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研究論文
2023年7月27日
腸管粘液層におけるギ酸酸化はSalmonella Enterica serovar Typhimuriumの体力を増強する

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00921-23?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_content=ASM&utm_id=falcon&utm_campaign=mBio

著者 Maria G. Winter, Elizabeth R. Hughes, Matthew K. Muramatsu, Angel G. Jimenez, Rachael B. Chanin, Luisella Spiga, Caroline C. Gillis, Michael McClelland, Helene Andrews-Polymenis https://orcid.org/0000-0002-1818-1335, Sebastian E. Winter https://orcid.org/0000-0003-1532-9178 SebWinter@ucdavis.eduAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00921-23
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mBio
オンライン・ファースト
概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
情報＆貢献者
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参考文献
図表とメディア
表
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ABSTRACT
サルモネラ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）は腸炎を誘発し、腸内細菌叢に病原体の増殖を促すニッチを形成する。炎症条件下でサルモネラは、腸内炎症の副産物として生成される終末電子受容体を利用し、呼吸によって細胞エネルギーを生成する。しかし、これらの電子伝達系における電子供与反応は、ほとんど理解されていない。我々は、ギ酸デヒドロゲナーゼ-N（FdnGHI）とギ酸デヒドロゲナーゼ-O（FdoGHI）を介したギ酸利用が、サルモネラの腸内コロニー形成にどのように寄与しているかを調べた。両酵素は、サルモネラ菌誘発大腸炎モデルマウスにおいて、体力増強に冗長な役割を果たし、テトラチオン酸、硝酸塩、酸素呼吸と結合していた。サルモネラ菌が感染時に利用するギ酸は、自身のピルビン酸-ギ酸リアーゼと腸内細菌叢によって生成された。ギ酸デヒドロゲナーゼとピルビン酸-ギ酸リアーゼの転写は、内腔に比べて粘液層に存在する細菌で有意に高かった。さらに、ギ酸の利用は粘液層でより顕著なフィットネスアドバンテージをもたらし、ギ酸の産生と分解は粘液層で主に起こることが示された。この結果は、サルモネラが腸内の局所的な微小環境にどのようにエネルギー代謝を適応させているかについて新たな知見を与えるものである。
重要性
細菌病原体は、宿主にうまく定着するために、免疫反応を回避するだけでなく、その代謝を適応させる必要がある。腸内病原体が遭遇する微小環境は、小腸と大腸のような解剖学的位置、粘液層や抗菌ペプチドのような宿主因子による空間的層別化、そしてこれらの微小環境に生息する固有の常在微生物群集によって異なる。サルモネラの個体群が腸内の異なる環境にどのように代謝を適応させているかについての理解は不完全である。今回の研究では、サルモネラがギ酸を電子供与体として利用して呼吸を支えていること、ギ酸の酸化は主に粘液層で起こることを発見した。われわれの実験から、粘液層と内腔の空間的に異なるサルモネラ集団は、そのエネルギー代謝において異なることが示唆された。この知見は、微生物代謝の空間的性質についての理解を深めるものであり、他の腸内病原体や宿主常在微生物群集に影響を与える可能性がある。
はじめに
腸内細菌叢は病原性生物による感染から身を守るが、これはコロニー形成抵抗性と呼ばれる現象である(1, 2)。コロニー形成抵抗性には、微生物と微生物の直接的な相互作用と、宿主を介して作用する間接的なメカニズムの両方がある。恒常的な条件下では、複合多糖類をめぐる栄養競合が個体群構造の重要な原動力となる(3, 4)。ほとんどの小栄養素代謝産物は小腸で吸収されるため、大腸で細菌が増殖するための主要な炭素源は、主に食事由来の複合多糖類である。エネルギー的に有利な炭素源の不足と常在細菌との栄養競合が、病原体の排除に寄与している可能性がある(5)。常在腸内細菌は、酪酸、プロピオン酸、酢酸などの短鎖脂肪酸を大量に生成する。短鎖脂肪酸は、病原性サルモネラ菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium：S.Tm）や他の腸内細菌科細菌の増殖を直接阻害する（干渉競争）(6, 7)。さらに、腸内細菌叢による抗菌性毒素の放出は、病原性細菌によるコロニー形成を抑制する(8)。微生物-微生物拮抗作用に加えて、腸内常在細菌は宿主を介した間接的なコロニー形成抵抗性メカニズムにも寄与している。大腸細胞はβ-酸化を通じて酪酸を主要な炭素源として利用する。β-酸化の高い酸素要求性は局所的な酸素欠乏につながり、偏性嫌気性発酵菌の増殖に適した環境を形成する(9, 10)。また、宿主は感染時に抗菌ペプチドを放出することで、病原体のコロニー形成を阻害する(11, 12)。
S. Tmのような腸内病原菌は、微生物叢に基づくコロニー形成抵抗性に対抗するために進化してきた(13)。例えば、コリシンや6型分泌系の産生により、S. Tmは他の腸内細菌科の細菌を抑制することができる（14, 15）。さらに、腸内病原菌によって引き起こされる炎症反応は、代謝産物の利用可能性を変化させる。炎症によって形成されたニッチは病原体の増殖に好都合である(16, 17)。炎症性の活性酸素と窒素種は、粘膜組織を突破した侵入微生物を殺すために局所的に放出される。これらの炎症性ラジカルが腸管内腔に漏出すると、標的外活性が生じる。チオ硫酸の酸化はテトラチオン酸の生成につながり(18)、ペルオキシ亜硝酸塩は硝酸塩に分解する(19)。これらの分子はサルモネラ菌によって終末電子受容体として利用される(18, 19)。さらに、感染によって大腸細胞の代謝が変化すると、酸素が腸管内腔に漏れ出す(20)。終末電子受容体が存在すると、S. Tmは呼吸性中心代謝を行う(21)。これによりS. Tmは有毒な短鎖脂肪酸を分解し、偏性嫌気性発酵菌との栄養競争を回避することができる(13, 21 - 23)。
末端還元酵素は、キノンプールを介して選択的な膜結合型デヒドロゲナーゼと結合し、電子輸送鎖を形成する。マウス腸内では、S. Tmは呼吸性L-乳酸デヒドロゲナーゼ（LldD）を介して宿主由来のL-乳酸を利用する(24 - 26)。LldDはシトクロムbdオキシダーゼを介した酸素呼吸と結合する(24)。S.Tmが感染時にどの呼吸性脱水素酵素を使って硝酸塩呼吸やテトラチオン酸呼吸に電子を供与するかは不明である。そこで我々は、ギ酸デヒドロゲナーゼを中心に、S. Tmの細胞呼吸に関与するデヒドロゲナーゼを調べようとした。
ギ酸代謝は大腸菌で広く研究されている(27)。この生物は2つの呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼ、FDH-NとFDH-Oを産生する。第3のギ酸デヒドロゲナーゼであるFDH-Hは、発酵に関与するギ酸-水素リアーゼ複合体の構成要素である(28)。FDH-NとFDH-Oはそれぞれ3つのサブユニット、FdnGHIとFdoGHIから構成され、対称的な三量体（FdnGHI）3を形成している(29)。大腸菌と同様、S. Tmはin vitroでギ酸を電子供与体として利用する(30)。参照生物である大腸菌K-12 MG1655とS. Tm LT2との比較から、それぞれのFDH-N（FdnGHI）およびFDH-O（FdoGHI）酵素のサブユニットが有意なアミノ酸配列の類似性を示し（図S1）、これらの酵素をコードする遺伝子はオルソログであると推定される。S. Tmも発酵型FDH-Hを産生する(28)。大腸菌とは対照的に、サルモネラの呼吸性ギ酸脱水素酵素の機能についてはほとんど知られていない。本研究では、サルモネラの腸内コロニー形成における呼吸性ギ酸脱水素酵素FDH-NとFDH-Oの生理的役割を調べた。
結果
呼吸性FDHを介したギ酸の利用は、特定の電子受容体の存在下で体力を増強する
FDH-N活性を欠くS. Tmの変異体は以前にも特徴づけられている（31 - 33）。これらの変異体のほとんどについて、バクテリオファージP22を用いて遺伝子座と遺伝子を物理的にマッピングした。全ゲノム塩基配列の解析から、これらの変異は多面的変異である可能性が高く、L-セリル-tRNASecセレン転移酵素、FDH-O、および／またはFDH-Hをコードする遺伝子に変異があった可能性が示唆された。さらに、サルモネラは呼吸電子受容体としてテトラチオン酸を利用するが、大腸菌は利用できない。そこで我々は、S. Tmの呼吸性FDH、FDH-NおよびFDH-Oの生理学的機能を評価することにした（図1）。冗長性の可能性を検討するため、FDH-NとFDH-Oの主要サブユニットを欠損した変異体（fdnG fdoG変異体）を作製し、外因性ギ酸存在下での体力を測定した。腸管内の環境を模倣するため、ブタのムチンを含むブロス（ムチン・ブロス）を用いた。ムチン・ブロスにS. Tm野生株とfdnG fdoG変異株を等量混合して接種した。16時間後、各菌株の存在量を数え、培地中の両菌株の比率を接種液中の両菌株の比率で補正し、競合指数を算出した。野生型株には、同定を容易にするため、病原性における役割が知られていない酸性ホスファターゼをコードするphoNに変異を印した。両菌株は、嫌気性増殖中に外因性電子受容体が存在しない場合でも同様に適合した（図1A）。野生型株は、電子受容体であるテトラチオン酸（嫌気性）、硝酸塩（嫌気性）、酸素（微好気性）の存在下で、fdnG fdoG変異株を上回った。FDH-NとFDH-Oの個々の寄与を評価するために、この実験を繰り返し、fdoG変異体のfdnG fdoG変異体に対するフィットネス（図1B）とfdnG変異体のfdnG fdoG変異体に対するフィットネス（図1C）をそれぞれ測定した。fdoG変異体はテトラチオン酸、硝酸塩、酸素の存在下で二重変異体を上回ったが、fdnG変異体は微好気的条件下でのみ有意な適合性の優位性を示した。一方、fdnG変異体は微好気的条件下でのみ有意な適性優位性を示した。外因性電子受容体がない場合には、いずれの単一変異体にも二重変異体に対する適性優位性は見られなかった（図1BとC）。遺伝的相補性を得るために、fdnG遺伝子とfdoG遺伝子を、染色体上の中立遺伝子座（phoN）に、それぞれの本来のプロモーターの制御下で導入した。これらの結果を総合すると、S. Tm FDH-Oは主にギ酸酸化を酸素呼吸に結合させ、S. Tm FDH-N酵素によって解放された電子は、この実験条件下でさまざまな電子受容体に供与されることが示唆される。
図1

図1 S. Tmはギ酸を嫌気呼吸の電子供与体として利用する。0.5%のブタ胃II型ムチンと2mMのギ酸を含むムチンブロスに、4mMのテトラチオン酸（S4O6 2-）または硝酸塩（NO3 -）を指示通りに添加した。ブロスに各菌株を等量混合して接種し、嫌気的または微好気的条件下（1% O2）で16時間培養した。競争指数は、実験終了時に回収された両菌株の比率を、接種液中の比率で補正して算出した。(A）野生型株（AJB715）とFDH-NおよびFDH-O活性の両方を欠損した変異株（SW1197）の競争力。(B）FDH-Nの寄与を評価するために、FDH-Oを欠失した変異株（MW526）とFDH-NとFDH-O活性の両方を欠失した変異株（SW1197）の競争適性を測定した。(C）FDH-Nを欠損した変異体（MW527）とFDH-NとFDH-O活性の両方を欠損した変異体（SW1197）の競争力をFDH-Oの寄与を評価して決定した。バーは幾何平均±幾何標準誤差を表す。各ドットは1生物学的複製を表す。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns, 統計的に有意でない。
呼吸性ギ酸脱水素酵素はマウス大腸内でS. Tmの体力を向上させる
次に、サルモネラ誘発大腸炎のマウスモデルにおいて、S. Tmのギ酸代謝を調べた。C57BL/6マウスにストレプトマイシンを経口投与すると、S. Tm感染に対する感受性が高まる（34, 35）。このモデルでは、腸組織の炎症浸潤は好中球が支配的であり(35)、ヒトの非チフス性サルモネラ感染と類似している(36, 37)。S.Tm野生株とfdnG fdoG変異体、野生株とfdnG変異体、または野生株とfdoG変異体の等量混合物をストレプトマイシン処理マウス群に感染させ、感染4日後の糞便および結腸内容物中の各菌株の存在量を測定した（図2AおよびB）。野生型株はfdnG fdoG二重変異体よりも多く回収され、呼吸性FDH活性がS. Tmの感染時の適性を高めていることが示された。単一変異株（fdnG変異株およびfdoG変異株）は野生株と同程度の適合性を示したことから（図2AおよびB）、この動物モデルではFDH-NとFDH-OがS. Tm感染時に冗長な役割を果たしている可能性が示唆された。
図2

図2 呼吸性ギ酸脱水素酵素はマウス腸管におけるS. Tmの適合性を高める。(AおよびB）ストレプトマイシンで前処理したC57BL/6マウスに、野生型（WT）株（AJB715）と、呼吸性ギ酸脱水素酵素活性（SW1197）、FDH-N活性（SW1195）またはFDH-O活性（SW2182）を欠損した変異株（SW2182）を等量混合して経口感染させた。感染4日後の盲腸内容物（A；灰色バー）と結腸内容物（B；黒バー）における競争適性を測定した。バーは幾何平均±幾何標準偏差を表す。(C）S.Tm野生株（IR715）または呼吸性ギ酸脱水素酵素欠損変異株（SW1197）を感染させた模擬処置C57BL/6マウスおよびストレプトマイシン前処置C57BL/6マウスの結腸内容物中のギ酸濃度をガスクロマトグラフ質量分析法により測定した。棒グラフは平均値±標準誤差を表す。(D）CBAマウスの群に野生型株を経口感染させた。7日後、大腸内容物中のギ酸濃度をガスクロマトグラフィー質量分析法により定量した。棒グラフは平均値±標準誤差を示す。(E）野生型（WT）株（AJB715）と呼吸性ギ酸脱水素酵素活性を欠く変異株（SW1197）の等量混合物をCBAマウスに経口感染させた。感染7日後の盲腸内容物（灰色バー）と結腸内容物（黒バー）における競争適性を測定した。バーは幾何平均±幾何標準偏差を表す。各ドットは1匹の動物から得られたデータを表す。*p < 0.05; ***p < 0.001。
我々は以前、非感染性大腸炎モデルマウスにおいて、マウス管腔内のギ酸濃度が上昇することを示した(38)。S.Tm誘発性大腸炎中にギ酸濃度が上昇するかどうかを評価するため、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて糞便内腔のギ酸濃度をモニターした（図2C）。ストレプトマイシンで治療し、S. Tm野生型株に感染させたマウスは、模擬治療動物（0.48μmol/g）と比較して、ギ酸濃度が有意に上昇した（1.5μmol/g）。ギ酸の濃度は、S. Tmが呼吸によってギ酸を利用する能力（fdnG fdoG変異体）を不活性化すると、さらに上昇した（3.6 µmol/g）。
ストレプトマイシンの経口投与は腸内細菌叢の組成を乱す（16, 39）。そこで我々は、微生物叢が乱れていない状態で、S. Tmがギ酸を利用するかどうかを調べた。C57BL/6マウスとは異なり、CBAマウスはS. Tmに感染しても生存し、感染後7〜10日の間に大腸で好中球性の炎症反応を起こす(21)。CBAマウスモデルでは、S. Tm感染後7日目に結腸内腔のギ酸濃度が有意に上昇する（図2D）。さらに、FDH-NとFDH-Oは盲腸と結腸の内容物において体力的に有利である（図2E）。我々は、呼吸性ギ酸脱水素酵素を介したギ酸の利用が、マウス大腸におけるS. Tmの適性を高めると結論づけた。
マウス腸内におけるギ酸酸化は、いくつかの炎症由来の電子受容体と結合している
次に、どの電子受容体がマウス腸内でのギ酸酸化を可能にするのかを明らかにしようとした。つの硝酸還元酵素（NR変異体）、テトラチオン酸還元酵素（ttrA変異体）、酸素呼吸（cydA変異体）を欠損した株で、競合的コロニー形成アッセイを行った（図3AおよびB）。FDH-NとFDH-Oによってもたらされる生長利点は、硝酸塩およびテトラチオン酸呼吸がない場合でも観察され、シトクロムbd-IIオキシダーゼを介した酸素呼吸がない場合はさらに顕著であった。これらの所見を説明する一つの理由は、これらの異なる電子受容体の利用における潜在的な冗長性であろう。この考えと一致するように、硝酸呼吸、テトラチオン酸還元、チトクロームbd-IIオキシダーゼを介した酸素呼吸を利用する能力を取り除くと、FDH-NとFDH-Oはフィットネス優位性を示さなくなった（図3AとB）。
図3

図3 S. Tmの腸内共生において、呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼは複数の冗長な好気性および嫌気性終末還元酵素に結合する。(AおよびB）ストレプトマイシンで前処理したC57BL/6マウスに、S. Tm野生株（IR7）とTm野生株（IR8）の等量混合株を経口感染させた。Tm野生株（IR715）と呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株（SW1197）、あるいは硝酸還元酵素（NR）欠損株（MW485 vs MW486）、テトラチオン酸還元酵素欠損株（MW561 vs MW562）、シトクロムbd-II酸化酵素欠損株（MW496 vs MW550）、あるいは前述の還元酵素活性をすべて欠損した株（MW412 vs MW413）を等量混合して経口感染させた。感染4日後の盲腸内容物（A）と結腸内容物（B）における競争力を測定した。(CおよびD）ストレプトマイシンで前処理したC57BL/6マウスに、S. Tm野生株（IR715）と呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株（SW1197）の等量混合株、または無病原性株（T3SS1/2；SW1401）と呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼを欠損した無病原性株（T3SS1/2 ΔfdnG ΔfdoG；SW1201）の混合株を経口感染させた。感染4日後の盲腸内容物（C）と結腸内容物（D）における競争力を測定した。バーは幾何平均±幾何標準誤差を表す。各点は1匹を表す。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。
硝酸塩とテトラチオン酸は、腸管内腔における炎症性活性酸素および窒素代謝の副産物として生成されることが示されている(18, 19)。さらに、炎症時には腸管内腔の酸素利用率が上昇する(9, 20)。そこで我々は、S. Tm感染時のギ酸利用に炎症が必要であるかどうかを調べた。つのIII型分泌系を不活性化すると、S. Tmは非侵襲性となり、組織内で複製できなくなる(40)。ギ酸の酸化によってもたらされる適性上の利点は、III型分泌系（T3SS1/2）の両方がない場合には消失した（図3CおよびD）。これは、炎症によって大腸内の代謝産物ランドスケープが再構築されると、硝酸塩、テトラチオン酸、酸素の利用可能性が高まるという考えと一致する。
S. Tmは微生物叢だけでなく、自身の代謝によって産生されたギ酸も利用する。
非感染性大腸炎のマウスモデルにおいて、常在性大腸菌は主に微生物叢由来のギ酸を利用することから（38）、S. Tmが利用するギ酸も腸内細菌叢によって生成されると考えた。大腸菌とMethanobrevibacter smithiiにギ酸を相互供給するバクテロイデス・テタイオタミクロンを、同胞性マウスにコロニー形成させた(41)。次に、B. thetaiotaomicronにコロニー形成させたマウス群と模擬処理したマウス群に、S. Tm野生株とfdoG fdnG変異株を感染させ、サルモネラのコロニー形成を測定した。ギ酸の酸化はB. thetaiotaomicronの存在下でも非存在下でも同程度のフィットネスアドバンテージをもたらしたことから（図4A）、S. Tmは食餌性ギ酸にアクセスするか、中心代謝の一部としてギ酸を産生することが示唆された。
図4

図4 S. Tmピルビン酸ギ酸リアーゼ活性は、S. Tmがアクセスするギ酸プールに寄与している。(A) S. Tm野生株（AJB715）とΔfdnG ΔfdoG 変異株（SW1197）を等量混合し、B. thetaiotaomicronと接触させたか、または模擬的に処理したGnotobiotic Swiss Websterマウスに感染させた。感染3日後に結腸内容物の競合指数を測定した。(B-D）ストレプトマイシンで前処置したC57BL/6マウスに、標記菌株を等量混合して経口感染させた。1群には野生株（AJB715）とΔfdnG ΔfdoG 変異株（SW1197）を感染させ（黒棒）、1群にはピルビン酸ギ酸リアーゼ欠損変異株（pfl；MW519）とギ酸デヒドロゲナーゼ／ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性欠損変異株（pfl ΔfdnG ΔfdoG； MW525）（薄いグレーのバー）、1群はピルビン酸ギ酸リアーゼ欠失変異体（pfl；MW519）、ギ酸デヒドロゲナーゼ／ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性欠失変異体（pfl ΔfdnG ΔfdoG；MW525）、ギ酸デヒドロゲナーゼ欠失変異体（ΔfdnG ΔfdoG変異体；SW1197）（濃いグレーのバー）に感染させた。(B）実験デザインの概略図。(C）盲腸内容物における1株と2株の競争力。(D）結腸内容物における1株と2株の競争力。棒グラフは幾何平均±幾何標準誤差を表す。各点は1匹を表す。*P＜0.05；nsは統計的に有意でない。
ギ酸の起源をよりよく理解するために、3つのピルビン酸-ギ酸リアーゼ（pflB、pflD、pflF）と2つの機能を持つピルビン酸-ギ酸リアーゼ/2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ（tcdE）を欠損したS. Tm変異体（pfl変異体）を作製した。In vitroでは、FDH-NとFDH-Oは、外因性ギ酸を添加しない場合でも、テトラチオン酸存在下の嫌気的条件下で、野生型細胞より体力的に有利である（図S3）。この成長優位性は、pfl変異体バックグラウンドでは観察されず（pfl変異体 vs pfl fdnG fdoG変異体）、成長培地にギ酸を添加すると回復した（図S3）。これは、ギ酸が混合酸発酵の一部として生育培地に放出され、FDH-NとFDH-Oによって利用されることを示唆している。
ストレプトマイシン処理マウスモデルにおけるギ酸の異なる供給源の寄与を評価するため、ギ酸を産生するが消費は妨げない株（fdnG fdoG変異株）の存在下または非存在下でのpfl変異株とpfl fdnG fdoG変異株の競争適合性を分析した。各菌株は異なる抗生物質耐性マーカーを持っており、各菌株の細菌コロニー形成をモニターすることができる（図4B）。FDH-NとFDH-Oがもたらす適合性の優位性は、ピルビン酸-ギ酸リアーゼ/2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ非存在下の糞便内容物では有意に減少した（図4C）。大腸内容物でも同様の傾向が見られたが（図4D）、この差は統計的に有意ではなかった。fdnG fdoG変異体をpfl欠損株に交配すると、pfl変異体バックグラウンドにおけるギ酸酸化によってもたらされる体力表現型が回復した（図4CおよびD）。したがって、ピルビン酸-ギ酸リアーゼ/2-ケト酪酸ギ酸リアーゼ活性によって産生されたギ酸はS. Tmによって排泄され、内膜ペリプラズム側のFDH-NとFDH-Oによって利用されると結論した。S.Tmはまた、微生物叢由来のギ酸にもアクセスしている可能性が高い。pfl変異体バックグラウンドでは、ギ酸酸化におけるわずかな成長優位性が残っているからである（図4CおよびD）。
ギ酸酸化は粘液層に存在するサルモネラ細胞で優先的に起こる
サルモネラは内腔と粘液層の両方にコロニーを形成する。サルモネラの亜集団は病原性遺伝子の発現に違いがあるが(42)、代謝に違いがあるかどうかは不明である。この疑問を解決するため、S. Tm感染gnotobioticマウスの感染1日後と2日後に管腔内容物と粘液層を採取し、RT-qPCRでpflB、fdoG、fdnG、napAのmRNAレベルを評価した（図5AとB）。これらすべての遺伝子のmRNAレベルにおいて、初期の時点では有意差は認められなかったが、2日後には管腔集団と比較して粘液関連サブ集団でmRNAレベルが顕著に増加した（図5B）。
図5

図5 ギ酸の酸化は粘液層で優先的に起こる。(AおよびB）同胞性のスイス・ウェブスターマウスにS. Tm野生型株を経口感染させた。感染1日後（A）および2日後（B）に、大腸粘液擦過物および管腔内容物からRNAを抽出し、fdoG（黒棒）、fdnG（薄灰色棒）、pflB（白棒）、およびnapA（濃灰色棒）のmRNAレベルを測定した。 mRNAレベルはgmkで正規化した。(CおよびD) S. Tm野生株(AJB715)とΔfdnG ΔfdoG 変異体(SW1197)の等量混合物を同系統のスイス・ウェブスター・マウスに経口感染させた。感染1日後（A）と2日後（B）に結腸内容物と粘液の競合指数を測定した。バーは幾何平均±幾何標準偏差を表す。各点は1匹を表す。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001
ギ酸利用における違いが体力に変化をもたらすかどうかを調べるため、gnotobioticマウスに野生型とfdnG fdoG変異体の混合株を感染させ、感染1日後と2日後に粘液層と管腔内容物の体力を評価した（図5CとD）。転写解析と一致して、野生型株とギ酸酸化欠損変異体は、1日目には内腔と粘液層で等しく適合していた。2日目には、野生型株はどちらの環境でもギ酸酸化欠損変異株を上回ったが、表現型の大きさは粘液層に存在する細菌で有意に高かった。これらの実験から、FDH-NとFDH-Oを介したギ酸の消費は、粘液層に関連する細菌で優先的に起こることが示唆された。
考察
腸内コロニー形成中、S. Tmはテトラチオン酸、硝酸塩、酸素の利用可能性の増加に依存する多彩な呼吸代謝を示す(43, 44)。テトラチオン酸塩と硝酸塩は反応性窒素代謝と酸素代謝の副産物として生成されるが、S. Tm感染時の酸素流入は炎症に伴う宿主細胞代謝の変化の結果である。膨大な数の外因性電子受容体を還元する能力は、S. Tmをほとんどの常在細菌と区別する特性であり、S. Tmが腸内細菌叢に打ち勝つことを可能にしている(45)。ここで我々は、呼吸性ギ酸脱水素酵素が、キノンプールに電子を供与し呼吸をサポートすることで、この炎症に適応した代謝の重要な構成要素であることを証明した。
呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼは、末端還元酵素と電子輸送鎖を形成する。これら2つの酵素の活性はキノンプールを介して結びついているだけでなく、これらのタンパク質複合体は物理的にも相互作用し、超複合体を形成する(46)。腸内細菌の硝酸還元酵素、シトクロムbd-IIオキシダーゼ、テトラチオン酸還元酵素、呼吸性ギ酸デヒドロゲナーゼはいずれも真のプロトンポンプ活性を示さないと考えられているので、プロトンの移動は、プロトンの消費反応と生成反応が細胞質膜の別々の側で起こる2つの半分の酸化還元ループ（スカラー化学）を通じて達成されると考えられる（47）。
呼吸は細胞エネルギーの生成効率が高いだけでなく、S. Tmがエタノールアミン、1,2プロパンジオール、乳酸などの発酵性の低い炭素源にアクセスすることを可能にする(21, 23, 24, 48)。これらの化合物は最終的にアセチル-CoAやピルビン酸などの中間代謝の主要分子に変換され、生合成のためのビルディングブロックとして利用される。対照的に、ギ酸は酸化されて二酸化炭素になり、おそらく環境に失われる。このように、FDH-NとFDH-Oによってもたらされるフィットネスの優位性は、呼吸のための電子供与体としてのエネルギー代謝に関係していると考えられる。
呼吸型ギ酸デヒドロゲナーゼは、基質の利用可能性に応じて特定の末端還元酵素と結合する。例えば、FDH-Nは培養液中に硝酸塩が存在する場合、硝酸還元酵素、特にNarGHIとカップリングし、一方、試験管内の微好気条件下ではFDH-Oが優勢な酵素である。大腸菌では、カップリングは主に遺伝子発現によるものである(33)。非感染性大腸炎のマウスモデルにおいて、常在性大腸菌は最適な腸内コロニー形成のためにFDH-Nに依存している。in vitroの条件下とは異なり、マウス炎症腸内ではFDH-Nはシトクロムbd-IIを介した酸素呼吸に結合する(38)。今回の研究では、in vitroの微好気的条件下ではS. TmのFDH-Oが優勢な酵素であり、FDH-Nを介したギ酸酸化は硝酸塩、テトラチオン酸、酸素の還元と結合していることが観察された。大腸菌とは対照的に、S. Tmはネズミの腸内ではギ酸酸化にこれら3つの電子受容体すべてを用いる。サルモネラ菌のFDH-NとFDH-Oの発現を制御する手がかりや遺伝的因子は不完全にしか解明されておらず、さらなる研究が必要である。
ギ酸の利用は、サルモネラ感染症のさまざまな動物モデルで起こる。サルモネラのコロニー形成因子の遺伝子スクリーニングにより、セレノシステイン生合成がニワトリのコロニー形成に重要な因子であることが同定された(49)。つのFDHは、大腸菌とサルモネラ菌が産生することが知られている唯一のセレンタンパク質である(50 - 52)。セレノシステインを産生できない変異体（selD）はin vitroでギ酸を代謝できない。ニワトリにおけるselD変異体のコロニー形成不全は、ギ酸代謝がこの動物におけるS. Tmの適性を高める可能性が高いことを示唆している。ニワトリの腸におけるselD変異体の欠損が、呼吸性FDH-NおよびFDH-Oの欠損によるものなのか、発酵性FDH-H活性の欠損によるものなのかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
ギ酸はエネルギー代謝に重要なだけでなく、病原性因子の発現を制御する手がかりとしても機能する。ギ酸は、SPI-1転写の主要な制御因子をコードするhilAとhilDを標的とすることで、S. Tmの侵入関連（SPI-1）III型分泌系の産生を誘導する(53, 54)。さらに、ギ酸は細胞内ステージで赤痢菌の病原性遺伝子発現を誘導する(55)。
局所的に利用可能な栄養素は、腸管内腔における微生物代謝を形成し、マイクロハビタットの形成に寄与する。ホメオスタシスが乱れると、上皮細胞と浸潤食細胞の両方が硝酸塩産生に寄与する(56, 57)。S. Tmが誘発した大腸炎では、S. Tmは主に食細胞由来の硝酸塩を利用し、一方、大腸菌は抗生物質誘発性腸内異常症の際に上皮細胞由来の硝酸塩を利用する（57）。抗生物質による不健全な環境では、S. Tmの不利な株は上皮由来の硝酸塩を利用できないので、これらのニッチはユニークであると思われる。細胞死を起こした上皮細胞は腸管内腔にピルビン酸を放出し、S. Tm菌にエネルギー的に価値のある炭素源を提供する(58)。我々の研究では、ピルビン酸ギ酸リアーゼはS. Tmが利用するギ酸の一因であった。宿主由来のピルビン酸は、S. Tmではピルビン酸ギ酸リアーゼPflBによって代謝された(58)。また、S. Tm感染時に上皮細胞から放出されるL-乳酸（24, 25）がサルモネラに取り込まれ、ピルビン酸に変換されることも考えられる。ギ酸利用が粘液層に関連するS. Tm菌で優先的に起こるという我々の発見は、呼吸を介したギ酸酸化に依存する疾患特異的・生息特異的代謝の存在を示唆している。我々の研究の限界のひとつは、ストレプトマイシンの投与によって腸内細菌叢の組成が変化することであり、抗生物質未投与の動物のS. Tm感染におけるギ酸の正確な起源が不明瞭になる可能性がある。
大腸上皮と密接な関係にあるマウスの病原体Citrobacter rodentiumは、FDH-Nを用いてマウスの腸管に定着することが遺伝学的に示唆されている(59)。サルモネラ菌に関する我々の研究は、シトロバクター菌におけるこの観察に裏付けられ、腸管内膜付近で呼吸性ギ酸脱水素酵素を介したギ酸利用が、腸内病原体に共通する代謝的特徴である可能性を提起している。
不思議なことに、ギ酸や他の短鎖脂肪酸は家畜の感染を防ぐために飼料に添加されている（60, 61）。この考え方は、微生物の利用を決定するのは、単にある代謝産物の入手可能性だけでなく、その地域の状況も重要であることを示唆している。ギ酸塩を飼料に添加することで、腸内細菌叢の組成が変化することは考えられる。例えば、腸内細菌科の細菌はギ酸を電子供与体として利用し、哺乳類の腸内で呼吸を通じて成長を支える(38)。大腸菌の呼吸は、大腸炎や抗生物質治療など、マウス腸内の様々な環境で起こる(38, 62, 63)。腸内細菌科細菌の存在は、マウスにおけるサルモネラのコロニー形成を阻害する（15, 64 - 66）。家畜に治療量以下の抗生物質を投与すると、家畜の成長を促進するために飼料に添加されるのが一般的であるが、腸内細菌科細菌の腸内での呼吸を可能にしている可能性がある。そのため、食餌性ギ酸塩と治療量以下の抗生物質の併用は、常在腸内細菌によるコロニー形成を促進し、サルモネラ菌のコロニー形成に対する抵抗性を高める可能性がある。また、食餌性ギ酸塩を大量に摂取すると、腸内のさまざまな部位でこの代謝物の濃度が上昇し、T3SS-1の適切な発現が妨げられる可能性がある(53)。我々の研究は、S. Tm感染中、呼吸に必要な電子受容体が組織から放出され、S. Tmがギ酸酸化を行うのに適した局所的代謝微小環境に寄与していることを示唆している。
材料と方法
細菌株と変異体
本研究で使用した菌株を表1に示す。すべてのS. Tm変異体は、14028Sのナリジクス酸耐性誘導体であるIR715で作製した(67)。特に断りのない限り、S. Tm株および大腸菌株は、リゾジニー・ブロス（LB；10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、10 g/L塩化ナトリウム）またはLBプレート（10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、10 g/L塩化ナトリウム、15 g/L寒天）中で、37℃で好気的に培養した。抗生物質はLBおよびLBプレートに以下の最終濃度で添加した：カルベニシリン（Carb）、100 mg/L；ナリジクス酸（Nal）、50 mg/L；カナマイシン（Kan）、100 mg/L；およびクロラムフェニコール（Cm）、15 mg/L（すべてSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国）。S.TmゲノムのphoN遺伝子は中性遺伝子座であるため、すべての競合適性実験に酸性ホスファターゼ欠損株を用いた(21)。酸性ホスファターゼ（PhoN）活性を検出するため、5-ブロモ-4-クロロ-3-イン ドリルホスフェート（X-phos, Chem-Impex, Wood Dale, IL, USA）をLBプレートに100 mg/Lの濃度で添加した。
表1
表1 本研究で使用した菌株
菌株 遺伝子型
バクテロイデス・テタイオタミクロン
ATCC29148 (VPI 5482) Δtdk (68)
大腸菌
DH5⍺ λpir F- endA1 hsdR17 (r-m+) supE44 thi-1 recA1 gyrA relA1 Δ(lacZYA-argF) U189 f80lacZΔM15 λpir (69)
S17-1 λpir C600::RP4 2-(Tet::Mu) (Kan::Tn7) λpir recA1 thi pro hsdR (r- m+) (70)
サルモネラ エンテリカ セロバー ティフィムリウム
ATCC14028 野生型株 ATCC
IR715 ATCC14028の完全病原性自然 発生型ナリジクス酸耐性誘導体 (71)
2026 ATCC14028 ΔfdnG::CmR (72)
5179 ATCC14028 ΔfdoG::KanR (72)
SW1195 IR715 ΔfdnG::CmR 本研究
SW2182 IR715 ΔfdoG::KanR 本研究
SW1197 IR715 ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR この試験
AJB715 IR715 phoN::KanR (73)
SW284 IR715 ΔphoN::CmR (74)
MW526 IR715 ΔfdoG::KanR phoN::KanR 本研究
MW527 IR715 ΔfdnG::CmR phoN::KanR 本研究
RC141 IR715 ΔfdoG::KanR phoN::pRC29 (fdoG +) この試験
RC142 IR715 ΔfdnG::KanR phoN::pRC30 (fdnG +) 本研究
SPN487 IR715 ΔinvA ΔspiB (20)
SW1401 IR715 ΔinvA ΔspiB phoN::Kan R (21)
SW1201 IR715 ΔinvA ΔspiB ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
SW661 IR715 ttrA::pSW171 (18)
MW561 IR715 ttrA::pSW171 phoN::KanR 本研究
MW562 IR715 ttrA::pSW171ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
CG40 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA この試験
MW485 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA phoN::KanR この試験
MW486 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
MW472 IR715 ΔcydA 本研究
MW496 IR715 ΔcydA phoN::KanR 本研究
MW550 IR715 ΔcydA ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR この研究
MW559 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA ΔcydA この試験
MW409 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA ΔcydA phoN::KanR この試験
MW411 IR715 ΔnapA ΔnarZ ΔnarG ΔcydA ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
MW412 IR715 ΔnarG ΔnarZ ΔnapA ΔcydA ttrA::pSW171 phoN::KanR 本研究
MW413 IR715 ΔnapA ΔnarZ ΔnarG ΔcydA ttrA::pSW171 ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
MW364 IR715 ΔpflF ΔpflD ΔtdcE 本研究
MW548 IR715 ΔpflF ΔpflD ΔtdcE phoN::CmR この試験
MW519 IR715 ΔpflF ΔpflD ΔtdcE phoN::CmR pflB::pMW304 本研究
MW557 IR715 ΔpflF ΔpflD ΔtdcE ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR 本研究
MW525 IR715 ΔpflF ΔpflD ΔtdcE ΔfdnG::CmR ΔfdoG::KanR pflB::pMW304 本研究
本研究で使用したプラスミドを表2に示す。新しいプラスミドはGibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)を用いて作製した。Q5 Hot Start High Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs）を用い、S. Tm IR715を鋳型としてDNA断片を増幅した。変異誘発に用いたプライマーを表3に示す。自殺プラスミドは大腸菌DH5α λpirで増殖させた。pCG15、pCG25およびpCG27を作製するために、narG、narZおよびnapAの上流および下流領域をPCR増幅し、ギブソンアセンブリー反応を用いてSphI消化したpRDH10に挿入した。同様に、プラスミドpMW301, pMW302, pMW303については、pflD, pflF, tdcEの上流および下流領域からなるDNA断片をSphI消化したpGP706に導入した。pMW304を作製するために、S. Tm pflB遺伝子の内部断片をPCRで増幅し、ギブソンアセンブリー反応を用いてpGP704のSphI部位にクローニングした。fdoGとfdnGのプロモーターとコード配列をPCRで増幅し、SphIで消化したpSW327にライゲーションして、それぞれpRC29とpRC30を作製した。インサートとキー断片のDNA配列はサンガー配列決定で確認した。
表2
表2 本研究で使用したプラスミド
プラスミド 関連する特性 ソースまたは参照
pRDH10 oriR6K mobRP4 cat sacRB, Tetr (67)
pSW327 oriR6K mobRP4 bla 'phoN' (21)
pGP704 oriR6K mobRP4 bla (75)
pGP706 oriR6K mobRP4 sacRB KanR (24)
pCG15 pRDH10 の S. Tm narG の上流および下流領域 本研究
pCG25 pRDH10におけるS. Tm narZの上流および下流領域 本研究
pCG27 pRDH10におけるS. Tm napAの上流および下流領域 本研究
pCG124 pRDH10におけるS. Tm cydAの上流および下流領域 (24)
pMW301 pGP706におけるS. Tm pflDの上流および下流領域 本研究
pMW302 pGP706におけるS. Tm pflFの上流および下流領域 本研究
pMW303 pGP706におけるS. Tm tdcEの上流および下流領域 本研究
pMW304 S. Tm pflB の内部断片（pGP704） 本研究
pRC29 S. Tm fdoG プロモーターおよびコード配列（pSW327） 本試験
pRC30 S. Tm fdnG プロモーターおよびコード配列（pSW327） 本試験
表3
表3 本研究で使用したオリゴヌクレオチド
ターゲットヌクレオチド配列
S. Tm narG；欠失変異体5′-GCCATCTCCTTGCATGACTGGCGGCGCTTTCAA-3′。
5′-ccgccttgttgtggtggtacgtaagatgaag-3′。

5′-caaggaatggtgcatgctgtatctggcgaccttcg-3′．
S. Tm narZ；欠失変異体 5′-GCCATCTCCTTGCATGAATTTCCCGACGTAAACATTC-3′．
5′-GTATTTCATTGTTTAAGTAACGAAAGCG-3′．
5′-ctttaaacaaatgaaaatacgctcacaggttgg-3′-ctttaaacaaatacgctcacaggttgg
5′-caaggaatggtgcatgggcagccgctgatacaca-3′．
S. Tm napA；欠失変異体 5′-GCCATCTCCTTGCATGTTGCCGCAGCCGTACAG-3′．
5′-GAAAGCTAAATGTCCGTACAGCGAAACC-3′-D
5′-CGGGACATTAGCTTCTCATAAAGCTACGAC-3′（カグガカットタグクトカタアガクトカガク-3′）。
5′-caaggaatggtgcatggacctattttctcgcacattg-3′．
S. Tm pflD；欠失変異体 5′-CTAGAGGTACCGCATGCTGGAAGGCAAGCTGGGTT-3′．
5′-GCTGTAGCCTTATCGGGCCTGAGC-3′の
5′-ccgataaggctacagcgccttctttg-3′-ccgataaggctacagcgccttctttg-3
5′-agctcgatcgcatgcgtttcaatagcacaaggaac-3′．
S. Tm pflF；欠失変異体 5′-CTAGAGGTACCGCATGCGCTAACCCGGCATGAATC-3′．
5′-ACTGAAACTCCTGATGCGCTACGTTT-3′。
5′-ccatcaggagtttcagttgggtcatgataattatc-3′．
5′-agctcgatcgcatgcgatcatggcgacggtactg-3′．
S. Tm tdcE；欠失変異体 5′-CTAGAGGTACCGCATGCTTTCACAGCGTCAACAGTTC-3′．
5′-GCGATGCGCGACGATCTCGCTG-3′-GCGATGCGCGACGATCTCGCTG
5′-ccgtcgcgcatatcgctggtatcgatatttac
cttcatgaaaaataatctc-3′．
5′-agctcgatcgcatgcatggggactcgcagcggc-3′．
S. Tm pflB；挿入変異5′-CTAGAGGTACCGCATGTCATTGGTCCAGCTCGC-3′。
5′-AGCTCGATCGCATGACACTCCGTATGAGGGTG-3′．
S. Tm fdnG；相補性5′-GCTTCTAGGTACCGCATGCCCTTACGCCTTCTCGATG-3′。
5′-atcgagctcgatcgcatgcgcaaaaaagttatcgattttgc-3′．
S. Tm fdoG；相補性5′-GCTTCTTAGAGGTACCGCATGTTACCTTTTCCACGTTC -3'
5′-ATCGAGCTCGATCGCATGGCTTACCTTCCACGTTC -3'
S. Tm fdnG；RT-qPCR5′-CATAGCCGTTGTTCTTTC-3′。
5′-actattgaagatgagctggaac-3′．
S. TmのfdoG；RT-qPCR 5′-ATAGCCAGTGAACAGACC-3′．
5′-tactgacattgccttctt-3′．
S. Tm napA；RT-qPCR5′-TGAAAGAGAAAGGACCAGAAGCG-3′。
5′-TTGTAGAGCGAAACCAGCG-3′。
S. Tm pflB；RT-qPCR5′-TTTGCCTGCTTTCAGGTCAC-3′。
5′-GCTCAGGAAGCAATCCAGTG-3′である。
S. Tmのgmk；RT-qPCR 5′-TTGGCAGGGAGGCGTTT-3′。
5′-GCGCGAAGTGCCGTAGTAAT-3′．
変異導入のために、プラスミドを大腸菌S17-1 λpirに導入し、これを適切なS. Tm株への結合のためのドナー株とした。S17-1λpirドナーとS. Tmレシピエントの1:1混合物をLBプレートに広げ、37℃で一晩培養した。コンジュゲーション後、Cm（pRDH10誘導体）、Carb（pGP704およびpSW327誘導体）、またはKan（pGP706誘導体）を添加したLBプレートに菌をまき、1回のクロスオーバーが起こったクローンを選択した。これらの株の純粋培養を、LBブロス中で37℃で一晩培養した。スクロースプレート（5%スクロース、15g/L寒天、8g/L栄養ブロスベース；Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）にプレーティングすることにより、カウンターセレクションを行い、2回目のクロスオーバーが起こったクローンを回収した。プラスミドpCD15、pCG25、およびpCG27をそれぞれ用いてこの変異誘発戦略を繰り返すことにより、IR715のnarG、narZ、およびnapAのきれいな無標識欠失を作製し、CG40を生じた。MW472とMW559は、pCG124を用いてIR715とCG40にこの変異誘発戦略を適用することにより作製された。同様に、プラスミドpMW301、pMW302、pMW303を用いてIR715のpflF、pflD、tdcEの無標識欠失を作製し、MW364を得た。MW519株、MW525株、RC141株、RC142株を作製するために、プラスミドpMW304、pRC29、pRC30をそれぞれMW548株、MW557株、SW2182株、SW1195株に接合した。CarbとNalを含むLB寒天培地にプレーティングして、1回のクロスオーバー（プラスミド挿入）事象が起こったクローンを得た。きれいな欠失と挿入変異はPCRで確認した。
抗生物質耐性遺伝子でマークされた変異は、P22を用いたファージ導入によって異なる株背景に導入された。ファージ溶解液は、4 mLのP22ブロス（LB、2 g/Lグルコース、E最小培地、〜108 pfu/mL P22 HT-int）（76）に1 mLの一晩培養液を接種して調製した。37℃で12時間好気培養した後、培養液を遠心分離し、上清を0.2mLのクロロホルムで滅菌した。トランスダクションのために、ファージ溶解物の10倍連続希釈液0.1mLをレシピエントの一晩培養液0.1mLと混合し、室温で1時間インキュベートした後、適切な抗生物質を含むLB寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーをエバンスブルー・ウラニン（EBU）寒天プレート（10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、5g/L NaCl、2.5g/Lグルコース、15g/L寒天、5g/L K2HPO4、12.5mg/Lエバンスブルー、25mgフルオレセインナトリウム塩）にストリークした（77）。白色コロニーは、P22 H5とのクロスストリークを用いてファージ耐性を評価した。選択寒天平板でシングルコロニーを得た。2026株および5179株のΔfdnG::CmRおよびΔfdoG::KanR変異をそれぞれIR715、SW1195、SPN487、CG40、MW472、MW559およびMW364に導入し、それぞれSW1195、SW2182、SW1197、SW1201、MW486、MW550、MW411およびMW557を作製した。AJB715とSW284のphoN::KanRとΔphoN::CmR変異をCG40、MW559、MW364に導入し、それぞれMW485、MW409、MW548を作製した。同様に、SW661のttrA::pSW171変異をAJB715、SW1197、MW409、MW411に導入し、それぞれMW561、MW562、MW412、MW413を作製した。
In vitro増殖実験
競合増殖実験は(18, 21)に記載されているように行った。簡単に述べると、生のブタ胃II型ムチン（Sigma-Aldrich）を70％（vol/vol）エタノールに懸濁し、65℃で2時間インキュベートした後、室温で一晩インキュベートした。エタノールは真空遠心機で穏やかに加熱しながら蒸発させた。滅菌したムチンを無炭素E培地（0.2g/L MgSO4七水和物、3.9g/L KH2PO4、5.0g/L 無水K2HPO4、3.5g/L NaNH4HPO4四水和物；Sigma-Aldrich）に懸濁した（78, 79）。ムチンの最終濃度は0.5%（wt/vol）であった。ギ酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、およびテトラチオン酸カリウム（すべてSigma-Aldrich）を滅菌水に溶解し、フィルター滅菌し、最終濃度がそれぞれ2 mM（ギ酸ナトリウム）または4 mM（硝酸ナトリウム、テトラチオン酸カリウム）になるように添加した。嫌気的増殖実験では、培地を嫌気チャンバー（Bactron EZ; Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR, USA）で一晩プレインキュベートした。嫌気チャンバー内の雰囲気は、二酸化炭素5％、水素5％、窒素90％であった。酸素がないことは日常的に確認されている（Oxoid, Basingstoke, Hampshire, United Kingdom）。接種液を調製するため、細菌株をLBで一晩、37℃の好気条件下で前培養した。2mlのムチン・ブロスに1×103 CFU/mLの各菌株を接種し、嫌気チャンバーまたは低酸素チャンバー（1％酸素、99％窒素；Coy Lab Products社、米国ミシガン州グラスレイク）で37℃、16時間培養した。接種株と最終培養株の連続希釈液を、X-phos添加LBプレートにまいた。競合指数は、最終培養における2つの対象株の比率を、接種株における対応する比率で補正することにより算出した。
マウス実験
すべての実験は、UT SouthwesternおよびUC DavisのInstitutional Animal Care and Use Committeesの方針に従って行われた。従来のC57BL/6およびCBAマウスは、もともとThe Jackson Laboratoryから入手した。その後、UT SouthwesternおよびUC Davisのバリア施設において、特定の病原体フリー条件下で飼育された。無菌のスイス・ウェブスター・マウスはプラスチック製のグノトビオティック・アイソレーターで飼育された。すべての部屋は12時間の明暗サイクルであった。マウスは実験期間中、餌と水を自由に摂取した。実験には8～10週齢の雌雄マウスを用いた。各処置群では雌雄が均等になるように努めた。明らかな性差は認められなかった。
ナイーブCBAマウスに1×109 CFUのS. Tmを経口投与またはLBブロスでモック処理した。C57BL/6マウスには20 mgの硫酸ストレプトマイシン（VWR）を経口投与した（35）。3日後、単一株感染実験では1×109 CFU、競合感染実験では各S. Tm株5×108 CFU（合計1×109 CFU）、3株を含む感染実験では各S. Tm株3.3×108 CFU（合計1×109 CFU）を投与した。マウスは指示された時点で安楽死させた。盲腸および大腸組織を液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。嚢および大腸内容物を氷冷した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ、重量を測定し、連続希釈液をNalおよびX-phos添加LBプレートにプレーティングした。競争指数は、腸内内容物中の対象2菌株の比率を、接種株中の対応する比率で除して算出した。
図4Aに示す実験では、gnotobiotic Swiss Websterマウスに、0.1 mL PBS中に1×109 CFUのB. thetaiotaomicronを投与した。7日後、両群ともS. Tm株を5×104 CFUずつ、合計1×105 CFU感染させた。競争体力は上記のように測定した。図5に示す実験では、gnotobiotic Swiss Websterマウスを、S. Tm野生型株1×105 CFU、または各S. Tm株5×104 CFUの混合物のいずれかに感染させた。粘液層はスパチュラで注意深く削り取った。競争力は上記のように決定した。
細菌遺伝子の発現
細菌RNAはTRI試薬法（Molecular Research Center, Sunnyvale, CA, USA）を用いて糞便または粘液擦過物から抽出した。サンプルはまずTRI試薬中で、Mini BeadBeater（Biospec Products, Bartlesville, OK, USA）を用いてホモジナイズした。cDNAはランダムヘキサマーなどのTaqMan Reverse Transcription Reagents（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）を用いて作成した。RNA調製におけるDNAコンタミネーションを評価するため、逆転写酵素を欠いた模擬RT-PCRを各サンプルと標的遺伝子について行った。SYBR green-based real-time PCRは、QuantStudio 6 Flex装置（Thermo Fischer社製）で表3に示したプライマーを用いて行った。データは比較Ct法を用いて解析した。遺伝子発現はS. Tm gmk mRNAレベルで正規化した。各粘液屑サンプルは、同じマウスの腔内サンプルと比較した。
GC/MSによるギ酸の定量
GC/MS分析は参考文献(38)に記載されているように行った。簡単に言うと、盲腸と結腸の腔内内容物を氷冷滅菌PBSに入れ、ボルテックスで注意深く分散させた。懸濁液を20,000g、4℃で15分間遠心し、上清を-80℃で保存した。この方法では代表的な腸内常在菌は溶解しないため、主に細胞外代謝物が反映される可能性が高い(38)。ギ酸は酸性化したサンプルから酢酸エチルで抽出した。乾燥抽出物を1% t-BDMCS（Cerilliant, Round Rock, TX, USA）を含むN-tert-ブチルジメチルシリル-N-メチルトリフルオロアセトアミドで80℃、1時間誘導体化した。誘導体化したサンプルをGC/MS（TQ8040；Shimadzu, Pleasanton, CA, USA）で分析した。注入温度は250℃、注入スプリット比は1:100、注入量は1 µLであった。オーブン温度は30℃で4分間、毎分10℃で230℃、毎分20℃で330℃まで上昇し、最終的にこの温度で30秒間保持した。ヘリウム流量は50cm/sの一定線速度に設定した。使用したカラムは30 m × 0.25 mm × 0.25 µm Rtx-5Sil MS（島津製作所）。界面温度300℃、電子衝撃イオン源温度200℃、イオン化電圧70V、電流150μA。イベントタイム50msの選択イオンモニタリングを行った。ギ酸塩のターゲットイオンおよび参照イオンは、それぞれm/z = 103およびm/z = 75であった。重水素化ギ酸のターゲットイオンとリファレンスイオンは、m/z = 104とm/z = 76でした。ギ酸濃度の定量には、内部標準と外部標準の両方を使用した。
統計分析
データはMicrosoft ExcelとGraphPad Prism v.9で分析・処理した。すべての生データは、統計解析の前に自然対数で変換した。実験終了前に健康上の理由で安楽死させた動物は分析から除外した。同様に、競合感染実験でコロニー形成が不十分であったマウス（原液100μL中＜10コロニー）は解析から除外した。試験管内におけるマウス群間または治療レジメン間の統計的差異を決定するため、対数変換したデータに両側無対スチューデントのt検定を適用した。GC/MSによるギ酸の測定には、対応のないスチューデントのt検定を用いた。P値が0.05未満を有意とみなした。
謝辞
S.E.W.の研究室での研究の一部は、NIH（AI118807、AI166263、AI171537）、Welch Foundation（I-1969-20180324）、Burroughs Wellcome Fund（1017880）、US-Israel Binational Science Foundation（2021025）の支援を受けている。M.M.の研究室での研究は、NIH（AI075093）の一部支援を受けている。C.C.G.はNSF大学院研究奨学金（1000194723）を受けた。E.R.H.とR.B.C.はNIHトレーニンググラント（AI007520）の助成を受けた。
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定に関与していない。本書に記載された意見、所見、結論、推奨はすべて著者らのものであり、必ずしも資金提供機関の見解を反映するものではない。
著者らは金銭的利害関係はないと宣言している。
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