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公開日：2023年7月19日
深部生物圏に存在する未培養の小型古細菌のウイルス細胞における空間機能組織化

https://www.nature.com/articles/s41396-023-01474-1

インドラ・バナス, サラ・P・エッサー, ...アレクサンダー・J・プロブスト 著者一覧
ISMEジャーナル17巻1789-1792ページ(2023)この記事を引用する

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メトリクス詳細

要旨
ウイルス細胞（ウイルスに感染した細胞）の生態学的役割は重要であるにもかかわらず、個々の細胞をin situで研究することは技術的に困難である。我々は、ウイルス細胞の生態生理を研究するための新しい相関顕微鏡的アプローチを紹介する。未培養の古細菌のウイルスFISH、16S rRNA FISH、および走査型電子顕微鏡による調査を同時に行うことで、様々な古細菌細胞の形態を、対応する系統学的シグナルおよび内在性ウイルス感染と関連付けた。未感染細胞ではリボソームとDNAの蛍光シグナルが中程度の分離を示したが、ウイルス細胞では染色体DNAとウイルスDNAが細胞内で完全に分離し、後者は宿主のリボソームシグナルと共局在した。同様の空間的分離が分裂細胞でも観察され、ウイルスシグナルは隔壁のリボソームの近くに集まった。これらの観察から、これらの未培養ウイルスの複製は宿主リボソームと一緒に起こり、リボソームはビリオンの組み立てに必要なタンパク質の生成に使われることが示唆された。重感染した細胞は、その表面にウイルス様の粒子が付着していることがあり、これは透過型電子顕微鏡で観察された細胞内のウイルス構造と一致していた。その結果、このアプローチは、未培養ウイルスのゲノムとそれぞれの構造および宿主細胞とを結びつける初めてのものとなった。今回の発見は、深部地下バイオフィルムにおける古細菌ウイルス細胞の複雑な生態系に新たな光を当て、今後のウイルス細胞のin situ研究に確かな枠組みを与えるものである。

環境原核生物の溶原性ウイルスに関するほとんどのin situ研究は、遊離ビリオンやそのゲノムに焦点を当てている[1]。近年、科学界はウイルス感染の犠牲となり、代謝変換を受けた細胞であるウイルス細胞の生態学的役割を調査し始めている[2]。宿主の分子機構は通常、ウイルスの複製を促進するために急速に再プログラムされ [3]、高度に進化した細菌ジャンボファージの場合には、繁殖のために細胞の区画が明確になることさえある [4]。古細菌に感染するウイルスは、しばしば異なるビリオン構造、生化学的特性、排出機構、協調的なウイルス細胞乗っ取りモチーフを持つ（[5,6,7]に総説あり）。これらの報告はすべて古細菌の単離培養から生まれたものであるため、未培養の大多数のウイルス細胞の構造や組織についての理解が科学界には不足している[1]。

最近では、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の進歩により、ウイルスゲノムにタグを付けることで未培養のウイルスを検出することが可能になり[8, 9]、Schaibleらは、16S rRNAタグを用いた特定の原核生物の同定のために、FISHイメージングと走査型電子顕微鏡（SEM）を相関させた[10]。しかしながら、ウイルスFISH（すなわち、ウイルスを標的とした直接遺伝子FISH）とSEMの組み合わせは提案されているが[11]、ウイルスFISHプロトコルは、標的細胞に入るために300塩基対の二本鎖（ds）プローブを必要とし、そのため細胞を過酷な温度で処理する必要があり、細胞超微細構造の崩壊をもたらすため、確立されていない（補足図S1）。ここでは、ウイルスFISH、16S rRNAベースのFISH、およびSEM解析を協調的に行うことにより、未培養の古細菌ウイルス細胞の生態生理学を研究するための新しい相関顕微鏡的アプローチを報告する。深部生物圏の未培養古細菌に適用し、様々なCandidatus Altiarchaeum hamiconexum細胞の形態と対応する核酸シグナルを結びつけた。

未培養古細菌Ca. Altiarchaeumは、世界中の地下深部の生態系を支配しており[12]、未培養の溶解性ds-DNAウイルスがこれらの古細菌に感染し、深部生物圏の炭素循環に重大な影響を及ぼしている[8]。主にCa. A.hamiconexumを主な標的とし、virusFISHによってタグ付けされたds-DNAウイルスのゲノムは、しかしながら、以前の研究ではウイルスの特徴的な遺伝子をコードしていないと予測されていた[8]。AlphaFold[13]を用いて予測されたウイルス遺伝子からタンパク質の三次構造をモデリングし、その結果を機能のアノテーションと関連付けることによって、新規の補助代謝遺伝子（すなわち、Ni-Feヒドロゲナーゼ）、カプシドタンパク質をコードする遺伝子、および環状ウイルスゲノムにコードされる他のウイルス関連タンパク質を同定した（補足図S2、補足表S1）。タグ付きゲノムのウイルス性を裏付けるこのインシリコ証拠を踏まえて、我々はCa. A.hamiconexumウイルス細胞の超微細構造を、新しい相関顕微鏡的アプローチで調べた。

細胞の超微細構造を保存することは、(ウイルス)FISHとそれに続くSEMのためのサンプルを調製する際に特に困難である。Ca. A.hamiconexumの際立った特徴は、細胞外ハミ構造であり、これは基底のバーブワイヤー構造とナノグラップリング末端フックを持つ細胞外細胞表面付属物であり、細胞を相互に連結する[14]。固定試薬の濃度と臨界点乾燥のバランスを注意深くとることにより（詳細は補足的方法を参照、補足図S1は比較のための不十分なサンプル保存を示す）、ハミ、ひいてはCa. hamiconexum細胞のハミ、ひいては超微細構造の保存に成功した（図1）。蛍光シグナルとSEMシグナルの適切な相関を確実にするため、グリッド付きカバースリップを使用したところ（図1a、補足図S3）、ほとんどの未感染細胞でリボソームと染色体DNAの空間的分離が明らかになった。このような現象は、古細菌細胞よりも大きな古細菌（すなわち、アスガルド古細菌）[15]で以前に観察されているが、DPANN超門の小さな古細菌（直径700-800 nm）のリボ細胞（感染を示さない細胞）でも同等の分離が観察された。分裂中の細胞でも同様の分離が観察され、DNAはそれぞれの娘細胞の外極付近に局在していた。同時に、われわれのアプローチにより、Ca. Hamiconexum肋膜に付着した小さなDNA充填小胞（直径：250-300 nm、n = 3）をまれに検出することができた。hamiconexum ribocellに付着していた。我々は、これらの小胞が、最近Ca. Altiarchaeaで最近報告された[16]。

図1：天然に存在するCa. hamiconexum バイオフィルムの蛍光顕微鏡写真と走査型電子顕微鏡写真の重ね合わせ。
図1
青色の蛍光シグナルはDAPIに対応し、緑色はCa. A. hamiconexumの16S rRNAを標識したSMARCH714プローブ[20]に対応する。A. hamiconexumの16S rRNAを標識したSMARCH714プローブ[20]（Atto488）、ウイルスゲノムを標識したvirusFISHプローブ[8]（Alexa594）。矢印は推定小胞を指す。 c 未感染分裂細胞 d 感染した膨張細胞 e 感染分裂細胞 f 単一の感染細胞 g fの蛍光画像のオーバーレイ。スケールバー： スケールバー：1 µm（a）、500 nm（b-g）。この図の色盲フレンドリー画像を補足図S4として提供し、単一チャンネル画像を補足図S5-S8として提供する。

フルサイズ画像
未培養ウイルスに感染したアルティア細胞（感染率5％[11]）は、リボ細胞よりも10～20％大きく、わずかに球形であった（図2b；感染細胞30個、非感染細胞145個；ウィルコクソン検定、両側、p値＜0.001；補足表S2、補足図S9、S10）。ビロセルの肥大化は以前にも純粋培養で報告されており、感染したSulfolobus islandicus細胞はそのサイズが数桁大きくなった[6]。分裂中のCa. A.hamiconexum細胞では、ウイルスシグナルが細胞分裂隔壁に沿って蓄積しており、2つの娘細胞の間の細胞質でウイルス繁殖が起こっていることが示された（図1d, e）。この染色体DNA、リボソーム、ビリオン合成の空間的分離は、個々の球菌でも観察された（図1f, g）。これらの観察をCa. A.hamiconexum細胞の超薄切片と比較すると、ウイルス繁殖活動が他の細胞質空間から明確に分離していることが確認された（図2c、補足図S12）。蛍光顕微鏡で観察された球状の細胞内構造に配列したウイルスシグナルの蓄積は、ビリオンの組織的なパッキングを示唆した（図1gと2a）。しかし、ウイルス細胞はほとんどの場合、このような球状構造を示さず、むしろウイルスシグナルが密集していた（例えば、図2aのウイルスシグナル）。これらの観察結果は、ウイルスの生殖サイクルの異なる段階を反映している可能性が高いが、いずれも宿主染色体から空間的に分離している。

図2：細胞内および推定細胞外ウイルス粒子の同定。
図2
a 蛍光顕微鏡写真と走査型電子顕微鏡写真の重ね合わせ（2022年に採取）。矢印は推定細胞外VLPを指す。青色の蛍光シグナルはDAPI、緑色はCa. Hamiconexumの16S rRNAを標識したSMARCH714プローブ[20]。A.hamiconexumの16S rRNAを標識したSMARCH714プローブ[20]（Atto488）、ウイルスゲノムを標識したvirusFISHプローブ[8]（Alexa594）。SEM 欄の破線のボックスプロットは、4 nm の Pt/Pd 層を差し引いた後の仮定のデータである（ボックスプロット上の t 検定の有意性）。測定された古細菌細胞サイズ（感染細胞30、非感染細胞145；Wilcoxon検定、p値＜0.001）と比較（箱ひげ図上のWilcoxon検定の有意性）。 c TEM画像（2018年[8]にサンプリング）。矢印はCa. hamiconexum細胞内の推定VLPを指す。hamiconexum細胞内の推定VLPを指す。スケールバー500 nm。

フルサイズ画像
個々の球に分離しない強いウイルスシグナルは、しばしば宿主細胞の表面構造の変化と共起した。これらの変化は、Ca. A. hamiconexum細胞の表面に付着した小さなウイルス様粒子（VLP）として現れた。hamiconexum細胞の表面に付着した小さなウイルス様粒子（VLP）として現れた（図2a）。これらの未培養ウイルスのビリオン構造は未知のままであるが、これらの構造は本明細書および他の文献[8, 17]の透過型電子顕微鏡（TEM）像と一致している。TEM薄切片の細胞内推定VLPと相関顕微鏡で同定された細胞外VLPのサイズを比較したところ、サイズに有意差が認められた［TEMのVLPの平均直径53 nm（n = 56） vs. SEMのVLPの平均直径65 nm（n = 71） t検定 p値 = 2.7-10-11; 補足表S3、図2、補足図S11、S12］。サイズの違いは、異なるイメージング技術の適用、またはウイルスの成熟状態の違い（例えば、細胞内と細胞外、カプシドの存在）に起因するかもしれないが、VLPのサイズは古細菌ウイルスの予想される範囲内である[18]。しかし、今回紹介した相関顕微鏡法は、メタゲノムデータと未培養ウイルスの構造を結びつけることで、配列データからしか存在が知られていないウイルスの形態学的特徴を解明することを可能にした。この新しいアプローチは、地下のバイオフィルム以外のサンプルマトリックスにも容易に適用できる可能性がある。

深部生物圏の微生物は、深部地下のサンプリング機会が限られているため、地球上で最も謎に包まれた生物学的存在のままである。オミックス」アプローチは、地下深部の微生物形質を解読するために主に使用されているが[19]、これらの生物の生態生理学と関連するウイルス感染を理解するための単一細胞レベルでの進歩は、依然として例外である。個々の細胞のまれな感染イベントを発見する能力を可能にする我々の新規プロトコルは、ほとんど特徴づけられていない深部生物圏を個々のウイルス細胞レベルで理解する上で大きな前進であり、小胞から未培養古細菌のサイズ変化までの特異的な形態を示す。ウイルス細胞内の空間的機能的分布は、深部分岐型古細菌における高度な細胞内組織化を明らかにしており、これはウイルスが複製するために必要かもしれず、TEM[9]のような高分解能イメージングと結びついた高度な手法の開発が必要な、今後の調査が必要である。深枝型古細菌におけるこのようなウイルス複製の基盤となる分子機構は未知のままであるが、リボ細胞やウイルス細胞における細胞内組織は、十分に特性化されたモデル系以外でも微生物の生理学において重要な役割を果たしており、古細菌の全樹を包含している可能性があることを示唆している。

参考文献
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謝辞
本研究は、ドイツ学術奨学財団の助成を受けて実施した（IBに授与）。AJPはノルトライン＝ヴェストファーレン州文化科学省（Nachwuchsgruppe "Dr. Alexander Probst"）およびドイツ研究財団（DFG grant PR1603/2-1）の支援を受けた。このプロジェクトは、欧州連合（EU）の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の下、欧州研究会議（ERC）から資金援助を受けている（助成金契約番号863664）。Sabrina Eisfeld氏、Ines Pothmann氏、Maximiliane Ackers氏、Agathe Materla氏にはラボの管理と技術的な支援をいただいた。Imaging Center EssenのチームとJennifer Grünertには、技術支援、顕微鏡のトレーニング、優れたサンプル調製プロトコルにつながる建設的な議論を、Duisburg-Essen大学の旧水生微生物生態学グループの同僚には、初期の支援と議論を感謝する。

資金提供
Projekt DEALによるオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者メモ
ヤニナ・ラーフ

現職： リンネ大学生物・環境科学部微生物モデルシステム生態学・進化学センター（EEMiS）、カルマル、スウェーデン

著者および所属
ドイツ、エッセン、デュースブルグ・エッセン大学化学部、ルール大学アライアンス・ワンヘルス研究センター、環境メタゲノミクス

インドラ・バナス、サラ・P・エッサー、ビクトリア・トゥルジンスキー、アンドレ・ソアレス、クリスティーナ・モラル、アレクサンダー・J・プロブスト

ドイツ、エッセン、デュイスブルグ・エッセン大学化学部、水圏微生物生態学・環境微生物学・バイオテクノロジーグループ

インドラ・バナス、サラ・P・エッサー、ビクトリア・トゥルジンスキー、アンドレ・ソアレス、ヤニナ・ラーフ、アレクサンダー・J・プロブスト

ルクセンブルク大学システム生物医学センター（ルクセンブルク、エッシュ・シュル・アルゼット

ポリーナ・ノビコワ、パトリック・メイ、ポール・ウィルムズ

海洋環境化学生物学研究所（ICBM）、カール＝フォン＝オシエツキー大学オルデンブルク、オルデンブルク、ドイツ

クリスティーナ・モラル

イメージングセンター・エッセン（EMU、ドイツ・エッセン

マイク・ハーゼンベルク

ルクセンブルク大学科学・技術・医学部生命科学・医学科（ルクセンブルク、ベルヴォー

ポール・ウィルムズ

植物発生・電子顕微鏡、ミュンヘン・バイオセンター、プラネッグ・マルティンスリード、ドイツ・プラネッグ

アンドレアス・クリングル

デュイスブルグ・エッセン大学水・環境研究センター（ZWU）、ドイツ、エッセン

アレクサンダー・J・プロブスト

デュイスブルグ・エッセン大学メディカルバイオテクノロジーセンター（ZMB）、ドイツ、エッセン

アレクサンダー J. プロブスト

貢献
IBはすべてのイメージングを行った。IB AK MHはSEM試料調製プロトコルを確立した。IB VT JRとCMはグリッドカバースリップディッシュのプロトコルを最適化した。ASとIBはRでデータ解析を行った。CM VT IBとAJPはFM結果の解釈について議論した； IBとAJPはSEM画像について議論し、相関顕微鏡の解釈を行った。SPE VT IBとJRはサンプリングを行った。SPEはIBと図について批判的に検討した。

共著者
Andreas KlinglまたはAlexander J. Probstまで。

倫理宣言
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
主な補足情報
補足情報2
補足情報3
表S1
表S2およびS3
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可する。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Banas、I., Esser、S.P., Turzynski、V. et al. 深部生物圏の未培養小型古細菌のウイルス細胞における空間機能組織. ISME J 17, 1789-1792 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01474-1

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受領
2023年1月24日

改訂
2023年6月26日

受理
2023年6月29日

発行
2023年7月19日

発行日
2023年10月

DOI
https://doi.org/10.1038/s41396-023-01474-1

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テーマ
バクテリオファージ
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ウイルス-宿主相互作用
ISME Journal (ISME J) ISSN 1751-7370 (online) ISSN 1751-7362 (print)

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