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公開：2021年7月30日
EF-G触媒による転座の際の+1リボソームフレームシフトの構造的基盤

https://www.nature.com/articles/s41467-021-24911-1

Gabriel Demo, Howard B. Gamper, ...Andrei A. Korostelev 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ12巻、論文番号：4644（2021） この記事を引用する

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メトリクス詳細

概要
翻訳中のmRNAのフレームシフトは、細胞やウイルスのコードレパートリーを拡大する戦略の一つである。伸長サイクルのどこで、どのようにして+1-フレームシフトが起こるのかは、まだよくわかっていない。我々は、70Sリボソーム複合体の3.5Å分解能の7つの低温電子顕微鏡構造（GTPase elongation factor G (EF-G)による伸長と転移の可視化）について記述する。1-フレームシフティングを起こしやすいmRNAを含む4つの構造から、tRNAとmRNAの転移中にフレームシフティングが起こることが明らかになった。EF-Gが結合する前の翻訳前複合体では、A部位でtRNAとmRNAがインフレームで対になっている。EF-G-GDPCPで部分的にトランスロケーションされた構造では、tRNAはP部位近くの+1-フレームにシフトし、遊離したmRNA塩基がP部位とE部位の間で膨らみ、16S rRNAのヌクレオチドG926上にスタックする。リボソームはほぼトランスロケーション後の状態でフレームシフトしたままである。この結果は、リボソームとEF-Gが協力して、tRNA-mRNA転座時に+1フレームシフトを誘導することを示している。

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はじめに
タンパク質を正確に合成するために、リボソームは一度に1つのトリプレットコドンを解読し転移させることにより、mRNAの読み枠を維持する。mRNAとtRNAが同時に約25Å移動するのは、細菌では保存されている翻訳GTPase EF-G（古細菌と真核生物ではEF2）によって触媒される。ペプチド結合の形成後、ペプチジルtRNAと脱アシル化tRNAはそれぞれA部位とP部位からP部位とE部位に移動する。この移動には、リボソームの自発的かつ大規模な（〜10°）サブユニット間の回転が必要である1,2。伸長サイクルごとにサブユニットが顕著に再配置され、tRNAとmRNAが広範囲に運動するにもかかわらず、リボソームは何百ものコドンを通して正しい読み枠を維持する3。

しかしながら、フレームシフトと呼ばれる読み枠の変更は、ウイルス、細菌、真核生物では一般的であり、これによりコードレパートリーの拡大や遺伝子発現の制御が可能になる4。フレームシフティングの際、翻訳中のリボソームは、順方向（+）または逆方向（-）に、それぞれ1つ以上のmRNAヌクレオチドを読み飛ばしたり、読み直したりして、別の読み枠に切り替わる。本研究では、様々な生物の遺伝子発現に重要な+1フレームシフティング(+1FS)に焦点を当てる。例えば、+1FSは細菌では必須放出因子2の発現を制御し5,6、代謝産物依存性酵素の発現を制御し7、真核生物ではハンチンチン8の病的発現を引き起こす。+1FSは、リボソームの品質管理機構の調節異常によって増幅される9,10。また、+1FSを実行できるtRNAを介して非天然アミノ酸を挿入することにより、ゲノムのコードレパートリーを合成的に拡大するために利用されている11。1FSはタンパク質伸長の動的な段階で起こるため、その分子機構を研究することは困難であった。

ここでは、低温電子顕微鏡（CE）を用いて、細菌ゲノムの中で最も+1FSを起こしやすい（"滑りやすい"）mRNA配列上の+1FSを可視化することにより、この課題に取り組む。mRNA配列CC[C/U]-[C/U]12は、tRNA濃度の不均衡13,14、tRNAの転写後修飾の欠如15,16,17,18、あるいはtRNAのアンチコドンループへのヌクレオチド挿入18,19,20,21が原因で+1FSを誘導する。通常の生育条件下では、大腸菌のCC[C/U]-[C/U]配列は最大1%22まで+1FSを誘導することができ、他の配列における自発的フレームシフトの平均頻度を2桁上回る23。In vitroでは、mRNAのCC[C/U]-N（N = A, C, G, U）配列はさらに+1FSを起こしやすく、70%の効率を達成している17。CC[C/U]-N配列はプロリン（Pro）をコードし、大腸菌ではtRNAProの2つのアイソアクセプターによって解読される17。ProMによってコードされるアイソアクセプターtRNAPro(UGG)は、4つのProコドンすべてを読み取る能力を持つため、細胞増殖に必須である24。転写後に修飾されたヌクレオチド5-オキシアセチルウリジン34（cmo5U34）17やグアノシン37のN1-メチル化（m1G37）が欠損すると、+1FSを起こしやすくなる22。ProLによってコードされるアイソアクセプターtRNAPro(GGG)は、スリッパリーモチーフのCC[C/U]コドンに結合しており、m1G37や伸長因子EF-P22が欠損すると+1FSが誘導される。

研究では、tRNAPro(UGG)による+1FSは、伸長サイクルの3つの段階のうちの1つで起こりうると提唱されている： (1)tRNAがリボソームA部位に結合する際の滑りやすい配列の解読25,26,27；(2)EF-G触媒によるtRNAのA部位のインフレーム位置からP部位の+1フレーム位置への転位22；または(3)転位および/またはEF-G解離後のP部位でのtRNAの停滞22,28,29,30。他の+1FSを起こしやすいtRNAのAサイトにおけるアンチコドンステムループ（ASL）の結晶構造26,31,32,33は、伸長因子の非存在下で形成され、デコーディング中のシフトを否定しており、デコーディングセンターの立体障害がtRNAのスリップを防いでいることを示している。しかし、リボソームのダイナミクスは、結晶化を回避する可能性のある異なる構造のサンプリングを可能にする。このように、3つの伸長段階すべてにおいてフレームシフト複合体の再配列が起こる可能性は、まだ解明されていない。上記の3つの機構を区別するためには、+1FSが起こりやすいmRNA上で完全長のアミノアシルtRNAとEF-Gとで形成される70S転位複合体を捉える必要がある。

本研究では、完全長ネイティブ大腸菌tRNAPro(UGG)とEF-Gの有無にかかわらず形成される70S複合体の低温電子顕微鏡構造を紹介する。この構造から、フレームシフトを起こさない「コントロール」mRNAと、+1FSを起こしやすいmRNAを含む複合体の違いが明らかになった。アンチコドンの隣に余分なヌクレオチドを含んでいた+1FSの先行研究のASL26,31,32,33とは異なり34、ネイティブの大腸菌tRNAPro(UGG)は正規のアンチコドンループを持っている。ここではまず、A部位に非フレームシフト型mRNAコドンモチーフC1CA-A4、あるいはフレームシフト型コドンモチーフC1CC-A4を含む2種類の翻訳前70S複合体について述べる。各複合体は、P部位にfMet-tRNAfMet、A部位にEF-Tu-GTPによって送達されるPro-tRNAPro(UGG)を用いて調製される。EF-G触媒による転座状態を捕捉するため、次にEF-Gと非加水分解性GTPアナログGDPCP（5′-guanosyl-β,γ-methylene-triphosphate）を各転座前複合体に加え、単粒子低温電子顕微鏡解析を行った（Methods）。クライオ電子顕微鏡データの最尤分類を用いることで、1つのサンプル内で多数の機能状態とコンフォメーション状態を分離することができる。我々のデータ分類により、各複合体において3つの伸長状態が明らかになった（補足図1、2、4）： (1) A部位にtRNAProを持つトランスロケーション前の非回転70S構造（I：非フレームシフト、I-FS：フレームシフト）、(2) P部位付近にtRNAProを持つ「トランスロケーション中期」EF-G結合構造（IIおよびII-FS）、および(3) P部位にtRNAProを持つほぼ完全にトランスロケーションしたEF-G結合状態（IIIおよびIII-FS）。さらに、EF-Gと相互作用する前の転座前リボソームを可視化するために、EF-Gなしで形成されたフレームシフト複合体を解析したところ、A/P*のハイブリッド構造（Irot-FS）でtRNAProを含む転座前70Sリボソームが回転していた（補足図3および4）。非フレームシフト型とフレームシフト型の構造を比較すると、リボソームは転移前に+1FS型になるように準備されており、フレームシフトはEF-G触媒による転移の中間段階で達成されることが明らかになった。

結果と考察
大腸菌tRNAPro(UGG)はin vivoおよびin vitroで+1FSの性質を持つ
我々は以前、大腸菌tRNAPro(UGG)がin vitroで+1FSを行うことを示したが17、全てのアイソアクセプターが存在する細胞内でこのtRNAが+1FSを行うかどうか、また転写後の修飾が+1FSに影響を与えるかどうかは不明のままであった。我々は、細胞ベースのレポーターアッセイでこれらの疑問に取り組んだ。このアッセイでは、C1CX-X4コドンモチーフをlacZ遺伝子の開始コドンAUGの隣の第2コドン位置に挿入し（図1a）、完全長のβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）を合成するために+1FSイベントが必要となるようにした。1FSの頻度は、CCX-Xレポーターを発現する細胞におけるβ-galの比率を、lacZレポーターへのCCCまたはCCAコドンのインフレーム挿入を発現する細胞に対する比率として測定した22。CCAコドンがtRNAPro(UGG)と同族である非FS C1CA-A4レポーターと、+1フレーム中のC2CA4コドンがtRNAPro(UGG)と同族である+1FS CCC-Aレポーターを作製した。また、CCCコドンがtRNAPro(GGG)と同族である+1FS CCC-Cレポーターも別に作製した。

図1：細胞ベースのアッセイにおける大腸菌tRNAPro(UGG)の+1FS。
図1
a lacZレポーター構築物。CCX-Xコドンモチーフが開始コドンAUGの隣にlacZ遺伝子に挿入され、完全長のβ-galタンパク質を産生するためには、モチーフでの+1FSイベントが必要である。 b-d m1G37+（青）またはm1G37-（オレンジ）状態を産生するために、Ara制御ヒトtrm5を発現する大腸菌trmD-KO/JM101株で+1FS頻度を測定した。CCA-Aレポーターを発現している株（b）、CCC-Aレポーターを発現している株（c）、CCC-Cレポーターを発現している株（d）について、対応する対照株の活性で正規化したミラーユニットとしてβ-gal活性を決定することにより、+1FS頻度を報告した。データは平均値±SD、n=4で示した。データセットCCA-A/proM+/proL+/m1G37-、CCA-A/proM+/proL-/m1G37-、CCC-A/proM+/proL-/m1G37-については、n = 3。P値はWelchの両側t検定から算出し、（b-d）に示した。

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CCA-Aレポーターを発現し、tRNAPro(UGG)とtRNAPro(GGG)の両方を含む細胞では、+1FSはバックグラウンドレベル（0.6%）まで抑制され、tRNAPro(GGG)を欠失させても安定したままであった（0.7%）（図1b）。このことは、tRNAPro(UGG)が細胞内でレポーターのCCAコドンを解読するのに十分であることを示している。tRNAPro(UGG)上のm1G37が欠損すると、+1FSが上昇し（1.7%）（図1b）、このtRNAアイソアクセプターがリーディングフレームを維持するためにm1G37に依存しているという考え方が支持された17。対照的に、CCC-Aレポーターを発現している細胞では（図1c）、tRNAPro(GGG)非存在下でtRNAPro(UGG)を発現させると、両方のtRNAを発現している細胞（1.5%）に比べて+1FSが大幅に増加し（4.2%）、m1G37を欠損させると+1FS頻度はさらに上昇した（11.6%）。これらの結果は、CCCコドンはcmo5U34-C3ウォブルペアリングを通してtRNAPro(UGG)によって読み取られるが、このペアリングは不安定であり、安定なcmo5U34-A4ペアリングを形成するために+1FSを起こしやすいという考え方と一致している。CCC-Cレポーターを発現する細胞（図1d）において、同族tRNAPro(GGG)の欠損は+1FSを0.9%から2.0%に増加させ、tRNAPro(UGG)がcmo5U34-C3またはcmo5U34-C4ペアリングを通して0-フレームまたは+1-フレームを読む能力を示した。m1G37の欠損により+1FSがさらに増加した（4.0%または4.2%）ことから、このメチル化がtRNAPro(UGG)の+1FSを抑制する上で重要であることが確認された。

次にin vitro翻訳アッセイを用いて、翻訳の忠実度と効率に影響を与えるMg2+やその他の成分の濃度を変えながら、異なる緩衝液条件下での+1FSの効率を測定した35,36。我々は、生理的な3.5mMに近いMgCl2を含むハイフィデリティ（HF）バッファーと、リボソーム複合体を捕捉するために一般的に用いられる安定化試薬であるスペルミンおよびスペルミジンの存在下、20mMのMgCl2を含む低温電子顕微鏡バッファーとを比較した（「方法」参照）。われわれはまず、自然な転写後修飾によるネイティブ状態のtRNAPro(UGG)のフレームシフトを調べることから始めた。P部位にfMet-tRNAfMetを持つ大腸菌70S開始複合体（70SIC）と、非FS配列AUG-CCA-AGU-Uまたは+1FS配列AUG-CCC-AGU-Uを含むmRNAを形成した。次に、70SICをEF-GとGTPの存在下で、EF-Tu-GTPとPro-tRNAPro(UGG)、Ser-tRNASer、Val-tRNAValの三元複合体の等モル混合物と混合した（図2a）。トランスロケーションとその後のデコーディングの結果、fMPSトリペプチドは0フレーム産物の量を報告し、fMPVは+1FS産物の量を報告する。予想通り、fMPVトリペプチドは+1FSを起こしやすいCCC-Aレポーター上では合成されたが、CCA-Aレポーター上では合成されなかった（図2b-d）。fMPからfMPVとfMPSへの変換率に基づく+1FS頻度の測定から、+1FS頻度は20℃よりも37℃の方が高いことが示された（図2b, c）。1FSの頻度は、クライオEM緩衝液よりもHF緩衝液の方が一般に高かったが、これは高濃度のMg2+がタンパク質合成を阻害するという考え方と一致する35,36。実際、0フレームfMPSの翻訳は、HF緩衝液と低温電子顕微鏡緩衝液の両方で、Mg2+濃度が高くなるにつれて減少した（補足図5）。

図2：生化学的機能アッセイにおける大腸菌tRNAPro(UGG)の+1FS。
図2
a +1FSの収率をfMPからfMPVへの転化率として測定する機能アッセイの反応スキーム。滑りにくいCCA-Aレポーターまたは滑りやすいCCC-Aレポーターでプログラムされた大腸菌70SICを、指示されたMgCl2濃度を含むHFまたはCEバッファー中で、tRNAPro(UGG)、Val-tRNA（*UAC、*U = cmo5Uアンチコドン）、およびSer-tRNA（GCUアンチコドン）のネイティブまたは転写産物とEF-Tu-GTPを含むTCと混合した。各反応は5分後に0.5 M KOHでクエンチした。ペプチドは電気泳動TLCで分離し、蛍光イメージングで定量した。b-f fMPからfMPV（ピンク色）への変換率は、37℃でのCCC-Aコドンモチーフのネイティブ状態のtRNAPro(UGG)（b）；20℃でのCCC-Aコドンモチーフのネイティブ状態のtRNAPro(UGG)（c）について報告した； 20℃におけるCCA-Aコドンモチーフのネイティブ状態（d）；20℃におけるCCC-Aコドンモチーフの転写産物状態（e）；および20℃におけるCCA-Aコドンモチーフの転写産物状態（f）。データはすべて平均値±SDで示した。グラフb-fのバーは、独立した3つの実験（n = 3）のSDである。データセットCCC-A転写物/HF(20),CE(3.5),CE(20); CCA-A転写物HF(3.5),HF(20),CE(3.5), n = 4。

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次に、tRNAPro(UGG)の転写後修飾が+1FSにどのように寄与するかを、完全に修飾されたネイティブ状態のtRNAPro(UGG)、あるいは修飾のないin vitro転写産物tRNAPro(UGG)を用いてアッセイを行うことにより測定した。修飾なしのtRNAでは、CCC-Aモチーフ上の+1FSは増加したが、CCA-Aモチーフ上の+1FSは増加しなかった（図2e, fと2c, dを比較）。このことは、U34（アンチコドンにおける唯一の転写後修飾ヌクレオチド）上のcmo5修飾がないことで、おそらくウォブルU34-C3塩基対が不安定化し、この不安定化によってCCC-Aモチーフ上の+1FSが増加することを示している。注目すべきことに、転写tRNAはCCC-Aモチーフにおける0フレームfMPSの分画合成が遅く、プラトーに達しなかった（補足図6a, b）。これは、未修飾tRNAとリボソームとの相互作用が非効率的であることを示している。これらの実験から、我々の精製したネイティブ状態のtRNAPro(UGG)はタンパク質合成の効率的な基質であり、細胞内でもin vitroの機能的アッセイでも+1FSを誘導できることが示された。

トランスロケーション前のフレームシフト構造は30Sオープン構造をとる
mRNAの解読は非回転リボソーム上で行われ、ペプチジルtRNAがP部位を占め、アミノアシルtRNAがEF-TuによってA部位に送られる。普遍的に保存されている16SリボソームRNAの解読中心G530、A1492、A1493（大腸菌の番号）のヌクレオチドがコドン-アンチコドンヘリックスと相互作用し、その結果30Sドメインが閉鎖され37、解読中の同族アミノアシルtRNAが安定化される38。ペプチジル転移により、脱アシル化されたtRNAがP部位に、ペプチジルtRNAがA部位に存在することになり、リボソームが転座する準備が整う3。従って、30Sドメインの閉鎖は、A部位における正統的解読の特徴である。

我々は、非フレームシフトCCA-AまたはフレームシフトCCC-Aモチーフを持つリボソームの低温電子顕微鏡解析を行い、まず非回転転位前構造に注目した（図3；「方法」）。低温電子顕微鏡データの分類により、EF-G-GDPCPで形成される非フレームシフト複合体とフレームシフト複合体の違いが明らかになった（図3）。粒子集団は類似している（それぞれ約11％と約12％）が、これは両mRNA配列のデコーディング効率が同等であることと一致する17が、得られたCEマップは30Sサブユニットのコンフォメーションが異なることを報告している。非フレームシフト構造Iは、G530、A1492、A1493がON状態38にあり、同族コドン-アンチコドンヘリックスの骨格と相互作用する、標準的な「閉じた」30Sサブユニットを特徴とする（図3b、c）。G530はA1492と接触し、その結果、他のtRNAと形成される同族70S複合体とほぼ同じラッチされた解読中心が形成される39,40。対照的に、cmo5U34-C3ウォブルペアのフレームシフト構造I-FSは、30Sショルダードメインが30Sボディドメインから離れたオープンな30Sコンフォメーション（図3e, f）を特徴とする。この開いたコンフォメーションは、低温電子顕微鏡でとらえた解読の一時的な中間体に似ており、コドン-アンチコドン二重鎖にミスマッチが存在する場合に好まれる38,41。ここで、G530（肩の部分）はONの位置から2Åほど引っ込んでおり、A1492（本体の部分）からもtRNAProのG35のバックボーンからも離れている（図3f）。このように、デコーディングセンターの3角形は破壊され、非フレームシフト構造（図3c）よりもコドン-アンチコドンヘリックスを弱く支持している。したがって、構造I-FSから、コドン-アンチコドンヘリックスは通常の0-フレームにあるが（図3eおよび補足図7a）、cmo5U34-C3ウォブルペアは30Sダイナミクス平衡を開いた30Sコンフォメーションにシフトさせることが明らかになった。

図3：fMet-tRNAfMet（P部位）とPro-tRNAPro（A部位）で形成された転移前70Sの低温電子顕微鏡構造。
図3
a 非フレームシフトmRNA（CCA-A; 構造I）を用いた70S構造の全体像。AおよびP部位よりもE部位の密度が低いことから、E-tRNAの部分的占有が示唆される（「方法」）。 b 構造IのA部位における非フレームシフトmRNAとtRNAProのコドン-アンチコドン相互作用の低温電子顕微鏡密度（グレーのメッシュ）。c デコーディングセンターヌクレオチドG530（ショルダー領域）とA1492-A1493（ボディ領域）は構造Iのコドン-アンチコドンヘリックスを安定化する。AおよびP部位よりもE部位の密度が弱いことから、E-tRNAの部分的な占有が示唆される（「方法」参照）。 e 構造I-FSにおける、滑りやすいmRNAコドンとtRNAProの間のコドン-アンチコドン相互作用の低温電子顕微鏡密度（グレーのメッシュ）。f 構造I-FSにおけるG530（ショルダー領域）のシフトによる30Sサブユニットの部分的なオープンコンフォメーション。構造アラインメントは16SリボソームRNA（rRNA）の重ね合わせによって得られた。すべてのパネルで、50Sサブユニットをシアン色、30Sサブユニットを黄色、mRNAを青色、tRNAProを緑色、tRNAfMetをオレンジ色、サブストイキオメトリックEサイトtRNAをマゼンタ色で示す。

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ペプチジル転移の際、30Sサブユニットは、tRNAがラージサブユニット上のアクセプターアームを移動させることによってハイブリッド状態を形成し、自発的に回転する1,2,42。ペプチジルtRNAはA/PまたはエルボーシフトしたA/Pコンフォーメーションをとり、脱アシルtRNAはP/E状態を形成する41。EF-Gなしで形成されたフレームシフト複合体の低温電子顕微鏡解析（補足図3）により、30Sサブユニット本体が〜11°回転し、30S頭部が〜4°わずかに旋回した構造Irot-FSが得られた。ジペプチジルtRNAはエルボーシフトしたA/Pコンフォーメーションをとり、脱アシルtRNAはP/Eコンフォーメーションをとる（補足図7bと8）。構造Irot-FSは、コドン-アンチコドンヘリックスが0-フレームにあり、30Sサブユニットが開いたコンフォメーション（補足図8b）をとっていることを明らかにしており、回転していない構造I-FS（補足図8c）と類似している。構造I-FSとIrot-FSを合わせると、A部位の滑りやすい配列上でデコードとペプチジル転移を行っても、フレームシフトは起こらないことを示している。

EF-Gが結合した構造II-FSとIII-FSではmRNAのフレームがシフトしている。
EF-G-GTPはトランスロケーション前のリボソームの回転したコンフォメーションに結合する2,3,43,44。EF-Gの存在下で30Sサブユニットが自発的に逆回転すると、30Sサブユニット内でtRNA ASLとmRNAコドンが同期して転位し、回転が完了するとP/PとE/Eの状態になる45。これまでの70S-2tRNA-EF-G複合体の構造では、30Sが10度から0度の範囲で回転した状態が捉えられており43,46,47,48、転座の初期（回転した状態）と後期（回転していない状態）が明らかにされている。その結果、EF-GのドメインIVは転座したペプチジルtRNAの隣に結合し、サブユニットの逆回転時に30SサブユニットのA部位に戻るのを立体的に妨げていることがわかった2,49,50。

我々の低温電子顕微鏡構造から、EF-G-GDPCPの2つの優勢な転位状態が明らかになった：部分的に回転した状態（～5°）と、ほぼ回転していない状態（～1°；回転していない転位前構造Iに対して）（図4と5）。非フレームシフト構造IIとIIIは、抗生物質によって形成される、これまでに報告されたトランスロケーション中期構造47,48（図4a-c）とトランスロケーション後構造46（図5a,b）に酷似している。部分的に回転した状態では、30Sサブユニットの頭部は〜16°旋回し、30Sのくちばしは50Sサブユニットに近づいている（図4a）。頭部の旋回が、小サブユニットのtRNAのASLとmRNAのトランスロケーションと連動し、最初に30S本体、次に30S頭部に対して徐々にトランスロケーションできる51。頭部が旋回した構造IIでは、ジペプチジルfMP-tRNAProは30SサブユニットのA部位とP部位の間にある（図4b）。ここでは、アンチコドンはボディドメインのP部位から4Åしか離れていないが（cmo5U34で測定）、転座方向へのヘッドの動きにより、ヘッドドメインのA部位付近にとどまっている。アクセプターアームは50SサブユニットのP部位にある。したがって、このtRNAのコンフォメーションは、以前に報告されたキメラap/Pコンフォメーション47（アンチコドンが30S頭部のA部位と30S本体のP部位近傍にある（ap）、アクセプターアームが50SサブユニットのP部位にある（P））と類似している。

図4：EF-G-GDPCPで形成されたミッドトランスロケーション状態の低温電子顕微鏡構造。
図4
b P部位近傍の非フレームシフトtRNAProとmRNAコドンの低温電子顕微鏡密度（グレーメッシュ）。c EF-GループI（Ser509-Gly511、赤）とコドン-アンチコドンヘリックスとの相互作用（空間充填表面と漫画表現）。 d フレームシフトするmRNAを含むミッドトランスロケーション構造II-FSの全体像。マップは-80Å2のBファクターを適用して鮮鋭化し、2.5σで示す。f EF-GドメインIVループI（Ser509-Gly511）とフレームシフトmRNAのコドン-アンチコドンヘリックスとの相互作用（cと比較）。g フレームシフト構造 II-FS における tRNAPro（緑）と tRNAfMet（橙）の位置の、非フレームシフト構造 II（灰色）に対する相対的な違い。 h フレームシフト構造 II-FS における tRNAPro（緑）の位置の、構造 II（灰色）に対する相対的なシフトに対応するための、EF-G のドメイン IV のループ II（赤）の調整。構造アラインメントは16S rRNAの重ね合わせによって行った。 i 構造II-FSの膨らんだC1の低温電子顕微鏡密度のクローズアップ図（eにも示す）。リボソームサブユニット、tRNA、mRNAは図3と同様に色分けされており、EF-Gは赤で示されている。

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図5: EF-G-GDPCPで形成された翻訳後近傍状態の低温電子顕微鏡構造。
図5
a 非フレームシフトmRNAを持つ翻訳後近傍構造IIIの全体像。 b P部位の非フレームシフトtRNAProとmRNAコドンの低温電子顕微鏡密度（グレーメッシュ）。マップは-80Å2のBファクターを適用して鮮鋭化し、2.5σで示した。 c フレームシフトしたmRNAを持つ翻訳後構造III-FS近傍の全体像。 d P部位のフレームシフトしたtRNAProとmRNAコドンの低温電子顕微鏡密度（グレーメッシュ）。eほぼトランスロケーションされたフレームシフト複合体（着色、III-FS）と非フレームシフト複合体（灰色、III）におけるmRNAとtRNAの位置の比較。 f構造III-FSとIII（灰色）におけるEF-GのループII（赤）とtRNAPro（緑）の位置。構造アラインメントは16S rRNAの重ね合わせによって行った。配色は図4と同じ。

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ほぼ回転していない構造IIIは、P部位に小さな頭部旋回（~1°）とジペプチジルtRNAを持ち（図5a, b）、回転していない転移後リボソーム46に似ている。ジペプチジルtRNAAProと脱アシル化tRNAfMetは、それぞれP部位とE部位でそれぞれのmRNAコドンと塩基対になっている。構造IIとIIIの両方において、EF-GのドメインIVはジペプチジルtRNAのASLと同族CCAコドンと相互作用しており（図4b, cと5b）、コドン-アンチコドンヘリックスを安定化するEF-Gの役割と一致している。触媒的に不活性なEF-GまたはGTP模倣体48,52,53,54を用いた以前のEF-G結合構造と同様に、EF-GドメインIのスイッチループは構造IIとIIIでよく分解されており、GDPCPによるGTPaseの安定化と一致している（補足図9）。

対照的に、EF-G-GDPCPはフレームシフトしやすいCCC-A mRNAモチーフ上でフレームシフトを仲介する。中間に位置する構造II-FSでは、ジペプチジル-tRNAPro（補足図7c）は、30SサブユニットのA部位とP部位の間の+1-フレーム（C2CA4）のmRNAと対になっている（図4d-f）。ここでは、tRNAProのcmo5U34がmRNAのA4と塩基対になっていることが、明瞭に解像された密度によって示されている（図4e）。隣接する脱アシル化tRNAfMetは、Eサイト近くのAUGコドンに結合している。したがって、+1FSの結果、E部位とP部位の間に膨らんだmRNAヌクレオチドC1が生じる（図4e, g, i）。C1はAUGコドンのグアノシンと16S rRNAのG926に挟まれている。この安定化によってmRNAが圧縮され、通常3ヌクレオチドを収容するE部位に4ヌクレオチドを収容することができる。フレームシフトにより、tRNAfMetとtRNAProは互いに離れている。それぞれ、非フレームシフト構造IIの位置から4Åと3Å移動している（図4g）。tRNAProのシフトは、高速トランスロケーションに重要なEF-GループII（His584-Asp587）のシフトによって補われている55,56。一方、ループI（Ser509-Gly511）を含むEF-GドメインIVの残りの部分は、非フレームシフト複合体と同様の位置にある（図4h）。

以前の結晶学的研究から、16S rRNAのヌクレオチドC1397とA1503は、それぞれA部位とE部位を挟んでおり、転移するmRNAの塩基と相互作用することでmRNAのスリップを防いでいることが示唆されている48,57。これら2つのヌクレオチドは、「ストッパー」C1397とA1503に隣接するヌクレオチドが形成する保存された1399-1504のワトソン-クリック塩基対を含む、多くの相互作用によって安定化されている30S頭部の中央領域の一部である。我々の構造から、C1397とA1503を含むこの頭部領域の位置とコンフォメーションは、フレームシフトしていない構造IIとフレームシフトした構造II-FSの間でほぼ同じであることが示された（補足図9）。したがって、コンパクトでフレームシフトしたmRNAは、転座の際、頭部ヌクレオチドのコンフォメーションを乱すことなくリボソームmRNAトンネルに収容することができる。

ほぼ転座した非回転構造III-FS（図5c）では、+1フレームCCAコドンとジペプチジル-tRNAProはPサイトにあり、C1と脱アシル化tRNAfMetを持つAUGコドンはEサイトにある（図5d）。C1をEサイトに収容するために、EサイトのAUGコドンとtRNAfMetは最大3Åシフトしている（図5e）。tRNAfMetの大部分はよく分解されているが、ASLの密度が低いことから、Eサイトコドン-アンチコドン相互作用が不安定化していることがわかる。弱いC1密度は、C1がG926から切り離され、代わりにPサイトコドンの最初のヌクレオチドのリン酸基と水素結合していることを示唆している（図5d, e）。PサイトコドンとtRNAProは、非フレームシフト構造IIIとほぼ同じ位置にある（図5f）。このように、フレームシフトしたmRNAとペプチジルtRNAは、転座軌跡の終点で正規のPサイト位置に配置され、mRNAの新しい+1フレーム上でリボソームが次の伸長サイクルに備える。

1フレームシフトの構造的メカニズム
これは、最近の生物物理学的研究18や、EF-G触媒による転移の際にフレームシフトが起こることを示唆する他の研究と一致している。ネイティブな大腸菌tRNAPro(UGG)を用い、EF-Gと結合した構造を可視化したことは、アンチコドンループを拡大した+1FSサプレッサーtRNA26,31,32,33や、単一のtRNAを用いたフレームシフト様複合体を用いたこれまでの構造研究58,59とは異なる。転座に必要な2つのtRNAを持つ完全な+1-FS-prone伸長複合体を得るために、フレームシフティングmRNA配列C1CC-A4とtRNAPro(UGG)17をA部位に配置した。したがって、フレームシフティングリボソーム複合体は、C1CC-A4配列にtRNAProが結合すると、ウォブルcmo5U34-C3ペアを含む（構造I-FS）。下流のA4はtRNAPro(UGG)のcmo5U34にとってより好ましい塩基対パートナーであったろうが、デコーディングとペプチジル転移の際にフレームシフトは起こらない（構造I-FSとIrot-FS）。このように、+1FSが起こりやすい転移前複合体は、正規の伸長複合体40や+1FSサプレッサーtRNAの結晶構造31,32,33に見られるような0フレームのアンチコドン-コドン対を維持している。しかし、cmo5U34-A3塩基対を含む0-フレーム複合体（構造I、図6a）や、サプレッサーtRNAを持つこれまでの複合体31,32,33とは異なり、構造I-FSは30Sサブユニットが開いており、一過性の解読中間体38に似ている。ここで、16S rRNAのG530は、コドン-アンチコドンヘリックス37の2番目の塩基対に近い正規の位置からシフトしており、そのため、おそらく効率的なアコモデーションとペプチジル転移の際に、cmo5U34-C3ペアを含む不安定な3塩基対のコドン-アンチコドンヘリックスを不安定にする18。したがって、トランスロケーション前のリボソームは、tRNAProが0-フレームのコグネイトコドンCCCから+1-フレームのコグネイトコドンCCAへスライディングするように、あらかじめ準備しているように見える（図6b）。しかし、A部位のスペースが限られているため、コドン-アンチコドンの動態が制限され、この翻訳前の状態でのスライディングが妨げられている。

図6：+1フレームシフトのメカニズム。
図6
a EF-Gによる正規のリボソーム転座とリボソーム再配置の模式図。 b EF-Gによるリボソーム転座が+1フレームシフトをもたらす模式図。a,bの2行目は、mRNA-tRNAの局所的再配置と、30Sサブユニットの解読中心ヌクレオチドG530とPサイトヌクレオチドG926の位置を示す。配色は図4と同じ。

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プレトランスロケーション複合体とは対照的に、EF-Gを持つミッドトランスロケーション複合体、および高度に旋回した30S頭部は、本体のPサイトおよび頭部のAサイト近傍に+1フレームC2CA4コドンと対になったtRNAPro塩基を持つ（構造II-FS）。このことは、tRNAProとmRNAがデコーディングセンターから移動するときにリボソームが+1-フレームに切り替わり、フレームシフトはEF-G触媒転座の中間体によって達成されることを示唆している。この複合体は、tRNAProがボディとヘッドの両方に対してP部位にあるとき、ヘッドの逆旋回によって転座が完了するまでフレームシフトしたままである（構造III-FS）。したがって、我々の研究は、EF-G触媒による転座の間に30Sサブユニットを開き、フレームシフトを促進することによって、転座前複合体の非正規ペアリングがフレームシフトの舞台を整えるという構造メカニズム（図6b）を示唆している。

翻訳前複合体およびEF-G結合フレームシフト構造の不安定化という我々の観察は、in vitro17および細胞内で示された、ミスマッチCCC-Aフレームシフトコドンモチーフに対する+1FSの高い効率と一致している（図1c）。しかしながら、図1dに示したように、tRNAPro(GGG)22によって解読されたCCC-C配列など、0-フレームと+1-フレームに完全に相補的なコドン-アンチコドン相互作用を含むフレームシフト配列も存在する。これらの場合、翻訳前複合体は、コドン-アンチコドンヘリックスがデコーディングセンターによって安定化された（構造Iのように）、正規の閉じた30Sコンフォメーションをとっている可能性が高い。このようなフレーム安定化は、少なくとも部分的には、このような配列におけるフレームシフトの効率の低さを説明しなければならない17（図1d）。とはいえ、このような配列で+1FSが起こる頻度が低いということは、30Sサブユニット、tRNA、mRNAが再配列するトランスロケーションの間に、tRNA-mRNA相互作用が確率的に不安定化する可能性があることを示している。実際、EF-Gなしで得られた最近の70S構造は、30Sの頭部旋回時にmRNAフレームが不安定化することを示している。単一のtRNAと旋回した30Sヘッドを特徴とするフレームシフト様複合体では、EサイトコドンとPサイトコドンの間の膨らんだヌクレオチドが、構造II-FSと同様にG92659によって安定化される。さらに、2つのtRNAと旋回した30Sヘッドを持つ非フレームシフト複合体の最近の結晶構造から、PサイトtRNAと0フレームコドンの完全な相補性にもかかわらず、Pサイトにおけるコドン-アンチコドン相互作用の摂動が明らかになった57。tRNAとmRNAの対合は頭部旋回中に不安定になるが、EF-GはtRNAアンチコドンとmRNAコドンの両方と転座軌跡に沿って相互作用することで、非フレームシフト複合体では読み枠を維持する（構造IIとIII）。これとは対照的に、フレームシフトしやすい複合体では、EF-Gは30Sサブユニットとともにトランスロケーションする際に一時的に不安定化するコドン-アンチコドン相互作用（本研究のCCC-Aモチーフなど）をサポートできず、tRNAと完全に相補的な+1フレームへのスリップを許してしまう。スリップの際、EF-Gと30S残基はトランスロケーションの最終段階で新しいフレームを安定化させることができる（構造II-FSとIII-FS；図6b）。細胞内のフレームシフトは、EF-G-GDPがリボソームから解離する間、あるいは解離後に、頭部が旋回したコンフォメーションで起こるという別のシナリオも否定できない60。EF-G-GDPCPで平衡化された低温電子顕微鏡サンプルでは、（III-FSのように）完全にトランスロケーションされたリボソームでフレームシフトが始まった可能性があります。どちらのシナリオも、停止した低温電子顕微鏡構造におけるフレームシフトの多さと一致しており、EF-G-GTPを用いた動的なトランスロケーション（図2）中のフレームシフトの少なさとは対照的で、mRNAのフレーム維持におけるEF-Gの適時な会合と解離の重要な役割を強調している。

方法
細胞ベースの+1FSアッセイ
我々が以前に開発したpKK223-3の大腸菌lacZプラスミド22は、IPTG誘導性レポーター遺伝子の開始コドンAUGに続くCCX-Xモチーフを含むようにQuikChange変異導入によって改変された。CCAまたはCCCのインフレーム挿入を含むコントロールプラスミドも並行して作製した。lacZプラスミドに滑りやすいモチーフまたは滑りにくいモチーフを挿入するための変異誘発に用いたプライマーは、補足表1に示した。レポーターから測定したβ-gal活性を、対応するCCAまたはCCCコントロールプラスミドの活性で正規化し、レポーターの+1FS頻度を計算した。m1G37が+1FSの頻度に及ぼす影響を調べるため、各レポーターと対応するコントロールプラスミドを、染色体からtrmDを除去し、pACYCプラスミドからヒト対応物であるtrm5をアラビノース（Ara）制御で発現させることで細胞生存を維持した大腸菌trmD-KO/JM109株で発現させた。この大腸菌trmD-KO/JM109株は、先に記述した大腸菌trmD-KO/MG165522のP1溶解液をJM109に形質導入することにより作製した。tRNAPro(GGG)アイソアクセプターの+1FSへの寄与を決定するために、大腸菌trmD-KO/JM109のproL欠失変異体を作製し、proM tRNAPro(UGG)アイソアクセプターのみがレポーターのCCA-AまたはCCC-Aコドンモチーフの解読に活性を持つようにした。この大腸菌trmD-KO/MG1655のproL欠失変異体は、先に記載した大腸菌proL-KO株18のP1溶解物を用いて染色体上のproLをKanマーカーで置換し、その後pCP20でKanマーカーを除去することにより作製した。

1FSの頻度を測定するために、trm5で維持された大腸菌trmD-KO/JM109株をlacZレポータープラスミドで形質転換した。各菌株のシングルコロニーを、0.2%Ara存在下のLuria-Bertani（LB）培地で37℃で一晩増殖させた後、0.2%Araありまたはなしの新鮮なLBに1:100で接種し、それぞれm1G37+条件またはm1G37条件を作製した。m1G37-条件では、Trm5が枯渇し、m1G37レベルが低下する37℃で1時間増殖した後、0.4 mM IPTGを加えてlacZ遺伝子をオンにし、細胞を37℃でさらに4時間増殖させた。細胞を回収し、β-gal活性をMiller Unit22として測定した。1FS効率（％）は、対応するインフレーム参照構築物のβ-gal活性に対するレポーター構築物のβ-gal活性を決定することによって計算した。CCA-AにはCCAを、CCC-AおよびCCC-CにはCCCを参照に用いた。

1FSの生化学的アッセイ
生化学的研究に用いた 2 種類の mRNA は、開始コドンの後に試験配列 CCX-X を配置するように T7 RNA ポリメラーゼを用いた in vitro 転写によって調製した。滑りにくいmRNA［5′-GGG AAG GAG GUA AAA AUG CCA AGU UAU AAG CAC CAC CAC CAC CAC］は、AUG開始コドンの後に滑りにくいCCA-Aコドンモチーフを含み、一方、滑りやすいmRNAは、それ以外は同一の配列コンテキストで滑りやすいCCC-Aモチーフを含んでいた。ネイティブの大腸菌tRNAPro(UGG)は、アフィニティー精製によってproMを過剰発現している細胞から単離された18。tRNAPro(UGG)の転写産物はT7転写によって生成され、最初は自己切断型5′-リボザイムを持つ前駆体として生成され、これが処理されて成熟型が放出され、ゲル精製された。他の tRNA については、ネイティブ tRNAVal(*UAC, *U = cmo5U)と tRNAfMet(CAU)は大腸菌で過剰発現させ、全 tRNA プールから単離したが、tRNASer(GCU)は in vitro 転写で作製した。各エロンゲーターtRNAは、その同族アミノアシルtRNA合成酵素によって荷電され、続いてフェノール抽出、エタノール沈殿、25 mM NaOAc, pH 5.0中-70℃で保存された。充電の程度は、反応物をトリチウム化アミノ酸でドープし、ゲルろ過スピンカラムで遠心分離した後、トリチウム化アミノ酸のtRNAへの取り込みを測定することでモニターした。イニシエーターtRNAfMetのチャージングは35S-メチオニン存在下で行った。ホルミル化は、ホルミルトランスフェラーゼとホルミル供与体10-ホルミルテトラヒドロ葉酸61を含むことにより、チャージングと同時に行われた。密結合70SリボソームとHisタグ付き翻訳因子を大腸菌MRE600細胞から単離し、-70℃で保存した。

大腸菌70SICは、70Sリボソームを、AUG開始コドンの隣のCCC-AまたはCCA-A、35S-fMet-tRNAfMet、開始因子IF1、IF2、IF3、およびEF-Gを含むmRNAと、HF3.5緩衝液（3.5 mM MgCl2、0. 5mMスペルミジン、1mMジチオスレイトール、30mM KCl、70mM NH4Cl、50mM Tris-HCl、pH7.5）、または0.5mM GTPを補充したcryo-EM3.5バッファー（3.5mM MgCl2、0.05mMスペルミン、2mMスペルミジン、6mM 2-メルカプトエタノール、120mM NH4Cl、20mM HEPES-KOH、pH7.5）。TCは、まずEF-Tuを0.5mM GTPを添加したHF3.5またはcryo-EM3.5バッファー中で37℃で15分間インキュベートし、次いでネイティブまたは転写産物Pro-tRNAPro(UGG)、転写産物Ser-tRNASer(GCU)、およびネイティブVal-tRNAVal(*UAC)を氷浴中で15分間添加することにより形成した。等容量のTCと70SICを混合する前に、それぞれのMgCl2濃度を3.5mMに保つ、または指示通り7-20mMに上方調整した。反応は20℃または37℃で行い、最終濃度0.4μMリボソーム、0.25μM 35S-fMet-tRNAiMet、0.5μM mRNA（CCC-AまたはCCA-A）、0. 5 µM IFs I、II、III、3 µM EF-Tu、0.5 µM tRNAPro(UGG)、0.75 µM Ser-および Val-tRNA、2 µM EF-G、0.5 mM GTP を HF または cryo-EM バッファーに溶解し、3.5、7.0、10、13.5、17、20 mM MgCl2 を添加した。反応アリコートを0.5 M KOHでクエンチし、37℃で30分間保持した後、それぞれ0.8 µLを20 cmのセルロース薄層クロマトグラフィー（TLC）シートにロードした。サンプルをシートの陽極端から15 cmの原点にロードすると、PYRACバッファー中、800 Vで2¼時間電気泳動すると、fMP、fMPV、fMPSペプチドが分解された。乾燥したTLCシートは蛍光イメージングで可視化し、スポットはImageJ62を用いて定量した。

低温電子顕微鏡用EF-Gおよびリボソームサブユニットの調製
pET24a+プラスミド（Novagen社製、カナマイシン耐性ベクター）中の全長大腸菌EF-G（704 aa、C末端His6タグ）をコードする遺伝子を大腸菌BLR/DE3株に形質転換した。プラスミドを導入した細胞は、50 µg mL-1カナマイシンを添加したLB培地でOD600が0.7-0.8になるまで37℃で培養した。EF-G の発現は、1 mM IPTG（Gold Biotechnology Inc. 細胞を回収、洗浄し、緩衝液A（50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 5% グリセロール、10 mM イミダゾール、6 mM β-メルカプトエタノール（βME）、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（complete Mini, EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤タブレット、Sigma-Aldrich, USA）に再懸濁した。マイクロフルイダイザー（Microfluidics、米国）で細胞を破砕し、36,000×g（JA-20ローター、18,000rpm）で50分間遠心して可溶性画分を回収し、孔径0.22μmの滅菌フィルター（CELLTREAT Scientific Products、米国）で濾過した。

EF-Gは3段階で精製した。各ステップ後のタンパク質の純度は、Coomassie Brilliant Blue R 250（Sigma-Aldrich）で染色した12% SDS-PAGEで確認した。まず、Ni-NTAカラム（Nickel-nitrilotriacetic acid, 5 ml HisTrap, GE Healthcare）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを、FPLC（Äkta explorer, GE Healthcare）を用いて行った。細胞溶解液の可溶性画分をバッファーAで平衡化したカラムにロードし、同じバッファーで洗浄した。EF-GはバッファーB（バッファーAに0.25Mイミダゾールを加えたもの）のリニアグラジエントで溶出した。EF-Gを含む画分をプールし、緩衝液C（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、6 mM βME、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル）に対して透析した。その後、タンパク質をHiPrep FF Q-カラム（20 mL、GEヘルスケア；FPLC）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで精製した。カラムを緩衝液Cで平衡化し洗浄した後、タンパク質を緩衝液Cにロードし、緩衝液Dの直線勾配で溶出した（緩衝液Cに0.7 M KClを添加）。最後に、タンパク質を50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、6 mM βMEに対して透析し、サイズ排除クロマトグラフィー（Hiload 16/600 Superdex 200 pgカラム、GE Healthcare）を用いて精製した。タンパク質の画分をプールし、緩衝液交換（25 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NH4Cl、10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、6 mM βME、5%グリセロール）し、10 kDaカットオフ膜（ミリポア社製）を用いた限外ろ過装置で濃縮した。濃縮タンパク質は液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。

70Sリボソームは大腸菌（MRE600）63から調製し、リボソーム保存バッファー（20 mM Tris-HCl（pH 7.0）、100 mM NH4Cl、12.5 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、6 mM βME）中で-80℃で保存した。リボソーム解離バッファー（20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 500 mM NH4Cl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 6 mM βME）中でスクロース勾配（10-35%）を用いてリボソーム30Sサブユニットと50Sサブユニットを精製した。30Sサブユニットと50Sサブユニットを含む画分を別々に集め、濃縮し、リボソーム保存バッファーで-80℃に保存した。

荷電tRNA、および低温電子顕微鏡用mRNA配列の調製
大腸菌tRNAfMetはChemical Block社から購入した。Native E. coli tRNAPro(UGG) (proM tRNA)は、pKK223-3に搭載されたIPTG誘導可能なproM遺伝子から大腸菌で過剰発現させた。全 tRNA を示差遠心分離で単離し、proM tRNA をストレプトアビジン-セファロースに結合した相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて単離した結果、1 リットルの培養液から約 40 nmoles の proM tRNA が得られた。大腸菌 tRNAPro (UGG) (10 µM)を、40 µM L-プロリン、2 µM prolyl-tRNA synthetase (ProRS)、0.625 mM ATP、15 µM 伸長因子 EF-Tu (最近の研究38で精製)の存在下、チャージバッファー (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT)中でアミノアシル化した。混合物を37℃で10分間インキュベートした。荷電したPro-tRNAProを安定化させ、伸長反応のための三元複合体を形成させるために、0.25 mMのGTPを混合物に加えた。混合物を37℃で3分間インキュベートした。

Shine-Dalgarno配列とAUGコドンをP部位に配置するためのリンカーを含むmRNAをIDTにより合成した。フレームシフトmRNAは配列5′-GGC AAG GAG GUA AAA AUG CCC AGU UCU AAA AAA AAAを含み、非フレームシフトmRNAは配列5′-GGC AAG GAG GUA AAA AUG CCA AGU UCU AAA AAA AAAを含む。

EF-G-GDPCPを含む、または含まない70S転位複合体の調製
70S-mRNA-fMet-tRNAfMet-Pro-tRNAPro(UGG)-EF-G-GDPCP複合体を、滑りやすいmRNAと滑りにくいmRNAに分けて以下のように調製した。それぞれ、0.33μMの30Sサブユニット（最終溶液の濃度はすべて指定）を、リボソーム再構成バッファー（20mM HEPES-KOH pH7.5、120mM NH4Cl、20mM MgCl2、2mM スペルミジン、0.05mM スペルミン、6mM βME）中、42℃で5分間予備活性化した。これらの活性化された30Sサブユニットに、0.33μMの50Sサブユニットと1.33μMのmRNAを加え、37℃で10分間インキュベートした。その後、0.33 µM fMet-tRNAfMet を加え、37 ℃で 3 分間インキュベートし、P サイト tRNA と 70S 複合体を形成させた。

Pro-tRNAPro（UGG）（0.33μM）、EF-Tu（0.5μM）、GTP（8.3μM）を溶液に加え、37℃で10分間インキュベートし、Aサイト結合70S複合体を形成させた。次に、EF-G（5.3 µM）とGDPCP（0.66 mM）を加え、37℃で5分間インキュベートした後、室温まで冷却し、EF-G-GDPCPとの70Sトランスロケーション複合体を形成させた。

EF-GとGDPCPの添加を除いた上記と同様の滑沢なmRNAを用いて、Structure Irot-FSが得られるプレトランスロケーション70S-mRNA-fMet-tRNAfMet-Pro-tRNAPro(UGG)複合体を調製した。

低温電子顕微鏡と画像処理
2nmのカーボン層を有するQUANTIFOIL R 2/1グリッド（Cu 200、Quantifoil Micro Tools）を、PELCO社製easiGlowグロー放電ユニットで、負極性で25mA、60秒間グロー放電した（EF-G-GDPCPを含まない回転前複合体では15mA）。各複合体（2.5μL）を別々にグリッドに塗布した。グリッドをブロッティング力9で5℃、湿度95%で4秒間ブロッティングし、Vitrobot MK4（FEI）を用いて液体エタンに突っ込んだ。グリッドは液体窒素で保存した。

クライオ電子顕微鏡データは、University of Massachusetts Medical School (Worcester, MA, USA)のクライオ電子顕微鏡センターで収集した。非フレームシフト70S-mRNA(CCA-A)-fMet-tRNAfMet-Pro-tRNAPro(UGG)-EF-G-GDPCP転座複合体については、62,716個の粒子を含むデータセットを以下のように収集した。K2 Summitカメラシステム（Gatan社製）を装備したTitan Krios（FEI社製）顕微鏡（300kVで作動）を用いて、-0.8～-2.0μmのデフォーカスで合計1041個の動画を収集した。マルチショットデータ収集は、ビームイメージシフト64を備えたSerialEMを使用して、1ホールにつき4回の露光を記録することにより行った。各露光は36フレーム/7.2秒の連続フレームストリーミングで取得され、総線量は47.5e-/Å2となった。カメラでの線量率は7.39e-/upix/sであった。公称倍率は130,000で、較正された超解像ピクセルサイズは試料レベルで0.525Åでした。動画は動き補正され、IMOD65の対応するゲイン基準で乗算した後、各動画内のすべての36フレームを使用してフレーム平均が計算されました。IMODでモーション補正を行う際、ムービーはピクセルサイズ1.05Åにビニングされました（アンビニングまたは1×ビニングと呼ばれます）。cisTEM66は、得られた各フレーム平均のデフォーカス値を決定し、粒子ピッキングに使用されました。すべてのムービーは、cisTEM内のCTFFIND4によって計算された平均値とパワースペクトルを検査した後、さらなる解析に使用されました。スタックと粒子のパラメータファイルは、cisTEMで1×、2×、4×のビニングで組み立てた（ビニングなしのスタックのボックスサイズは400）。データの分類を補足図1にまとめた。FREALIGNXは粒子アライメント、精密化、最終再構成ステップのすべてのステップに使用され、FREALIGN v9.11は3D分類ステップに使用された67。分類のためのFREALIGNXからFREALIGNへのパラメータファイルの変換は、位相シフト情報を含む列12を削除し（位相板が使用されなかったので該当しない）、絶対倍率値を追加することによって実行された。精密化のためのFREALIGNからFREALIGNXへの逆変換は、FREALIGNXによって自動的に行われた。4×ビン化した画像スタック（62,716粒子）を、平均スコアが収束するまで、300～30Åの分解能範囲のデータを含むモード3（グローバル検索）アライメントを5サイクル使用して、最初にリボソーム参照（PDB 5U9F）68にアライメントした。続いて、4×ビン化スタックを前のステップで得られた共通参照に対して、モード1（refine）を用いて分解能300～18Åの範囲でアライメントした（モード1を3サイクル）。次のステップでは、4x-ビン化スタックを2x-ビン化画像スタックに置き換え、モード1（refine）を使用して、8Åまで徐々に増加する分解能限界（各分解能限界につき5サイクル；18-12-10-8Å）を含む共通参照に対して連続的に位置合わせを行いました。この分類により、6つの高分解能クラス、1つの低分解能（ジャンク）クラス、および50Sサブユニットのみを表すクラスが明らかになった（補足図1a）。高分解能70Sクラスに割り当てられた粒子は、merge_classes.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）を使用して、2×ビン化スタックから抽出され（占有率50%以上、スコア0以上）、41,382粒子を含むスタックが得られた。このスタックの分類は、A部位とP部位の間に焦点を合わせた球形マスク（マスク中心座標：x = 191.1 Å、y = 224.7 Å、z = 159.6Å、半径30Å、FREALIGNに実装されている）を用いて50サイクル実行されました。この8つのクラスへのサブ分類により、tRNAとEF-Gの両方を含む2つの高分解能クラス（構造IIとIII）と、3つのtRNAを含む1つの高分解能クラス（構造I）が得られました。目的のクラス（構造I, 4263粒子; 構造II, 3179粒子; 構造III, 4612粒子）については、占有率が50%以上でスコアが0以上の粒子を2×ビン化スタックから抽出しました。それぞれの1×-binnedスタックのモード1（5サイクル）を用いて、最高スコアを持つ粒子の95％を用いて6Å分解能に精密化した結果、〜3.4Å（構造I）、〜3.5Å（構造II）、〜3.4Å（構造III）のマップが得られた（Fourier shell correlation (FSC) = 0.143）。

フレームシフト70S-mRNA(CCC-A)-fMet-tRNAfMet-Pro-tRNAPro(UGG)-EF-G-GDPCP転座複合体については、164,504個の粒子を含む2591個の動画のデータセットを収集し、非フレームシフト複合体の場合と同様に処理した。すべての動画は、cisTEM内のCTFFIND4によって計算された平均値とパワースペクトルを検査した後、さらなる解析に使用した。スタックと粒子のパラメータファイルは、cisTEMで1×、2×、4×のビニングで組み立てた（ビニングなしのスタックのボックスサイズは400）。データの分類を補足図2にまとめた。FREALIGNXは粒子アライメント、精密化、最終再構成ステップのすべてのステップに使用され、FREALIGN v9.11は3D分類ステップに使用された67。4xビン化した画像スタック（164,504粒子）を、平均スコアが収束するまで、300から30Åの解像度の範囲のデータを含むモード3（グローバルサーチ）アライメントを5サイクル使用して、最初にリボソーム参照（PDB 5U9F）にアライメントした。続いて、4×ビン化したスタックを、前のステップで得られた共通参照に対して、モード1（refine）を用いて、分解能300～18Åの範囲でアライメントした（モード1を3サイクル）。次のステップでは、4×-ビン化スタックを2×-ビン化画像スタックに置き換え、モード1（refine）を使用して、8Åまで徐々に増加する分解能限界（各分解能限界につき5サイクル；18-12-10-8Å）を含む共通参照に対して連続的に位置合わせを行いました。この分類により、11の高分解能クラス、3つの低分解能（ジャンク）クラス、および50Sサブユニットのみを表す2つのクラスが明らかになった（補足図2a）。高分解能70Sクラスに割り当てられた粒子は、merge_classes.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）を使用して、2×-ビン化スタックから抽出され（占有率50%以上、スコア0以上）、109,094粒子を含むスタックが得られた。このスタックの分類は、A部位とP部位の間に焦点を合わせた球形マスク（マスク中心座標：x = 189.5 Å、y = 225.0 Å、z = 158.3Å、半径30Å、FREALIGNに実装されている）を用いて50サイクル行った。この8つのクラスへのサブ分類により、tRNAとEF-Gの両方を含む1つの高分解能クラスと、3つのtRNAを含む1つの高分解能クラスが得られた（構造I-FS）。EF-G結合転座状態に対応するマップは、2つの状態（高度に旋回した頭部コンフォーメーションとあまり旋回しない頭部コンフォーメーション）の混合に対応する不均一な30S特徴を有していた。tRNAとEF-Gの両方を持つ高分解能クラスに割り当てられた粒子は、merge_classes.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）を使用して、2×-binnedスタックから抽出され（占有率が50％以上、スコアが0以上）、15,088個の粒子を含むスタックが得られた。このスタックの分類を、30Sサブユニットの頭部を中心にデザインした3Dマスクを用いて50サイクル行った。この2つのクラスへのサブ分類により、tRNAとEF-Gの両方を含むが、30S頭部の回転が異なる2つの高分解能クラスが得られた（構造II-FSとIII-FS）。各クラスをさらにサブクラス化しても、さらなる構造は得られなかった。目的のクラス（構造I-FS, 12,108粒子; 構造II-FS, 9,059粒子; 構造III-FS, 6,029粒子）について、占有率が50%以上でスコアが0以上の粒子を2×ビン化スタックから抽出した。それぞれの1x-binnedスタックのモード1（5サイクル）を用いて、最高スコアを持つ粒子の95%を用いて6Å分解能に精密化した結果、〜3.2Å（構造I-FS）、〜3.2Å（構造II-FS）、および〜3.3Å（構造III-FS）のマップが得られた（FSC = 0.143）。

構造Iと構造I-FSの両方において、E-tRNAの密度は弱く、部分的なEサイト占有を示している。これは以前の観察結果41と同様で、分類を追加した結果、Eサイトが空いたマップとtRNAが結合したマップが得られたが、それ以外の違い（他の部位の占有率やリボソームのコンフォメーションなど）は観察されなかった。部分密度を考慮するため、先行研究41に基づいてEサイトtRNAをモデル化した。

EF-Gなしで形成された、回転したトランスロケーション前のフレームシフト70S-mRNA(CCA-A)-fMet-tRNAfMet-Pro-tRNAPro(UGG)複合体について、178,117個の粒子を含む1909個の動画のデータセットを、K3カメラシステム(Gatan)を装備したTitan Krios(FEI)顕微鏡(300kVで作動)で、-0.8～-2.0μmのデフォーカスで収集した。各露光は25フレームの連続フレームストリーミングで取得され、総線量は40.2e-/Å2となった。公称倍率は105,000倍で、試料レベルでの較正超解像ピクセルサイズは0.415Åであった。データセットの収集と処理は、EF-G-GDPCPを用いた非フレームシフトまたはフレームシフト複合体の場合と同様であった。すべての動画は、cisTEM内のCTFFIND4によって計算された平均値とパワースペクトルを検査した後、さらなる解析に使用した。スタックと粒子のパラメータファイルは、cisTEMで1×、2×、4×のビニングで組み立てた（ビニングなしのスタックのボックスサイズは512）。データの分類を補足図3にまとめた。FREALIGNXは粒子アライメント、精密化、最終再構成ステップのすべてのステップに使用され、FREALIGN v9.11は3D分類ステップに使用された67。4xビン化した画像スタック（178,117粒子）を、平均スコアが収束するまで、300から30Åの解像度の範囲のデータを含むモード3（グローバルサーチ）アライメントを5サイクル使用して、最初にリボソーム参照（PDB 5U9F）にアライメントした。続いて、4×ビン化スタックを、前のステップで得られた共通参照に対して、モード1（refine）を用いて、分解能300～18Åの範囲でアライメントした（モード1を3サイクル）。次のステップでは、4x-ビン化スタックを2x-ビン化画像スタックに置き換え、モード1（refine）を使用して、8Åまで徐々に増加する分解能限界（各分解能限界につき5サイクル；18-12-10-8Å）を含む共通参照に対して連続的に整列させた。この分類により、11の高分解能クラス、2つの低分解能（ジャンク）クラス、および50Sサブユニットのみを表す3つのクラスが明らかになった（補足図3a）。高分解能70Sクラスに割り当てられた粒子は、merge_classes.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）を使用して、2×ビン化スタックから抽出され（占有率50%以上、スコア0以上）、118,602粒子を含むスタックが得られた。このスタックの分類は、A部位とP部位の間に焦点を合わせた球形マスク（マスク中心座標：x = 187.0 Å、y = 224.9 Å、z = 176.9Å、半径30Å、FREALIGNに実装されている）を用いて50サイクル実行されました。この8つのクラスへのサブ分類により、1つのtRNAを持つ回転リボソームを含む1つの高分解能クラスが得られた。高分解能クラスに割り当てられた粒子は、merge_classes.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）を使用して、2×-binnedスタックから抽出され（50%以上の占有率とスコア>0）、25,345粒子を含むスタックになりました。このスタックの分類は、リボソームのP部位（マスク中心座標：x = 179.0 Å、y = 225.5 Å、z = 178.1Å、半径40Å）に焦点を合わせた球状マスクを用いて50サイクル行った。この5つのクラスへのサブ分類により、回転状態のtRNAとリボソームの両方を含む1つの高分解能クラスが得られた（Structure Irot-FS）。目的のクラス（Structure Irot-FS、3,658粒子）については、2×ビン化スタックから占有率50%以上、スコア0以上の粒子を抽出した。それぞれの1×-binnedスタックのモード1（5サイクル）を用いて、最高スコアを持つ粒子の95％を用いて6Å分解能に精密化した結果、〜3.2Å（Structure Irot-FS）マップが得られた（FSC = 0.143）。

マップ（構造I、II、III、I-FS、Irot-FS、II-FS、III-FS）は、Bsoftパッケージ69のblocresとblocfiltによって、構造精密化のためにフィルタリングされた。この目的のために、Bsoftでマップを30Åにローパスフィルタリングした後、EMAN270で2値化し、3ピクセル拡大し、3ピクセルのガウスエッジを適用することにより、各マップに対してマスクを作成した。Blocresはすべてのマップに対して20ピクセルのボックスサイズで実行された。いずれの場合も、解像度の基準はFSCで、カットオフは0.143であった。blocresの出力は、blocfiltを用いて局所解像度に応じたマップのフィルタリングに用いられた（補足図4）。高分解能領域と低分解能領域の最適なバランスを得るために、-50から-120Å2の範囲のBファクター値がblocfiltマップにテストされた。bfactor.exe（FREALIGNディストリビューションの一部）で-80Å2のBファクターでシャープにしたマップをモデル構築と構造精密化に使用した。FSC曲線は、偶数と奇数の粒子ハーフセットについてFREALIGNによって計算されました。

モデル構築と精密化
EF-TuとtRNAを除いた大腸菌70S-fMet-tRNAMet-Phe-tRNAPhe-EF-Tu-GDPCP複合体の低温電子顕微鏡構造（PDB 5UYM）を構造精密化の出発モデルとして用いた。PDB4V7DのEF-G構造を出発モデルとして、PDB4V9Pからホモロジーモデリングによりスイッチ領域を生成した。tRNAPro(UGG)の構造は、リボソーム結合tRNAPro(CGG)(PDB 6ENJ)を用いた相同性モデリング（tRNAPro(UGG)の配列に従って）によって作成した。

タンパク質とリボソームドメインの低温電子顕微鏡マップへの初期フィッティングはChimera71を使い、その後PyMOLを使って手動でモデリングした。ドメイン間のリンカーや低温電子顕微鏡マップではよく定義されていないドメイン部分（例えば、EF-Gのループ）はモデル化しなかった。

すべての構造は、RSRef72の原子電子散乱因子を用いた実空間シミュレーテッドアニーリング精密化により精密化した。リボソームタンパク質の水素結合拘束とRNA分子の塩基対拘束からなる二次構造拘束を採用した。立体化学的拘束の相対的重み付けや実験エネルギー項などの精密化パラメータは、対応するマップと密接に一致する立体化学的に最適なモデルを作成するために最適化された。最終段階では、 phenix.real_space_refine73を使用して構造を精密化し、続いてRSRefで調和拘束を適用してタンパク質のバックボーン形状を保持する精密化を行った。実空間R因子（RSRef精密化）と相関係数（モデルとマップのフィット-Phenix精密化）は、対応するマップへのモデルのオーバーフィットを防ぐために注意深くモニターされた。洗練された構造モデルは、低い実空間R因子と高い相関係数によって示されるように、対応するマップと密接に一致した（補足表2）。最終モデルとマップ間のFSC、およびクロスバリデーションによるハーフマップFSCをPhenix73を用いて計算したところ、構造モデルとマップがよく一致することが示された（補足図4）。得られたモデルは、Supplementary Table 2に示すように、理想的な結合長と角度からの乖離が少ない、高分子骨格の外れ値が少ないなど、良好な立体化学パラメータを持つ。構造の品質はMolProbity74を用いて検証した。

構造の重ね合わせと距離の計算はPyMOLで行った。2つの70S構造間の30S体の回転またはヘッドローテーション（swivel）の程度を計算するために、30S体の23S rRNAまたは16S rRNAをPyMOLでアライメントし、その角度をChimeraで測定した。構造II、III、Irot-FS、II-FS、III-FSのこれらの回転度（30Sボディ/サブユニットの回転と30Sヘッドの回転）は、それぞれ古典的な非回転構造IとI-FSに対する相対値として報告されている。図はPyMOLとChimeraで作成した。

報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。

データの利用可能性
本研究で作成したEM密度マップは、EMD-22669 (Structure I); EMD-22670 (Structure II); EMD-22671 (Structure III); EMD-22672 (Structure I-FS); EMD-23528 (Structure Irot-FS); EMD-22673 (Structure II-FS); EMD-22674 (Structure III-FS)のアクセッションコードでEMDBに登録されている。この研究で作成された原子座標は、アクセッションコード7K50 (構造I); 7K51 (構造II); 7K52 (構造III); 7K53 (構造I-FS); 7LV0 (構造Irot-FS); 7K54 (構造II-FS); 7K55 (構造III-FS)でPDBに登録されている。ソースデータは本論文に添付されている。

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参考文献ダウンロード

謝辞
UMass Medical Schoolの低温電子顕微鏡施設でグリッドスクリーニングとデータ収集を行ってくれたChen XuとKangkang Song、原稿に対する議論とコメントをくれたKorostelev研究室のメンバーに感謝する。本研究は、チェコ科学財団の助成を受けた。GJ20-16013Y（G.D.へ）、NIH助成金R35 GM134931（Y.M.H.へ）およびR35 GM127094（A.A.K.へ）。

著者情報
著者および所属
RNA治療学研究所、生化学・分子薬理学教室、UMass医科大学、ウースター、マサチューセッツ州、USA

ガブリエル・デモ、アンナ・B. Loveland, Christine E. Carbone, Egor Svidritskiy & Andrei A. Korostelev

中央ヨーロッパ技術研究所、マサリク大学、ブルノ、チェコ共和国

ガブリエル・デモ

米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、トーマス・ジェファーソン大学、生化学・分子生物学科

ハワード・B・ギャンパー、増田功、Ya-Ming Hou

貢献
概念化： Y.M.H.およびA.A.K. 方法論： 検証：G.D.、H.B.G.、A.B.L.、I.M.、Y.M.H.、A.A.K： G.D.、H.G.、Y.M.H.、A.A.K. 調査： リソース：G.D.、H.G.、A.B.L.、I.M.、C.E.C.、E.S： Y.M.H.、A.A.K. 執筆-原案： G.D.、Y.M.H.、A.A.K. 執筆-校閲・編集： 視覚化： 監修：G.D.、H.G.： A.A.K. 資金獲得： G.D.、Y.M.H.、A.A.K.

連絡先
Ya-Ming HouまたはAndrei A. Korostelevにご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報
査読情報 Nature Communicationsは、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読報告書はこちら。

出版社注：Springer Natureは、出版された地図における管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
アップデートの確認 CrossMarkで通貨と真正性を確認する
この記事の引用
Demo,G.、Gamper,H.B.、Loveland,A.B.他. EF-G触媒による転座における+1リボソームフレームシフトの構造基盤. Nat Commun 12, 4644 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24911-1

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受領
2020年10月21日

受理
2021年7月12日

発行
2021年7月30日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-021-24911-1

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テーマ
クライオ電子顕微鏡
リボソーム
この論文の引用元
リボソーム自発的フレームシフトの決定因子としての、滑りやすいmRNA上での翻訳中のtRNAダイナミクスの変化
パナギオティス・プーリスアノシ・パテルサラ・アディオ
ネイチャー・コミュニケーションズ (2022)

EF-GとGTPを用いたリボソーム転移の時間分解低温電子顕微鏡による可視化
クリスティン・E・カルボーンAnna B. LovelandAndrei A. Korostelev
ネイチャー・コミュニケーションズ（2021）

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