変化させる特徴を共有していることが示唆された。我々は、異なるツリシバクター菌株によって調節される宿主脂質の幅広いグループを同定したが、宿主が複雑であるため、これらの違いをさらに解明する力は弱く、ツリシバクター菌のより菌株特異的な作用を明らかにする今後の研究に期待したい。
ツリシバクター属におけるbsh遺伝子の制御、胆汁とツリシバクターのコロニー形成および感染行動との関係、さらに我々が試験した推定BSHおよび7α-HSDHホモログの本来の機能性についてのさらなる研究により、これらの細菌が腸内でどのように胆汁修飾を行うかがさらに解明されるであろう。加えて、細菌によって誘発された血清と便の胆汁プロフィールの間に観察された相違を調べることで、修飾胆汁酸の宿主による再吸収の違いなど、これらの影響における他の複雑な要素を説明できるかもしれない。非共役胆汁酸の増加など、いくつかのin vitroでの胆汁調節は、我々のin vitroでの特徴とTuricibacterのコロニー形成との間で一貫していたが、Turicibacterのコロニー形成および個々のTuricibacter BSHの発現中に見られた胆汁合成遺伝子の発現および糖共役胆汁酸レベルのin vivoでの同時増加は、宿主の胆汁産生とTuricibacterの活性との間のより複雑な相互作用の可能性を示している。個々のBSHホモログの特異性と活性が、異なる細菌背景で発現した場合に異なるという事実は、他の未知の細胞因子や環境因子が、個々のBSHの生体内での作用の仕方に影響を与えていることを示している。これには、我々の実験に使われた特定の共役胆汁酸を脱共役しなかったTuricibacterから同定した他の推定BSHホモログの機能を修正するメカニズムも含まれるかもしれない。これらの知見は、微生物叢工学を通じて宿主の脂質プロファイルを形成するために胆汁修飾遺伝子を用いる方法に影響を与える可能性があり、特定の微生物種を宿主に特異的な効果を付与するためのより適切なベクターとして位置づけることができる。また、B. thetaiotaomicronの特定のbsh過剰発現株をマウスにコロニー形成させた所見とは対照的に、Turicibacterがコロニー形成動物で他にどのような活性を発揮してWAT増加につながるかを明らかにすることも有益であろう。この所見から、ツリシバクターは、我々が特徴付けた胆汁形質転換以外にも、他のメカニズムを通じて宿主の脂質に影響を与えている可能性が高い。
我々の研究はまた、特定のツリシバクター属細菌とBSH活性を、宿主の特定の結果と結びつけている。広範なトリグリセリドの減少など、いくつかの宿主の反応はBSH受容マウスで一貫していたが、正確な脂質やコレステロールの反応は異なっており、これは脱共役のタイプが宿主の生理学と異なる関係を持っている可能性を示している。他の細菌54,67で提案されているように、ツリシバクターおよび／またはその胆汁修飾体を利用して宿主の脂質生物学を意図的に変化させ、宿主の代謝および脂質関連の健康を改善する65,66という見込みを、今後もさらに強めていくであろう。また、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）は、ツリシバクター特有のセロトニントランスポーター38の活性を阻害する可能性があるため、ツリシバクターの増殖やコロニー形成に悪影響を及ぼすことが分かっている70。SSRIの使用は、体重増加71,72のような代謝性の副作用としばしば関連しており、今回の知見は、SSRIの使用とこれらの副作用を結びつける仮説を示唆している： SSRIの使用は、ツリシバクターのような細菌の腸内コロニー形成を減少させ、宿主の生理学への影響を意図せずに変化させる可能性がある。将来的には、SSRIと微生物叢の活性との相互作用を軽減し、これらの薬剤の副作用を最小限に抑え、宿主の転帰を改善する戦略が開発されるかもしれない。全体として、これらの関連性は、多様なTuricibacter属のメンバーと宿主の生理を結びつけるメカニズムを理解することの重要性をさらに強調するものである。
方法
マウスの飼育
すべてのマウス実験プロトコルはUCLA Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。すべての動物実験には、成体（6-8週齢）の無菌Swiss Websterマウスを用いた（詳細は補足データS3を参照）。マウスはフレキシブルなgnotobiotic isolatorで12時間：12時間の明暗スケジュールで標準的な餌（Labdiet 5K52、22.1%：16.6%：61.3%タンパク質：脂肪：炭水化物、カロリー）を与えて飼育した後、オートクレーブ処理した餌（Labdiet 5010、28.7%：13.1%：58.2%タンパク質：脂肪：炭水化物、カロリー）と水を入れたオートクレーブ処理したフィルタートップケージに移した。実験期間中、マウスは温度（22℃～25℃）と湿度管理のもと、12時間：12時間の明暗サイクルで飼育した。1日のケージ馴化の後、指定されたTuricibacterまたはBacteroides thetaiotaomicron株をYCFA培地（下記参照）で一晩培養し、遠心分離でペレット化し、1X PBSに再懸濁した。ツリシバクター106コロニー形成単位（CFU）またはバクテロイデス・テタイオタミクロン108CFUを含む200μLの経口投与でマウスをコロニー形成させた。あるいは、同量のPBSのみ（無菌マウス[GF]と呼ぶ）、または特定の病原体を含まない成体マウスの糞便スラリーをPBS懸濁したもの（従来型マウス[CONV]と呼ぶ）をマウスに与えた。コロニー形成は、菌株特異的 TuriSERT プライマー（Supplementary Data 8）を用い、Low Abundance Microbiota Standard（Zymo社製）を添加し、ZymoBIOMICS DNA Miniprep kit（Zymo社製）を用いて抽出した後、遠位小腸および近位結腸の重量を正規化した内容物から定量的 PCR（qPCR）を行い、その菌株の培養物の連続希釈プレーティングから得られた CFU の標準曲線を基準として測定した。
細菌培養
Turicibacter単離株とBacteroides thetaiotaomicron株（補足データ4）を、嫌気性85%/10%/5%窒素/二酸化炭素/水素混合液（Airgas社製）中、フレキシブルビニルチャンバー（Coy社製）で培養した。TuricibacterはSchaedler寒天培地（BD Biosciences）または改良YCFA73（pH7.4、1リットル当たり：100 mM MOPS、10 g casitone、2.5 g yeast extract、2 g glucose、2 g maltose monohydrate、2 g cellobiose、44 mg MgSO4、68 mg CaCl2、0.9 g NaCl、10 mg hemin、0. 45 g K2HPO4、0.45 g KH2PO4、4 g NaHCO3、1 g システイン、1 mg レサズリン、1.9 mL 氷酢酸、0.7 mL プロピオン酸、90 μL イソ酪酸、100 uL イソ吉草酸、100 uL 吉草酸、10 mL ATCC ビタミン混合物、0.2% Tween-80）。通常、細胞は振盪せずに増殖させたが、必要に応じて、Turicibacter培養物を密封したハンゲートチューブまたは1.7mL微量遠心チューブに嫌気的に移し、37℃で225RPMで振盪した。
B. thetaiotaomicronの増殖曲線については、一晩培養したものをBHI-S中で37℃で48時間嫌気的に増殖させ、培養が飽和したことを確認した後、1:50の割合で37℃で6時間継代培養した（最終OD600 = 0.41-0.51）。亜培養をすべてOD600 = 0.1に希釈し、さらに6つの複製を96ウェルプレート中の100μL BHI-Sで1:10に希釈した。プレートをパラフィルムで嫌気的に密封し、37℃で培養した。OD600 の測定は、Biotek Synergy H1 マイクロプレートリーダー（Agilent）で 15 分ごとに行った。
大腸菌C41-pLys（Lucigen）は、pET21+プラスミドから発現させた推定胆汁修飾遺伝子の特性解析に使用した。大腸菌は、100μg mL-1のアンピシリンを添加したルリアブロス（LB、1％NaCl、1％トリプトン、0.5％酵母エキス）中、37℃で好気的に振とう培養した。遺伝子の発現は100μM IPTGの添加により誘導した。
細菌の分離と同定
成人ヒトの凍結便サンプルを氷上で解凍し、PRAS嫌気性希釈ブランク培地（Anaerobe Systems）で1:10に希釈した。希釈した便100 μLを、0.05%牛胆汁、0.2%Tween-80、50 mMレゾルフィンを含む改良YCFA培地でさらに1:1000に希釈し、メーカーの指示に従ってProspector®システムアレイ（Isolation Bio社、カリフォルニア州サンカルロス、米国）にロードした。時間 0 でのアレイの蛍光緑色シグナルを、コイ嫌気チャンバー内の Prospector® 装置で読み取り、アレイを Anaerobic Systems AS-580 嫌気チャンバー（Anaerobe Systems）で 37℃でインキュベートした。培養17時間後と41時間後にアレイを再度スキャンし、時間0からの緑色蛍光の減少をアレイナノウェル内の細菌増殖の指標とした。アレイからの細菌を、50mM レゾルフィンを添加しない、1ウェルあたり200μLの改変YCFA培地を含む96ウェルトランスファープレートに移した。トランスファープレートをガス透過性フィルムで密封し、ガス発生小袋（Remel社製）を入れた三菱アネロパックジャー内で37℃で7日間培養した。培養後、トランスファープレートの538ウェルの内容物のうち、目に見える濁りのあるものを二次96ウェルプレートにまとめ、還元グリセロールで保存し、必要な時まで-80℃で保存した。特に断りのない限り、すべての便および分離株の操作は、5%CO2/5%H2/90%N2雰囲気で嫌気的に行った。
ゲノムDNAは、Extract All Kit（Applied Biosystems）を用いて、連結したProspector®培養プレートから96ウェルフォーマットで抽出した。20μLの培養液を20μLのLysis Solutionと合わせ、95℃で10分間、続いて室温で3分間インキュベートした。DNAは20μLのDNA Stabilizing Solutionを加えて安定化させ、得られたDNA溶解液は必要な時まで-20℃で保存した。
新規Turicibacter分離株のqPCRスクリーニング
538株から得られたゲノムDNAを、多重プライマーセットを用いてTuricibacter 16SおよびTuricibacter TuriSERT38遺伝子についてスクリーニングした（補足データ8）。各25μL qPCR反応混合物は、1μLのExtract All溶解液、10μLのSYBR Powerマスターミックス（Applied Biosystems）、0.5μLの各10μMプライマー、および12μLの分子グレードの水を含んでいた。反応はQuantStudio 6 Flex（Thermo Fisher）で95℃ホールド後、95℃15秒、50℃30秒、72℃30秒のサイクルを40回繰り返した。
分子クローニング
PhusionまたはQ5 DNAポリメラーゼ（NEB）とTuricibacter遺伝子を増幅するように設計されたプライマーを用いて、鋳型培養溶解液からTuricibacter遺伝子を増幅した。pET21またはpWW383748由来の発現プラスミドを、それぞれ大腸菌またはBacteroides thetaiotaomicronで発現させるためにGibsonアセンブリー（オリゴについては補足データ8を参照）を用いて組み立てた。クローン化された構築物は、機能的特性を明らかにする前に、サンガー配列決定によって確認された。pWW3837由来の構築物は、以前に記載されたようにB. thetaiotaomicron VPI-5482にクローン化された48,74。bshを発現するB. thetaiotaomicronは、オリジナルのpWW3837構築物を含むB. thetaiotaomicron（野生型B. thetaiotaomicronと呼ばれる）と比較された。
ゲノムアセンブリー
各菌株をSchaedler寒天培地プレート上にストリークし、嫌気的に培養した後、各単離株から個々のコロニーをYCFA培地に採取し、37℃で一晩培養した。ZymoBIOMICS DNA Miniprep kit（Zymo社製）を用いてDNAを抽出し、ビーズビートを用いて細胞を溶解した。精製したゲノムDNAはMiGS（migscenter.org）で塩基配列を決定し、CLC Genomics Workbench（Qiagen）を用いて151bpのペアエンド配列をアセンブルした。ゲノムアセンブリーはNCBIのBioProject PRJNA846348に寄託されている。
全ゲノムと遺伝子の比較
anvi'o75を使用して、異なるTuricibacter株のDNA配列をプロファイリングおよび可視化し、コンティググループ内の推定胆汁酸ヒドロラーゼおよび7α-HSDHホモログを見つけ、変動性プロファイルを作成し、遺伝子カバレッジおよび検出統計量を測定した。平均塩基同一性(ANI)はOrthoANIu76 (available https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)を用いて計算した。
16S rRNAとbsh遺伝子/BSHアミノ酸配列間の配列比較はCLC Genomics Workbench (Qiagen)で行った。7α-HSDH配列比較は、Clostridium absonum44の翻訳アミノ酸配列を用い、tblastn（v.20.12.0）77を用いて行った。
胆汁形質転換の評価
人工大腸菌またはB. thetaiotaomicron株による胆汁形質転換のin vitroでの特性評価は、上述の各培地条件に0.5 mM（合計濃度）の指定胆汁種を添加した培地で細胞を増殖させることにより行った。細胞は定常期（37℃で振盪）まで増殖させた後、さらに処理するまで-80℃で凍結した。その後、細胞を解凍し、ペレット化し（16,000×gで5分間）、上清を新しい微量遠心チューブに移した。3容量のメタノールを加え、混合物を30-60秒間激しく混合し、インキュベートした（室温、15分間）。混合物を遠心分離し（5分、16,000×g）、上清を清潔な微量遠心管に取り出し、真空濃縮機で乾燥させた。乾燥残渣をメタノール/水/ギ酸（50/50/0.1、全量）で処理した後、激しく混合し、上記のように遠心分離した。上清をポリプロピレンHPLCバイアルに移し、キャップをし、4℃に保ちながら、アリコート（通常5μL）を逆相HPLCカラム（Cadenza CD-C18、3. 0 μm、250×2 mm、Imtakt）に注入し、溶液A（水/ギ酸、100/0.1、vol./vol.）で平衡化し、溶液B（アセトニトリル/ギ酸、100/0.1、vol./vol.）の濃度を増加させながら溶出した（0.2 mL minute-1）。カラムからの流出液をエレクトロスプレーイオン源（キャピラリー電圧42 V、キャピラリー温度275 °C、シースガス流量15 L min-1、スプレー電圧5 kV、-1.2 kVマルチプライヤー付き-15 kVコンバージョンダイノード）に通し、リニアイオントラップ質量分析計（Thermo LTQ）に接続し、正イオンモードでm/z 95-1000をスキャンした。スペクトルの記録と分析は、装置メーカーが提供するソフトウェアで行った。提案された元素組成の確認は、オービトラップ質量分析計（Thermo LTQ XL）でスキャンして記録されたスペクトルと同じクロマトグラフィーとイオン源構成を使用して達成された。
胆汁種の定量には、標準化基準として100 mM chenodeoxycholic acid-D4 (CDCA-D4, Sigma)の内部スパイクインスタンダードを最初の培養上清に添加した。再構築したイオンクロマトグラムの曲線下面積を用いて、各生物種の存在量を定量した。
血清代謝物分析
マウスをイソフルランで安楽死させ、心臓穿刺により全血を採取した。血液はSST Vacutainerチューブ（BD）に入れ、氷上で凝固させた後、遠心分離した（4℃、1分、1500×g）。上清を除去し、液体窒素中でスナップ凍結した。血清代謝物は、Metabolon社（米国ノースカロライナ州モリスビル）のグローバルメタボロミクスプラットフォームを用いて分析した。特に断りのない限り、表示された値は、体積補正した定量値の対数変換によって決定された、特定の代謝物の任意単位（a.u.）である。
循環脂質分析
マウスは4～6時間絶食させた後、上記の方法で安楽死させた。心臓穿刺により血液を採取し、氷上で抗凝固K2EDTA Vacutainer tube (BD)に入れた。血液を遠心分離し（4℃、15分、2000×g）、上清から血漿を採取し、液体窒素中でスナップ凍結した。ショットガン・リピドミクスはUCLA Lipidomics Core (Los Angeles, CA, USA)が以下のプロトコールで実施した。解凍した血漿をガラス管に移し、70 種類の内部標準脂質（Sciex および Avanti）の混合液を加え、Bligh and Dyer 抽出法78 を用いて脂質を抽出した。2回の抽出からプールした有機層を真空濃縮機で乾燥し、50/50（vol./vol.）のメタノール/ジクロロメタンに10 mM酢酸アンモニウムを加えたものに懸濁した。ロボバイアルに移した後、Sciex 5500 with DMS Device (Lipidyzer Platform)を用いて、1450 脂質種のターゲット取得リストを用いてサンプルを分析した。Lipidyzer微分移動度装置は、EquiSPLASH LIPIDOMIX標準混合物（Avanti）を用いて調整した。データ解析は、既述のパラメータ79 を用いて社内プラットフォームで行い、定量値は入力量に対して正規化した。図6dのヒートマップに含める生物種の統計的有意性の同定は、Bt-WT（p値カットオフ<0.05）との補正なしの両側Welchのt検定で行った。生値と補正p値の両方が補足データ7に含まれている。
全セカ胆汁分析
マウスは上記のようにコロニー形成され、盲腸末端からの内容物は犠牲となった時点でスナップ凍結された。サンプルは氷上で解凍され、全胆汁分析パイプラインを用いた分析のためにMetabolonに送られた。0 "で示された値は、定量されておらず、検出限界以下であった。
脂肪細胞面積の算出
犠牲後、マウスの表皮下または生殖腺白色脂肪組織(e/g WAT)パッドの重量を測定し、1X PBS中の4%パラホルムアルデヒドに4℃で48時間入れた。脂肪パッドは70％エタノールで2回洗浄した後、UCLA Translational Pathology Core Laboratory（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）に提出し、パラフィン包埋、切片化、H&E染色を行った。EVOS顕微鏡（Thermo社製）の20倍の対物レンズを用い、各動物から10枚（各脂肪パッドから5枚）の脂肪細胞像を可視化した。Fiji80 Adiposoft81プラグイン（バージョン1.1.16）を用いて、視野内に完全に含まれるすべての細胞の脂肪細胞面積を自動的に測定した。
肝臓転写産物のqRT-PCR測定
グノトビオティックマウスを上記のようにコロニー形成させ、犠牲にした後、肝臓の中央葉を切り離し、液体窒素で直接スナップ凍結するか（すべてのTuricibacterコロニー形成動物）、Trizolに入れ、1分間ビーズビートした後、液体窒素で凍結した（すべてのB. thetaiotaomicronコロニー形成動物）。すべての肝臓は、さらに処理するまで-80℃に移された。直接スナップ凍結した肝臓を、RNALater-ICE（ThermoFisher社製）中、-20℃で一晩解凍し、Trizol中で1分間ビーズビートを行った後、すべてのサンプルを同様に処理した。解凍したTrizolサンプルからDirect-Zol RNA Miniprep Kit（Zymo社製）を用いてRNAを抽出し、qScript cDNA Synthesis Kit（Quantabio社製）を用いてcDNAを作成した。QuantStudio5 Real-Time PCR System（ThermoFisher社製）でPowerUp SYBR Green Master Mix（ThermoFisher社製）を用いてqPCRを行った（プライマー82,83はSupplementary Data 8に掲載）（サイクリング条件： サイクリング条件：50 °C、2分間、95 °C、2分間、95 °C、15秒間、55 °C、15秒間、72 °C、1分間のサイクルを50回繰り返した後、メルトカーブを行った）。性マッチさせたコントロール（Turicibacter colonizationsはGF、B. thetaiotaomicron colonizationsはBt-WT）との比較におけるFold変化は、ppiaをハウスキーピング遺伝子として自動閾値Ct値を用いたΔΔCt法を用いて算出した。
統計解析と再現性
サンプルサイズは、過去の経験との比較を用いて決定したが、サンプルサイズを決定するための統計的手法は用いなかった。統計計算はPrism 9.3.1（Graphpad）またはMicrosoft Excel 14.7.1で行った。Turicibacterコロニー形成後の糞便胆汁定量については、Q = 1%のROUT法を用いて外れ値を除去し、解析から除外したが、元のデータはソースデータファイルに含まれている。本研究の他のデータは解析から除外されなかった。点線は直下の群間の統計的比較を、実線は一対比較を示す。特に断りのない限り、検定はすべて両側検定、***p < 0.0005, **p < 0.005, *p < 0.05, written p = 0.05 < 0.15。ヒートマップはRのpheatmap84パッケージ（バージョン3.6.3）85を用いて作成した。
すべてのデータは、異なる日に行われた少なくとも2つの別々の実験にわたって行われた生物学的複製を代表する、および/または含む。すべてのマウス実験は、1つの産仔の雌雄両方を含むCONVを除き、複数の産仔の雌雄両方からのサンプルを含む。マウスは無作為に条件に分けられ、盲検化された研究者によってタグ付けされた。脂肪細胞の画像解析は2名の盲検化された研究者によって行われた。すべての質量分析およびクロマトグラムは、異なる日の少なくとも2回の実験の代表値である。
報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
本研究で得られたメタボロミクスとリピドミクスのデータは、補足データ表として本原稿に添付されている。質量分析データセットはMTBLS7921プロジェクトとしてMetabolights (www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS7921/)に寄託されている。Turicibacter株の生シーケンスリードとゲノムアセンブリは、BioProject ID PRJNA846348としてNCBIに寄託されている。図を作成するために使用したデータは、上記のソースで提供されていない限り、ソースファイルまたは補足データ表に含まれている。ソースデータは本論文とともに提供される。
材料の入手可能性
本研究で使用した菌株は、対応する著者への合理的な要請により入手可能である。一部の材料はMTAの要求により制限されている場合がある。
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謝辞
Turicibacter単離株H121、TA25、T46、T129はThomas Auchtungより頂いた。pWW3837とB. thetaiotaomicron VPI-5482はFatima EnamとJustin Sonnenburgから頂いた。LC-MSの操作とプロトコルの技術的支援をしてくれたAlexander Yoon、Gazmend Elezi、Lauren Seaman、統計的指導をしてくれたNathan Hwangboに感謝したい。本研究は、パッカード財団（E.Y.H.）およびフォード財団（J.B.L.）からの資金援助により行われた。E.Y.H.はNew York Stem Cell Foundation-Robertson Investigatorである。本研究の一部はニューヨーク幹細胞財団より助成を受けた。
著者情報
著者情報
ジョナサン・B・リンチ
現職： Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21205, USA（ジョンズ・ホプキンス大学医学部生物化学教室
著者および所属
カリフォルニア大学ロサンゼルス校統合生物学・生理学教室、ロサンゼルス、カリフォルニア州、90095、USA
Jonathan B. Lynch、Erika L. Gonzalez、Kayli Choy、Kristie B. Yu、Jorge Paramo、Elaine Y. Hsiao
カリフォルニア大学ロサンゼルス校精神医学・生物行動科学科、ロサンゼルス、カリフォルニア州、90095、USA
カイム・F・フォール
ジェーン＆テリー・セメル神経科学・人間行動研究所、カリフォルニア大学ロサンゼルス校、カリフォルニア州ロサンゼルス、90095、USA
キム・F・フォール
パサロウ質量分析研究所、カリフォルニア大学ロサンゼルス校、カリフォルニア州ロサンゼルス、90095、USA
キム・F・フォール
アイソレーション・バイオ（米国カリフォルニア州サンカルロス、94070
タリア・ジュエル、アベラルド・アレラノ、ジェニファー・リアン
貢献
J.B.L.、E.L.G.、K.C.、K.B.Y.、J.P.、E.Y.H.が細菌およびマウス実験のコンセプト立案および計画。J.B.L.とK.F.F.はLC-MS実験の企画と実行を行った。J.B.L.、T.J.、A.A.およびJ.L.は新規ツリシバクター分離株の分離と特性解析を行った。J.B.L.とE.Y.H.は原稿を執筆した。最終原稿は著者全員が読み、編集した。
責任著者
Jonathan B. Lynch宛。
倫理申告
競合利益
本原稿で報告したTuricibacterの宿主効果に関する知見は、UCLAが所有する仮特許出願63/288980の対象であり、J.B.L.、E.L.G.、K.C.、E.Y.H.は発明者である。J.B.L.とE.Y.H.は、本特許のライセンスを供与しているパーパスバイオ社の科学顧問であるが、本研究のデザイン、データ収集、データ解析、解釈には関与していない。他の著者に利害関係はない。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献したRuth Ley氏と他の匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。
追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。
補足情報
補足情報
査読ファイル
補足データ説明
補足データ1-8
報告書サマリー
ソースデータ
ソースデータセット
権利と許可
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転載と許可
この記事について
この記事の引用
Lynch, J.B., Gonzalez, E.L., Choy, K. et al. 腸内細菌ツリシバクター（Turicibacter）株は、胆汁酸と宿主脂質を異なって修飾する。Nat Commun 14, 3669 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39403-7
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2023年3月28日受領
2023年6月07日受理
2023年6月20日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39403-7
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