唾液グルコース測定の標準化による信頼性の高い糖尿

哉百名

唾液グルコース測定の標準化による信頼性の高い糖尿病診断バイオマーカーの獲得
崔洋洋、張漢群、[...]、劉偉強

論文情報追加

関連データ
データ利用許諾書
要旨
唾液グルコースは糖尿病（DM）において頻繁に利用され、非侵襲的で費用対効果が高く、DM患者の診断に十分な性能を発揮することから、DMのバイオマーカー候補として提案されるかもしれない。しかし、唾液中のグルコース濃度は、特定の条件下で変化する可能性があります。そのため、唾液中のグルコース濃度に影響を及ぼす外的要因の可能性を考慮し、唾液の測定戦略を一貫して維持することが不可欠である。本研究では、年齢、日内変動、採取・処理方法など、異なる取り扱い条件およびドナー依存因子下での唾液グルコースレベルを分析した。DMの症状および素因を明らかにするために構造化質問票を使用した。グルコースオキシダーゼペルオキシダーゼ法を用いて、空腹状態の人の血液と唾液中のグルコースレベルを推定した。この研究の目的は、このような条件が唾液中のグルコース濃度に及ぼす影響を調べることである。今後、唾液グルコースをDMの予測バイオマーカーとして使用する際には、これらの外来変数を考慮する必要があることがわかった。

キーワード：唾液、唾液グルコース、標準化、糖尿病、検体採取

  1. はじめに
    糖尿病（DM）は、21世紀の公衆衛生にとって最も重要な脅威の一つである[1]。世界保健機関は、2019年に400万人以上の成人がDMとその合併症で死亡すると推定しており、これは8秒に1人の割合で死亡することに相当する[2]。2021年には約5億3,700万人がDMに罹患しています。DM患者の総数は、2030年には6億4300万人に、2045年には7億8300万人に増加すると予測されています[3,4]。

しかし、DMの原因や病因はまだ不明です[5]。DMの進行を食い止める治療法はありませんが、その症状を治療する方法はあります。この病気の症状を管理することで、患者の苦痛を軽減し、QOLを高めることができます[6]。さらに、継続的なモニタリングは、重要な時期に観察される困難を防止または軽減することができます。Simら[7]は、患者の状況をしっかりと把握し、問題の発生を防ぐためには、患者の血糖値を定期的にモニタリングすることが最も重要であることを強調しました。残念ながら、従来の血糖値モニタリング方法は、通常、採血を必要とし、侵襲的なモニタリングプロセスは、患者にとって苦痛と不便さを伴います[8]。特に、1日に何度も血糖値のモニタリングを必要とする患者にとっては、採血はある程度、患者の精神的ストレスとなり、QOLに影響を与える可能性があります[9]。したがって、非侵襲的な血糖値の検出は、DMの予防、治療、管理に関して、早急に解決しなければならない緊急の課題です。

DMの強力なバイオマーカーを探すために、世界中の科学者が一致団結して標準的な基準を採用することに合意しました。これらの要件には、収集が簡単で、高い感度と特異性を持ち、市販の検査形式で安価であり、明確なカットオフ値を持ち、長期間にわたって再現性のある結果をもたらす試料が含まれています[10,11]。我々は最近、唾液グルコースが前述の要件に合致することから、DMの前向きバイオマーカーとしての可能性を明らかにしました。我々の発見は、唾液グルコースレベルの変化がDMに特有のものであることを示すものであった。この可能性のあるバイオマーカーは、非侵襲的で費用対効果が高いことに加え、非常に高い感度と特異度を持つ正確なパラメータを示しました[12,13]。

唾液の採取は、非侵襲的で、便利で、簡単に入手することができます。唾液は95％から99％が水で構成され、1～5％がタンパク質、核酸、グルコース、電解質、脂質を含むいくつかの局所的および全身的な成分で構成されています[14,15]。これらの成分は相互に作用し、唾液の多様な機能を担っており、身体の健康を反映している[16]。唾液は、多くの疾患に対するバイオマーカーに基づく検査のための魅力的なソースですが、唾液の組成は、サンプルの手順、処理方法、保管条件、および多くの環境とライフスタイル変数などの特定の条件下で変化し得るため、唾液グルコース値を変化させる要因を調べることが極めて重要です[17,18]。唾液グルコースをDMの診断バイオマーカーとして今後の臨床現場に導入する前に、唾液グルコースがDMの診断バイオマーカーとして適切であるという概念を確認するために、本質的な検討事項が議論されなければなりません。唾液サンプルの採取、取り扱い、保管、病理学的変数などは、様々な条件下での唾液グルコース値の変動を防ぐために非常に重要である。

唾液の成分は、採取した時間帯によって異なる場合があります。そのため、唾液中のグルコース産生の潜在的な日内変動を最小限に抑えるための研究を実施する必要があります[19]。したがって、唾液の採取時間は唾液グルコースレベルに影響を与える可能性があるため、考慮すべき重要な要因の1つである。考慮すべきもう1つの重要な要因は、市販されているほとんどの唾液採取装置では、患者がさまざまな化学物質でサンプルを刺激することによって刺激唾液を採取できることです[20,21]。人が安静にしているときは、顎下腺が唾液分泌の大部分を担っている [22]。耳下腺と舌下腺は、それぞれ唾液の約20%と8%の分泌にしか関与していませんが、例えば塩化ナトリウムや酸刺激によって唾液の分泌が刺激されると、発生する唾液の大部分は主に耳下腺に由来するようになります[23]。したがって、刺激の有無だけでなく、刺激物質や刺激の程度も考慮する必要がある。さらに、DMの症状や素因も唾液グルコースのレベルに影響を与える重要な要因です[24,25]。

重要なことは、刺激された唾液と刺激されていない唾液中の炭水化物は、基礎となる病的状態および/または薬物および/または他の化学物質または溶液への曝露により変化する可能性があり、これらすべてがデータの正しい導出を妨げる可能性があることです[26]。したがって、唾液が診断および治療目的で選択されるサンプルとなるように、病的状態ではなく、健康な生理的状態の唾液に存在する生体分子が選択されました。本研究の目的は、唾液中のグルコース濃度に影響を与える可能性のある様々な手順、採取方法（リンスの有無、咀嚼時間、刺激条件）、前処理手順（保存条件、凍結融解サイクルなど）、健常者における要因（概日リズム、病態、症状、素因）の条件付け外影響について検討することにある。したがって、唾液グルコースの採取・保存方法の標準化、唾液グルコース分析技術のバリデーション、日常臨床での基準範囲の確立が重要であり、そのためには、唾液グルコースの採取・保存方法の標準化、唾液グルコース分析技術のバリデーション、基準範囲の確立が必要です。

  1. 材料と方法
    2.1. 倫理に関する声明
    唾液と血液は、有効なインフォームドコンセントを得た参加者から入手した。清華大学の地方倫理委員会は、ヒトからの唾液および血液サンプルの採取を許可した（倫理承認コード：Tsinghua.2021.74）。

2.2. 参加者
本研究は、40 名の DM 患者を含む、合計 80 名の参加者を対象とした。包含基準：糖尿病と診断された患者、糖尿病合併症、免疫疾患、放射線治療、化学療法の既往がない、口腔衛生状態が良好、罹病期間が1年以上である。除外基準：血糖値の変動が大きい患者，正常なコミュニケーションがとれない患者，口腔内腫瘍のある患者など．さらに、患者群と対照群との間で年齢や性別の構成に大きな差がなく、全身疾患を認めない健康な対照群40名を加えた。対照群の包含基準：糖尿病、免疫代謝疾患、およびその他の全身疾患を持たない参加者。除外基準：他の免疫疾患や遺伝性疾患に罹患していること。データ収集日、参加者全員は発熱がなく、口腔衛生状態も良好であった。口腔検査で、口腔衛生状態の悪さ、唾液分泌低下、口腔内の訴え、その他の口腔内の問題（例えば、粘膜病変や持続的歯周病の臨床症状）が見つかった場合、参加者は速やかに研究対象から除外された。唾液の採取方法や前処理が唾液糖に及ぼす影響を調べるために、健常者40名の唾液を使用し、病的状態が唾液糖に及ぼす影響を調べるために、80名全員の唾液と血液を使用した。10の症状因子と10の素因を含む20の危険因子に関する質問紙を実施した。症状要因には、多飲多尿、イライラ、治癒遅延、多尿、視力低下、多食、肥満、体重減少、皮膚感染、疲労が含まれる。素因は、性別、家族歴、妊娠回数、年齢、場所、運動、飲酒、喫煙、職業、生活習慣などであった。

2.3. 2.3. 検体採取
参加者は、サンプル採取の30分前から、喫煙、歯磨き、飲食を控えるように指示された。サンプル採取の前に、口腔内を水で洗浄し、食べ物の粒子を除去した[27]。唾液の採取には、標準化された2分割のチューブと綿が使用された。綿と二重区画のチューブは同じ会社（SalivetteTM, Shanghai, China）で製造されたものである．綿入り試験管の上部には穴が開いており，遠心分離後，下部に唾液を回収し，分析に利用した．同じ臨床室で、すべての唾液サンプルを順番に採取した。感受性の高いペプチドの分解を防ぐため、すべてのサンプルはあらかじめ冷却したポリプロピレンチューブに入れ、氷上で採取した。最後に、サンプルは実験室に運ばれ、将来の使用のために-20℃で遠心分離された。唾液の収集プロセスは、我々の以前の研究 [28,29] で使用されたものと一致している。この研究では、全唾液を採取した。すべてのサンプリング工程は、安全に関する規定に準拠している[30]。

我々は、唾液グルコース値に影響を与える可能性のある異なる手順、採取方法（すすぎの有無、咀嚼時間、刺激条件）、前処理手順（異なる保存条件と凍結融解サイクルを含む）、参加者（概日リズム、病的状態、症状、素因）を通じた要因の条件付け外的影響について調査しました。したがって、唾液グルコースの採取と保存方法の標準化、唾液グルコース分析技術の検証、日常臨床で使用するための基準範囲の設定が重要であった。異なる条件のそれぞれについて、同じ40人の健康な参加者が選ばれた。具体的な実験手順は以下の通りである。

2.3.1. 2.3.1. 歯磨きの有無の手順 このパートでは，健康な被験者 40 人が選ばれ，1 分間に 70 回綿棒を噛む，3 分間に 70 回噛む，5 分間歯間に綿棒を挟むという 3 つの採取方法が提案され た．被験者は絶食状態で歯を磨かず、口をすすいだ後に3つの方法で唾液を採取した。翌日、朝、絶食状態で歯を磨いた後、30分後に再び上記3つの方法で唾液を採取するよう指示した。
2.3.2. 咀嚼時間の手順 本パートでは、健常者40名を選出した。朝の空腹時の歯磨き後、30分以上口腔内を無刺激状態にし、1分間に40〜50回、50〜60回、60〜70回、綿棒を噛んで唾液を採取した。
2.3.3. 遠心分離速度の手順 このパートでは、40人の健康な被験者が選ばれた。空腹時の歯磨き後、口腔内を30分以上無刺激状態にした後、唾液を綿で採取し、遠心分離の速度を変えて綿からチューブに移し替えた。遠心分離の速度は、2000 r/min、3000 r/min、4000 r/min、5000 r/minであった。最後に、採取した唾液を同定し、評価した。
2.3.4. 刺激条件の手順 このパートでは、健康な参加者40名を選び、水をベースラインとして、0.075M、0.15M、0.30Mの塩化ナトリウムと0.005、0.01M、0.02Mのクエン酸で口腔を刺激させた。6日間に渡り、各参加者は1時間のセッションを6回行った。室温で、水、3種類の塩化ナトリウム・クエン酸、3種類のフレーバー化合物のそれぞれで刺激した後に唾液を採取した。セッションの開始時（ベースライン）と終了時（ベースラインへの戻りを確認）に水刺激を行った。各刺激で、5mLの試料が提供された。参加者は、サンプル全体を口に含み、15秒間静かに振り混ぜ、排痰し、45秒間待った後、残りの4つのサンプルについてこの手順を繰り返した。唾液は、5分間の刺激時間中、ずっと採取された。次の刺激の前に、参加者は脱イオン蒸留水で3回口を洗った。刺激提示の順序は全個人に共通で、6日間の実験期間中、6つの異なるセッションで変更されることはなかった
2.3.5. 保存条件の手順 このパートでは、40人の健康な参加者が選ばれた。採取した唾液の半分を遠沈管に入れ、保存方法は、即時検出、室温で2時間後の検出、4℃で2時間後の検出とした。
2.3.6. 凍結融解サイクルの手順 このパートでは、40人の健康な被験者が選ばれた。採取した唾液サンプルの半分を2等分して保存した。次に、2つのサンプルのうちの1つを9つの小さなパーツに分割した。これらのサンプルは、セクション2.3.5で説明する手順に使用された。残りの唾液サンプルは、冷凍庫で保管した。唾液サンプルは5d、10d、15d、20d、25d、または35d保存した後、取り出して遠心分離し、上清を検査用に採取した。採取した唾液はブドウ糖の検査を行い、冷凍保存時間を決定した。さらに、未使用の唾液の大部分を同期して検査し、凍結サイクルが唾液中のグルコース濃度に及ぼす影響を分析した。
2.3.7. 採取時間の手順 このパートでは、40人の健康な被験者を選び、同じ6つの時間帯に唾液サンプルを採取した。採取時間は、3回の食事によって分けられた。唾液は、3回の食事の前後に採取された。参加者は全員、同じ食事をした。"食後 "とは、食後2時間を指す。採取時間は、7:30-8:00（空腹時血糖値、朝食前）、9:30-10:00（朝食後）、11:30-12:00（昼食前）、13:30-14:00（昼食後）、15:30-16:00（夕食前）、17:30-18:00（夕食後）であった。唾液サンプルはすべて臨床室で同時に採取された。
2.3.8. 病的要因の手順 このパートでは、健常対照者 40 名と DM 患者 40 名を選び、異なる時間帯に唾液と血 糖を採取し、異なる時間帯の唾液糖度と血糖値を比較し、病的要因が唾液糖度に及ぼす 影響を分析した。時間帯は、セクション 2.3.7 に記載した採取時間と同じである（8:00, 10:00, 12:00, 14:00, 16:00, 18:00 の 6 つの時間帯を設定した）。
2.4. 血糖値および唾液腺血糖値の測定
血中および唾液中のグルコース濃度は、グルコースオキシダーゼペルオキシダーゼ（GOD-POD）法を用いて測定された。血液と唾液のサンプルを3本の試験管に分け、「ブランク」、「標準」、「テスト」とラベル付けした。以下の手順で実施した。まず、「標準」のウェルに濃度の異なる標準品を50μL添加する；「検査」のウェルに試料希釈液を40μL添加した後、検査対象の試料を10μL添加する；「ブランク」を除く各ウェルに酵素標識試薬を100μL添加する；プレートを密閉フィルムでシールし37℃、60分間インキュベーション；20倍濃度の洗浄液を20倍の蒸留水で希釈し後で使用する；「検査」のウェルに酵素を添加した試薬の入った試薬の入った試料希釈液を20倍濃度の蒸留水で希釈し後で使用する。各ウェルに発色剤Aを50μL、発色剤Bを50μL添加し、軽く振り混ぜ、37℃、暗所で15分間発色させる。最後に「Blank」をゼロにし、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad iMark, 168-1130, Tokyo, Japan）で各ウェルの波長450 nmの吸光度（OD値）を順次測定する。

2.5. 統計解析
データは Graphpad 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) を用いて解析した。各群の平均値および標準偏差（SD）を計算した。グループ間の変動を評価するために、スチューデントの独立t検定によるANOVAを使用し、変数間の関連を測定するためにスピアマンの係数を使用した。有意性はp＜0.05とし、p＜0.01は非常に有意であるとみなした。

  1. 結果
    3.1. 質問票調査
    解析の結果、リスクファクター間の相関はほとんど見られなかった。すべての危険因子を組み合わせて血糖値を予測すれば、よりよい効果が得られるであろう。図1に示すように、22歳から60歳までの計80名を対象にアンケートを実施した。その結果、多食、多飲、多尿、著しい体重減少がDM患者のみに起こり、これらはDMの症状であることがわかったが、ほとんどのDM患者には「3多くて1少」という典型的な症状はない。次に、目が疲れやすいと感じるとともに、徐々に視力が低下し、目がかすむことも、DM患者のリスクを高めます。最後に、年齢、DM歴、妊娠回数もDMと強い関連があることがわかりました。

図1
図1
質問票による危険因子相関
3.2. すすぎの有無
このパートでは、健康な被験者 40 名が選ばれた。唾液の採取方法は、綿棒を1分間で70回噛む、3分間で70回噛む、綿棒を5分間歯間に挟むの3種類を提案した。2日目も、朝の空腹時の歯磨き後30分後に、上記3つの方法で唾液を採取するよう指示した。その結果を表1に示す。この結果から、咀嚼方法によらず、歯磨き・うがいをしない空腹時30分後と歯磨き・うがいをする空腹時30分後では、唾液中のブドウ糖濃度に有意差は認められなかった（p>0.05）。

表1
表1
歯磨きが唾液グルコースに及ぼす影響。(単位：mmol／L）。
3.3. 咀嚼回数
その結果、表2に示すように、40～50回/分、50～60回/分、60～70回/分のいずれにおいても、唾液グルコースおよび唾液量に統計的な差は認められなかった。また、咀嚼時間の違いによる唾液グルコース値や唾液量の男女差は見られなかった（いずれもp＞0.05）。したがって、参加者が容易に咀嚼回数をこなし、安定した唾液量を得られることを考慮すると、1分間に40～50回の咀嚼条件が推奨される。

表2
表2
咀嚼回数が唾液中のグルコースに及ぼす影響。(単位:mmol/L).
3.4. 遠心分離の速度
本研究では、遠心分離速度の違いなど、唾液グルコース試料の処理方法の違いが、唾液グルコース濃度の検出結果に影響を与えることを明らかにしました。唾液グルコース試料の処理過程では、表3に示すように、遠心分離の速度を上げると、まず唾液グルコース濃度が上昇し、その後、閾値速度に達すると唾液グルコース濃度に変化が見られなくなりました。遠心分離速度が3000r/min以下の場合、全体の平均唾液グルコースレベルの変化は、p<0.05で統計的に有意であった。

表3
表3
唾液グルコースに対する遠心分離速度の影響。(単位：mmol/L).
3.5. 刺激条件
水をベースラインとした口腔内刺激の後、塩化ナトリウム水溶液（0.075, 0.15, 0.30 M）とクエン酸水溶液（0.005, 0.01, 0.02 M）を用い、40名の被験者から片側耳下腺唾液を採取した。唾液の分泌量は、各味覚刺激の強さに比例して増加した。最大流出量は、味覚の強さが同等であるクエン酸で誘発された。

表4は、刺激を受けていない唾液と刺激を受けた唾液の未補正データである。刺激の開始とともに平均流速がかなり増加した。その後、刺激が継続するにつれて、流量は減少するように見えた。全体の平均流量の変化は、p>0.05で統計的に有意であったが、第1刺激試料と第2刺激試料の間の差は、統計的に有意でなかった。総唾液グルコースの平均レベルは、刺激期間中に減少した。すべての平均レベルの差は統計的に有意であった。また、刺激を与えた第1サンプルと第2サンプルの間には、有意な変化は見られなかった。

表4
表4
唾液グルコースに対する刺激条件の違いの影響。(単位：mmol/L).
3.6. 保存条件
このパートでは、健常者40名の唾液サンプルを選び、1ケースを9等分した。酵素法で即時検出、室温2時間保存後検出、4℃2時間保存後検出を行った。表5に示すように、室温2時間、4℃2時間保存後の唾液グルコース値に有意差は認められなかった（いずれもp＞0.05）。唾液サンプルは、追跡調査によって異なる条件で保存された。このパートでは、唾液サンプルはアリコートで-20℃、35日間保存された。その結果、保存条件は唾液中のグルコース濃度に大きな影響を与えず、唾液中のグルコースは安定であることがわかりました。唾液腺ブドウ糖は-20℃で少なくとも1ヶ月間保存可能である。

表5
表5
唾液グルコースに対する保存条件の違いによる影響。(単位：mmol/L).
3.7. 凍結融解サイクル
唾液中のグルコースの長期安定性を維持するために、唾液サンプルは採取後、アリコートに分けて-20 ℃で凍結することをお勧めします。一度に1つのアリコートを解凍できるように、凍結融解サイクルを避けるには、少量のアリコートが最適な解決策となります。唾液グルコースレベルをさらに測定するために、サンプルを採取し、4℃で保存した。凍結融解サイクルを全く行わないサンプルと2回しか行わないサンプルの間に、唾液グルコースレベルの差はなかった。表6に示すように、2回以上の凍結融解サイクルを経ると、唾液グルコースレベルは徐々に低下し、2サイクル後よりも顕著に低くなった。この唾液グルコースレベルの低下は、唾液グルコースレベルに影響を与える唾液中の他の化合物の変性に起因すると考えられる（p < 0.01）。生体試料では、凍結・融解の方法によってレベル勾配が生じることがある。このような勾配を避けるために、チューブ内のレベルを適切に混合する必要があります。

表6
表6
唾液中のグルコースに対する保存条件の違いによる影響。(単位：mmol/L).
3.8. 採取時間
80名の被験者の唾液を6つの時間帯で採取し、それぞれの時間帯の血糖値を測定した。その結果、図2に示すように、空腹時の血糖値と唾液中のグルコース濃度が最も低く、安定していることがわかりました。また、生理的条件下では、食後に大量のブドウ糖が血液中に吸収され、一時的に血糖値が上昇し、2時間後には元の値に戻ることがわかりました。唾液糖の傾向も血糖値と同様で、食後に唾液糖が急激に上昇し、その後時間と共に徐々に低下していくことが確認できました。全体の平均唾液グルコース値の経時的変化は、p<0.05で統計的に有意であった。

図2
図2
異なる採取時間における参加者の唾液グルコースレベルの変化。
3.9. 病態への影響
健常対照者40名とDM患者40名を選び、性別をマッチングさせた。その結果、図3に示すように、DM患者の唾液グルコース値および血糖値は、対照群よりも高いことがわかった。この結果から、唾液グルコースと血糖値には、健常者、DM患者ともに大きな個人差があることがわかった。参加者の選択基準は明白であったため、本研究ではアンケート調査の側面が必要であった。

図3
図3
DM患者と健常対照者の唾液と血糖値の比較。
4. 考察
本研究の結果は、DMの診断マーカーとしての唾液グルコースの有効性は、唾液の前分析、採取、処理方法の標準化によって左右されることを示している。本研究では、唾液組成の個人間変動を最小化するためには、標準化された唾液の収集と処理技術が重要であることを見出した。

異なる採取条件、咀嚼時間、遠心分離速度、刺激条件、保存条件、凍結融解サイクル、および採取時間における唾液グルコースレベルを比較することにより、採取前の歯磨きは唾液グルコースレベルに影響しないと結論づけた。被験者が1分間で40〜50回綿棒を噛んで唾液を採取したところ、得られた唾液量と唾液グルコース濃度は安定した値を維持した。遠心分離速度が3000r/minであることから、唾液中のグルコース濃度が上昇しなかったことがわかる。刺激された唾液の流量は増加したが、刺激が強くなると唾液流量、唾液グルコース値ともに減少した。唾液サンプルは、室温または4℃で短期間、-20℃で1ヶ月以上保存することが可能です。また、2回の凍結で唾液グルコース濃度が低下することがわかったので、小分けして保存することが推奨されます。さらに、唾液グルコース値は昼夜の影響をかなり受け、空腹時の唾液グルコース値が最も安定していることがわかりました。最後に、今回の研究では空腹時唾液を主な研究対象としました。以前の研究で詳しく述べたように、DM患者では酵素学的に決定された血糖値と唾液糖の間に強い正の相関があり、唾液糖レベルはDM患者の間でかなり異なる可能性があります[12,13]。

現在までに、唾液によるDMの検出に関する研究は行われているが、唾液の採取方法についてはかなりの違いがある。Dhanyaら[31]は、唾液グルコースによるDM検出の研究を行い、参加者に唾液採取前に蒸留水で口をすすぎ、5分間口の中を刺激したままにしてもらった。採取の際、被験者は5分間飲み込まずに頭を下げた。口腔内で生成された唾液を共通の採取管に採取し、5分後に口腔内に残った唾液を採取管に吐き出した。DM患者の唾液中のグルコース、アミラーゼ、免疫グロブリン、その他の成分の変化を探る別の研究でも、上記の方法でデータを収集した[32,33]。直接唾液を採取する方法では、唾液に口腔内のゴミが混じることがあり、また採取の過程で被験者に不快感を与えるため、綿棒を通して唾液を吸収させる方が衛生的で便利なことから、研究者は綿棒を含む専用の唾液採取チューブを使用して唾液採取を行うようになってきています。Uygunら[34]は、唾液コルチゾールの研究において、被験者に唾液採取チューブに綿棒を2～3分浸すように指示しました。Mészárosら[35]は、被験者に1～2分間綿棒を舌下に飲み込ませて唾液を採取した。Ciurliら[36]は、被験者にSalivette唾液採取チューブに入れた綿棒を1分間噛むように指示した。本研究では、Salivette唾液採取チューブを用いて唾液を採取した。1 分間に 40～50 回綿棒を噛むことが推奨されている．これは、採取時間が短く、唾液量が安定し、患者さんに受け入れられやすいという、積極的な臨床運用が可能なものです。

また、採取方法を検討する際に、刺激唾液と非刺激唾液のグルコースサンプルの採取方法を検討した研究が多数あり、その結果、非刺激唾液より刺激唾液の方がグルコース値が低いことが確認されています[37,38]。Dhanyaら[31]は、非刺激下で採取した唾液グルコースレベルは、刺激下で採取したものより高いことを発見し、この研究の結果と一致するものであった。他の研究では、非刺激下と刺激下で採取した唾液グルコースレベルに有意な差はないことが示されている[39]。個人は刺激を受け入れにくい場合があり、刺激された唾液は非刺激の唾液よりも水分を多く含むため、非刺激の唾液は正常な生理状態の指標としてより優れている可能性があります。武田ら[40]は、様々な条件下で健常者の唾液の化学レベルを調査し、無刺激唾液のほぼすべての代謝物のレベルが、刺激唾液よりも高いことを発見しました。Jhaら[41]はまた、刺激唾液と比較して、刺激唾液の平均唾液グルコースレベルは、コントロールと非コントロールのDM患者の両方で高いことを発見した。このことも、本研究で導き出された結論の妥当性を示している。さらに、我々の研究は、異なる刺激の種類と程度が唾液グルコースレベルに及ぼす影響についての知見を広げた。Newbrun [42]の研究によると、クエン酸によって引き起こされる大量の唾液分泌は、口腔粘膜を保護するための希釈メカニズムであるという。船越[43]が報告したように、塩化ナトリウムとの反応による唾液分泌はかなり安定した増加を示した。塩化ナトリウムによる流量の誘導は、口腔内のイオン数の急激な増加に対する生物学的な保護反応と解釈することもできる。クエン酸に対する曲線的な流量反応は、口腔内には体液分泌の最大容量があり、クエン酸刺激によって生じる高い流量は、流量がこの最大値に近づき、流量が平準化されることを示唆するものであった。また、唾液中のグルコース濃度は刺激量の増加とともに減少し続けるが、唾液流量は最初に増加し、その後減少することを見出した。

唾液採取後の遠心分離速度および保管方法の報告も研究によってかなり異なっており、血液または唾液サンプルの臨床化学検査の大部分は、血球とグルコースなどの他の成分を分離するために分析前に遠心分離を必要とします[44]。この分析前操作は世界中の多くの医療検査室で日常的に行われているが、遠心分離が検査結果に与える影響はあまり報告されていない。遠心分離の分離効率は主に遠心分離速度によって決まるため、本研究では、遠心分離速度の違いが唾液中のグルコース濃度に及ぼす影響について検討しました。その結果、遠心分離速度が速くなると唾液中のグルコース濃度は上昇しますが、ある閾値の遠心分離速度を超えると、遠心分離が不十分で綿棒に唾液が残留するためか、唾液中のグルコース濃度は変化しないことがわかりました。しかし、遠心分離速度が十分な閾値に達すると、唾液中のグルコース濃度は変化しなくなるのです。

また、数多くの専門家が様々な保存方法に関する研究を行っている。Mészárosら[35]は、唾液コルチゾールサンプルを採取後、検査前に-20℃で保存した。別の研究では、唾液サンプルは採取後4℃の冷蔵庫で保管され、24時間以内に唾液コルチゾールが検出された[45]。唾液は採取後すぐに検査できず、短期間の輸送が必要なため、4 ℃で即時検出する場合と室温で2時間保管した後に検出する場合を比較しました。その結果、唾液の輸送を考慮した短期保存では、有意差は認められませんでした。生体試料を-20℃で研究室間で輸送することは、試料の保存を容易にしますが、そのような条件は唾液グルコース関連の結果にマイナスの影響を与える可能性があります。一度解凍し、-20℃で35日間保存したアリコートでは、参照サンプル（分析のために解凍するまで-20℃で保存したアリコート）と比較して、唾液グルコースレベルが多少減少しましたが、有意ではありませんでした。しかし、-20℃で保存した唾液サンプルは、少なくとも35日間は唾液中のグルコース濃度が変化しないことが示唆されましたが、この期間を超えての-20℃での保存は避けることが推奨されます。また、検体はできるだけ早く次の分析に回すことが望ましいことも実証されました。すぐに分析できない場合は、-20℃で1ヶ月間、一時的に保管することが可能です。

凍結サイクルは試料に影響を与えるが、凍結融解技術は生体試料にレベル勾配を発生させる可能性がある[46]。このような勾配を防ぐには、チューブ内のレベルを適切に混合する必要がある。いくつかの研究により、含有物質の生物物理学的特性が調べられている。これらの研究では、繰り返される凍結融解サイクルが、唾液中の物質の安定性とレベルに影響を与える可能性があることが実証された[47,48]。この現象は我々の研究でも確認され、グルコースレベルは3回目の反復凍結融解サイクルの後に有意に減少し、これは以前の研究の結果と一致した。このことから、唾液中のグルコース濃度を誤解させる可能性のある試料の劣化を最小限に抑えるために、過度の凍結融解サイクルを避けることの重要性が浮き彫りになりました。

まとめると、サンプルは研究の目的に応じて、短期間または長期間の保存が可能である。さらに、サンプルの大きさ、採取・処理の難易度、ロジスティックス、サンプルライブラリ管理などの要因を総合的に考慮し、サンプルをローカルに保存するか、中央に保存するかを決定する必要がある。サンプルを35日以上保存する場合は集中保管を推奨し、機器故障や自然災害の影響を軽減するため、電源系統の異なる離れた2カ所の保管場所を使用することを推奨する。また、各保管場所には機器の故障に備え、少なくとも1台の空の予備冷蔵庫が必要です。さらに、すべての試料を一度に包装せず、試料を別々に保存し、保存の過程で凍結と融解を繰り返すことは避けるべきである。

本研究では、唾液中のグルコース濃度とサーカディアンリズムの関係についても検討した。唾液の成分は、採取した時間帯によって変化する可能性がある[19,49]。我々の発見は、唾液グルコースレベルが一日中変動することを実証している。いくつかの研究は、DM放出および代謝経路が概日時計の変化に迅速に反応する可能性を示唆しているが[50]、我々の発見は、唾液グルコースレベルが時間と共に変動し、かなりの概日リズムの影響を示すという発見と一致するものであった。血糖値も唾液グルコース値も空腹時に最も低くなることがわかりました。成人の生理活動は一定の生体リズムを示し、脳や体の各器官の活動が最も低くなる日周期の周期的な変化をする生理活動がある[51]。夜間はほとんどの人が睡眠状態にあり、交感神経の興奮度は低く、インスリンに対する抑制作用は低下し、グルカゴンや副腎皮質ホルモンの濃度は最も低く、グリコーゲンの分解も低下している。夜間は糖新生もグルコゲン分解も低下し、血糖値は低くなり、低血糖の確率が高くなる[52]。空腹時血糖値と唾液グルコースは夜間に最も安定する。8時以降は、人が起きて動き出す時間帯であることが多い。環境の変化は自律神経の興奮性に影響を与え、その多くは交感神経の興奮性の亢進を示し、結果として血糖値を上昇させる[53]。さらに、生理的な条件下では、食後に大量のブドウ糖が血液中に吸収され、血糖値は一時的に上昇し、2時間後には元の値に戻る。血糖値は翌朝7時～8時の間に一定の空腹時レベルとなる。したがって、生理状態を最もよく反映する臨床血糖値を得るためには、7:00〜8:00の空腹時採血が推奨される。

本研究では、DM患者および健常対照者の唾液グルコース値も分析した。健康な対照者は、DM患者よりも平均唾液グルコース値が低かった。我々の結果と同様に、Mahdaviら[54]やその他多数の著者が、DM患者における唾液グルコースの存在を報告している。Ivanovsiら[55]は、DM患者が健常対照者よりも高い唾液グルコースレベルを有していることを観察した。Abikshyeetら[56]が行った研究では、DM患者と健常対照者の唾液と血糖値の間に正の統計的に有意な関連が発見された。したがって、唾液グルコースは、DM患者の血液中のグルコースレベルの指標として利用することができる。我々の発見は、荒川らによる研究結果[57]と一致しており、DM患者と健常対照者のどちらも唾液中にグルコースが検出され、DM患者は健常対照者よりも唾液グルコースレベルが高いことが示唆された。これは、グルコースが小さな分子であるため、歯肉の血管膜液中を容易に移動し、唾液と結合するためと考えられる[58]。DM患者では、血糖代謝の最終産物が唾液腺細胞の基底膜に微小血管や血管の損傷を与え、唾液中のグルコースレベルが上昇する[59]。さらに、ブラウン大学の研究者は、ヒトの唾液中のグルコースレベルを選択的に測定できる新しいバイオチップセンサーを開発し、参加者の選択基準と唾液の採取方法の標準化が重要なステップであり、糖尿病患者が採血せずにグルコースレベルを検査できると結論付けています[60,61]。この研究では、唾液の採取方法を標準化しました。参加者の選択基準は、アンケートによって決定された。質問票には、唾液グルコース値に影響を与える可能性のあるDM症状要因などを聞き出した。

多尿、多食、多飲、急激な体重減少、目のかすみなどは典型的なDM症状である[62,63]。Harrisらによる最近の研究 [64]では、DMは臨床診断の7年あるいは12年前に存在する可能性があることが示されている。この期間中に、心臓病、足潰瘍、腎臓障害、その他の多臓器障害などの致命的な合併症が患者に進行していきます[65]。DMが迅速に診断され、治療されれば、これらの結果は通常管理することができる。コンピュータ技術の進歩により、疾病をより正確に特定することができ、時間と費用を節約することができる。データマイニングを利用して病気を予測するには、病気の症状や臨床データが必要であり [66]、これが今回の調査における質問票の機能であった。これらは、唾液中のグルコース濃度に影響を与える。アンケート調査の結果、「3多くて1少」という典型的な症状は見られないが、「多食」「多飲」「多尿」「体重減少」は明らかにDMの症状であることがわかった。DM患者の多くは「三多一少」の典型的な症状がないため、DM患者は血糖値の健康状態を軽視しやすい。さらに、DMの参加者は、目の疲れ、視力低下の進行、目のかすみなどを経験するリスクが高いことがわかりました。

アンケートで明らかになったこれらの要因はすべて、今後の多施設共同研究で調査・検討されなければならない重要な検討事項です。本研究で得られた興味深く説得力のある証拠に示されるように、唾液グルコースの変動は、外部からの影響を受ける。さらに、本研究は、唾液グルコースがDMの高感度かつ非侵襲的な指標であることを示す証拠でもある。唾液サンプル採取の前に、実験上の必要性に応じて参加者の選択基準を厳密に管理する必要がある。血糖値の代わりに唾液グルコースの非侵襲的検出の精度を大幅に向上させるために、質問票の回答、詳細な病歴、および該当する場合は完全な臨床検査に基づいて、関心のある参加者を慎重に選択する必要があります。

この研究にはいくつかの限界があります。まず、今回の結果は、唾液サンプルを-20℃で1ヶ月間保存しても唾液グルコース値に影響がないことを証明しただけであり、唾液サンプルを-80℃でより長期間保存できるかどうかは、まだ確定していません。また、本研究はサンプル数が少ないので、今後の研究で様々な検出方法やマトリックスに関連した唾液グルコース値の一貫性を確認するためには、サンプル数を増やすことが重要である。また、本研究では唾液の採取方法を標準化し、参加者の選択基準を最適化したが、唾液採取に関する注意事項は限られており、シェーグレン症候群や歯周炎など、アンケートで取り上げた要因以外にも唾液分泌に影響を与える要因は多い。これらの変数をコントロールすることで、これらの要因が唾液中のグルコースレベルに影響を与えるかどうかを判断することができる。最後に、唾液は複雑なマトリックスであり、分析に干渉する可能性のある他の生体分子を含んでいることはよく知られている。したがって、唾液中の他の物質が唾液グルコースに及ぼす影響も、今後の研究で検討する必要があります。

  1. 5.結論
    バイオマーカー研究において、分析前の手順が標準化されていないと、得られる結果にかなりの差が生じる可能性がある。そこで本研究では、唾液グルコースの採取・保存方法の標準化、唾液グルコース分析技術の検証、日常臨床での基準範囲の設定を目的として、採取方法（リンスの有無、咀嚼時間、刺激条件など）、前処理方法（保存条件、凍結融解サイクルなど）、外部影響因子（概日リズム、病的状態、症状、素因）の相違を検討しました。

本研究では、唾液グルコース濃度が刺激条件や凍結融解サイクルの繰り返しなどの外的要因に影響されることを発見しました。しかし、試料を-20℃で35日間保存し、凍結融解を3回まで繰り返しても、唾液中のグルコース濃度に大きな変化はありませんでした。このような条件であれば、サンプルの移し替えや分析が可能となり、効率的かつ経済的な処理が可能となります。したがって、今回の結果を再現し、分析前の要因が結果に影響しないことを確認するためには、統一したデータ収集・保存方法を採用することが推奨されます。さらに、唾液中のグルコースの長期安定性を確保するために、唾液のサンプルを-20℃で凍結することをお勧めします。

また、唾液グルコースはサーカディアンリズムの影響を受けるため、唾液の採取時期が重要であることがわかりました。さらに、唾液グルコースレベルが変動する可能性を排除するために、1日の同じ時間帯に空腹時に唾液サンプルを採取することが必要である。DMの症状や素因などの外来因子は、ドナーの唾液グルコース産生に影響を与える可能性がある。唾液グルコースレベルはこれらの変数に反応して変動する可能性があるが、これらの変動は同じ患者で発生することはなかった。したがって、健常者とDM患者の唾液グルコースレベルを比較するためには、参加者のサンプリングが実験の正しさに不可欠であるため、厳密な参加者抽出基準を提案する。

今後、唾液グルコースをDMバイオマーカーとして検証する際には、これらの外因的要因をすべて考慮する必要がある。結論として、我々は、すべての研究グループおよび研究所が、DMのバイオマーカーとしての唾液グルコース値の検証を特に重視し、上記のような試料処理と保存の技術を活用することを推奨する。さらに、唾液グルコースレベルの変動に関連する質問項目の変数を検討することを推奨する。これらの推奨事項は、十分に特性化されたサンプルを大量に得るために、バイオマーカーのサンプル収集を標準化するためのチェックリストとなる。

資金提供について
このプロジェクトは、広東省基礎応用基礎研究財団（助成番号2020B1515120082）、深圳市科学技術革新委員会（助成番号JCYJ20190807144001746、助成番号JCYJ20200109150605937、助成番号JSGG20191129114422849）により支援されています。

著者による貢献
Y.C.：執筆-原案、データキュレーション、メソドロジー、プロジェクト管理；H.Z.: H.Z.：データキュレーション、形式分析、方法論、ソフトウェア、S.W.：執筆・校正、資金獲得、調査、監督、J.L.：データキュレーション、形式分析、方法論、検証、J.H.：データキュレーション、形式分析、方法論、可視化、L.L.：データキュレーション、形式分析、方法論、W.L.：資金獲得、調査、資料、監修。すべての著者は、掲載された原稿を読み、同意している。

施設審査委員会声明
該当なし

インフォームド・コンセント
すべての研究参加者は、インフォームド・コンセントに署名し、ヒトの血液および唾液サンプルの採取は、清華大学の地方倫理委員会によって承認された。

データの利用可能性に関する声明
該当なし

利益相反
著者らは、利益相反のないことを宣言する。

脚注
出版社からのコメント：MDPIは、出版された地図や所属機関の管轄権に関する主張については中立的な立場をとっています。

論文情報
バイオモレキュールズ 2022 Oct; 12(10): 1335.
オンライン公開 2022 Sep 21. doi: 10.3390/biom12101335
PMCID: PMC9599863
PMID: 36291544
Yangyang Cui,1,2,3 Hankun Zhang,1,2,3 Song Wang,3,* Junzhe Lu,3 Jinmei He,3 Lanlan Liu,3 and Weiqiang Liu1,2,3,*.
Paolo Paoli、学術編集者
1清華大学深圳国際大学院（中国深圳市） 〒518055
2清華大学機械工学部，〒100084 中国 北京市桂区桂町1-1-1
3清華大学深圳研究所バイオメカニクス・バイオテクノロジー研究室 〒518057 中国深圳市錦江区錦江町1-1-1
*Correspondence: gro.zs-auhgnist@sgnaw (S.W.); moc.liamtoh@uilqiew (W.L.); Tel: Tel. +86-0755-26558633 (S.W.); +86-0755-26551376 (W.L.)。
2022年8月14日受領; 2022年9月19日受理.
Copyright © 2022 by the authors.
ライセンシー：MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。
Biomoleculesからの記事は、Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI)の提供でここに提供されます。
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