環境変動にもかかわらず、保存された領域間微生物ネットワークが死体の分解を支えている
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出版：2024年2月12日
環境変動にもかかわらず、保存された領域間微生物ネットワークが死体の分解を支えている
https://www.nature.com/articles/s41564-023-01580-y
ザッカリー・M・バーチャム、エーリエル・D・ベルク、...ジェシカ・L・メトカーフ 著者一覧を見る
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指標詳細
概要
微生物による有機物の分解は、地球上で最も重要なプロセスの一つであるが、分解の制御についてはほとんど理解されていない。ここでは、36体の陸上ヒト死体を3つの場所で追跡し、場所、気候、季節による選択効果にもかかわらず、系統発生学的に異なるドメイン間の微生物ネットワークが腐敗中に形成されることを示す。我々は、遺体関連土壌からメタゲノムで構築されたゲノムライブラリーを作成し、メタボロミクスデータと統合することで、分類学と機能との関連を明らかにした。この微生物分解者の普遍的なネットワークは、分解生成物を代謝する相互摂食によって特徴づけられる。主要な細菌と真菌の分解者は、非分解環境全体ではまれであり、ヒト、豚、マウス、牛などの陸上腐敗肉の分解に特有であるようで、昆虫が拡散の重要な媒介者である可能性が高い。観察された微生物間相互作用のロックステップは、死後時間の予測に役立つ可能性のある、強固な微生物法医学的ツールの基盤となっている。
主な内容
分解は地球で最も基礎的なプロセスのひとつであり、死んだ生物物質のリサイクルを通じて生命を維持している1,2。この資源変換は、植物の生産性や土壌呼吸など、生態系の中核的機能を支えるために不可欠である。微生物ネットワークは有機物の分解を支えているが3、その生態系はブラックボックスのままであり、生態系の機能、回復力、生物地球化学的な炭素・栄養収支を正確に理解し、モデル化する能力を妨げている。DNAを用いた分解者微生物群集の評価は、植物遺体4,5や哺乳類6,7でいくつか行われているが、分解者微生物群集がどのように集合し、相互作用し、生態系で機能しているかという微生物生態については、ほとんど明らかにされていない。動物の遺体、つまり腐肉がどのように分解されるのかについての理解は、世界的に分解バイオマスの大半を占める植物リターに歴史的に焦点が当てられてきたため、まだ始まったばかりである。とはいえ、推定20億トンの高栄養動物バイオマス8は、生態系の生産性、土壌肥沃度、その他多くの生態系機能や属性に大きく寄与している9,10。腐肉バイオマスの炭素と栄養分は、無脊椎動物や脊椎動物のスカベンジャーによって消費されたり、ガスとして大気中に放出されたり、微生物によってその場で代謝されたり、浸出液を通じて周囲の土壌で代謝されたりする11,12。各資源プールに流入する腐肉の炭素と栄養分の割合は定量化されておらず、おそらく生態系スケールでそれぞれに大きく寄与し、大きく変動している2,13。セルロースを主成分とする植物性リターとは異なり、動物性分解者は主にタンパク質と脂質を分解しなければならない。これらの有機化合物を分解するために、微生物分解体がどのように集合するのかは、よくわかっていない。植物性リターの場合、機能的な冗長性によって、微生物の異なる群集が任意の場所に集まり14、同様の機能を果たすことができると提唱されている。あるいは、同じような微生物群集のメンバー、あるいは微生物ネットワークが、場所を越えて集合し、他の微生物群集のメンバーと競合し、栄養塩で繁栄する可能性もある15。
最近の研究では、陸上のヒトの死体分解過程における微生物群集の反応と、様々な哺乳類における微生物群集の経時的な変化は、個体間で再現可能であり6,7,16,17,18、異なる土壌タイプ6においてもある程度類似しており、スカベンジャーの活動に対して頑健であることが示されている16。これらのデータは、哺乳類の遺体に反応して集合する普遍的な微生物分解者ネットワークの可能性を示唆している。しかし、気候や地理的な場所、季節の違いといった環境変動が、微生物分解者の集合プロセスや相互作用にどのような影響を与えるかは、依然として不明である。しかし、このような集合を理解し予測することは、生態系を理解する上で重要であり、実用的な応用にも役立つ。例えば、ヒトの遺体に関連する微生物の継代パターンをプロファイリングすることで、死後間隔（PMI）を予測するための新しいツールにつながる可能性がある。実験室での実験6,18や一カ所での野外実験6,19では、微生物の分解者群集の遷移は、法医学的応用に関連する精度でPMIと密接に関連している6,17,18。したがって、哺乳類、特にヒトの腐敗の微生物生態学的パターンがどのように変化するのかをしっかりと理解することは、このような重要な法医学的手段を利用し、改善するために不可欠である。哺乳類の腐敗、より一般的には腐肉の腐敗に関する微生物生態学的ブラックボックスを解き明かすことは、農業や人の死体処理産業（例えば、遺体の堆肥化）20、持続可能性（例えば、動物の大量死イベント）21、法医学（例えば、PMIの推定）22における技術革新のための実用的な知識を提供するだけでなく、植物の腐敗や人為的変化下での地球規模の生産性の維持に関する将来の研究の指針となる可能性がある。
分解者ネットワークの構築と機能に関する生態学的・法医学的研究課題を解決するため、米国内の2つの気候タイプにまたがる陸上環境における3つの遺体提供人類学的施設を用いた（図1aおよび拡張データ図1a,b）23。我々は、以前、単一の地理的な場所にある人間の遺体を用いた限定的な実験6で特徴付けた微生物分解者群集の時間的傾向が、気候、地理的な場所、季節を越えて一般化できるかどうかを調べた。腐敗の過程で、36体の人体について、気候タイプ（温帯林）内と気候タイプ間（温帯林対半乾燥草原）で、腐敗に対する微生物の反応を比較した。マルチオミクスデータ（16Sおよび18Sリボソーム（r）RNA遺伝子アンプリコン、メタゲノミクス、メタボロミクス）を用いて、一般に腐敗速度が速くダイナミックである死後21日間の死体腐敗に対する微生物の生態学的応答を明らかにした（図1bおよび拡張データ図1c）（図1c、補足表1のメタデータ）。ここでは、場所、気候、季節の影響にもかかわらず、普遍的な微生物分解者ネットワークが形成され、儚く豊富な脂質やタンパク質に富む化合物を処理するための代謝効率が向上していることを示す。微生物分解者ネットワークの主要メンバーは、豚、牛、ネズミの腐肉とも関連している16,24,25,26。さらに、普遍的な微生物ネットワーク・コミュニティは、PMIを予測するための微生物ベースの頑健なモデルの基礎となっている。
図1：研究デザインの概要
図1
a, ARFとSTAFSを「乾季と暑い夏のない温帯」、FIRSを「乾燥した草原の寒冷地」とするケッペン・ガイガー気候図（文献23より引用）。b,各データタイプの総サンプル数（x軸）と共有/ペアサンプル数（y軸）の実験計画を表す逆プロット。MetaGはメタゲノミクス、Metabはメタボロミクス、18Sは18S rRNAアンプリコン、16Sは16S rRNAアンプリコン。c, トータルボディスコア、分解の経過27にわたって計算された分解の視覚的スコアで、各場所および3連の季節ごとに分解がどのように進行するかを示している。破線は、0℃以上の1日の平均気温を左から右に連続的に合計して算出される累積気温日数（ADD）という温度ベースの時間単位によって決定される分解の初期段階、活動段階、進行段階のセクションを区切っている。点の透明度は、設置後日数が経過するにつれて高くなる。
出典データ
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結果
栄養豊富な死体の分解
陸生哺乳類の腐敗はダイナミックなプロセスであり、その一部は環境条件に支配される1,2。私たちは、同じ気候（温帯）に置かれた死体は、1シーズン中、場所によって同じように腐敗することを観察した（図1c）27。半乾燥気候（すなわち、FIRS）に置かれた死体は、一般的に21日間 の腐敗の進行がより遅かったが、これはおそらく半乾燥環境の気温、湿度、降水量が 低下したためであろう（Extended Data Fig.1a,b）9,28。視覚的な死体腐敗の進行は季節に影響されることが観察され、夏が場所によって最も一貫していた（図1c）。死体や哺乳類の腐肉が分解されると、複雑な栄養プールが放出され、周辺環境に影響を与える。主にアンモニウムの形をとる窒素2,6,9,30,31や炭素2,6,10,30,31、リン9,29の投入量が一般的に多いため、周辺植物が枯死したり、再構築されたりすることが多い2,29。我々は、タンデム質量分析付き液体クロマトグラフィー（LC-MS/MS）データを用いたアンターゲットメタボロミクスによって、死体由来の栄養プールを特徴付けた。死体の皮膚と関連する土壌の代謝物プロファイルは明瞭であった（Extended Data Fig.） 全体的に、プロファイルは、植物由来のリグニン様化合物とともに、死体由来の脂質様化合物およびタンパク質様化合物が大部分を占めていた（Extended Data Fig.） 分解が進むにつれて、死体由来の土壌と皮膚のプロファイルはともに、リノール酸、アロイリチン酸、パルミチン酸、長鎖脂肪酸、脂肪アミド、一般アミノ酸に濃縮された（補足表2および3）。さらに、すべての場所で栄養プールの熱力学的有利性の低下が推定された（Extended Data Fig. これらのデータから、分解が始まって最初の数週間は、分解者が難溶性のタンパク質様資源を優先的に利用するため、より難溶性の脂質様栄養素と脂質誘導体栄養素が土壌内に蓄積されるが、脂質様化合物（拡張データ図2g）は気候に依存した存在量の変動があり、タンパク質様化合物（拡張データ図2h）は地理に依存した存在量の変動があることが示唆される。これらのパターンは、テクスチャー、密度、化学量論など、それぞれの場所の土壌の物理的特性にも影響されている可能性がある。
死体微生物分解者の集合体
脂質やタンパク質が豊富な死体栄養塩の流入は、生物界全体からスカベンジャーを引き寄せ、特定の微生物分解者群集の形成を開始させる、生態学的に大きな撹乱イベントである。メタボロミクスデータに基づき、土壌分解微生物群集は、より分解しやすい化合物（例えばタンパク質由来のアミノ酸や、LC-MS/MSメタボロミクスでは検出されなかったがグリコーゲンなどの炭水化物）を効率的に利用するように優先的にシフトし、より分解しにくい化合物（例えば脂質）を一時的に系内に残すという仮説を立てた。ヒトの腐敗に関連した土壌からメタゲノム（MAG）データベースを構築し（Extended Data図3a,bおよび補足表4-6）、ゲノムスケールの代謝モデルを再構築して、土壌微生物群集の潜在的な代謝効率が3つの主要資源（脂質、アミノ酸、炭水化物）に反応してどのように変化するかを明らかにした。実際、温帯の腐敗菌の可溶性資源の代謝効率は、温度に基づく分解の時間軸（累積度日（ADD））と正の相関があることがわかった（図2a-c、Extended）。(図2a-c、拡張データ図3c、補足表7-9）。温帯域で増加したアミノ酸と炭水化物の代謝効率の大部分を、2つのMAGが占めていることがわかった： Oblitimonas alkaliphila（Thiopseudomonas alkaliphila）（拡張データ図3d）とCorynebacterium intestinavium（拡張データ図3e）である。このような微生物の反応は、おそらく分解者群集の集合体を駆動する不均質選択（つまり、群集が異なるものになるように駆動する選択）の効果であろう。なぜなら、不均質選択は、確率的な力や分解中の均質選択に比べて増加するからである（図2d,e、拡張データ図3f、補足表10と11）。さらに、微生物と微生物の相互作用が選択に寄与しているのではないかという仮説を立て33、ゲノムスケールの代謝モデル間で代謝競合ポテンシャルと代謝協力相互作用ポテンシャルを計算して調べた34,35。その結果、温帯地域と半乾燥地域では、最初に代謝競合ポテンシャルが上昇し、同じような資源を必要とする微生物が増加していることが示唆された（拡張データ図3g、補足表12と13）。さらに、温帯気候の群集では、分解初期／活動期から分解が進むにつれて相互摂食の可能性（すなわち、代謝産物の共有）が高まり（図3a、補足表12と13）、半乾燥気候の群集よりも分解後期の相互摂食交換の数が大幅に多かった（図3bと補足表14）ことから、代謝活動の可能性が高まっていることが示唆された。モデルによって最も交換が多いと予測された分子は、哺乳類の分解36,37、特にタンパク質分解38の一般的な副産物であり、硫化水素、アセトアルデヒド、アンモニウムが含まれ、交換された全分子の上位25個のうち56％がアミノ酸であった。温帯地域とは対照的に、半乾燥地域の分解者群集は、分解段階に対する反応性が相対的に低下しており（図3c、拡張データ図4a、補足表15と16）、代謝効率に有意な変化は見られなかった（図2a-c、拡張データ図3c、補足表7-9）。半乾燥地では微生物の反応があまり測定できなかったにもかかわらず、分解初期から活発な分解段階にかけてクロスフィーディングの可能性が増加したことが検出されたことから、半乾燥地の群集は分解栄養塩に反応する能力が高まっていることが示唆された（図3a、および補足表12と13）。
図2：分解者群集の形成は、確率的および決定論的なバクテリアの形成過程に支配されている。
図2
a-c、脂質（a）、炭水化物（b）、アミノ酸（c）の代謝効率（各集落から得られる基質1C-molあたりの最大ATPで決定）。ARF n = 212、STAFS n = 198、FIRS n = 158の生物学的に独立したサンプル。データは平均値±95%信頼区間（CI）で示した。有意性は、両側ANOVAを用い、多重比較調整を行わず、死体のランダム切片を含む各ロケーション内の線形混合効果モデルを用いて検定した。ARF アミノ酸 P = 6.27 × 10-23、STAFS アミノ酸 P = 6.626 × 10-10、STAFS 炭水化物 P = 2.294 × 10-07、STAFS 脂質 P = 3.591 × 10-02。d, βNTI値を得るための一対比較では、16S rRNAアンプリコンデータセットにおいて、遺体安置時の初期土壌と早期腐敗土壌を比較し、その後、早期から活発へと比較することで、後継的な集合体の傾向に着目した（PL, 安置; EA, 早期; AC, 活発; AD, 先進）。ARF n = 232、STAFS n = 202、FIRS n = 182の生物学的に独立したサンプル。箱ひげ図では、箱の下縁と上縁は第1四分位点と第3四分位点（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、上下のひげはそれぞれ1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値と最小値まで伸び、中央の線は中央値を表す。分解段階間のβNTI平均値（菱形記号）の変化を連結線で表す。破線は｜βNTI｜＝2の場合を表す。βNTI|値が<2であれば、確率的な力（白背景）が群集形成を駆動していることを示す。βNTIの値が<-2および>2は、それぞれ均一選択（青背景）および不均一選択（黄背景）が群集形成を駆動していることを示す。バイオリンプロットの幅は、異なる値におけるデータの密度を表す。有意性はDunn Kruskal-Wallis H-検定で検定し、多重比較P値はBenjamini-Hochberg法で調整した。 e, 16S rRNAアンプリコンデータセットにおいて、アセンブリー過程の総プール内の異種選択圧の相対量が分解より増加することを表す。棒グラフは、βNTI > +2のコミュニティ比較の数を比較の総数で割って計算した。P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001。
出典データ
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図3：分解微生物の生態は微生物の相互作用と環境条件に影響される。
図3
a,MAGから予測される相互摂食相互作用は部位特異的であり、分解に伴って有意に変化する。ARF n = 201、STAFS n = 188、FIRS n = 151の生物学的に独立したサンプル。箱ひげ図では、下ヒゲと上ヒゲは第1四分位点と第3四分位点（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、上ヒゲと下ヒゲはヒゲから1.5×IQR以内の最大値と最小値まで伸び、中央線は中央値を表す。有意性はDunn Kruskal-Wallis H-検定で検定し、多重比較P値はBenjamini-Hochberg法で調整した。ARF初期活性P=1.95×10-23、初期活性P=1.67×10-23；STAFS初期活性P=5.53×10-39、初期活性P=3.65×10-03、活性活性P=2.04×10-24；FIRS初期活性P=3.81×10-15。b,半乾燥期の活発分解と温帯期の高度分解で増加したクロスフィード反応をまとめ、アミノ酸（赤）などの化合物がMAGからのクロスフィードの可能性がある上位25分子に共通していることを示す。c, 16S rRNA遺伝子アンプリコンデータセットを用いた、分解土壌対対照土壌の系統的回転は、温帯気候では分解に素早く反応するのに対し、より乾燥したサイトでは素早く変化しないことを示している（破線は分解初期、活性分解（灰色網掛け）、高度分解段階の区切りを表す）。ARF n = 414、STAFS n = 316、FIRS n = 310の生物学的に独立したサンプル。データは平均値±95% CIで示した。有意性の検定は、各ロケーション内で線形混合効果モデルを用い、両側ANOVAを用い、多重比較調整は行わず、死体のランダム切片を含めて行った。d,マルチオミクス（16S rRNA遺伝子量、18S rRNA遺伝子量、MAG遺伝子量、MAG遺伝子機能モジュール、代謝産物）合同-RPCAは、微生物群集生態が腐敗段階と地理的位置に影響されることを示している。**P < 0.01、***P < 0.001。
出典データ
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さらに、次元削減のためのマルチオミクス、ジョイントロバスト主成分分析（joint-RPCA）を用いて環境条件の選択的影響の可能性を調べたところ（Methods参照）42、すべての条件（気候、地理的位置、季節、分解段階）が微生物分解者群集生態を有意に形成していた（図3d、拡張データ図4b-f、補足表17）。気候（温帯対半乾燥）と場所（ARF、STAFS、FIRS）は、土壌微生物群集組成（補足表18-20）とその潜在的遺伝子機能（補足表21-22）を有意に形成した。温帯地域の分解土壌では、微生物群集の系統的な入れ替わりが激しく（図3cおよび補足表15）、分解中の微生物リッチネスは減少した（拡張データ図4aおよび補足表16）が、半乾燥地域では測定可能な影響はあまり認められなかった（図3c、拡張データ図4a、補足表15および16）。季節は、分解中の微生物群集組成とは対照的に、主に土壌化学に影響を与えるようであり（補足表23）、温度に関連した微生物分解者分類群の代謝変化／制限の可能性を示唆している。これらのデータを総合すると、分解者群集の形成には確率的な力も一役買っているが、微生物の相互作用や環境条件などの決定論的な力も重要な役割を果たしていることが示唆される。
保存された土壌微生物分解者ネットワーク
土壌中の微生物分解者の集合体に対する気候、場所、季節の選択効果にもかかわらず、死体の分解に応答する微生物の普遍的なネットワークを発見した。場所を超えた普遍的な分解効果に注目するため、分解段階による変化が大きく、場所、季節、気候の影響が少ないことから、ジョイントRPCA主成分2（PC2）スコアを用いて普遍的な分解ネットワークを作成した（図4a,b、拡張データ図4b-f、補足表24）。そのため、PC2スコアを用いて、分解後期の土壌の対数比を初期および分解初期の土壌と比較してマルチオミクス計算し（図4c、拡張データ図4g、補足表25）、分解後期に関連する主要な共存細菌および真核微生物分解者、細菌機能パスウェイ、代謝物を同定することができた（図5a、拡張データ図5、補足表26）。ネットワークの中心的存在であり、温帯でのアミノ酸代謝効率上昇に大きく寄与している生物O. alkaliphila（拡張データ図3d）は、温帯気候における不安定な資源利用の制御者として、陸上の死体分解において重要な役割を果たしている可能性があるが、その生態についてはほとんど知られていない43,44,45。さらに、ほとんどの微生物の主要ネットワーク分解者（図5a；O. alkaliphila、Ignatzschineria、Wohlfahrtiimonas、Bacteroides、Vagococcus lutrae、Savagea、Acinetobacter rudis、Peptoniphilaceae）は、American Gut Project（AGP）やEarth Microbiome Project（EMP）のデータセットに含まれる宿主関連微生物群集や土壌微生物群集では極めて稀であるか、あるいは検出されない独自の系統的多様性を示していた（図5b、拡張データ図6、補足表27と28）。バクテロイデス（Bacteroides）グループに属する分解菌は、以前はヒトの腸に由来すると考えられていたが46,47、我々はその代わりに、これらはおそらく腸に関連するバクテロイデスとは異なる分解菌の専門家グループであることを発見した（図5b、拡張データ図6、および補足表27と28）。土壌や宿主関連環境から出現した主要なネットワーク細菌分解者の強力な証拠は、Acinetobacter属とPeptoniphilus属のみであった（図5b、拡張データ図6、補足表27と28）。MAGデータを用いて、微生物分解者の系統的独自性をより包括的に特徴付けたところ、これまで未記載であった細菌の目、科、属、種にまたがることがわかった（拡張データ図3a）。全体として、土壌微生物分解者ネットワークは系統学的にユニークであり、死体の栄養プールが利用可能になるまで、環境中の相対存在量は極めて低いことがわかった。
図4：マルチオミックスジョイントRPCA主成分値。
図4
a,b,主成分値は、(a)施設の変動は主に主成分3（PC3）（つまり、グループスコア間の重複が最も少ない）で説明され、(b)分解段階による変動はPC2で説明されることを示している。 c,初期土壌から高度分解段階土壌までのオミックスデータセット（代謝物、MAGアバンダンス、18S rRNA遺伝子アバンダンス、MAG遺伝子機能モジュール）内のPCスコアの対数比の変化は、分解段階の進行が組成シフトに対応することを強調している。すべてのデータタイプで、生物学的に独立した同じn = 374サンプルを使用した。データは平均値±95% CIで示した。
出典データ
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図5：季節、場所、気候を超えた普遍的な分解者ネットワークが出現している。
図5
a, 共起ネットワークで可視化されたjoint-RPCA PC2における普遍的な分解後期の対数比シグナルに関与する特徴の上位20%の相関値。 b, AGP腸、AGP皮膚、EMP土壌、EMP宿主関連データセットから得られた最も豊富なASVの上位50個に沿って配置されたネットワークから主要な分解者ノードに関連するASVを表す系統樹は、主要な分解者が系統学的にほぼユニークであることを示している。最も内側のリングは分解者の配置を表し、外側のリングはAGPとEMPのASVを表し、バーの高さはそれぞれの環境におけるASVのランクを表す。棒グラフがない場合は、そのASVがデータセット全体に存在しなかったことを示す。AGPとEMPのASVは、各環境で見つかったサンプル数に従ってランク付けされた。分解者ASVには時計回りに番号を付けた（完全な分類は補足表27を参照）。
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分解者ネットワークの専門分類群は、栄養プールを代謝するために相互作用している可能性が高いという仮説を立てた。これらの主要な分類群の重要性を強調するために、微生物分解者ネットワークのメンバーは、予測された分解後期の栄養塩交換のほぼ半分（42.8%）を占め（図3bと5a、補足表29）、ガンマプロテオバクテリアは代謝物の供与体としても受容体としても顕著であった。例えば、O. alkaliphilaはIgnatzschineria、Acinetobacter、Savagea、Vagococcus lutraeと相互供給する能力を持ち、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、バリンなどの哺乳類の分解に関連することが知られているアミノ酸や、脂質代謝中間体であるsn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン36を供給する（補足表30）。レシーバーとして、O. alkaliphiliaは必須鉄イオン（Fe2+）をAcinetobacter、Savagea、Vagoccocusから、グルタミン酸、プロリン、リジンをIgnatzschineriaから受け取ると予測される。さらに、プトレシン（オルニチンとアルギニンの脱炭酸によって分解時に生成される悪臭化合物）とアルギニン／オルニチン輸送系は、我々のネットワーク内で普遍的な機能であった（図5a）。クロスフィード解析により、Ignatzschineria、Savagea、Wohlfahrtiimonas、O. alkaliphiliaなど複数のオルニチンおよび／またはアルギニン交換体の可能性が同定された（補表31）。プトレシンは、分解微生物を分散させるクロバエ48のようなスカベンジャーにシグナルを送るだけでなく、真菌49,50,51のような他の主要な微生物分解者に直接シグナルを送ることで、普遍的な微生物分解者ネットワークを構築する上で重要な役割を果たしていると考えられる。
真菌は有機物の分解において重要な役割を果たしているが、死体の分解過程におけるそのプロセスや領域間の相互作用については、まだ十分に解明されていない。われわれのネットワーク解析では、細菌と共生している複数の真菌類が同定された。この真菌類は子嚢菌門（図5a）に属し、有機物を分解することで知られる門である6,44,52,53。特にヤロウィア属とカンジダ属は、脂質、タンパク質、炭水化物を利用する能力で知られ44,53、両者ともO. alkaliphilaと最も高い相関を示した（図5aおよび補足表25）。分解中に脂質やタンパク質を分解するヤロウィア属とカンジダ属の能力は、O. alkaliphilaがこれらの資源を利用するための領域間栄養相互作用として機能している可能性がある44。例えば、ヤロウィア属とカンジダ属のゲノムにはアルギニンとオルニチンの生合成機能があり、排泄されればO. alkaliphiliaに取り込まれる可能性がある。O. alkaliphiliaの完全ゲノム（Genbankアクセッション番号CP012358）には、オルニチンを主要化合物プトレシンに変換する酵素オルニチンデカルボキシラーゼが含まれている43。
機械学習により、予測可能な微生物分解者の生態が明らかになった
普遍的な微生物分解者ネットワークの構築は、強固な科学捜査ツールを構築する可能性を示唆している。PMI（ADDとして計算）は、ランダムフォレスト回帰モデルを介して、微生物群正規化存在量パターンから直接正確に予測できることを示した（図6a）。高解像度の分類学的群集構造がPMIの最良の予測因子であり（図6b）、特に皮膚分解微生物のSILVAデータベースレベル-7分類学的ランク（L7）における16S rRNA遺伝子の正規化存在量が最も優れていた（図6a-c）。興味深いことに、PMIモデルにとって最も有益であった皮膚関連分解者分類群4種のうち3種は、すべての場所の遺体について、分解に伴う正規化存在量の傾向が類似しており、土壌分解者よりも皮膚分解者の方が気候を問わず偏在していることが示唆された（図6dおよび拡張データ図7）。これは、ヒトの皮膚マイクロバイオームが、土壌マイクロバイオームが地理的な場所間で保存されているよりも、個体間で保存されているためだと考えられる54。実際、皮膚と土壌の両方の16S rRNAベースのモデルで、最も重要な予測因子として同じ分類群であるHelcococcus seattlensisがトップであった（図6dおよび拡張データ図7）。H. seattlensisはTissierellales目とPeptoniphilaceae科のメンバーであり、どちらも普遍的分解者ネットワークの重要なノードであった。我々の仮説に沿い、皮膚上のH. seattlensisは、両方の気候タイプで分解された死体でより類似した存在量の傾向を示したが、土壌中のH. seattlensisの傾向は主に温帯の場所で測定された（図6eおよび拡張データ図8）。このことは、H. seattlensis、O. alkaliphila、Savagea sp.、Peptoniphilus stercorisuis、Ignatzschineria sp.、Acinetobacter sp.などの温帯気候における反応性の低下を示唆している（Extended Data Fig.） しかし、最も重要なPMIモデル土壌分類群であるペプトストレプトコッカス属、スポロサルシナ属、クロストリジウム属ファミリーXI属の3種は、半乾燥気候と温帯気候の両方で分解に伴って検出量が増加することがわかった（Extended Data Fig. さらに、マイクロバイオームベースのモデルとTBSベースのモデルの平均絶対誤差（MAE）は同程度であったが（拡張データ図9a）、16S rRNAマイクロバイオームベースのモデル予測値は平均して実際の観測値に近く（つまり平均残差値が小さい）、精度が高いことが示唆された（図6cおよび拡張データ図9a）。最後に、16S rRNAアンプリコンデータを用いて、PMI予測モデルの精度と信頼性を確認しました。16S rRNAアンプリコンデータは、私たちのモデルでは表現されていない場所や気候の死体から、異なる時期に採取された独立したテストセットです。その結果、すべての独立したテストセットの場所で、ランダム化されたPMIを持つサンプルよりも、サンプルの真のPMIを正確に予測できることを発見し（拡張データ図9b,cおよび補足表32）、法医学的死亡調査に有用な精度で、複数の地域や気候から得られた新しいデータを予測する上で、我々のモデルの一般性と頑健性を確認した。
図6：機械学習により、普遍的な分解者を通して死後時間（ADD）の微生物群集の予測性が明らかになった。
図6
a, マルチオミクスデータセットの交差検証誤差。16Sおよび18S rRNA遺伝子データは、SILVA分類レベル7（L7）および12（L12）に折りたたんだ。ボックスプロットは、36体のデータセットのネステッドクロスバリデーション中の個々の体のADDにおける平均予測MAEを表す。16S rRNA soil face、soil hip、skin face、skin hipデータセットには、それぞれn = 600、616、588、500の生物学的に独立したサンプルが含まれる。18S rRNA soil face、soil hip、skin faceおよびskin hipデータセットには、生物学的に独立したサンプルがそれぞれn = 939、944、837および871個含まれる。対になった16S rRNA+18S rRNA soil face、soil hip、skin face、skin hipのデータセットには、それぞれn = 440、450、428、356の生物学的に独立したサンプルが含まれる。MAGデータセットにはn = 569の生物学的に独立したサンプルが含まれる。メタボライト土壌ヒップデータセットと皮膚ヒップデータセットには、それぞれn = 746と748の生物学的に独立したサンプルが含まれる。a,bの箱ひげ図において、箱ひげ図の下側と上側のひげは、第1四分位点と第3四分位点（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、上側と下側のひげは、ひげから1.5×IQR以内の最大値と最小値まで伸び、中央の線は中央値を表し、ひし形の記号は平均値を表す。 c,モデルの予測精度を評価するために、予測されたADDと真のADDを線形回帰すると、すべてのサンプリング位置がADDを有意に予測することがわかる。データは平均値±95％信頼区間として示した。黒い破線は、1:1で予測されたADDと実際のADDの予測値の比率を表す。d, 顔の皮膚からサンプリングした16S rRNA遺伝子アンプリコンデータから得られた最も優れたモデルから、モデル精度を牽引する最も重要なSILVA L7分類群。 e, 皮膚における最も重要な分類群であるHelcococcus seattlensisの存在量変化の比較から、低存在量の分類群が予測応答を提供することが明らかになった。データは平均値±95％信頼区間として表示されている。Bact.は細菌、Avg.は平均、Marg.は限界。
出典データ
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考察
我々は、死体腐敗時の微生物動態をゲノム分解して包括的に捉え、普遍的な微生物腐敗ネットワークの構築、相互作用、代謝シフトに光を当てた。この結果は、微生物生態学の他の概念モデル33,55,56,57と一致している。これらのプロセスにより、季節、場所、気候に関係なく、系統発生学的にユニークな分類群からなる分解者ネットワークが出現し、有機物を相乗的に分解するようになった。我々のマルチオミクスデータから明らかになったユビキタスな分解者と機能的ネットワークは、死体腐敗生態学において、代謝が少なくともある程度分類学と連関していることを示唆している。しかし、微生物分解者群集の全体的な構成は、異なる気候や場所によって異なっており、機能的な冗長性もおそらく存在することを示している。農作物の有機物分解（稲わらと養分改良材）の研究でも、研究者たちは同様に、機能的な冗長性がおそらく一役買っているものの、主要な微生物分類群が重要な植物分解者として浮上していることを示した15。死体の腐敗に対する気候の制御という点では、温帯地域の土壌の方が、本研究の乾燥地域よりも測定可能な微生物の反応（例えば、系統的な入れ替わりや相互摂食の可能性など）が大きく、気候が腐敗速度と微生物の活動を強く決定するという考え方が植物研究で支持されている59。
乾燥地では反応が少なかったにもかかわらず、死体分解者の微生物生態系は類似していた。このことは、気候が強力な制御因子として働く一方で、微生物群集組成は類似の集合経路をたどることを示唆している。我々は、死体の主要な領域間微生物分解者（すなわち真菌とバクテリア）が多様な環境で出現し、おそらく資源分配と相互摂食を利用して、脂質、タンパク質、炭水化物を豊富に含む栄養パルスを分解している証拠を発見した。このプロセスは、菌類分解者は通常複雑な基質に特化した分解者であるのに対し、バクテリアはより幅広い栄養を分解するジェネラリストであるという、腐葉土生態学のドグマと一致する60。したがって、ヤロウィア菌やカンジダ菌などの真菌類は、複雑な死滅有機物（脂質やタンパク質など）をより単純な化合物（脂肪酸やアミノ酸など）に異化する働きをし、これらの副産物を効率的に代謝できる細菌群集のメンバー（O. alkaliphilaなど）が利用するという仮説を立てた。このような役割分担と微生物の相互作用が相まって、腐敗微生物群集の形成が促進される。これは、腐葉土の分解で観察される生態学的ダイナミクスを彷彿とさせるプロセスである60。
主要なネットワーク微生物分解者は、おそらく人間の死体の分解に特有なものではなく、昆虫によって維持されたり、播種されたりしているのではないかと思われる。遺体の主要な細菌分解菌であるO. alkaliphila、Ignatzschineria、Wohlfahrtiimonas、Bacteroides、Vagococcus lutrae、Savagea、Acinetobacter rudis、Peptoniphilaceaeは、豚、牛、マウスの陸上分解研究（補足表33）16,24,25,26で検出されており、サブセットは水中分解で検出されている61。よく知られたクロバエに関連するIgnatzschineria属やWohlfahrtiimonas属62を含む主要なネットワーク細菌分解者のほとんどは、昆虫を除外したラボベースのマウス分解研究6では、まれか検出されなかった（補足表33）。しかし、クロバエは除外したが腐肉カブトムシを含む別のラボベースの研究26では、これらの主要な微生物分解者のサブセットが検出されたことから、微生物と昆虫の相互作用や昆虫による散布に役割があることが示唆された26,48,63。昆虫が重要な媒介者であることを示唆するさらなる証拠としては、ここで紹介した主要なネットワーク細菌分解体がすべてクロバエで検出されていることである（補足表28）6,64。さらに、ヤロウィア（Yarrowia）やカンジダ（Candida）などの子のう菌類が、ヒト、ブタ、マウスの遺体から検出されたことがある6,26,44,53。ヤロウイエカは腐肉虫の親から子へ垂直感染する可能性があり63、腐肉虫の腐肉消費を促進する可能性がある。これらの知見を総合すると、今回のヒト遺体の研究で同定された主要な微生物分解者分類群は、おそらくより一般化可能な腐肉分解者であり、少なくとも部分的には昆虫によって接種されている可能性が高いことが示唆される。
我々は、微生物群集の継起パターンと機械学習技術を活用してPMIを正確に予測することにより、法医学におけるマイクロバイオームツールの実用化の可能性を示した。重要な点として、予測モデルは、様々な地理的場所や気候から収集された独立したテストサンプルのPMIを正確に予測することで、その一般性を示している。最も優れたモデルは、内部検証および独立したテストセットにおいて、±3暦日以内にPMIを正確に予測することができた（補足表34および35）。これは、法医学にとって有用な時間枠であり、捜査官が重要なタイムラインを確立し、犯罪捜査を支援することを可能にする。予測誤差はおそらく、モデルで考慮されていない内在的要因（例えば、BMI／総質量）19,24,65および／または外在的要因（例えば、スカベンジャー、降水量）19,26によるものであるが、モデルを改善するための今後の研究分野とすべきである。例えば、総質量は豚の微生物分解組成に影響を与えないことが以前に示されている24。19は、ガンマプロテオバクテリアの相対量がヒトのBMIと相関することを明らかにした。死体の初期総質量が大きく変動した我々の研究では（補足表1）、アシネトバクター（Acinetobacter）とイグナツシネリア（Ignatzschineria）（Gammaproteobacteria属）がPMIモデルの重要な特徴であり、おそらくBMIに頑健であることが示唆された（Extended Data Fig.7）。さらに、無脊椎動物や脊椎動物による捕食は、腐敗微生物組成（例えば腐肉甲虫）26だけでなく、揮発性有機化合物（例えば、脊椎動物は忌避するが昆虫は誘引する48,66）を介して捕食者群集を形成しうる微生物自体にも影響を与えうるもう一つの要因である。PMIを予測する上で重要な特徴である、微生物に直接影響を与える内在的・外在的要因の理解を深めることは、次のステップとして重要である。
腐敗した人間の死体の微生物生態と、重要でありながらほとんど研究されていない腐肉栄養プールに対するより一般的な意味合いについての理解が深まったことは、炭素収支や栄養収支に含めるべきものの概念や、生態系の機能や変化を予測するために使用するモデルを見直す上で重要である11。炭素と栄養塩の循環を促進する腐肉分解の役割に関する新たな知見は、生物地球化学的循環と栄養過程の概念モデルと数値モデルに必要である11。最後に、これらの知見は、新たな法医学的ツールとしての可能性を提供し、また、ここで同定された主要な微生物分解者を介して、農業および人死に関わる産業における分解プロセスを調節できる可能性を提供することで、社会に貢献できるかもしれない。
方法
実験場所とドナーの選択
3つの遺体提供施設において、36体のヒト死体に対する屋外実験を行った： コロラド・メサ大学法医学捜査研究施設（FIRS）、サム・ヒューストン州立大学南東テキサス応用法医学（STAFS）施設、テネシー大学人類学研究施設（ARF）である。プロジェクト開始前にSTAFSでミーティングが開かれ、サンプリング・プロトコルの実演、議論、合意がなされた。施設内審査委員会および被験者保護委員会は、連邦規則で定義されたヒト・ドナーに関わる研究ではないため、それぞれの施設において、審査は必要ないと判断するか、ドナーの免除を認めた。2016年と2017年の春、夏、秋、冬に、各施設において、3名の死亡したヒトのドナーが仰臥位で服を着ずに土の表面に置かれた（N = 36）。遺体は、過去に人の腐敗が確認されていない土壌に置かれた。STAFSでは遺体を置く前に、落ち葉かきや低木の除去など最低限の植生除去を行い、STAFSに置かれた遺体は脊椎動物の掃き掃除を防ぐため、1cm×1cmの金網と木枠でできたケージに入れられた。ARFとFIRSでは、標準的なプロトコルとして、植生の除去や檻の下への遺体の安置は行なわれなかった。さらに、遺体は胸骨の中間点から2.5m以内に置かれた。各ドナーの収集日は、死因（判明している場合）、初期状態、剖検状況、安置前の体重、年齢（判明している場合）、推定年齢（判明していない場合）、性別、ドナーの保管タイプ、ドナーの保管日数、死後冷却までの時間、安置方向の他に、サンプルのメタデータで確認できる（補足表1）。ドナーの体重はARFおよびFIRSでは摂取時に測定されたが、STAFSでは生前のドナーまたは家族による自己申告であった。毎日のサンプリング中、入手可能な場合または該当する場合は、1日の周囲平均気温と湿度、TBS27、掃気状態、および昆虫の状態を記録した。遺体は、あらゆる気象要素や無脊椎動物の掃討活動に完全に曝された。遺体の包含基準は実験開始前に指定され、遺体は腐敗の新鮮な段階にあり、施設に置かれる前に凍結されておらず（また、広範囲に冷却されておらず）、解剖されていないことが要求された。
分解指標の計算
ケッペン・ガイガー気候分類システムは、ARFとSTAFSの両施設を乾季と暑い夏を伴わない温帯気候（Cfa）、FIRS施設を寒冷半乾燥草原気候（BSk）と分類している23。日平均気温は国立環境情報センター（NCEI）のウェブサイト（https://www.ncei.noaa.gov/）から、調査期間中の月別総降水量はWeather Undergroundのウェブサイト（https://www.wunderground.com/）から、地元の気象観測所から収集した： グランドジャンクション地域空港駅、マクギー・タイソン空港駅、イースターウッド空港駅。参考文献27 TBSは、3つの主な領域（頭部、体幹、四肢）でどの程度分解が進んでいるかを数値化したものである27。利用者は、死体の目視評価に基づいて腐敗の進行度を表す値を割り当て、これらの値を加算してサンプリング時のTBSを作成した。死体が乾燥骨格に達した時点で、各部位に最大スコアが割り当てられた。ADDはNCEIから提供された気象データを用いて推定した。遺体安置日の気温は含まず、0℃を基準とした。ADDは、文献27と同様に、それ以前のすべての分解日の0℃以上の日平均気温を合計し、基準温度0℃を差し引くことで算出した。
サンプル採取とDNA抽出
21日間の腐敗期間中、頭部と胴体の臀部付近の皮膚表面と、各皮膚部位に関連する墓土（腐敗に伴う土壌）を採取した。対照の土壌サンプルは、各施設内またはそのすぐ外側のエリアから、遺体の腐敗（過去または現在の既知）に関連しない同じ土壌系列およびホライズンから採取した。非腐敗土壌（対照）756検体、臀部付近の墓土756検体、顔面付近の墓土756検体、臀部皮膚756検体、顔面皮膚756検体のスワブを採取した（N = 3,780）。すべての部位サンプル（皮膚表面、gravesoilおよび対照土壌）は、文献18に記載されているように、滅菌済みデュアルチップBD SWUBEアプリケーター（REF 281130）スワブを用いて採取した。18 に記載されている方法で採取し、各サンプリング後に直ちに凍結し、-20 °Cで保存した。サンプルはドライアイスで一晩かけてCU Boulderまたはコロラド州立大学に輸送され、到着後DNA抽出まで直ちに-20℃で保管された。皮膚と土壌のDNAは、標準EMPプロトコル（http://www.earthmicrobiome.org/）に従って、PowerSoil DNA isolation kit 96-htp（MoBio Laboratories）を用いて、二股綿棒の先端1本から抽出した。
アンプリコンライブラリーの調製と塩基配列決定
皮膚と土壌のDNA抽出物（n = 3,547）について、細菌と古細菌の群集は16S rRNA遺伝子領域を用いて、真核生物の群集は18S rRNA遺伝子領域をユニバーサルマーカーとして用いて特徴づけを行った。細菌と古細菌の調査には、これらのドメインをほぼ普遍的にターゲットとするプライマーセット515f（5′GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）と806rb（5′GGACTACNVGGGTWTCTAAT）を使用し67,68、EMPのプロトコールに従ってマルチプレキシングを可能にするバーコード付きプライマーを使用した69。微生物の真核生物を調査するために、18S rRNA遺伝子の3′末端をターゲットとするプライマー1391f_illumina（5′GTACACCGCCCGTC）とEukBr_illumina（5′TGATCCTTCTGCAGGGTTCACCTAC）を用いて、18S rRNA遺伝子のサブ領域の塩基配列を決定した。18S rRNA遺伝子プライマーはref. 70を参考にしたもので、真核生物の幅広い系統をターゲットにしている。これらの遺伝子マーカーを用いたデータの作成と解析は以前にも成功している6,18。プライマーにはエラー訂正されたゴレイバーコードが含まれており、ミスアサインメントを防ぎながら多重化を可能にした。PCRアンプリコンはPicogreen Quant-iT (Invitrogen, Life Technologies)を用いて定量し、各サンプルから等モル比になるように1本のチューブにプールした後、UC San Diegoのゲノミクス研究所に輸送して塩基配列を決定した。両アンプリコンとも、プールはUltraClean PCR clean-up kit（Qiagen）を用いて精製した。16S rRNAプールはIllumina MiSeqシーケンスプラットフォーム上の300サイクルキットを用いて、18S rRNA遺伝子プールはIllumina HiSeq 2500シーケンスプラットフォーム（Illumina）上の300サイクルキットを用いてシーケンスした。サンプルタイプ（皮膚対土壌）内のサンプルは、潜在的なバッチ効果を防ぐため、シーケンスランにランダムに割り当てられた。コンタミネーションをモニターするため、DNA抽出からPCR増幅までの全プロセスにおいて、ブランクDNA抽出およびPCRネガティブコントロールを含めた（n = 592ネガティブコントロール）。
ショットガンメタゲノムライブラリーの調製とシーケンス
臀部関連土壌サンプルのサブセット（n = 756）、土壌コントロール（n = 9）、ブランクコントロール（n = 102）、およびノーテンプレートPCRコントロール（n = 15）から抽出したDNAを選択し、分解土壌内の微生物動態を詳細に調べるために、浅いショットガンシーケンスを行った（補足表4）。我々の標準プロトコールは文献71のものを踏襲した。71の標準プロトコールに従い、1反応あたり1 ng DNAのインプット量に最適化した。ライブラリー調製の前に、インプットDNAを384ウェルプレートに移し、PicoGreen蛍光アッセイ（ThermoFisher）を用いて定量した。入力DNAは、Echo 550音響液体ハンドリングロボット（Labcyte）を用いて、3.5μlの分子グレードの水中で1ngに正規化した。断片化、末端修復、A-tailing、ライゲーション、PCR用の酵素ミックスを調製し、Mosquito HVマイクロピペッティングロボット（TTP Labtech）を用いて1:8スケールで添加した。断片化は37℃で20分間、続いて末端修復とA-tailingを65℃で30分間行った。シーケンスアダプターとバーコードインデックスは、iTruアダプタープロトコールに従って2段階で添加した72。ユニバーサルアダプター「スタブ」アダプター分子とリガーゼミックスを、まずMosquito HVロボットを用いて末端修復したDNAに加え、20℃で1時間ライゲーションを行った。その後、AMPure XP磁気ビーズとBlueCat精製ロボット（BlueCat Bio）を用いて、ライゲーションされていないアダプターとアダプターダイマーを除去した。7.5μlの磁性ビーズ溶液を、アダプターをライゲーションした総サンプル量に加え、70％エタノールで2回洗浄した後、7μlの分子グレードの水に再懸濁した。
次に、Echo 550ロボットを用いて、アダプターで固定したサンプルにi7とi5のインデックスを追加した。このリキッドハンドラーはウェルに個別に対応し、384個のユニークなエラー訂正i7およびi5インデックスのフルセットを使用したため、バーコードを繰り返すことなく384個のライブラリーの各プレートを作製し、バーコードのスワッピングによる配列のミスアサイメントの問題を排除した（61, 62）。必要であれば異なるプレートで作製したライブラリーをプールできるようにし、ラン間のサンプルのキャリーオーバーによる汚染の可能性を防ぐため、ランごとにi7インデックスとi5インデックスの割り当てを繰り返し、各ユニークなi7:i5インデックスの組み合わせが147,456ライブラリーごとに1回だけ繰り返されるようにした72。溶出したビーズ洗浄ライゲーションサンプル4.5μlをPCRマスターミックス5.5μlに加え、15サイクルPCR増幅した。増幅され、インデックス化されたライブラリーは、AMPure XP磁気ビーズとBlueCatロボットを用いて再度精製され、10μlの水に再懸濁され、最終精製ライブラリー9μlが、ライブラリーの定量、配列決定、保存のために、Mosquito HTSリキッドハンドリングロボットを用いて384ウェルプレートに移された。すべてのサンプルは、PicoGreen蛍光アッセイに基づいて正規化され、シーケンシングに用いられた。
サンプルは当初Illumina HiSeq 4000でシーケンスされたが、いくつかのシーケンス失敗のため、サンプルはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで再シーケンスされた。可能な限り最良のシーケンス結果を得るために、両方のシーケンスランを評価し、2つのランのうち最もパフォーマンスの高いサンプルを最終解析に加えました（すなわち、サンプルXがNovaSeqランよりもHiSeqランでより多くのリードを提供した場合、そのサンプルのHiSeqデータを最終解析に加え、逆も同様です）。サンプルは、2回のシーケンス実行によるバッチ効果がベータ多様性解析に存在しないことを確認するため、目視で評価しました。HiSeqランとNovaSeqランからどのサンプルを取り出したかのリストは、サンプルメタデータの'best_MetaG_run'カラムと、'MetaG_read_count'カラムに対応するリードカウントで見ることができます（補足表1）。合計762サンプルがシーケンスされ、25サンプルがHiSeqランから、737サンプルがNovaseqランから得られた。生のメタゲノムデータはアダプターを除去し、Atropos（v.1.1.24）73を用いてq = 15、最小長100 ntのカットオフでクオリティフィルターを行った。すべてのヒト配列データは、2016年3月21日にリリースされたGenome Reference Consortium Human Build 38 patch release 7 (GRCh37/hg19)参照データベース(ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/)に対してアライメントし、配列データから参照と一致するすべてのデータを削除することでフィルタリングした。アライメントはbowtie2（v.2.2.3）74で--very-sensitiveパラメータを用いて行い、得られたSAMファイルはsamtools（v.1.3.1）75およびbedtools（v.2.26.0）76を用いてFASTQ形式に変換した。メタゲノミックサンプルは、リード数が500 k未満の場合は解析から除外した。最終的なメタゲノミックサンプル数は、股関節隣接土壌569、土壌コントロール5、ブランクコントロール102、テンプレートなしコントロール15であった。
代謝物抽出とLC-MS/MSデータ作成
腐敗した皮膚と墓石に関連する代謝物プールを調査するため、すべてのデータセットが対になっていることを確認するために、ヒップサンプリング位置に関連する皮膚と土壌から採取したデュアルチップ綿棒の2番目の先端で代謝物抽出を行った。皮膚と土壌の綿棒サンプルは、80％メタノール溶液を用いて抽出した。A1-D1は溶媒ブランク、E1-H1は抽出溶媒を加えたブランクの清浄綿棒として使用した。綿棒の軸を無菌的に切断し、500μlの溶媒（0.5μMスルファメタジンを含む80％メタノール）を加えた。DeepWellプレートに蓋をし、2分間ボルテックスした後、超音波水槽で15分間静置した。次に、サンプルを4℃で2時間インキュベートし、その後-20℃で12時間インキュベートした。その後、綿棒の先端を溶媒から除去し、サンプルを凍結乾燥した。各サンプルから非標的メタボロミクスLC-MS/MSデータを作成しました。各サンプルから2種類のデータセットが生成されました： MS1データはグローバルな統計解析用、MS/MSデータは分子アノテーション用です。分子アノテーションはGNPSプラットフォームhttps://gnps.ucsd.edu/。分子は、2007年のメタボロミクス標準イニシアチブ78で定義されたアノテーションのレベル2またはレベル3に従って、正確な親質量とMS/MSフラグメンテーションパターンを使用してGNPS参照ライブラリ77でアノテーションされました。必要に応じて、また真正の化学標準物質が入手可能な場合は、化学標準物質からMS/MSデータを収集し、サンプルからアノテーションされた分子のMS/MSスペクトル（アノテーションのレベル1）と比較した。
アンプリコンデータの処理
データ作成後、コロラド州立大学のMetcalf研究室で、QIIME2解析プラットフォームv.2020.2およびv.2020.8（文献79）を用いてアンプリコン配列データを解析した。合計4,139サンプルが配列決定され、592サンプルのDNA抽出ブランク陰性およびノーテンプレートPCRコントロールが含まれた。シーケンスの結果、合計89,288,561個の16S rRNA部分遺伝子リードと1,543,472,127個の18S rRNA部分遺伝子リードが得られた。配列は、事前に割り当てられたGolayバーコードを使用して、品質フィルターされ、デマルチプレックスされた。リードの長さは150 bp。18S rRNA遺伝子の配列は、cutadaptを用いてプライマー（5′GTAGGTGAACCTGCAGAAGGATCA）を除去し、18S領域の可変長がプライマー汚染なしに処理されるようにした。その後、Deblurノイズ除去法(v.2020.8.0)80を用いて、プログラムが機械からの潜在的なエラーレートを正確に適用できるように、同じシーケンスランに含まれるサンプルのグループにおいて、配列をアンプリコン配列バリアント(ASV)に分類した。各シーケンスランのノイズ除去から得られたフィーチャーテーブルと代表配列をマージし、各アンプリコンメソッドの完全なデータセットを作成した。分類学的識別子は、QIIMEのfeature-classifier classify-sklearn法を用いてASVに割り当てた81。16S rRNA遺伝子データについては、515fb/806rb遺伝子配列のSILVA 132 99%分類器を用いてこれらの割り当てを行った。葉緑体またはミトコンドリア（非微生物配列）に割り当てられたASVは、解析を続ける前にデータセットからフィルタリングされた。18S rRNAデータについては、RESCRIPt (v.2022.8.0)プラグインを使用して、SILVA 138 99%データベースのプライマーに一致する配列から完全な12レベルの分類法を抽出し、抽出した配列をデリプリケートし、特徴テーブル82のASVにラベルを割り当てる分類器をトレーニングした。この分類法を用いて、古細菌門、連生植物門、細菌門、古脊椎動物門、節足動物門、軟体動物門、哺乳類門に分類されたASV、および分類されていないASVを除外し、5,535個のASV、総頻度772,483,701を得ました。DNA抽出陰性およびノーテンプレートPCRコントロールサンプルは、サンプル内の汚染が最小限であることを確認するために分析された。ほとんどのコントロールサンプルは存在量が少なく、希釈に使用した閾値以下であった。レアファクションの閾値を超えた数少ないコントロールサンプルは、主座標分析（PCoA）において真のサンプルとは離れた場所にクラスターを形成し、アルファ多様性が低かったため、レアファクションの深さ以上のサンプルは汚染が最小限であり、分析に許容できると考えられた。その後、DNA抽出陰性およびノーテンプレートPCR対照サンプルはデータセットおよび今後の解析から除外した。
微生物多様性の指標は、QIIME2系統多様性プラグインを使用して両方のアンプリコンタイプから作成した。系統樹は、SILVA 128 99%参照樹に対してフラグメント挿入SEPP法83を用いて、各アンプリコンタイプについて個別に構築した。アルファ多様性メトリクスは、ASVリッチネスとFaithの系統的多様性公式として観察された特徴の数を用いて計算した。統計的比較は、αレベル0.05でBenjamini-Hochberg多重検定補正をかけたペアワイズKruskal-Wallis H検定を用いて行った（文献84）。β多様性を評価するために、0.5で重み付けした一般化UniFrac法を用いて非類似度を計算した85。統計的比較は、多重検定補正を行い、アルファ値0.05の並べ替え分散分析（PERMANOVA）を用いて行った（参考文献86）。分類学とアルファ多様性の可視化は、R87,88のggplot2とviridisパッケージを使って作成した。β多様性の主座標プロットは、QIIME2のEmperor（v.2022.8.0）プラグインを使って作成した（文献89）。線形混合効果モデルを用いて、1つの従属変数に対する共変量の寄与を評価し、群集のα多様性指標（例えば、ASVリッチネス）とβ多様性距離（例えば、UniFrac距離）が、分解時間（すなわち、ADD）とサンプリング位置（すなわち、ヒップに隣接する分解土壌と対照土壌）によって影響を受けるかどうかを検定した。応答変数は、サンプリング地点（すなわち、分解土壌対対照土壌）を独立変数（固定効果）とし、反復測定を考慮した個々の遺体のランダム切片を用いて、多様性指標≒ADD×サンプリング地点＋（1｜遺体ID）という式で、ADDにわたって統計的に評価した。
他の分解研究における主要分解者の検出
参考文献6,24,25,64,64の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列データファイル。6,24,25,64,69,90,91はQIITA92からそれぞれ研究ID 10141-10143、1609、13114、10317、13301、11204で入手した。QIITA92から得られたデータは、Deblur80を用いてDemultiplexedとDenoiseが行われており、QIITA92 study pageで入手可能である。ref.16のデータは、NCBI Sequery Centerから入手した。16のデータはBioProject PRJNA525153のNCBI Sequence Read Archiveから入手した。フォワードリードはQIIME2 (v.2023.5)79にインポートし、Deblur (v.1.1.1)80を用いてデマルチプレックスおよびノイズ除去を行った。文献26のデータは、Max Planck Society Edmondのリポジトリ（https://edmond.mpdl.mpg.de/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.17617/3.UV4FBN）から入手した。フォワードリードはQIIME2（v.2023.5）79にインポートし、デマルチプレックスした。プライマー（5′ GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）はcutadapt（v.4.4）93を用いて除去し、データはDeblur（v.1.1.1）80を用いてノイズ除去した。SILVA 138のV4 (515f/806r)領域で学習させたナイーブベイズ分類法を用いて、全研究のASVに99%の運用分類単位（OTU）を割り当てた。データテーブルはJupyterノートブック（Jupyter Lab v.4.0.5）94にインポートされ、さらに解析が行われた（Python v.3.8.16）。各データセット内で、35個の普遍的なPMI分解酵素ASVの検索を行った。この検索では、我々のデータセットに含まれるASVと他のデータセットに含まれるASVとは正確に一致したが、同じ分類群に分類される可能性のある類似のASVとは一致しなかった。それぞれの分解者ASVの相対存在量は、まず特定のメタデータカテゴリー内の全サンプルを平均した。次に、平均相対現存量を各分解質者属で合計した。有病率表は、各ユニバーサル分解者ASVが存在する特定のメタデータカテゴリー全体のサンプル数を合計して作成した。Wohlfahrtiimonasの存在は文献26のデータセットで見つかった。しかし、これらのASVは、われわれの普遍的なWohlfahrtiimonas分解者と配列が完全に一致するものではなく、おそらく昆虫に関連した菌株であろう（補足表33；Wohlfahrtiimonadaceae列）。Wohlfahrtiimonas属に分類された他のASV、またはWohlfahrtiimonadaceae科に分類されたものの属レベルで未同定のASVが存在しないか、残りの研究で検索した。平均相対存在量は上記のように計算した。
群集形成メカニズムの決定
細菌の集合を促進する生態学的プロセスを調べるため、文献95,96に記載されているように、16S rRNA遺伝子アンプリコンデータの系統学的ビンベースのヌルモデル解析により、群集集合メカニズムを定量的に推定した。95,96. βNTIの値が<+2であれば、確率的な力によって群集が形成されていることを示し、>+2であれば、ランダムな偶然（決定論的な力）によって予想される系統的な入れ替わりが少ないか、または大きいことを示す。βNTI値<-2は同質的選択に対応し、値>+2は異質的選択に対応する。同質的選択とはランダムな偶然によって予想されるよりも互いに類似している群集をいい、異質的選択とはランダムな偶然によって予想されるよりも互いに類似していない群集をいう。決定論的な力には、環境のフィルタリングや生物学的相互作用などの選択要因があり、確率論的な力には、分散、出生-死亡イベント、移民などのランダムな要因がある。
MAGsの生成と分類
アセンブリーを最大化するため、メタゲノムはMEGAHIT（v.1.2.9）97を用い、以下のフラグを付けてサイト内で共アセンブリーした： -k-min 41（メタゲノムデータの生成に使用したサンプルのリスト、共集合統計、GTDB分類、および各サンプル内のMAGのTPM正規化カウントアバンダンスについては、補足表4-6を参照）。2,500kbを超えるアセンブルされたスキャフォールドは、MetaBAT2（v.2.12.1）98を用いてデフォルトのパラメータでMAGにビニングされた。MAGの完成度とコンタミネーションはcheckM（v.1.1.2）99を用いて評価した。MAGは、50％以上完了し、10％未満汚染されている場合、ローカルMAGデータベースに保存された。MAGは、dRep（v.2.6.2）100を使用して、99％の同一性で複製解除された。MAGの分類はGTDB-tk（v.2.0.0、r207）101を用いて割り当てた。新規の分類学は、GTDB分類文字列の最初の名前のない分類学レベルとして決定された（MAGの品質と分類学情報については補足表5を参照）。DRAM（v.1.0.0）102（補足表5;https://doi.org/10.5281/zenodo.7843104）を用いて、MAGとコアアセンブリのアノテーションを行った。575個のメタゲノムから1,130個のMAGを回収し、そのうち276個は中質または高質であった。このMAGセットは、新規の細菌目（n = 3）、科（n = 9）、属（n = 28）、種（n = 158）を包含し、ガンマプロテオバクテリアと放線菌が優占する微生物分解体のゲノム設計図を提供した（補足表5）。
MAGと遺伝子量のマッピング
各サンプルにおけるMAGの存在量を決定するために、各サンプルから得られたリードを、bowtie2（v.2.3.5）74を用い、以下のフラグで、複製解除されたMAGセットにマッピングした： -D 10 -R 2 -N 1 -L 22 -i S,0,2.50. 出力されたsamファイルはsamtools (v.1.9)75を用いてソートされたBAMファイルに変換された。BAMファイルは、BBMap（v.38.90）（https://sourceforge.net/projects/bbmap/）のidfilter=0.95のフラグを持つreformat.shスクリプトを使用して、95%の同一性でマッピングされたリードについてフィルターをかけた。フィルタリングされたBAMファイルは、ゲノムモードでCoverM (v0.3.2) (https://github.com/wwood/CoverM)に入力され、transcripts per million (TPM)が出力された。サンプル間の遺伝子の存在量を決定するために、MMseqs2（リリース13）のeasy-linclust（v4e23d5f1d13a435c7b6c9406137ed68ce297e0fc）103を使用して、DRAMによって出力されたアセンブリから遺伝子のヌクレオチド配列を以下のフラグでクラスタリングした： -min-seq-id 0.95-alignment-mode 3-max-seqs 100000。次に、bowtie2（ref.74）を用いてクラスター代表にリードをマッピングし、MAGについて上述したように95%同一性になるようにフィルターをかけた。遺伝子量を決定するために、フィルターしたbamをcoverMにコンティグモードで入力し、TPMを出力した。細菌MAGフィーチャーテーブルをQIIME2（v.2020.8）79 にインポートした。合計50回存在せず、6サンプル未満で見つかった細菌フィーチャーは、ノイズを減らすためにデータセットから削除された。細菌フィーチャーテーブルは、門、綱、目、科、属、種のGTDB分類レベルで折りたたんだ。群集の多様性をMAGと16S rRNA ASVの特徴テーブル間で比較し、両方のデータタイプが同じ生物学的シグナルを示すことを確認した。各表は、16S rRNAとメタゲノミックデータのペアを持つサンプル（つまり、メタゲノミックデータと16S rRNAデータの両方を持つサンプル）を含むようにフィルタリングされた。ブレイカーティス非類似度行列は、TPM正規化MAGアバンダンス表と希釈16S rRNA ASV表について計算した。Procrustes/PROTEST104,105とMantel検定は、それぞれPCoA序列と距離行列の間で行われた106。その結果、それぞれのデータセットに有意差はなく、生物学的シグナルが共有されていることが確認された（Extended Data Fig.10）。
代謝相互作用シミュレーション
HiOrCo（v.1.0.0）（カットオフ0.001）（https://github.com/cdanielmachado/HiOrCo）を用いて、各施設の各分解段階（すなわち、初期、活性、高度）のMAG相対頻度表から高次（20微生物メンバー）の共起パターンを計算した。HiOrCoは、シミュレーションの精度を向上させるために、共起するMAGコミュニティーの100回の反復を提供する。FIRS施設では、分解が進行している間、有意に共起しているMAGは検出されなかった。したがって、FIRSの分解初期段階と活発な分解段階のみを用いて解析を継続した。CarveMe（v.1.5.1）107を使用して、デフォルトパラメーター（https://github.com/cdanielmachado/carveme）を用いて、各MAGからゲノムスケール代謝モデル（GEM）を構築した。各共存MAG群集のGEMを微生物群集としてSMETANA（v1.0.0）（https://github.com/cdanielmachado/smetana）に入力し、文献34,35に記載されているように、群集メンバー間の代謝的な協調的・競合的相互作用の可能性を記述するいくつかの指標を計算した。34,35. メトリクスには、代謝相互作用ポテンシャル（MIP）、代謝資源重複（MRO）、種間結合スコア（SCS）、代謝物取り込みスコア（MUS）、代謝物生産スコア（MPS）、SMETANAスコアが含まれます。MIPは、外部資源への依存度を減らすために、種がどれだけ多くの代謝物を共有できるかを計算します。MROは、ゲノムに基づいて全メンバー種の最小栄養要求量の重なりを測定することにより、代謝競争を評価する方法である。SCSは、ある種が生き残るために他の種が存在する場合の依存度を、コミュニティのサイズに依存して測定するものである。MUSは、ある種が生き残るためにどれくらいの頻度で代謝物を取り込む必要があるかを測定する。MPSは、代謝物を生産する種の能力の二値測定である。個々のSMETANAスコアはSCS、MUS、MPSのスコアの組み合わせであり、相互摂食相互作用（例えば、種Aが種Bから代謝物Xを受け取る）の確実性の尺度を与える。シミュレーションは、無機化合物の水素、水、リン酸塩を分析から除外し、両生物の生育をサポートする、分子量を用いて計算された最小培地に基づいて作成された。ランダムヌルモデル解析は、それぞれの場所と分解段階において、共存するMAGの変化が相互作用の可能性の変化を引き起こしていることを確認するために行った。各サイトと分解段階について、random.sample()を用いた置換なしのランダム選択により、20 メンバーのコミュニティを 100 個生成した。MIPとMROを計算するシミュレーションは上記のように行った。各施設の分解後期段階（温帯気候の高度分解段階と半乾燥の活発分解段階）について、クロスフィードされる可能性のある分子の詳細な調査を行った。
代謝効率シミュレーション
代謝モデルとConstraint Based Reconstruction and Analysis（COBRA）ツールボックス（v.3.0）108 を用いて、時空間的に異なるサンプル間の代謝能力の違いをシミュレートした。炭水化物、アミノ酸、脂質、その他のビタミン、ミネラルのリストを含む一般的な基本増殖培地M0を、以前の研究109から採用した。この基本培地から、炭水化物に富む培地M1、アミノ酸に富む培地M2、脂質に富む培地M3が定義された。炭水化物リッチ培地は、ベース培地に含まれるすべての化合物を含むが、タンパク質や脂質よりも炭水化物を多く取り込むことができ、その逆も同様である。MATLABのCOBRA toolbox108を使用して、好気的条件下で各 MAG個体について、M1、M2、M3からの全体的なATP産生を最適化した。この仮定は、分解が起こる表土の状態が比較的好気性であることから行われた。計算された最大ATP収量は、増殖培地からATPを抽出する各 MAGの最大能力と解釈できる。最後に、サンプル中のGEMからの総ATP産生の加重平均は、各 MAGの相対存在量に最大総ATP産生量を掛け合わせ、サンプル中の全てのGEMを合計することで算出した110。
分子ネットワークとスペクトルライブラリー検索
分子ネットワークは、GNPS (https://gnps.ucsd.edu; 参考文献77)上のFeature-Based Molecular Networking (FBMN) ワークフロー(v.28.2)111 を用いて作成した。質量分析データは、まずMZMINE2（v.2.53）112で処理し、結果をGNPSにエクスポートしてFBMN解析を行いました。プリカーサーイオンの質量許容差は0.05 Daに、MS/MSフラグメントイオンの質量許容差は0.05 Daに設定した。分子ネットワークは、コサインスコアが0.7以上で、5つ以上のピークが一致するようにエッジがフィルタリングされて作成されました。さらに、2つのノード間のエッジは、各ノードが互いに最も類似したノードのトップ10に現れる場合にのみ、ネットワークに保持された。最後に、分子ファミリーの最大サイズを100に設定し、分子ファミリーのサイズがこの閾値を下回るまで、最低スコアのエッジを分子ファミリーから削除した。次に、ネットワーク内のスペクトルをGNPSスペクトルライブラリ77,111に対して検索した。ネットワークスペクトルとライブラリースペクトルの間のすべてのマッチは、スコアが0.7以上であり、少なくとも6つのピークが一致することが必要であった。
代謝物の式とクラス予測
スペクトルはGNPSからダウンロードし、ZODIAC114を含むSIRIUS (v.4.4)113にインポートし、デフォルトパラメータでデータベースに依存しない分子式アノテーションを行った。ZODIACスコアが少なくとも0.95で、MS/MSスペクトル強度の少なくとも90%がSIRIUSで説明できる場合、式アノテーションは保持された。114. 最終的な同定リストは、ZODIAC による同定と GNPS によるライブラリヒットをマージして作成しました（補足表 36）。代謝物が ZODIAC の予測式とライブラリヒットの両方を持つ場合は、ライブラリヒットの割り当てが優先されました。最終的な式リストには 604 の式が割り当てられた。有機化合物の組成をvan Krevelen図で調べ、モルH:C比とO:C比115に基づいて主要な生化学的クラスに割り当てた。分子比に基づく分類は、化合物が特定の生化学的クラスに属することを保証するものではないので、化合物は、割り当てられたクラス（例えば、タンパク質様）に'-like'を追加することにより、化学的に類似しているものとしてラベル付けされた。さらに、C、H、N、O、P、Sの分子量に基づいて炭素の公称酸化状態を計算するために、文献116に記載されているように化合物の式を使用した。116（補足表37および38）に記載されている。
代謝物特徴テーブルの処理
GNPS からダウンロードした代謝物フィーチャテーブルを sum normalization で正規化し、pareto scaling117 でスケーリングして QIIME2 (v.2022.2)79 にインポートした。このテーブルには、すべてのライブラリヒット代謝物、予測式を持つ代謝物、および注釈のない代謝物が含まれます。Bray-Curtis および Jaccard 距離を用いた PCoA クラスタリングにより、土壌および皮膚サンプルとは別の処理対照のクラスタリングが確認されました。5つの土壌サンプルは、加工コントロールとのクラスタリングのために除去された。加工コントロールはデータセットから除去され、その後、ノイズを減らすために最低30サンプルから欠失した代謝物が除去された。PERMANOVA (perm. = 999) を使用して、土壌と皮膚のサンプル間で Bray-Curtis および Jaccard β 多様性グループ比較を実行しました。代謝物特徴テーブルは、GNPS ライブラリでヒットした化学式および/または ZODIAC で予測された化学式に基づく代謝物を含むようにフィルタリングされました。これらの表について、死体関連の土壌および皮膚から差分存在量分析を行い、初期（0 日目）のサンプルを基準フレームとして、QIIME2（v.2022.2）プラグイン ANCOM-BC（Analysis of Composition of Microbiomes with Bias Correction）118 を使用して、分解段階による代謝物の対数比の変化を調べました。
Joint-RPCA
Joint-RPCAの数式を含む完全な方法論はSupplementary Textにあります。簡単に説明すると、合同因数分解を行う前に、まずデータセットをすべての入力データ行列にまたがる共有サンプルの総セットから訓練用サンプルセットとテスト用サンプルセットに分割します。この分析に含まれるデータセットは、16S rRNA遺伝子量、18S rRNA遺伝子量、MAG遺伝子量、MAG遺伝子機能モジュール、および股関節隣接分解土壌からの代謝物であった。その後、各行列をロバスト中心対数比変換（robust-clr）により変換し、データをゼロ付近に中心化し、正規分布に近づけた42,119。従来のclr変換とは異なり、robust-clr変換は生物学的データによく見られるスパース性を、インピュテーションを必要とせずに処理する。robust-clr変換は、トレーニングセットとテストセットの行列に独立して適用された。ここで使用された合同因数分解は、局所多様体上で最適化された特異値分解であるOptSpace行列補完アルゴリズムに基づいて構築された42,119。共有行列は、すべての入力行列の共有サンプルにわたって推定された。各行列について、観測値は非ゼロ項目についてのみ計算され、その後、最小化された共有推定行列がすべての行列にわたって最適化されるように平均化された。最小化は、勾配降下法によって繰り返し実行された。推定行列の回転が一貫していることを保証するために、すべての入力行列にまたがる共有推定行列と共有固有値行列は、各反復で再計算された。共同因数分解のオーバーフィッティングを防ぐために、再構成の交差検証を行った。この場合、先に説明したすべての最小化は、トレーニングセットのデータに対してのみ実行された。次に、訓練セットデータの推定行列を用いてテストセットデータを同じ空間に射影し、テストデータの再構成を計算した。これにより、訓練データ推定値の最小化誤差は、各反復でこれらの推定値に組み込まれないテスト集合データの最小化誤差も最小化することが保証される。トレーニングデータの推定値が確定された後、これらのサンプルが失われるのを防ぐために、テストセットのサンプルが再び最終出力に投影された。最終的に推定された行列から、すべての入力行列にわたるすべての特徴の相関が計算された。最後に、ここでは入力行列が1つだけのjoint-RPCAを元のRPCA119と同様に扱ったが、他の手法との比較のためにクロスバリデーションを追加するという利点もある。
マルチオミクス生態ネットワークの可視化
この分析に含まれるデータセットは、18S rRNA 遺伝子量、MAG 量、MAG 遺伝子機能モジュール、およびヒップ隣接分解土壌からの代謝物である。対数比は、サンプルの順序付けに基づいて選択された joint-RPCA PC2 スコアを使用して生成され、初期非分解土壌および初期分解土壌、または後期分解土壌（つまり、活性および高度）時間帯のいずれかとの関連に基づいて、各オミックス特徴をランク付けした。対数比は、上位 N 個の特徴の生カウント/表値の合計と、下位 N 個のランクの特徴の生カウント/表値の合計の対数比であり、分解段階によって最も変化することが観察されたため、順序分析から生成された PC2 負荷に基づいている。スパース性に起因する対数比のサンプルの脱落を防ぐため、文献120,121に記載されているように 120,121に記載されているように、各オミックの分子特徴量と分母特徴量を2～1,500個合計し、少なくともサンプルの90%が保持されるようにした：メタゲノミクス（MAG）N-特徴量＝30個（99.2%）、18S N-特徴量＝1,499個（90.1%）、メタゲノミクス（遺伝子モジュール）N-特徴量＝26個（100%）、メタボロミクスN-特徴量＝238個（100%）。Joint-RPCA相関行列は、ネットワークの視覚化を生成するための対数比に使用される初日ゼロ、初期、アクティブ、または高度分解に関連する特徴の合計にサブセットされました。ネットワークの視覚化におけるノイズを減らすため、選択したノード間の相関の上位20%のみが保持された。
系統樹の生成
Redbiom（v.0.3.9）122を使用して、主要な分解者を少なくとも100カウント含むサンプルについて、すべての一般公開されているAGP90およびEMP69の研究を検索した。AGPサンプルは腸内環境と皮膚環境のみを含むように、EMPサンプルは土壌と宿主環境のみを含むように、さらに絞り込んだ。次に、各環境から、主要な分解者とともに最も多く存在するASVの上位50種を抽出し、Greengenes2（リリース2022.10）123を用いて系統樹に配置した。その後、ASVをサンプル数に応じてランク付けし、EMPress（v.1.2.0）を用いて可視化した124。
ランダムフォレスト回帰モデリング
各'omic'データタイプから処理された特徴量表は、ADD予測力をテストするためにネストされた交差検証（CV）を伴うランダムフォレスト回帰モデリングに使用された。データは、各サンプリング位置（例えば、臀部に隣接する土壌、顔面に隣接する土壌、臀部の皮膚、顔面の皮膚）ごとにモデルを個別に学習およびテストするようにサブセットした。データはcalour（v.2018.5.1）（http://biocore.github.io/calour/index.html）を用いてモデルの前処理を行い、モデルはscikit-learn（v.0.24.2）125を用いて学習／テストした。フィルタリング後のデータセット中の存在量がゼロの特徴は除去された。サンプリングが行われた施設は、地理的位置がモデリングに重要かどうかを判断するため、モデルの特徴として含まれた。オーバーフィッティングを防止するため、1つの施設からのサンプルが訓練セットとテストセットの間で分割されないように、個々の施設からのサンプルはグループ化された。モデルの精度と汎化性を徹底的にテストするために、ネスティッドCVを実施した。最適化のためにテストされたハイパーパラメータは、 max_depth = [None, 4], max_features = ['auto', 0.2], bootstrap = [True, False]であった。入れ子のCVは、外側のCVループと内側のCVループからなる。外側のループは、LeaveOneGroupOut分割によって作成され、36のボディの1つからのサンプルは、内側のCVループが完了した後、モデル検証のために脇に置かれた。残りの35体は、内側のCVループでRandomForestRegressor（n_estimators = 500）モデルのトレーニングに使用されました。内側CVループは、同様にLeaveOneGroupOut分割を行い、34体がモデルの学習に使用され、内側CVループで保留された1体からのサンプルでテストされた。この内部CVは、どのハイパーパラメータが予測に最適かを決定するために、内部ループ内のすべての35ボディが1度テストボディとして使用されるまで繰り返された。次に、最も性能の良い内側CVモデルを、外側CVループで保留された36番目のボディからのサンプルを予測するために使用し、これは現在、検証テストセットとして機能する。モデル精度は、すべての検証体サンプルの実際のADDに対する予測ADDのMAEを計算することによって決定された。モデルのトレーニングから完全に除外された36番目の体からのサンプルの予測は、オーバーフィッティングを減らし、モデル精度の推定値を得ることを可能にした。ネストされたCVプロセス全体を、各ボディが外側のCVループの検証ボディとして1回使用されるまで（つまり36回の反復）繰り返した。その結果得られた各ボディの36の平均絶対誤差は、モデルの精度、一般化可能性、およびどのデータ型が最もよく機能したかを決定するために使用された。モデルを駆動する重要な分類群を決定するために完全なデータセットを使用していることを確認するために、最良のハイパーパラメータ（bootstrap=False, max_depth=None, max_features=0.2）を使用して、重要な特徴を抽出するためにRandomForestRegressor（n_estimators = 1,000）モデルを訓練しました。重要な特徴は、その相対的な重要度によって 0-1 の尺度でランク付けされ、すべての重要度の合計が 1 となる。各サンプリング日のTBSをADD予測のトレーニングデータとして使用したランダムフォレストモデルを、同じ手法でトレーニング・テストし、マイクロバイオームベースのモデルと、より伝統的な分解進行の評価方法とを比較した。
最後に、死後間隔予測の精度と信頼性を、我々のモデルには含まれていない遺体から採取した独立テストセットで確認した。独立テストセットは、3つの施設（ARF、テキサス州サンマルコスの法医人類学研究施設（FARF）、カナダ・ケベック州の実験的・社会的タナトロジー研究施設（REST））で、臀部に隣接する土壌と臀部の皮膚から収集した。(補足表39）。独立テストセットは、各施設から採取された時間的サンプルで構成された。ARFとRESTのサンプルは、各施設の各遺体から採取された3つのタイムポイントを持つ3つの遺体から構成されている。各タイムポイントで、土壌サンプルがパージ内とパージ外で、皮膚サンプルが臀部から採取された。ARFの1体（B3.D4）は最初のタイムポイントにパージがなかったため、このサンプルは採取されなかった。FARFは4体からサンプルを提供した。2体(2021.04および2021.45)はARFおよびRESTと同じサンプリング手順であったが、他の2体(2021.39および2021.44)は最初のサンプリング・タイムポイント中にパージが行われなかったため、サンプルは採取されなかった。サンプルは採取、出荷、保管され、既述の方法でDNAが抽出され、16S rRNA V4の塩基配列が決定された。データ作成後、MetcalfラボでQIIME2（v.2020.8）79を用いてアンプリコン配列データを解析した。配列は事前に割り当てられたGolayバーコードを使用して、品質フィルターをかけ、多重化を解除した。リードの長さは150 bpであった。その後、deblurノイズ除去法80を用いて、塩基配列をASVに分類した。515fb/806rb遺伝子配列のSILVA 132 99%分類器を用い、QIIME feature-classifier classify-sklearn法81を用いてASVに分類学的識別子を割り当てた。葉緑体またはミトコンドリア（非微生物配列）に割り当てられたASVは、解析を続ける前にデータセットからフィルタリングされた。データはサンプルあたり5,000リードに希釈し、SILVAデータベースの7ランク分類学レベル（L7）に折りたたんだ。フィーチャーテーブルを土壌データと皮膚データに分割し、サンプリング位置とフィーチャーが同じになるように、検証データテーブルを元のデータセットにマッチさせた（つまり、両方のデータセットで股関節に隣接する土壌で見つかった分類群のみを使用）。ランダムフォレスト回帰モデル（n_estimators=1000, max_depth=None, bootstrap=False, max_features=0.2）を構築し、検証サンプルの真のADD測定値を予測するために適合させた。ランダムに割り当てられたADDは、ヌルモデルとして使用された。
統計と再現性
2016年3月から2017年12月まで、36体のヒト死体が、設置日から21日間の腐敗まで毎日サンプリングされた。本研究は地理的に異なる3つの人類学研究施設を包含し、4つの季節ごとに各施設に3体の死体を配置した。綿棒サンプルは、臀部、顔面、および対照となる腐敗していない場所に直接隣接する土壌から採取された。また、臀部と顔面の皮膚からも綿棒サンプルが採取された。サンプル数を事前に決定するための統計的方法は用いなかった。サンプルは処理中に無作為化された。治験責任医師は、実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていなかった。十分なDNAが抽出されなかったり、塩基配列が決定されなかったり、塩基配列の質が悪かったりしたサンプルは除外された。DNA/代謝物の抽出、増幅、ライブラリー調製の際には陰性対照が含まれた。線形統計モデリングは、単一の従属変数に対して線形混合効果モデルを用いて実施し、応答変数は反復測定を考慮するために個々の体に対してランダム切片を用いてADDにわたって統計的に評価した。群間比較は、Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較P値を調整したDunn Kruskal-Wallis H-検定、多重比較調整を行わない両側分散分析（ANOVA）、または多重検定補正を行ったPERMANOVAを用いて行った。有意差分析は、ANCOM-BC118を用い、0日目の初期サンプルを参照フレームとして行った。Procrustes/PROTEST104,105およびMantel検定は、それぞれPCoA序列と距離行列の間で実施した106。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
生アンプリコンおよびメタゲノム解析データとサンプルメタデータは、QIITAオープンソースマイクロバイオーム研究管理プラットフォーム（study 14989およびENA accession PRJEB62460（ERP147550））で入手可能である。脱複製MAGおよびDRAM出力は、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7843104; https://zenodo.org/record/7938240)およびNCBI BioProject PRJNA973116で公開されている。質量分析データはMassIVEパブリックリポジトリに寄託された（アクセッション番号： 皮膚サンプルはMSV000084322、土壌サンプルはMSV000084463）。分子ネットワーキングジョブはhttps://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=1c73926f2eb5409985cc2e136062db2f。GNPSデータベースはhttps://gnps.ucsd.edu/。GreenGenes2データベースはhttps://ftp.microbio.me/greengenes_release/。SILVAデータベースはhttps://www.arb-silva.de/documentation/release-1381/。 Earth Microbiome ProjectデータおよびAmerican Gut Projectデータは、それぞれERP125879およびERP012803のアクセッションでEBIに掲載されている。文献6,24,25,64,64,64の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列データファイル。6,24,25,64,69,90,91の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列データファイルは、QIITA92から研究ID 10141-10143（文献6）、1609（文献24,25）、13114（文献69）、10317（文献90）、13301（文献64）および11204（文献91）で入手した。ref.16のデータは、NCBI Sequence Centerから入手した。16のデータはBioProject PRJNA525153のNCBI Sequence Read Archiveから入手した。ref.26のデータはMax Planck Society Edmondのリポジトリ(https://edmond.mpdl.mpg.de/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.17617/3.UV4FBN)から入手した。GTDBデータはhttps://data.gtdb.ecogenomic.org/releases/。ソースデータは本論文で提供している。
コードの利用可能性
解析コード、中間ファイル、メタデータはGithub (https://github.com/Metcalf-Lab/2023-Universal-microbial-decomposer-network)で公開されている。Joint-RPCAの完全な数学的アルゴリズムはSupplementary Textにある。
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著者情報
著者および所属
コロラド州立大学動物科学部（米国コロラド州フォートコリンズ
ザッカリー・M・バーチャム、エーリエル・D・ベルク、アレクサンドラ・エモンズ、ビクトリア・ニエッキ、ジェシカ・L・メトカーフ
米国テネシー州ノックスビル、テネシー大学微生物学部
ザッカリー・M・バーチャム
米国アラバマ州オーバーン大学動物科学科
エリエル・D・ベルク
コロラド州立大学土壌作物科学部（米国コロラド州フォートコリンズ
Bridget B. McGivern、Michael Shaffer、Kelly C. Wrighton
カリフォルニア大学サンディエゴ校スカッグス薬学部共同質量分析イノベーションセンター（米国カリフォルニア州サンディエゴ
アミナ・ブスリマニ、モーガン・パニッチパクディ、ケリー・C・ウェルドン、ピーテル・C・ドーレスタイン
コロラド州立大学化学・生物工学部（米国コロラド州フォートコリンズ
パルサ・ガーデルマジ & シウ・フン・ジョシュア チャン
米国カリフォルニア州ラホヤ、カリフォルニア大学サンディエゴ校小児科
キャメロン・マルティーノ、チユン・ズー、グレッグ・C・ハンフリー、ゲイル・アッカーマン、ダニエル・マクドナルド、ロブ・ナイト
ロックフェラー大学物理生物学研究センター（米国ニューヨーク州ニューヨーク
リアット・シェンハヴ
ニューヨーク大学グロスマン医学部システム遺伝学研究所（米国・ニューヨーク州・ニューヨーク
リアット・シェンハヴ
ニューヨーク大学コンピューターサイエンス学部（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
リアット・シェンハヴ
米国ノースカロライナ州ダーラム デューク大学 生物統計学・バイオインフォマティクス学科
アンルー・R・チャン & ピシュー・シー
米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学コンピューターサイエンス学部
アン・R・チャン
コロラド州立大学大学院細胞分子生物学プログラム（米国コロラド州フォートコリンズ
ヘザー・L・ディール、ビクトリア・ニエッキ、ジェシカ・L・メトカーフ
中国・江西省南昌市・南昌大学食品科学技術学院
ゼック・シュウ
アリゾナ州立大学生命科学部（米国アリゾナ州テンピ
Qiyun Zhu
アリゾナ州立大学基礎・応用マイクロバイオミクスセンター（米国アリゾナ州テンピ
Qiyun Zhu
カリフォルニア大学サンディエゴ校コンピューター科学・工学部（米国カリフォルニア州ラホヤ
カレン・キャントレル、ロブ・ナイト
コロラド州立大学コンピューターサイエンス学部（米国コロラド州フォートコリンズ
アサ・ベン・ハー
米国地質調査所、南西生物科学センター、米国ユタ州モアブ
サーシャ・C・リード
米国コロラド州グランドジャンクション、コロラド・メサ大学法医学捜査研究ステーション
メリッサ・コナー
米国テネシー州ノックスビル、テネシー大学人類学部、法医人類学センター
デレク・ボイド、ジェイク・スミス、ジェナ・M・S・ワトソン、ジョバンナ・ヴィドリ、ドーニー・ステッドマン
米国テネシー州チャタヌーガ、テネシー大学社会・文化・司法研究学部
デレク・ボイド
米国インディアナ州ジェファーソンビル、ミッドアメリカ葬祭大学
ジェイク・スミス
サム・ヒューストン州立大学生物科学部（米国テキサス州ハンツビル
アーロン・M・リン＆シビル・ブチェリ
米国ハワイ州ホノルル、チャミネード大学自然科学・数学部法医学ユニット、法医学タフォノミー研究室
デビッド・O・カーター
カリフォルニア大学サンディエゴ校マイクロバイオーム・イノベーションセンター（米国カリフォルニア州ラホヤ
ロブ・ナイト
米国カリフォルニア州ラホヤ、カリフォルニア大学サンディエゴ校バイオエンジニアリング学科
ロブ・ナイト
カナダ先端研究所ヒトとマイクロバイオームプログラム（カナダ・オンタリオ州トロント
ジェシカ・L・メトカーフ
貢献
Z.M.B.、D.O.C.、R.K.、K.C.Wrighton、J.L.M.がプロジェクトの構想を練った。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、A.B.、C.M.、H.L.D.、M.P.、K.C.Weldon、G.C.H.、G.A.、M.C.、D.B.、J.S.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.、J.L.M.がデータキュレーションに貢献。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、P.G.、C.M.、L.S.、A.R.Z.、P.S.、A.E.、H.L.D.、V.N.、M.S.、K.C.、D.M.が正式な解析を行った。K. C. Wrighton、D.O.C.、R.K.、J.L.M.が資金を獲得。A.B.、M.P.、K.C.ウェルドン、M.C.、D.B.、J.S.、J.M.S.W.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.はプロジェクト調査に貢献。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、A.B.、P.G.、C.M.、L.S.、A.R.Z.、P.S.、Z.Z.X.、V.N.、Q.Z.、M.S.、M.P.、K.C.ウェルドン、K.C.、A．S.H.J.C.、M.C.、D.B.、J.S.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.、J.L.M.が方法論を開発した。Z.M.B.、M.C.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.、J.L.M.がプロジェクトを管理した。S.H.J.C.、M.C.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.がリソースを提供。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、P.G.、C.M.、L.S.、A.R.Z.、P.S.、Z.Z.X.、M.S.、K.C.、A.B.-H.、D.M.、P.C.D.はソフトウェアを開発。S.H.J.C.、M.C.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.が監修。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、P.G.、C.M.、M.C.、G.V.、D.S.、A.M.L.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、R.K.、J.L.M.がデータ検証を行った。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、P.G.、C.M.、A.E.、S.C.R.が可視化に取り組んだ。Z.M.B.、A.D.B.、A.E.、B.B.M.、S.C.R.、D.O.C.、J.L.M.が原案を執筆。Z.M.B.、A.D.B.、B.B.M.、P.G.、C.M.、H.L.D.、S.C.R.、D.M.、M.C.、S.B.、P.C.D.、K.C.Wrighton、D.O.C.、R.K.、J.L.M.が査読・編集を担当。
責任著者
Jessica L. Metcalfまで。
倫理申告
競合利益
P.C.D.は、2023年にDSMアニマルヘルス社のコンサルタントを務め、Sirenas社およびCybele Microbiome社のコンサルタントおよび株式保有者であり、Ometa Labs LLC社、Arome社およびEnveda社（カリフォルニア大学サンディエゴ校の承認を得て）の創設者兼科学顧問および株式保有者である。R.K.は、Gencirq（株式およびSABメンバー）、DayTwo（コンサルタントおよびSABメンバー）、Cybele（株式およびコンサルタント）、Biomesense（株式、コンサルタント、SABメンバー）、Micronoma（株式、SABメンバー、共同設立者）およびBiota（株式、共同設立者）と提携している。他の著者は競合する利害関係はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Anna Heintz-Buschart氏、Michael Strickland氏、Aleksej Zelezniak氏による本著作の査読に感謝する。
その他の情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して中立を保っている。
拡張データ
図1 研究情報。
死体安置日を含む実験期間中の場所ごとの平均a)気温データおよびb)総降水量。気温データは、National Centers for Environmental Informationに報告された地方気象台から収集した。月間総降水量データはWeather Undergroundから収集した。c) さらなる分析に使用された、抽出、処理、品質フィルタリング後のサンプルとオミックスタイプの交点を示すアップセットプロット。MetaG = メタゲノミクス、Metab = メタボロミクス、18S = 18S rRNAアンプリコン、16S = 16S rRNAアンプリコン。
ソースデータ
Extended Data 図2 メタボローム比較。
a)全ユニーク代謝物および全メタボロームサンプルのJaccard距離およびb)Bray-Curtis距離の主座標分析（PCoA）は、死体皮膚と死体関連土壌が有意に異なるコミュニティプロファイルであることを示している。有意性はPERMANOVA（順列=999）によって決定された。Van Krevelen図は、c)死体関連土壌とd)死体皮膚において、脂質様、タンパク質様、リグニン様のクラスが強く存在することを示した。データベースの化学式に一致するか、または有意に予測された化学式を持つ代謝物は、水素：炭素および酸素：炭素のモル比によってVan Krevelen有機化合物分類に割り当てられた。色は有機化合物分類に対応。化学式が割り当てられた遺体関連e)土壌およびf)遺体皮膚代謝物の名目炭素酸化状態(NOSC)スコアは、累積度日数(ADD)で測定した分解時間の経過に伴い、すべての地理的位置で熱力学的有利性が有意に減少している。土壌：ARF n = 251、STAFS n = 250、FIRS n = 245の生物学的に独立したサンプル。皮膚： ARF n = 250、STAFS n = 249、FIRS n = 249の生物学的に独立したサンプル。データは平均値+/- 95%信頼区間として示した。g)脂質様代謝物は、累積度日数（ADD）により測定された分解よりも、死体に関連した土壌で存在量の増加を示し、温帯土壌で有意に増加した。h) タンパク質様代謝物は、蓄積度日数（ADD）で測定した分解に伴う死体関連土壌での存在量が脂質様代謝物よりも少なく、STAFS土壌では有意に減少した。ARF n = 251、STAFS n = 250、FIRS n = 245の生物学的に独立したサンプル。データは平均値+/- 95%信頼区 間で示した。有意性は、各ロケーション内で線形混合効果モデルを用いて測定し、死体については両側ANOVAと多重比較調整なしのランダム切片を追加した。代謝物量は中心対数比変換で正規化。
出典データ
拡張データ Fig.
a)ゲノム分類データベースの分類を持つ、99%脱複製された中～高品質のMAG257種と、b)各ロケーション内の各分解段階におけるMAGの平均存在量（100万あたりの転写産物、TPMとして与えられる）のサンケイ図。プロテオバクテリア（Proteobacteria）とバクテロイディオータ（Bacteroidota）の発現量は分解が進むにつれて増加し、一方、アクチノバクテリア（Actinobacteria）の発現量はそれぞれの場所で減少した。このMAGセットには、新規の細菌目（n=3）、科（n=9）、属（n=28）、種（n=158）が含まれる。c)円の大きさで表した各位置における脂質、炭水化物、アミノ酸のADDに対するC-molあたりの最大ATPのスピアマン相関。温帯気候では、代謝効率はADDと相関している。ARF n = 212、STAFS n = 198、FIRS n = 158の生物学的に独立したサンプル。有意性は、それぞれの場所内で線形混合効果モデルを用いて測定し、死体についてはランダム切片を加え、p<0.05 ()、p<0.01 ()、p<0.001 ()で示した。ARF: アミノ酸 p = <2e-16, STAFS: アミノ酸 p = 1.18e-06, 炭水化物 p = 4.22e-04. d) O. alkaliphilaに起因すると考えられる群集全体のアミノ酸代謝効率と、e) C. intestinaviumに起因すると考えられる群集全体の炭水化物代謝効率は、ゲノムの代謝効率と相対的存在量の積として、温帯の場所での分解よりも増加する。データは平均値+/- 95%CIとしてLoess回帰でプロットした。ARF n = 212、STAFS n = 198、FIRS n = 158の生物学的に独立したサンプル。 f) 16S rRNAアンプリコンデータセットの初期非分解土壌と初期分解土壌、次に初期分解土壌と活性土壌など（PL = プレースメント、EA = アーリー、AC = アクティブ、AD = アドバンスド）を比較することで、後継的なアセンブリーの傾向に着目したβNTI値を得るための一対比較。集合力の相対的な存在量から、異種選択（βNTI > +2）の圧力は分解に伴って増加し、同種の選択（βNTI < -2）は減少することが明らかになった。g) メタゲノムから予測される代謝競合は部位特異的であり、分解とともに大きく変化する。h) メタゲノムから予測される代謝協力と競合は、各サイト内の20メンバーコミュニティにランダムにサブサンプリングされ、分解はMAG共起の重要性を示すヌルモデル比較として機能する。ARF n = 201、STAFS n = 188、FIRS n = 151の生物学的に独立したサンプル。ボックスプロットの下ヒゲと上ヒゲは、第1四分位点と第3四分位点（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応する。上ヒゲはヒンジから1.5 * IQR以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5 * IQR以内の最小値まで伸びている。箱ひげ図の中心は中央値で表される。有意性はDunn Kruskal-Wallis H-検定で測定し、多重比較のp値はBenjamini-Hochberg法で調整し、p<0.05 ()、p<0.01 ()、p<0.001 ()で示す。
ソースデータ
Extended Data 図4 マルチオミクス統合。
a) 分解土壌と対照土壌のASVリッチネスを分解時間軸で比較した結果、温帯地域では細菌リッチネスが有意に減少していることが明らかになった。ARF n = 414、STAFS n = 316、FIRS n = 310の生物学的に独立したサンプル。有意性は、各ロケーション内で線形混合効果モデルを用いて測定し、両側ANOVAと多重比較調整なしで死体についてランダム切片を追加した。ARFとSTAFSの豊かさのp = <2e-16。p<0.05()、p<0.01()、p<0.001()で示す。 b) マルチオミクスJoint-RPCAは、微生物群集生態が季節と地理的位置に影響されることを示している。マルチオミックスJoint-RPCAは土壌の16S rRNA、18S rRNA、メタボローム、メタゲノム集合ゲノムデータを統合したもの。すべてのデータタイプで同じn = 374生物学的に独立したサンプルを使用。マルチオミクスJoint-RPCAの主成分スコアから、c) 施設の変動は主に主成分3（PC3）とPC4で説明され、d) 分解段階は主にPC2で説明され、e) 季節は主にPC1で説明され、f) 気候は主にPC3とPC4で説明されることが示された。マルチオミクスJoint-RPCAには、土壌の16S rRNA、18S rRNA、メタボローム、メタゲノム集合ゲノムデータが組み込まれています。すべてのデータタイプで同じ n = 374 の生物学的に独立したサンプルを使用。パネル g のデータは平均値 +/- 95% CI で表示。
ソースデータ
図5 Universal Initial Non-Decomposition And Early Decomposition Soil Network（普遍的な初期非分解と初期分解土壌ネットワーク）。
Joint-RPCA PC2における普遍的な初期非分解土壌と早期分解土壌の対数比信号の選択ノード間の相関の上位20%を共起ネットワークで可視化。すべてのデータタイプで同じn = 374の生物学的に独立したサンプルを使用。
ソースデータ
図6 現在のデータベースに配置された分解者ASV。
AGP腸、AGP皮膚、EMP土壌、およびEMP宿主関連データセットから得られた最も豊富なASVの上位50個以内に、ネットワークから得られた主要な分解者ノードに関連するASVを配置した系統樹は、主要な分解者が系統学的にほぼユニークであることを示している。最も内側のリングは分解者の配置を表し、外側のリングはAGPとEMPのASVを表し、バーの高さは各環境におけるASVランクの有病率を表す。AGPとEMPのASVは、各環境で見つかったサンプル数に従ってランク付けされた。棒グラフがない場合は、そのASVがデータセット内に存在しないことを示す。分解者のASVは時計回りに番号を付け、完全な分類については補足表27を参照。
ソースデータ
図7 16S rRNAランダムフォレストモデルの重要な特徴。
死後間隔を予測するための16S rRNAランダムフォレスト回帰モデルで決定された最も重要なSILVAレベル7分類群20種は、すべてのサンプルタイプで同じ分類群の多くがモデル予測に重要であることを示しているが、いくつかの違いが現れている。
拡張データ 図8 重要な特徴の縦断的存在量。
a)顔の皮膚、b)臀部の皮膚、c)臀部に関連する土壌、d)顔に関連する土壌の16S rRNAデータから、死後間隔を予測するランダムフォレスト回帰モデルで決定された最も重要なSILVAレベル7の6分類群。それぞれの地理的位置における分類群とADDにわたる正規化存在量の変化でプロットしたデータ。データはloess回帰でプロットされ、16S rRNAの土壌顔、土壌腰、皮膚顔、皮膚腰のデータセットには、それぞれn = 600、616、588、500の生物学的に独立したサンプルが含まれる。データは平均値+/- 95%信頼区間として示されている。
図9 16S rRNAランダムフォレストモデルの検証。
a) PMI（ADD）の予測のためのランダムフォレストモデルを訓練するために使用されたトータルボディスコア（TBS）は、TBSスコアが低いMAEに基づいて比較的正確にPMIを予測できることを示しているが、微生物学ベースのモデルよりも高い残差値で表されるように、予測における変動性が高い。臀部に関連する皮膚と土壌から採取したSILVAレベル7の分類群を用いて16S rRNAデータから構築したモデルを、b)我々のモデルでは表現されていない場所と気候の死体から採取したサンプルからなる独立したテストセット、およびc)ヌルモデルとして機能するように、サンプルに真のADDの範囲内でランダムに割り当てられたADDを与えた同じデータで検証した。有意性は、各場所で線形混合効果モデルを用いて測定し、両側ANOVAと多重比較調整なしで、死体についてランダム切片を追加した。データは平均値+/- 95%CIで示す。
出典データ
Extended Data 図10 16S rRNAとメタゲノミックデータの多様性比較。
股関節に隣接する土壌から得られた、対になった希薄化16S rRNA特徴量（左）とTPM正規化MAG存在量（右）から計算されたBray-Curtis非類似度行列のPCoA順序プロット。PCoA ordinancesと距離行列の間で、それぞれProcrustes/PROTESTとマンテル検定を行った。
補足情報
補足情報
補足表1-9、14-16、25-39の凡例。補足表10-13、17-24、および本文。
報告概要
補足表
補足表1. サンプルのメタデータ。表には摂取時および試験期間中に採取されたデータが含まれる。表2. ANCOM-BCによる死体皮膚代謝物の対数比の分析結果。最初の0日目のサンプルを基準レベルおよび切片として使用した。結果には、0日目の代謝物の分解初期、活動期、進行期に対する対数比変化、P値、ホルム・ボンフェローニ補正P値（Q値）、標準誤差、W値が含まれる。表3. ANCOM-BCによる死体関連土壌代謝物の対数比の分解段階別変化の差分存在量分析結果。最初の0日目のサンプルを基準レベルおよび切片として使用した。結果には、0日目の代謝物の分解初期、活動期、進行期に対する対数比変化、P値、ホルム・ボンフェローニ補正P値（Q値）、標準誤差、W値が含まれる。表4. ショットガンメタゲノムデータ作成に使用したサンプルのリスト。表5. メタゲノムサンプルから共集合したゲノムビン（metagenome-assembled genomes; MAGs）のアセンブリ統計とGTDB分類。各 MAG の完全性とコンタミネーションを含む。表6. メタゲノムサンプル内のMAGのTPM正規化カウントアバンダンス。表7. 各施設のADDにわたるメタゲノミックデータから算出された応答変数ATP/C-molアミノ酸の変化を検定するための線形混合効果モデル統計量と、各施設内で代謝の有効性がシフトするかどうかを検定するための反復測定を考慮した、各個体のランダム切片。計算式 ATPm ≈ ADD + (1|body ID)'。表8. メタゲノムデータから算出された炭水化物1C-molあたりのATPの反応変数の変化を、各施設のADDにわたって検定するための線形混合効果モデルの統計量と、各施設内で代謝の有効性がシフトするかどうかを検定するための反復測定を考慮した、個々の体についてのランダム切片。計算式 ATPm ≈ ADD + (1|body IT 表9. 各施設のADDにわたってメタゲノミックデータから算出されたC-mol脂質あたりのATPの応答変数の変化を検定するための線形混合効果モデルの統計量と、各施設内で代謝効力がシフトするかどうかを検定するための反復測定を考慮した、個々の身体ごとのランダム切片。計算式 ATPm ≈ ADD + (1|body ID)'。表14. 分解後期の各施設における交差供給化合物の予測交換数。分解後期とは、STAFSとARFでは分解が進んだ段階、FIRSでは分解が活発な段階と定義した。表15. サンプリング部位（すなわち、ヒップに隣接する土壌と対照土壌の比較）を独立変数（固定効果）とし、反復測定を考慮するために各個体のランダム切片を用いた、各施設のADDにわたる16S rRNA遺伝子データから算出したGeneralized UniFrac PC1距離の応答変数の変化を検定するための線形混合効果モデル統計量。モデルは、サンプリング部位とADD変数を個別に測定し、変数間の交互作用を測定した。変数間の交互作用は、サンプリング部位が分解に対して異なる反応を示すかどうかを検定するために用いた。計算式 多様性指標≒ADD×サンプリング部位＋（1|個体ID）」。表16. サンプリング部位（すなわち、ヒップに隣接する土壌 vs 対照土壌）を独立変数（固定効果）とし、反復測定を考慮するために個々の個体についてランダム切片を用いた、各施設のADDにわたる16S rRNA遺伝子データから算出したASVの豊かさの応答変数変化を検定するための線形混合効果モデル統計量。モデルは、サンプリング部位とADD変数を個別に測定し、変数間の交互作用を測定した。変数間の交互作用は、サンプリング部位が分解に対して異なる反応を示すかどうかを検定するために用いた。計算式 多様性指標≒ADD×サンプリング部位＋（1|個体ID）」。表25. 分解後期（つまり活発で進行した）土壌に対応するネットワーク特徴ノード間で計算されたJoint-RPCA PC2相関。表 26. 初期分解土壌、非分解土壌、早期分解土壌のネットワーク特徴ノード間で計算されたJoint-RPCA PC2相関。表27. 分解者ネットワーク分類群と同じ分類群に割り当てられた16S rRNA遺伝子ASV。表には、図4eの系統樹ラベル、150bp長のASV、および他の研究でASVの存在を調べるために使用された100bp長のASVのトリミングを含む。表28. 他のいくつかの研究において、ヒトおよび陸生由来の可能性がある環境における普遍的分解者の存在。表は、各サンプルタイプにおける各分解菌ASVの平均相対存在量を示している。平均相対存在量は各分解者属について合計した。表29. 分解後期にクロスフィーダーとして予測されたMAGのクロスフィーディング統計量。表には、GTDB分類、各MAGが複合レシーバーおよび/またはドナーとみなされた反応数、および後期分解中のすべての供与と受容を担った割合が含まれる。分解後期とは、STAFSとARFでは分解が進んだ段階、FIRSでは分解が活発な段階と定義した。表30. 分解後期におけるOblitimonas alkaliphilaの相互摂食交換。FIRSでは、Oblitimonas alkaliphilaはこの時間枠の間、予測された交雑摂食者ではなかった。表には、交換に関与したゲノムのMAG IDと分類学的分類、交換された化合物、計算された相互作用指標が含まれる。表31. 分解後期のL-アルギニンまたはオルニチンのクロスフィーディング交換。表には、交換に関与したゲノムのMAG IDと分類学的分類、交換された化合物、計算された相互作用指標が含まれる。表32. 臀部の皮膚および臀部に隣接する土壌について、SILVAデータベースレベル7の分類学的ランクランダムフォレスト回帰モデルで16S rRNA遺伝子を使用してサンプルの独立したテストセットを予測したモデル検証結果。誤差はADDのMAEで表す。表33. 哺乳類の腐敗環境に焦点を当てた他のいくつかの研究における普遍的分解者の存在。各データセット内で35種類のPMI普遍的分解者ASVの検索を行った。各分解菌ASVの相対存在量は、まず特定のメタデータカテゴリー内の全サンプルを平均した。次に、平均相対存在量を各分解菌属で合計した。有病率表は、特定のメタデータカテゴリーにおいて、それぞれの普遍的分解者ASVが存在するサンプル数を合計して作成した。表34. 各施設の各遺体について算出した暦日あたりの平均ADD。暦日あたりの平均ADDは、最終最大ADD値を総日数（つまり21日）で割って算出した。1日あたりの平均ADDは、死体ごと、季節ごと、施設ごと、気候タイプごと、および調査全体の平均として算出した。表35. 独立試験セットの各施設の各死体について算出した暦日あたりの平均ADD。暦日あたりの平均ADDは、最終最大ADD値をサンプリング日数の合計で割ることにより算出した。1日あたりの平均ADDは、各遺体、施設、および試験全体の平均として計算した。表36. 化学式が予測された代謝物、またはデータベースライブラリ内の化合物と一致した代謝物の代謝物同定情報。利用可能な場合、データベースライブラリの化学式は、モルH:CおよびO:C比に基づくNOSCおよび主要生化学クラスの計算において、予測化学式よりも優先された。表 37. 土壌代謝物特徴量表は、合計正規化で正規化し、パレートスケーリングでスケーリングした。表には、化学式と、モルH:CおよびO:C比に基づく主要生化学クラスが含まれる。表38. 皮膚代謝物特徴量表。和を正規化し、パレートスケーリングでスケーリングしたもの。表には、モルH:CおよびO:C比に基づく化学式と主要生化学クラスが含まれる。表 39. 機械学習独立テストセットのサンプルメタデータ。表には、摂取時および試験期間中に取得されたデータが含まれる。
ソースデータ
図1～6、拡張データ図1～6、拡張データ図9のソースデータ
図1のSD。サンプルタイプ数とサンプルのメタデータ。図2のSD。各基質のサンプルごとのC-molあたりのATPとペアワイズβ-NTI計算。図3のSD。SMETANA MIP および MRO スコア計算、予測されるクロスフィード代謝物、Faith の PD 計算、およびジョイント-RPCA 距離行列/調整。図4のSD。Joint-RPCA距離行列/調整およびマルチオミックス対数比。図5のSD。後期分解の多原子相関。図6のSD。ランダムフォレスト予測、16S rRNAモデル重要特徴、16S rRNA SILVA-L7特徴表。EDのSD Fig. サイト気象データ。EDのSD 図2. 代謝物特徴表、化学式、およびVan Krevelen代謝物分類。SD for ED 図3. MAG分類と特徴表、MAGおよびサンプルごとのC-molあたりのアミノ酸と炭水化物のATP。図4. 16S rRNAの計算リッチネス。EDのSD 図5. 初期／早期分解のマルチオミクス相関。SD（EDの場合） 図6. 分解中に見つかったASVとEMPおよびAGPデータセットで見つかったASVを比較した系統樹のトップランク分類群。SD（EDの場合） 図9. 16S rRNAランダムフォレスト検証による予測。
権利と許可
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転載と許可
この記事について
アップデートの確認 CrossMarkで通貨と真正性を確認する
この記事の引用
Burcham,Z.M.、Belk,A.D.、McGivern,B.B.他、環境変動にもかかわらず、保存されたドメイン間微生物ネットワークが死体の腐敗を支えている。Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01580-y
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受領
2023年6月28日
受理
2023年12月08日
発行
2024年2月12日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-023-01580-y
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微生物生態学
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分解者コミュニティは世界共通である
マイケル・S・ストリックランドローレル・リンチ
ネイチャー微生物学 (2024)
ネイチャー・マイクロバイオロジー (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)
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