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母体マイクロバイオームはマウスの胎盤発育を促進する

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk1887

GEOFFREY N. PRONOVOST HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-6421-9739 , KRISTIE B. YU HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-6735-3968, [...], AND ELAINE Y. HSIAO HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-1633-588X +9著者著者情報&所属
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2023年10月6日
第9巻 第40号
DOI: 10.1126/sciadv.adk1887
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要旨
母体のマイクロバイオームは妊娠中の健康状態を制御する重要な因子であるが、それが母親と胎児の接点である胎盤にどのような影響を及ぼすかは未解明のままである。ここでは、母体の腸内細菌叢がマウスの胎盤発育をサポートしていることを示す。母体の腸内細菌叢が減少すると、胎盤の成長が制限され、胎児-胎盤間の脈管形成が損なわれる。母体の腸内細菌叢は、母体と胎児の循環における代謝産物を調節する。短鎖脂肪酸（SCFA）は培養内皮細胞の管形成を刺激し、微生物叢欠損マウスにおける胎盤血管形成の異常を防ぐ。さらに、母体の栄養不良モデルにおいて、妊娠中にSCFAを補充すると、胎盤の成長制限と血管不全が予防される。これらの知見は、妊娠中の宿主-微生物共生の重要性を浮き彫りにし、母体の腸内細菌叢がマウスの胎盤成長と血管形成を促進することを明らかにした。
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はじめに
最近の研究では、出生前の時期に始まる母体マイクロバイオームが子孫の発育に及ぼす顕著な影響が強調されている（1、2）が、妊娠中に母体マイクロバイオームが母体と胎児の健康にどのような影響を及ぼすのかについては、正確にはまだ不明である。母親と胎児の交差点には高度に血管が発達した胎盤があり、胎盤は胎児の発育を維持する栄養素とガスの母体-胎児交換を可能にする役割を担っている（3, 4）。我々は、長期的な健康の軌跡を形成する重要な臓器として、マウスの胎盤の発達に対する母親の腸内細菌叢の影響を調べた。
結果
胎盤の発達に対する母体腸内細菌叢の影響を調べるため、まず妊娠マウスを無菌飼育（GF）または広域抗生物質（ABX）投与により母体腸内細菌叢を枯渇させた状態で飼育した。母体の腸内細菌叢を欠失または枯渇させると、胚発生14.5日目（E14.5）の胎盤重量が、従来の方法でコロニーを形成させた（特異的病原体フリー（SPF））マウスおよび従来の方法でコロニーを形成させたGFコントロール（すなわち、成体期にSPF微生物叢をコロニー形成させたGFマウス、GF CONV）と比較して減少した（図1、AおよびB）。ABXのうち非吸収性のサブセットを母体に投与すると、ABXフルカクテルで見られた胎盤重量の減少が再現され（図S1、A～D）、微生物多様性の減少も予想された（図S1、E～G）。このことから、ABXによる胎盤重量の減少は、ABXのオフターゲット効果ではなく、母体の腸内細菌叢の枯渇によるものであることが示唆される。胎盤重量の変化が胎盤の特定の部分領域への局所的な障害によるものであるかどうかを調べるために、gnotobioticのダムの胎盤をマイクロCT（μCT）で画像化した。μCTで検出されたすべての組織密度を容積分析とみなし、放射線密度の指標であるハウンズフィールド単位の比色オーバーレイを適用して、部分領域の組織密度の相対的変化を表示した。胎盤重量の減少と一致して、母親のマイクロバイオーム欠乏は、胎盤総容積の減少を引き起こし、母体-胎児交換の主要部位である胎盤迷路の容積と組織密度の減少をもたらした（図1、C～E）。母体のABX誘発胎盤病態生理に加えて、E14.5では胎児の体重と体積の減少が観察されたが、これはGF条件では見られなかった（図S2）。胎児体重の減少はE18.5でも同様に明らかであり（図S3）、母体のマイクロバイオーム枯渇が胎児の成長に持続的な障害を引き起こすことを示している。しかし、E18.5における胎盤重量に群間有意差は認められなかった（図S3）。これは、SPFおよびGF CONV条件下では妊娠月齢が進むにつれて胎盤総面積が縮小することが予想され（5）、GFおよびABX条件下では変化がなかったためである。全体として、これらのデータは、胎盤の成長と発達を促進する上で、母親の腸内細菌叢が、特に迷路小領域において重要な役割を果たしていることを明らかにした。

図1. 母親のマイクロバイオームは胎盤の発育を促進する。
(A)E14.5胎盤重量（リッター平均）［SPF（n = 10）、GF（n = 10）、ABX（n = 10）、GF CONV（n = 10）］。(B）図1Aに示した産仔［SPF（n＝80）、GF（n＝81）、ABX（n＝65）、GF CONV（n＝77）］の各個体のE14.5胎盤重量。(C)SPF、GF、ABX、およびGF CONV産仔のE14.5全胎盤μCT再構成の代表的な断面。白いハッシュ線は胎児胎盤迷路コンパートメントを区別する；スケールバー、1mm；Houndsfieldスケールは-105（薄緑）から9728（青）。(D）μCT再構成からのE14.5全胎盤体積のリター平均による定量化［SPF（n = 6）、GF（n = 6）、ABX（n = 6）、GF CONV（n = 5）］。(E）（D）に示したμCT再構成からの胎児胎盤迷路体積の定量化。データは平均値±SEMを表す。統計は、Tukey post hoc検定付き一元配置分散分析（litter平均）、またはSidak多重比較補正付き一元配置ネステッド（個々の胎仔）で行った。**P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001。
胎盤迷路は、絨毛細胞、基底膜、胎児内皮細胞によって隔てられた母体と胎児の血液スペースから構成されており、それらが一体となってガス交換と栄養交換を行っている。胎盤迷路の容積が減少しているという我々の観察結果を受け、また妊娠中期に胎児の胎盤血管系が急速に成長することを考慮し（6, 7）、我々は母体の微生物叢の減少が胎児胎盤血管系の発達を変化させる可能性があるという仮説を立てた。これを検証するため、胎盤をラミニンで染色し、胎盤内皮細胞の下にある細胞外マトリックスを可視化したところ、微生物欠乏症のダムの胎盤迷路組織では、コントロールに比べて染色強度が有意に低下していた（図2、AからB）。さらに、胎盤-胎盤動脈ギプスを作製し、μCTイメージングを用いてその本来の構造を解析した。微生物群に欠損のあるダムの胎仔胎盤血管系は、E14.5において、コントロールと比較して、血管枝の目に見える減少を伴って、血管容積と表面積の減少を示した（図2、CからE）。このことは、腸や脳を含む他の臓器において、血管新生とバリアー完全性の調節にマイクロバイオームが果たす役割を報告した先行研究と一致している(8, 9)。SPF群では、GF群およびABX群に比べてデータのばらつきが大きかった。SPF群で見られたばらつきは、従来のコロニー形成された対照群で報告されたものと一致しており(10)、同じ産仔内の異なる胎盤間で見られる自然な生物学的ばらつき、および/またはマウスの発育において最大12時間異なる胎盤を指すために同じ妊娠月齢が使用される、異なる産仔間で見られる予想される生物学的ばらつきを反映している可能性がある。微生物叢欠損ダムを妊娠中期に出産した胎盤で胎児胎盤血管枝の減少が観察されたことは、母体の微生物叢が重要な妊娠時期に血管の発達を指示することを示唆している。胎盤生理におけるマイクロバイオーム依存性の障害が、より早い妊娠月齢で検出可能であり、妊娠後期まで持続するかどうかについての洞察を得るために、E10.5とE18.5で胎盤血管系を評価した。E10.5産仔の迷路内皮CD31染色（図S4）やE18.5産仔のラミニン染色（図S5、A～B）において、母体微生物群に依存した差は観察されなかったが、E18.5産仔の胎盤内動脈容積は全体的に減少していた（図S5、C～E）ことから、母体微生物群の影響は、胎盤が急速に成長する時期である妊娠中期に最も顕著に現れることが示唆された。これらのデータを総合すると、胎盤-胎盤間血管系の適切な発達には母親のマイクロバイオームが必要であることが明らかになった。

図2. 母体マイクロバイオームは胎盤血管の発達を促進する。
(A）SPF、GF、ABX、GFCONV産仔のラミニン染色したE14.5胎盤迷路の代表的な画像（スケールバー、100μm）。(B）ラミニン染色強度の生の積算密度を、胎仔迷路総面積で正規化して定量化した［SPF（n = 6）、GF（n = 9）、ABX（n = 10）、およびGF CONV（n = 5）］。(C）E14.5胎仔胎盤動脈血管容積の定量［SPF（n＝9）、GF（n＝11）、ABX（n＝5）、GF CONV（n＝5）］。(D）E14.5胎仔胎盤動脈表面積の定量［SPF（n＝9）、GF（n＝11）、ABX（n＝5）、およびGF CONV（n＝5）］。(E）E14.5のSPF、GF、ABX、およびGF CONV産仔の血管ギプスのμCTイメージングによる代表的な胎盤-胎盤動脈血管再構成；スケールバー、1mm。データは平均値±SEM；統計は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukeyポストホック検定で行った。*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001。
母体のマイクロバイオームが多くの循環代謝産物を制御していることから(2)、胎児-胎盤血管系におけるマイクロバイオーム依存性の不全は、胎児循環における主要代謝産物の変化から生じる可能性があると仮定した。そこで、胎児血清メタボローム中の753代謝物についてアンターゲットメタボロームプロファイリングを行った（表S1）。主成分分析により、GFとABXのダムの胎児血清メタボロームプロファイルは、一般的にSPFコントロールから離れてクラスター化した（図S6A）。GFとABXの両条件に共通する胎盤の欠損に基づいて、次に共通のメタボローム変化をフィルターした。P＜0.05の閾値を適用したところ、SPF対照と比較して、GFおよびABXダムの胎児血清では、27代謝物が共通して有意に発現低下しており、14代謝物が共通して有意に発現上昇していた（図S6、B～D）。全メタボロームデータセットのランダムフォレスト解析により、母体の微生物叢の状態を89％の精度で予測する30種類の胎児血清代謝物が同定された（図S6E）。血管系が欠損すると栄養交換やガス交換が障害される可能性があるが、グルコースや多くのアミノ酸を含む中核代謝に関連する胎児血清代謝物には統計学的に有意な変化が見られなかったことから（表S1）、母体微生物叢の欠損による胎盤および胎児の欠損は、あからさまな胎児の栄養制限によるものではないことが示唆された。これらのデータは、母体マイクロバイオームが胎児循環中の代謝産物の生物学的利用能を調節していることを示しており、これは妊娠中に母体マイクロバイオームが母体血清および胎児脳内の代謝産物を調節していることを示した以前のデータと一致している(2)。胎児血清中の選択的な母体マイクロバイオーム依存性代謝産物が胎児胎盤血管発達と胎盤成長を促進するかどうかを調べるために、マイクロバイオータ欠損ダムから得られた母体血清と胎児血清の両方で有意かつ共通に減少した19種類の代謝産物のプールをマイクロバイオータ欠損ダムに補充した（図S6、F～J）。生理的に適切な濃度の微生物調節代謝物を毎日全身注射しても、母体のABXによる胎盤および胎児の体重減少（図S7、A～C）と胎盤組織の微小血管ラミニン染色（図S7、DおよびE）を防ぐことはできなかった。したがって、母親のマイクロバイオーム欠乏によって誘発される胎盤不全は、この選択された母親のマイクロバイオーム依存性代謝産物群によって制御されていない可能性が高い。
同定および試験した代謝産物に加えて、短鎖脂肪酸（SCFA）の微生物による生成が胎盤および胎児の発育の制御に果たすかもしれない役割を検討した（11-13）。SCFAは細菌の炭水化物発酵によって産生され、微生物叢が欠損したダムの母体および胎児血清では有意に減少している(14)。母体にSCFAを補充すると、母体循環から胎児循環へSCFAが直接移行することを示した先行研究(14)に基づき、我々はE0.5からE14.5までABXダムをSCFA補充水(13)またはビヒクル（ナトリウム適合）対照水で処理した。この補給戦略により、E14.5胎児全血中の酪酸およびプロピオン酸濃度が有意に上昇することが確認されたが、投与1時間後の母体血清および胎盤全組織中のSCFA濃度には変化がなかった（図S8）。この食い違いは、マウスでは飲水が周期的に繰り返され、ほとんどが夜間に起こることから、SCFA添加水の摂取時間に対するSCFAの薬物動態学的分布によるものと考えられる。母体へのSCFA投与により、ABXマウスの胎盤重量はSPF対照群に匹敵するレベルまで増加し、それに伴ってμCTイメージングで測定した胎盤総体積および迷路体積も増加した（図3、A～D）。母体のSCFA処理では、微生物叢を欠失させたダムの胎児の体重は増加しなかった（図S9）。胎盤の成長の増加と一致して、母親のSCFA処置はABXダムの胎盤迷路の内皮ラミニン染色をSPF対照で見られるレベルまで増加させた（図3、EおよびF）。これらの観察は、胎児-胎盤動脈ギプスのμCT再構成を用いてさらに支持され、母体のSCFA処置はABXダムの胎盤において胎児の血管容積と表面積を増加させた（図3、G〜I）。最後に、微生物叢を欠失させたダムは、E14.5胎盤迷路において収縮期ピーク速度の増加を示し、血管収縮に対する反応と一致したが、これはSCFA処理後に部分的に回復した（図S10）。臍帯血管では収縮期ピーク速度に有意差は認められなかった（図S10）。臍帯流量が胎児の体重に正比例して増加することを考えると、これは異常な反応を反映している可能性があり、ABX胎児のサイズが有意に減少した一因である（図S2）。これらのデータを総合すると、微生物叢由来のSCFAは胎盤の成長と胎児-胎盤血管の発達を促進することが明らかになった。

図3. 母親のSCFA補充は、母親のマイクロバイオーム枯渇によって誘発される胎盤の成長と微小血管系の障害を防ぐ。
(A）E14.5胎盤重量のリッター平均［ABX Na（n＝9）およびABX SCFA（n＝10）；ハッシュ線は図1AのSPF平均を表す］。(B) ABX NaおよびABX SCFA産仔のE14.5全胎盤μCT再構成像の断面。(C) μCT再構成によるE14.5全胎盤容積の産仔平均［ABX Na (n = 6)およびABX SCFA (n = 5)；ハッシュ線は図1DのSPF平均値］。(ハッシュ線は図1EのSPF平均値。(E) ABX NaおよびABX SCFA産仔のE14.5胎盤迷路のラミニン染色；スケールバー、100μm。(F) 胎児迷路総面積で正規化したラミニン染色の生の積算密度［ABX Na（n = 6）およびABX SCFA（n = 5）；ハッシュ線は図2CのSPF平均値］。(G) E14.5 ABX NaおよびABX SCFA産仔の代表的な胎仔胎盤動脈血管再構成図；スケールバー、1mm。(H）E14.5胎仔胎盤動脈血管容積［ABX Na（n＝4）およびABX SCFA（n＝4）；ハッシュ線は図2DのSPF平均値］。(I) (H)に示したリッターのE14.5胎仔胎盤動脈血管表面積；ハッシュ線は図2Eに示したSPF平均を表す。(J）HUVECチューブ形成アッセイ（スケールバー、250μm）、ネガティブコントロール（補充なし）、ポジティブコントロール（2％FBS補充）、酢酸塩補充（Ace、40μm）、酪酸塩補充（But、5μm）、およびプロピオン酸塩補充（Pro、5μm）を示す。(K）HUVECチューブ形成アッセイ（n＝6独立実験）。データは平均値±SEMを表す。統計はStudentのt検定、またはTukeyポストホック検定を用いた一元配置分散分析で行った。*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001。
SCFAは受容体を介した直接的なシグナル伝達により、大動脈内皮機能障害を予防し、線維血管新生を促進することが報告されている(15, 16)。SCFAが胎児内皮細胞に直接シグナル伝達して血管新生を促進する可能性があるかどうかを知るために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を生理的濃度のSCFAで処理し（17, 18）、分枝管形成を定量した。酢酸エステルおよびプロピオン酸エステルSCFAは、ビヒクルコントロールと比較してHUVECの分枝長を有意に増加させたが、酪酸エステルSCFAは統計学的有意差は認められなかったが、分枝長を変化させた（図3、JおよびK、ならびに図S11）。HUVECにおける遊離脂肪酸受容体2（FFAR2；Gタンパク質共役型受容体43（GPR43））またはFFAR3（GPR41）のCRISPR-Cas9を介したノックアウトは、SCFAによる分枝長の増加を阻止したことから、チューブ形成を刺激するためには、両認知受容体を介したSCFAの直接的なシグナル伝達が必要であることが示唆された（図S11G）。分岐管形成の増加は、細胞を他の様々な微生物依存性代謝産物で処理した場合には見られなかった（図S12）。これらの代謝産物は、ABXダムに投与した場合に胎盤障害を予防できなかったプール（図3）に含まれており、SCFAに対する特異性を示唆している。全体として、これらのデータは、SCFAが培養臍帯静脈内皮細胞の血管形成を直接刺激することを示しており、SCFAの補充がin vivoにおいて胎盤の血管発達を促進するという我々の知見と一致している。
母体のタンパク質制限（PR）を含む母体の栄養不良は、胎盤のサイズ縮小や血管系障害などの胎盤不全と関連している（19, 20）。マイクロバイオームが欠損したダムの胎盤で観察された表現型の類似性に基づいて（図1～3）、我々は次に、母親のSCFA投与が妊娠中の母親のPRによって引き起こされる胎盤異常を予防できるかどうかを検討した。複合糖質の代償的な増加ではなく、タンパク質の制限によるPRの影響を分離するために、PR食と、標準的なマウスの餌と同じレベルのタンパク質を含む対照食（CD）を、主要な炭水化物源としてセルロースを用いて調製した（表S5）。以前の知見(20)と一致して、母親のPRはCDを与えたダムと比較して胎盤重量および体積を減少させた（図4、A～D）。母体の SCFA 処理は、PR を与えたダ ムからの産仔の胎盤重量、総体積、および迷路特異的体積を、CD および以前の SPF コントロールで見られたレベルまで回復させるのに十分であった（図 4、A から D）。母体の SCFA 処理は胎仔胎盤脈管容積および表面積の増加によって測定されるように、胎仔胎盤脈管形成を増加させた（図 4、E～G）。胎児体重は母親の食事やSCFA処理による影響を受けなかった（図S13）。注目すべきことに、食物繊維の豊富な飼料を与えたSPF対照と比較して、CD胎盤血管系の減少が観察され、胎盤血管系の促進におけるSCFAの重要性がさらに示唆された。しかしながら、PRはCD対照と比較して母親のSCFAレベルの変化を誘導しなかったことから、PRは母親のSCFA欠乏に関与しない機序によって胎盤障害を引き起こすことが示唆された（図S14）。これらのデータを総合すると、SCFAは母体の栄養不良の条件下でも胎盤の成長と血管の発達を促進することが示唆される。

図4. 母体のSCFA補給はタンパク質制限下における胎盤の成長と脈管形成を促進する。
(A）E14.5胎盤重量（リッター平均値）［CD Na（n = 9）、CD SCFA（n = 10）、PR Na（n = 8）、PR SCFA（n = 10）；ハッシュ線は図1Aに示したSPFリッター平均値を表す］。(B）CDNA、CD SCFA、PR NaおよびPR SCFA産仔のE14.5全胞体μCT再構成の代表的断面。(C) μCT再構成から得られたE14.5胎盤全体の体積のリッター平均による定量［CD Na（n = 6），CD SCFA（n = 5），PR Na（n = 6），PR SCFA（n = 5）；ハッシュ線は図1Dに示したSPFリッター平均値を表す］。(D）（C）に示したμCT再構成からの胎児胎盤迷路容積の定量化；ハッシュ線は図1Eに示したSPFリター平均値を表す。(E) CD Na、CD SCFA、PR NaおよびPR SCFA産仔の血管鋳型のμCTイメージングによる代表的な胎盤動脈血管再構成；スケールバー、1mm。(F）E14.5胎仔胎盤動脈血管容積の定量［CD Na（n = 5），CD SCFA（n = 5），PR Na（n = 5），PR SCFA（n = 5）；ハッシュ線は図2Dに示したSPF産仔の平均値を表す］。(G）（F）に示した産仔のE14.5胎仔-胎盤動脈表面積の定量；ハッシュ線は図2Dに示したSPF産仔の平均値を表す。データは平均値±SEMを表す。統計は二元配置分散分析（ANOVA）とTukeyポストホック検定で行った。P < 0.05、***P < 0.01、**P < 0.001。
考察
本研究の結果から、妊娠中の胎盤の成長と血管の発達をサポートする上で、母親のマイクロバイオームが果たす役割が明らかになった。ABXの経口投与によって母体のマイクロバイオームが枯渇すると胎盤の発育が損なわれるが、これは複雑な食餌性炭水化物の微生物発酵に由来するSCFAを補充することによって阻止されることが明らかになり、特に腸内の母体のマイクロバイオームが関与していることが強く示唆された。この違いは、胎盤自体にマイクロバイオームが存在することを報告しているいくつかの研究（21-24）に照らしても注目に値する。胎盤サンプルで検出された微生物配列は、胎盤固有の微生物叢ではなく、実験室での汚染によるものであったり、ヒト胎盤への病原性の侵入を反映したものであったりすることを示唆する証拠が追加されたためである(25, 26)。加えて、例えば免疫細胞によって捕捉された微生物の遺伝物質とは対照的に、胎盤に生存共生微生物が存在することを裏付ける証拠は不足している。マウスでは、分娩直前に帝王切開で子宮を摘出することでGF動物を作製できるため、胎児に到達する胎盤中の生きた微生物の存在は否定される。マウスを用いた本研究で得られた知見は、母体の腸内細菌叢と腸内微生物の代謝産物が胎盤の形態形成をサポートするために必要であるという原理を証明するものである。
各腹子の胎盤と胎児の体重はすべて評価されたが、我々の実験デザインでは胎児の性別の違いは考慮されていなかった。このことは、特に胎仔-胎盤間血管系、胎盤トランスクリプトーム、胎盤イメージングを評価する際に問題となる可能性がある。Ishikawaら(27)が提供したデータによると、XY胎仔のE14.5胎盤はXX胎仔の胎盤より約10％重かった。対照的に、母親のマイクロバイオーム欠乏は胎盤重量を約15％減少させ、母親のPRは胎盤重量を13％減少させ、SCFA補充は胎盤重量を10％増加させることが観察された。したがって、母親のマイクロバイオーム調節、母親のPR、およびSCFA補充に反応して観察される表現型を、胎児の性別の違いが完全に説明できる可能性は低いと考えられる。
我々は、SCFAを母体から補充することで、2つのマウスモデル、母体マイクロバイオーム欠損症、PRにおいて、胎盤サイズと胎盤-胎盤間血管系が増大することを見出した。GFおよびABXマウスがSCFAレベルが低いことはよく知られているが、我々のデータは、タンパク質制限食を与えたダムとCDを与えたダムの間でSCFAレベルに差がないことを示している。したがって、SCFAが不足することが微生物叢欠損マウスの胎盤障害に関与している可能性はあるが、PRそのものは胎盤生理を破壊するような同じメカニズムでは作用しない可能性が高い。このことはさらに、PRによる胎盤異常の病因がSCFA欠乏を伴わないメカニズムで生じている可能性が高い場合でも、SCFAの補充が胎盤異常の予防に有効であることを示唆している。母体PRのマウスモデルで得られた知見と一致して、妊娠中の母体の高脂肪食摂取は胎盤の低酸素状態と胎盤血管構造の変化をもたらし、これは母体の腸内細菌叢におけるSCFA産生菌の減少と相関していた。母体にSCFAである酪酸を補充すると胎盤の障害が予防され(28)、胎盤の発育促進におけるSCFAの役割が支持された。
SCFAが胎盤に影響を及ぼすメカニズムはまだ不明であるが、SCFA濃度は妊娠とともに上昇し（29）、モノカルボン酸トランスポーターを介した経胎盤輸送により胎児循環に到達する（30）。SCFA受容体は哺乳類全体の子宮胎盤組織で発現していることが知られており(31)、受容体を介したSCFAの胎盤細胞への直接的なシグナル伝達の可能性を示唆している。このことは、SCFAが胎盤細胞に直接受容体を介したシグナル伝達を行う可能性を示唆している。これと一致して、選択的なSCFAが同族受容体であるFFAR2およびFFAR3を介してHUVEC細胞による分枝管形成を増加させることが示された。この可能性を裏付けるように、母体のSCFA補給は1時間以内に胎児血中の酪酸およびプロピオン酸レベルを上昇させた。これはSCFAが胎盤に入り、胎児胎盤内皮細胞を介して移行することを示唆している。胎盤内血管の発達を促進する母親のSCFA補給の能力が、胎盤内皮細胞の直接的な受容体を介したシグナル伝達によって媒介されるかどうかを評価するためには、より明確な実験が必要である。我々の研究では、SCFA産生に対する特定の食物繊維の寄与は考慮されておらず、胎児胎盤の健康を促進する主要栄養素の重要性を拡大することになるであろう。母体PR実験に用いた対照食と低タンパク食はいずれも、主な炭水化物源としてセルロースを配合したものであったが、これはセルロースが不溶性食物繊維として宿主にほとんど消化されず、マウスおよびヒトの腸内マイクロバイオームによる発酵が不十分であるためである。このことから、PR食に反応してみられる効果は、発酵性炭水化物の代償的増加ではなく、真のPRによるものである可能性が高い。しかし、PR食とCD食の両方が水溶性繊維を犠牲にしてセルロースを配合していることから、標準的なチャウ食と比較して、マウスのベースラインSCFAはどちらも同等に減少すると考えられる。したがって、我々が観察したSCFA補給の有益な効果は、使用した食餌の水溶性食物繊維組成が低いことに依存した、状況特異的なものである可能性がある。高繊維食がマウスにおけるSCFA補充と同様の表現型レスキューを示していることから（14）、今回の知見は、様々な食物繊維が胎盤の健康にどのような影響を与えるかを評価する必要性を支持するものである。
胎盤との相互作用にとどまらず、母体の微生物叢とSCFAはマウスの胎児の腸、膵臓、神経組織の発達をサポートすることが報告されている(14)。本研究では、ABX系マウスの胎仔はSPF系マウスの胎仔と比較して、E14.5から18.5において有意に小さいことが観察された。いくつかの研究で、ABX投与による生理学的結果は、GF飼育で見られる結果と完全には一致しないことが報告されている(32-36)。視床皮質軸索の発達はGFとABXの両ダムで同様に低下しているにもかかわらず、ABXのダムの胎児の脳だけが対照に比べて有意に低下していることが以前にわかった(2)。GF飼育で見られる違いは、発育中、全生涯にわたって、また数世代にわたるGF飼育において、マイクロバイオームが持続的に存在しないことに反応した宿主の生理学的変化によるものである可能性がある。これは、成体期のABX投与による急性かつ不完全なマイクロバイオームの枯渇とは対照的である。この文脈から、世代を超えたGF飼育に対する代償的な生理学的適応が、ABX投与群に比べGF投与群に表現型が見られないことを説明している可能性がある。さらに、本研究では、吸収性ABX投与（Abs）は胎盤重量を有意に損なわないが、ABXと非Absの産仔でそれぞれ観察された胎仔重量の減少を部分的に表現することが示された。このことは、我々の研究で胎盤重量を決定するものとは異なる、胎児重量の決定因子が存在することを示唆している。
SCFAアセテート濃度の低下は子癇前症の女性で報告されており、周産期のアセテート補給はGFマウスにおいて胎児の胸腺CD4+ T細胞および制御性T細胞の発達を促進するのに十分である(37)。胎盤の構造と機能に対するSCFAの影響が、胎児の発育に対するSCFAの報告の影響に寄与しているかどうかは、さらなる実験的研究が必要である。しかし、血管障害を含む胎盤の機能不全は、長い間、発育中の胎児の不利な転帰や成人期の慢性疾患のリスク上昇に関係してきた(38)。胎盤の血管障害は、胎児の体重や体長の減少、小児期の体重減少、収縮期血圧の上昇、左心室量の減少と関連している(39)。これと一致して、胎盤の大きさの低下は成人期の高血圧の発生率の増加と相関している(38)。さらに、妊娠高血圧症候群、特に子癇前症に特徴的な胎盤の血管欠損は、心血管疾患、腎臓病、認知機能障害など、成人期における無数の疾患のリスク増加と関連している(40)。胎児の性別は胎盤と胎児の成長に異なる影響を与えるが(27)、われわれの実験デザインでは、産仔平均に基づく偏りのない定量を優先するため、胎児の性別は考慮しなかった。しかし、本研究で得られた知見から、妊娠中の母体の腸内細菌叢が寄与する代謝機能は、マウスの胎盤の成長と血管新生をサポートするために不可欠であることが明らかになった。母体の腸内細菌叢が胎盤の構造と機能にどのように影響するかについての理解を深めることは、母体と胎児の健康を促進し、慢性疾患のリスクを減少させるための新たなアプローチに役立つ可能性がある。
材料と方法
実験デザイン
本研究の目的は、グノトビオティックマウスモデルを用いて、胎盤の発達に対する母親の腸内細菌叢の寄与を明らかにすることであった。微生物叢の枯渇に伴う胎盤の表現型の特徴付けに加えて、in vivoおよびin vitroの戦略を用いて、制御の異なる代謝産物を同定し、これらの分子が胎盤の欠損を修飾するかどうかを評価した。
マウス
C57Bl/6JマウスはJackson Laboratoriesから購入し、SPFとして飼育するか、またはGFとして再導入し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）健康科学センターバリア施設のフレキシブルフィルムアイソレーターで飼育した。動物は12時間の明暗サイクルで、オートクレーブ滅菌された寝具を用い、温度管理された環境で飼育された。滅菌水とオートクレーブ滅菌した標準飼料（Lab Diet 5010）を自由摂取させた。すべての実験において、CO2曝露による母体および胎児の生理への影響を避けるため、妊娠中のダムは子宮頸部脱臼により安楽死させた。すべての実験は、UCLAのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコル（2015-077-01）を用いて、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われた。
サンプルサイズの決定
8週齢のマウスを、年齢および性別が一致した雄および雌のコホートを含む実験群に無作為に割り付け、定時交配を行った。すべての動物実験において主要な実験変数である母親のマイクロバイオームの状態を考慮するため、生物学的サンプルサイズは独立したダムの数を反映し、繁殖には処女の雌のみを使用した。胎盤および胎児の表現型の特徴付けには、各個体のダムについて、1産子あたり少なくとも2つの受胎卵を無作為に選択した。胎盤および胎児体重の統計については、リッター平均を原稿の主要図に示し、それに付随する個々のコンセプ タスのデータは主要図または補足図に示した。
ABX治療と慣行化
広域ABX治療のため、8週齢のSPFマウスに、GF状態を模倣するために以前に記載された方法（41）に基づき、ネオマイシン（100 mg/kg）、メトロニダゾール（100 mg/kg）、およびバンコマイシン（50 mg/kg）のカクテルを1日2回（08:00および17:00）、1週間経口投与した。アンピシリン（1 mg/ml）は飲料水として自由摂取させた。その後、交配を行った。E0.5は滅菌膣プローブを用いた交尾栓の観察により決定した。その後、ダムを分離し、個別に飼育し、妊娠中のダムに経口摂取のストレスを与えないよう、E14.5までアンピシリン（1mg/ml）、ネオマイシン（1mg/ml）、バンコマイシン（0.5mg/ml）を添加した滅菌飲料水で飼育した。
選択的ABX治療のために、8週齢のSPFマウスを、宿主循環に吸収されるABX（Abs）または宿主循環に吸収されないABX（non-Abs）のいずれかを投与するために無作為に選択した。Absマウスにはメトロニダゾール（100 mg/kg）を1週間、1日2回（08:00および17:00）経口投与し、アンピシリン（1 mg/ml）を飲水で自由摂取させた。非Absマウスには、ネオマイシン（100 mg/kg）およびバンコマイシン（50 mg/kg）を1週間、1日2回（08:00および17:00）経口投与し、その後、滅菌飲料水にネオマイシン（1 mg/ml）およびバンコマイシン（0.5 mg/ml）を添加して飼育した。ブリーダーはペアにし、時間交配を行い、ダムは上記のようにE0.5で分離した。
GFマウスのコンベンショナル化
GF化対照を作製するため、GFとして生まれ飼育されたマウスは、成体期に従来のマウス微生物叢でコロニー形成された。SPFドナーの糞便ペレットを100mg/mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でホモジナイズし、200μlを8週齢の雌性GFレシピエントに週1回、2週間投与した。また、SPFドナーのホームケージの寝具をGF CONVレシピエントケージに加え、慣行を最大化した。
母親のタンパク質制限
標準飼料（Lab Diet 5010）を与えていた8週齢のマウスを、タンパク質20.3重量％、炭水化物61.3重量％、脂肪5.5重量％のCD（TD.91352、Envigo）またはタンパク質6.1重量％、炭水化物75.6重量％、脂肪5.5重量％のタンパク質制限食（TD.90016、Envigo）のいずれかに無作為に選択した。炭水化物の違いはショ糖とセルロースの量によるもので、使用した飼料はいずれも等カロリー（3.8kcal/g）で、カルシウム（0.7%）とリン（0.54%）は一致させた。雄マウスも雌マウスもそれぞれの飼料に2週間馴化させた後、それぞれの飼料処理群内で繁殖のためにペアを作った。E0.5で交尾プラグが観察された後、雌は個別に飼育され、妊娠期間中はそれぞれの飼料で維持された。
16S rRNA 遺伝子配列決定
DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen）の標準プロトコールに従い、マウスの糞便サンプルから細菌ゲノムDNAを単離した。配列決定ライブラリーは、Caporasoら(42)の方法に従って作成し、個別にバーコード化したユニバーサルプライマーと30 ngの抽出ゲノムDNAを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により16SリボソームRNA(rRNA)遺伝子のV4領域を増幅した。各PCR反応は3連で行い、増幅後にプールした。最終PCR産物はQiaquick PCR purification kit（Qiagen）を用いて精製した。個々にバーコード化された各サンプルから合計250 ngの精製されたPCR産物をプールし、イルミナMiSeqプラットフォームとペアエンドシーケンス用2×250 bp試薬キットを用いて、Laragen Inc.によりシーケンスされた。すべての解析はQIIME2 (43)を用いて行われ、品質管理のためのDeblur (44)、分類の割り当て、α-rarefaction、β-diversity解析が含まれた。サンプルあたり合計29,152リードを解析した。操作上の分類単位は、SILVA 132データベースと比較した99%の配列類似性に基づいて割り当てられた。α-rarefaction曲線とβ-diversity主座標分析プロットは、それぞれPrismソフトウェア（GraphPad）とQIIME2 Viewを用いて作成し、分類群バープロットはMicrosoft Excelを用いて作成した。
免疫蛍光染色
E14.5胎盤を4%パラホルムアルデヒドで4℃、24時間固定し、PBS中30%スクロースで4℃、24時間凍結保護し、Leica CM1950クライオスタットを用いて12μmで切片化した。切片は10％ヤギ血清で室温で1時間ブロックした。一次抗体を10％ヤギ血清で希釈し、それぞれラミニンウサギ抗マウス抗体（1：250、Sigma-Aldrich、L9393）またはCD31ラット抗マウス抗体（1：100、Thermo Fisher Scientific、14-0311-82）を用いて4℃で18時間インキュベートした。次に、Alexa Fluor 568（1:1000、Thermo Fisher Scientific）と4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドールを結合させた対応するヤギ抗ウサギ抗体で切片を室温で1時間インキュベートした。画像は、Zeiss Axio Examiner LSM 780共焦点顕微鏡を用い、405nm（0.2％レーザーラインアッテネーター透過率、575マスターゲイン、0デジタルオフセット、1.0デジタルゲイン）および561nm（2.0％レーザーラインアッテネーター透過率、605マスターゲイン、-2.0デジタルオフセット、1.0デジタルゲイン）レーザーで取得した。Zen Black 2012 ソフトウェア、20× 対物レンズ、1.5× ズーム、5×1μm 間隔の z スライス、各蛍光色素について 3 つの個別トラックを使用し、各サンプルについて 1～2 枚の胎盤切片をスキャンした。画像取得設定は以下の通り：スキャンモードはframe、フレームサイズは1024×1024、スキャンスピードは7、平均値はlineとmeanで2、ビット深度は8bitに設定。ピンホールは1AUに設定した。画像は10％の重なりを持たせてつなぎ合わせ、Zen Blue 2021ソフトウェアを用いてz系列の全範囲を圧縮した。
画像解析
取得した画像はすべて、各サンプルの実験グループと盲検化された研究者が同じ手順で解析した。画像はFijiにインポートされ、設定されたスケールを用いて較正された。迷路領域の周囲を手作業でトレースし、輝度とコントラストを最小0から最大8まで設定して全組織を過飽和にすることで迷路面積を算出し、信号のない領域を空隙と定義した。ラミニンの積算密度を定量化するため、バックグラウンドの自家蛍光を除去するように輝度とコントラストの設定を調整した。各サンプルの生の積算密度値は、各サンプルの全迷路面積に対して正規化された。
マイクロコンピューター断層撮影
E14.5胎盤全体を、30～50～70％エタノールで順次脱水し、70％エタノールで希釈した4％（w/v）リンタングステン酸中で4℃、4日間インキュベートした。組織は、卓上型μCTスキャナー（SkyScan 1275、Bruker）を用い、1mm Alフィルターを用いて60kVp/150μAで8μmの解像度でスキャンした。ダイナミックレンジ調整とガウス平滑化、リングアーチファクト低減10、欠陥画素マスク8％を用いて二次元画像の再構成を行った。胎児迷路体積測定のための関心体積は、盲検化された研究者が、迷路密度と組織の形態を利用して、迷路とその上の接合帯および脱落膜とを区別するために手動で選択した。胎盤全体の体積は、CTAnおよびCTVolソフトウェア（Bruker Corporation）を用いて、88（最小）から255（最大）の閾値範囲を用いて再構成および測定した。胎盤全体の代表画像は、Dataviewerソフトウェア（Bruker Corporation）を用いて作成し、ヒートマップにはラジオ密度の指標としてハウンズフィールド単位を反映させた。E14.5胎児の全体積の定量化は、(2)で脳体積の定量化に用いたμCT画像を用いて行った。
胎盤動脈血管ギプス
胎仔-胎盤間動脈血管ギプスは、以前に記載された方法(45)を用いて作成した。簡単に説明すると、ダムをE14.5で頸部脱臼により安楽死させ、子宮角を直ちに剥離して氷冷PBSに入れた。胎仔を個々に取り出し、37℃に設定した加温パッドの上に置き、加温（37℃）したPBSで連続的に流して胎仔の心拍を回復させた。脈打つ血流を観察して胎児の臍帯動脈を同定し、部分的な血管拡張のためにPBS中の4％PFAを動脈に滴下し、動脈に微小切開を加えた。チューブに固定した手引き式ガラスピペットを動脈管腔に挿入し、シリコン接着剤Kwik-Sil（World Precision Instruments）を用いて切開部位を覆い、ピペットを所定の位置に接着した。シリコーン接着剤が固まったら、臍帯静脈に小さな切開を加え、灌流用の流出口とした。胎盤-胎盤血管系を洗浄し、血管収縮を防ぐため、ヘパリン化（100 IU/ml）PBSと10％リドカインの1：1溶液を加温（37℃）し、灌流液に血液がなくなるまで胎盤を通して灌流した。気泡を入れることなく、氷冷したMICROFILシリコーンゴム注入コンパウンド（Flow Tech Inc.）を入れたチューブラインを、圧力を維持するための抵抗が満たされるまで臍動脈を通して灌流した。両方の臍帯血管を直ちに縫合し、充填した胎盤を室温のPBS中に少なくとも30分間置き、キャスティングコンパウンドを重合させた。その後、胎盤組織からのバックグラウンド電子密度を減少させるため、サンプルを4℃で30、50、70％エタノールと順次エタノールで脱水した。灌流した胎盤ギプスを、上述のようにμCTで画像化した。胎仔-胎盤動脈容積および表面積は、CTAnおよびCTVolソフトウェア（Bruker Corporation）を用いて3次元再構成した後に決定した。注目すべきは、μCTの解像度の限界（1ボクセル＝11μm）により、小さくて高密度の迷路微小血管系を検出できないことである（46, 47）。このことが、より解像度の高い染色や共焦点イメージングと比較して、この方法で観察される血管の密度が低い理由であると考えられる。そこで、この問題を回避するために、補完的なアプローチとして血管灌流と組織学的解析の両方を行った。
メタボロミクス
E14.5で、母体の血液は心臓穿刺によって採取し、胎児の血液は複数の断頭した胎児から体幹部血をプールすることによって採取した。血清はSST vacutainer tube（Beckton Dickinson）を用いて分離し、-80℃で凍結した。サンプルは自動化されたMicroLab STARシステム（Hamilton Company）を用いて調製し、Metabolon Inc.のガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）、液体クロマトグラフィーMS（LC-MS）、およびLC-MS/MSプラットフォームで分析した。有機水性溶媒を用いてタンパク質画分を連続抽出し、TurboVapシステム（Zymark）を用いて濃縮し、真空乾燥した。LC-MSおよびLC-MS/MSでは、サンプルは11種類以上の注入標準物質を含む酸性または塩基性LC適合溶媒で再構成され、Waters ACQUITY UPLCおよびThermo-Finnigan LTQ質量分析計（リニアイオントラップフロントエンドおよびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計バックエンド）で分析された。GC-MSでは、サンプルを乾燥窒素下でビストリメチルシリル-トリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化し、電子衝撃イオン化を用いたThermo-Finnigan Trace DSQ高速走査型単一四重極質量分析計で分析した。化学物質の同定は、精製標準物質のメタボロームライブラリエントリとの比較によって行いました。各化合物の最小観測値で対数変換およびインピュテーションを行った後、一元配置分散分析（ANOVA）を使用してデータを解析し、群間効果を検定しました。P 値と q 値は、二元配置分散分析の対比に基づいて計算した。主成分分析を用いて分散分布を可視化した。複数の決定木を使用して入力データを分類および回帰する機械学習アルゴリズムである教師ありランダムフォレスト分析を実施し、メタボロミクス予測精度を同定した。すべての参照データを表S1に示す。SCFAは部分的な親水性を考慮した異なる抽出方法を必要とするため、これらの方法では検出されなかった。そこで、この非標的メタボロミクスプロファイリングを、後述する標的SCFA定量で補完した。
サプリメント実験の候補代謝物の選択
生理学的に関連する代謝物濃度は、マウス多組織メタボロームデータベースから報告されたマウス血清濃度、ヒトメタボロームデータベースから報告されたヒト血清濃度、および既存の文献に基づいて決定した。すべての参考文献を表S2に示す。目的の代謝物は、それぞれ胎児血清または母体血清[既出(2)]の上位30個の識別特徴を特定するランダムフォレスト分析に基づいて選択され、選択基準は表S2に記載されている。合理的に市販されていない代謝物は実験の対象とはしなかった。最後に、妊娠発育への交絡作用を避けるため、催奇形作用が知られている化合物はすべてin vivo補充から除外した。
生体内代謝物の補充
候補となる微生物依存性胎児代謝産物の効果を調べるため、妊娠中のダムへのストレスを最小限にするため、MetabカクテルまたはビヒクルコントロールをE0.5からE14.5まで1日1回腹腔内投与した。代謝物の投与量は、胎児血清のメタボロームデータおよび文献で報告されている生理学的に関連性のある代謝物濃度に基づいて計算し、SPF胎児血清で観察される濃度と一致させるために必要な1日あたりの濃度を反映させた（表S2）。代謝物濃度は、マウスまたはヒト血液中の生理学的レベル（表S2）、妊娠マウスのダムの総血液量［約58.5 ml/kg (48)］、およびSPF胎児と比較してABX胎児の胎児血清で観察された相対的減少量に基づいて計算した（表S2）。代謝物ストック溶液は以下の組成であった： 29.64μMイミダゾールプロピオネート、714.096μM N,N,N-トリメチル-5-アミノバレレート、13.452μM 4-ヒドロキシフェニルアセテート、316.008μM 硫酸フェノール、428. 868μMインドールプロピオネート、360.24μMインドキシルグルクロニド、323.76μM N-メチルプロリン、595.080μMフェニルアセチルグリシン、957.6μMトリメチルアミンN-オキシド、118. 56 μMタウロデオキシコール酸、160.8768 μMビオチン、893.76 μMヒプリン酸、42.864 μM2-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、222.072 μMシンナモイルグリシン、273. 6 nM エクオールグルクロニド、433.2 μM 2-アミノフェノール硫酸塩、1.55952 mM 3-インドキシル硫酸塩、268.128 μM p-クレゾール硫酸塩を0.1 M PBSに溶解した。この原液を滅菌した0.1M PBSで1:100に希釈し、200μlの作業溶液をE0.5 ABXダムに1日1回14日間腹腔内注射した。SCFA処理には、プロピオン酸ナトリウム（25 mM）、酪酸ナトリウム（40 mM）、酢酸ナトリウム（67.5 mM）をE0からE14.5までの妊娠ABXダムの飲料水に添加した。これらの濃度は、腸から遠位にある宿主組織に十分に浸透し、循環生理的濃度を回復できることを示した既存の研究に基づいて決定された（12）。SCFAを添加した飲料水とナトリウムをマッチさせた対照飲料水は滅菌濾過し、4日ごとに新しくした。胎盤の表現型を評価するため、代謝物を投与したダムを E14.5 に安楽死させ、胎盤を採取し、上記の各項に記載したように処理した。
E14.5 組織からの SCFA 定量化
ABX ダムの胃内 SCFA 投与が酢酸、プロピオン酸、酪酸の組織特異的濃度を増加させるか否かを評価するため、それぞれ SCFA 添加飲料水またはナトリウム適合対照飲料水で処理したダムを一晩絶食させ、循環濃度を正常化した。SCFAは胎仔組織で検出可能な濃度まで経胎盤関門を通過することが以前に証明されている(14)。絶食させたE14.5ダムを、それぞれSCFAストック溶液またはナトリウム適合溶液200μlを経口投与し、1時間後に安楽死させて組織採取を行った。母体血は心臓穿刺により、胎児血は断頭した胎児から体幹血をプールすることにより採取した。母体血清はSST vacutainer tube（Beckton Dickinson）を用いて分離し、-80℃で凍結した。各腹仔から無作為に3個の胎盤を採取し、-80℃で凍結した。合計150～250mgの組織サンプルを150μlのPBS（ビーズミル24、サーモフィッシャーサイエンティフィック）でホモジナイズし、ボルテックスし、氷水中で10分間超音波処理した。その後、組織溶解液を14,000g、4℃で10分間遠心し、上清を回収した。血清/全血または上記組織溶解液上清50μlを、同位体標識内部標準物質（酢酸-d3、プロピオン酸-d5、酪酸-d7、各5μg/ml）を添加したイソプロピルアルコール50μlとよく混合し、-20℃で一晩沈殿させ、14,000g、4℃で10分間遠心した。上清40μlをクリーンチューブに移し、50％アセトニトリル水溶液中200mM 3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩20μlおよび6％ピリジン含有50％アセトニトリル中120mM N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩20μlと40℃で30分間反応させた。反応物を80μlの0.5%ギ酸/H2Oでボルテックス希釈し、遠心分離し、LC-MSに準備した。LC-MS分析は、Agilent Zorbax SB-C18 2.1X150 mmを用い、カラム温度50℃で行った。溶離液Aは0.1%ギ酸アセトニトリル。溶離液Bは0.1%ギ酸水溶液。以下のグラジエント溶出を行った： 5%Aから25%Aまでは30分、25%Aから40%Aまでは10分で、流速は0.2ml/分であった。分析は、TSQ Quantum (Thermo-Finnigan) LC-エレクトロスプレーイオン化-MS/MSシステムを用い、ネガティブモードで行った。定量はXcaliburデータシステムを用いて行った。酢酸：質量/電荷比（m/z）194.1/137.1（酢酸d3は197.1/137.1）、プロピオン酸：m/z 208.1/137.1（プロピオン酸d5は213.1/137.1）、酪酸：m/z 222.1/137.1（酪酸d7は229.1/137.1）。検量線は、分析対象物の濃度と同位体標識内部標準物質のピーク面積比をフィッティングすることにより作成した。サンプル中の標的分析物と同位体標識内部標準物質のピーク面積比を使用して濃度を計算した。
ドップラー超音波分析
胎盤迷路および臍帯血管のドップラー超音波分析に採用した方法は、以前に記載された方法と同様に行った(49)。簡単に説明すると、E14.5 のダムを最初に 3.5%のイソフルランで麻酔し、背臥位で体温を 37℃に保つ加温ステージに移し、1.5%のイソフルランと酸素で麻酔鼻チューブに固定したまま麻酔した。各電極に電極ゲルを塗布し、各電極に対応する四肢をサージカルテープでテーピングしてダムを加熱ステージに固定した。体温、呼吸数、母親の心拍（450～550回/分）を実験期間中モニターした。腹部に脱毛クリームを塗布し、3分間休ませた後、水に浸した湿布で毛を拭き取った。あらかじめ温めておいた超音波ジェルを脱毛した皮膚に塗布した。超音波イメージングとパルス波ドップラー記録（血流に平行な入射角）はVevo 3100（富士フイルム、VisualSonics社製）を用いて撮影し、1頭につき少なくとも3個のランダムな受胎概念を撮影した。ドップラー記録はVevo Labソフトウェア（富士フイルム、VisualSonics）を用いて解析した。各胎児は胎盤迷路と臍帯血管の両方からそれぞれ2～3個の記録を持ち、それらはその胎児のテクニカルレプリケートとして平均された。その後、同じ産仔のすべての胎仔の値を平均して、1つの哺乳動物あたりの測定値を作成した。
HUVECチューブ形成アッセイ
第一世代のHUVEC（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、C0035C）を、大血管内皮サプリメント（LVES；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）およびペニシリン（10U/ml）／ストレプトマイシン（10μg/ml；シグマアルドリッチ社製）を添加した培地200（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）中、37℃、5％CO2で第三世代または第四世代まで継代した。分岐管形成アッセイは、組織培養処理したμスライド（Ibidi）を用いて行った。簡単に説明すると、氷冷したGeltrex LVES-freeの還元成長因子基底膜マトリックス（Thermo Fisher Scientific）10μlを、あらかじめ冷やしたピペットを用いて冷やしたμスライドの各ウェルに加え、すべてのウェルにマトリックスが均等に分布していることを確認した後、マトリックス重合のためにμスライドを37℃に30分間移した。第3世代または第4世代のHUVECを、ペニシリン（10U/ml）／ストレプトマイシン（10μg/ml；Sigma-Aldrich）を添加したLVES-free Medium 200（最小内皮細胞培地）に再懸濁し、次いで表S3に示す濃度のメタボライト添加培地に2×105細胞/mlで再懸濁し、細胞懸濁液50μlを各ウェルに添加した。LVESを含まない培地200中のHUVECをネガティブコントロールとして用い、2％ウシ胎児血清（FBS）を添加した培地200をポジティブコントロールとして用いた。μスライドは37℃、5% CO2で12時間インキュベートし、Leica DMi8顕微鏡を用いて画像化した。画像解析と定量化は、Fiji（50）とAngiogenesis analyzer plugin（51）を用いて行い、枝分かれ距離の合計値は、まず実験ごとの技術的複製について、次に複数の実験にわたる生物学的複製ごとに平均し、最終的な図に表示した。
HUVECにおけるCRISPR-Cas9リボ核タンパク質ゲノム編集
ガイドRNA設計、CRISPR-Cas9リボ核タンパク質（cRNP）複合体形成、およびエレクトロポレーションは、一次自然免疫細胞におけるゲノム編集のために設計された方法論から採用した（52）。ガイドRNA配列は、最近の全ゲノムベースのCRISPR-Cas9 KOライブラリー（53）から得た。予測される編集効率とオフターゲットミスマッチの数に基づいて、Chopchop (54)を用いて、FFAR2については上位6つのシングルガイドRNA (sgRNA)配列を、FFAR3については上位4つのsgRNA配列を選択し、HUVECでテストした。Tバッファー（Thermo Fisher Scientific）中のHUVEC（1×106）を各反応の複合体cRNPと合わせ、Neon Transfection System（Thermo Fisher Scientific）を用いてパルスコード1800 V 20 ms×1パルスでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後、細胞をHUVEC培地に再懸濁し、Tバッファーを希釈し、37℃で90分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、10％ジメチルスルホキシドを加えたHUVEC培地に再懸濁し、次のノックアウト効率およびin vitro HUVECチューブ形成アッセイのために液体窒素セルフリーザーに保存した。ノックアウト効率を評価するために、ガイドターゲット配列をトランスフェクトしたHUVECから単離したゲノムDNAからPCRで増幅し、塩基配列を決定し、SYNTHEGO ICEプラットフォームを用いてインデル％とノックアウトスコアを評価した。FFAR2に使用した最終的なsgRNA（ガイド配列、GCTGCAATCACTCCATACAGAGG）のインデル率は41%、ノックアウトスコアは41であった。FFAR3に使用した最終的なsgRNA（ガイド配列、AAAGTCGGCTTGGAACCCGGAGG）は、86％のインデルと83のノックアウトスコアを有していた。両方の遊離脂肪酸受容体でシグナル伝達するSCFAの影響を調べるため、FFAR3KO HUVECをFFAR2阻害剤GLPG 0974（Tocris社）で10μM処理した。
統計解析
統計解析は、Prismソフトウェア（GraphPad）を用いて行った。データは正規分布を評価し、平均値±SEMとして図にプロットした。各図において、特に断りのない限り、nは独立した母体の生物学的複製数を表す。全産仔は生存受精卵の総数が4未満の場合のみ除外し、そうでない場合はどの産仔からも受精卵を除外しなかった。2 つ以上のグループ間の差は、1 つの変数のみで、Tukey post hoc 検定を伴う一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて評価した。胎盤重量と胎児重量の個体差は、それぞれ一元配置分散分析（one-way nested ANOVA）とTukey post hoc testで解析した。16S rRNA遺伝子配列解析による分類学的比較は、Kruskal-Wallis検定とTukeyのポストホック検定で解析した。1つの変数による2群間の差は、対応のない両側t検定を用いて評価した。2つの変数を持つ2つ以上のグループの比較には、Tukeyのポストホック検定を伴う二元配置分散分析を用いた。すべての図において、上記の検定から得られた有意差はP < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001で示し、顕著な有意差は「n.s.」で示した。
謝辞
Goodman-Luskin Microbiome Center Gnotobiotics Core facility、S. Devaskar、L. Iruela-Arispe、およびHsiao研究室のメンバーの有益なフィードバックに感謝する。
資金提供： 本研究は、NIHフェローシップF31HD101270（G.N.P.）、Packard Fellowship in Science and Engineering（E.Y.H.）、New York Stem Cell Foundation Robertson Neuroscience Investigator Award（E.Y.H.）、NICHD Pathway to Independence Award c（H.E.V.）の支援を受けた。
著者貢献： 構想： G.N.P.およびE.Y.H.： G.N.P.、K.B.Y.、E.J.L.C.-O.、S.S.T.、A.S.C.、A.C.、H.E.V.、D.W.W.、T.K.R.、J.P. 資金獲得： G.N.P.およびE.Y.H.： 原案執筆：G.N.P.、E.Y.H： 原稿執筆：G.N.P.、E.Y.H.： G.N.P.、K.B.Y.、E.J.L.C.-O.、S.S.T.、A.S.C.、A.C.、H.E.V.、D.W.W.、R.H.K.、E.Y.H.
利益相反： 本原稿で報告された胎盤の発達に影響を与える母体マイクロバイオームの操作に関する知見は、UCLAが所有する仮特許出願US 62/817,629の対象である。著者らは他に競合する利害関係がないことを宣言する。
データおよび資料の入手： この研究で作成または解析されたデータは、この発表論文およびその補足情報ファイルに含まれている。本研究の結果を裏付ける16S rRNA遺伝子配列データは表S4に掲載されており、Qiitaデータベース https://qiita.ucsd.edu/ に研究ID 14433で寄託されている。
補足資料
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この原稿のその他の補足資料には以下が含まれます：
表S1からS5
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データ S1 から S18
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参考資料
1
M. S. Thion、D. Low、A. Silvin、J. Chen、P. Grisel、J. Schulte-Schrepping、R. Blecher、T. Ulas、P. Squarzoni、G. Hoeffel、F. Coulpier、E. Siopi、F. S. David、C. Scholz、F. Shihui、J. Lum、A. A. Amoyo、A. Larbi、M. Poidinger、A. Buttgereit、P.-M. Lledo, M. Greter, J. K. Y. Chan, I. Amit, M. Beyer, J. L. Schultze, A. Schlitzer, S. Pettersson, F. Ginhoux, S. Garel, Microbiome influences prenatal and adult microglia in a sex-specific manner. Cell 172, 500-516.e16 (2018).
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