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ヘリコバクター・ピロリ
オリジナル研究
ヘリコバクター・ピロリ菌は、腸管免疫を調節し、粘液を分解する微生物叢シグネチャーを誘導することにより、大腸発癌を促進する FREE

https://gut.bmj.com/content/72/7/1258?utm_campaign=usage&utm_content=gut_sprout&utm_id=BMJ006&utm_medium=social&utm_source=twitter

Anna Ralser1、Alisa Dietl1、Sebastian Jarosch1,2、Veronika Engelsberger1、Andreas Wanisch1、http://orcid.org/0000-0002-4707-7887Klaus Peter Janssen3、Moritz Middelhoff4、Michael Vieth5、http://orcid.org/0000-0002-8497-582XMichael Quante4,6、http://orcid.org/0000-0002-6977-4085Dirk Haller7,8、Dirk H Busch1,9、Li Deng10,11、http://orcid.org/0000-0002-4602-4927Raquel Mejías-Luque1,9、http://orcid.org/0000-0001-9110-3950Markus Gerhard1,9。
Markus Gerhard教授（ミュンヘン工科大学医学部医療微生物学・免疫学・衛生学研究所、ミュンヘン80333、ドイツ）; markus.gerhard@tum.de 宛てにご連絡ください。
要旨
目的 ヘリコバクター・ピロリ感染は、世界中で最も流行している細菌感染症である。胃癌発症の最も重要な危険因子であるだけでなく、疫学的データによると、感染者は大腸癌（CRC）の発症リスクを約2倍増加させる。しかしながら、ピロリ菌感染と大腸がんとの直接的な因果関係や機能的な関連は明らかにされていない。

デザイン 2種類のApc変異マウスモデルとC57BL/6マウスにピロリ菌を感染させ、フローサイトメトリー、チップサイトメトリー、免疫組織化学、単一細胞RNA配列決定法を用いて、ピロリ菌による腸管免疫応答と上皮シグネチャーの変化を包括的に解析した。微生物シグネチャーは、無菌マウスおよび便移植実験によって特徴づけられ、評価された。

結果 H. pylori感染はApc変異マウスにおいて腫瘍の発生を促進した。我々は、制御性T細胞および炎症性T細胞の減少によって特徴づけられる、ピロリ菌によるユニークな免疫変化のシグネチャーを同定した。さらに、ピロリ菌は腸や大腸の上皮において、発癌を促進するSTAT3シグナルを誘導し、杯細胞を消失させた。この変化は、炎症性および粘液分解性の微生物シグネチャーと組み合わさって、腫瘍の発生に寄与することが示されている。同様の免疫と上皮の変化は、ピロリ菌感染患者からのヒト大腸生検でも見られた。Apc変異マウスを無菌条件下で飼育すると、ピロリ菌感染は改善され、ピロリ菌感染を早期に抗生物質で除菌すると、腫瘍発生率は感染していないコントロールのレベルまで正常化した。

結論 我々の研究は、ピロリ菌感染が大腸発癌の強力な原因であるという証拠を提供した。したがって、CRCの予防対策にH. pyloriの状態を導入することを検討すべきである。

データの利用可能性に関する声明
データは公開のオープンアクセスリポジトリで入手可能である。データは合理的な要求があれば入手可能である。生の単細胞RNAシーケンスおよび16S rRNAシーケンスデータは、NCBI BioProjectデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA808836/）のBioProjectアクセッション番号PRJNA808836にリンクして寄託されている。

https://doi.org/10.1136/gutjnl-2022-328075

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このトピックで既に知られていること
ヘリコバクター・ピロリ感染は、世界で最も流行している細菌感染症であり、胃癌発症の最も重要な危険因子である。

感染者は結腸直腸癌（CRC）の発症リスクが約2倍上昇する。

この研究で追加されたこと
ピロリ菌感染はApc変異マウスにおいて腸腫瘍の発生を促進する。

H.ピロリ菌の感染は、マウスおよびヒトの大腸において炎症性および発癌性の環境を誘導する。

観察された表現型は除菌療法により正常化し、微生物叢に強く依存している。

本研究が研究、実践、政策にどのように影響するか
ピロリ菌感染が大腸発癌の強力な原因であり、CRCの適応リスクスコアに含めるべきであるという証拠を提供する。

ピロリ菌の除菌は、このリスクを減少させる有効な手段である可能性がある。

はじめに
ヘリコバクター・ピロリ感染は世界人口の半数以上が罹患しており、胃癌の主な危険因子である。ピロリ菌は胃粘膜に多くの変化を引き起こし、その結果、上皮が腫瘍化する。このように、ピロリ菌感染はまず、小腸のパイエル板と腸間膜リンパ節でのプライミングに端を発し、ピロリ菌に向けられ、ピロリ菌自身によって制御される複雑な多数の免疫カスケードを引き起こす1。2 ピロリ菌に対する主要な炎症反応は、Tヘルパー（Th）1およびTh17の混合反応であり1、その大部分は4型分泌系の存在と活性に関連している3。この分泌系は、がん原性で免疫原性の高いタンパク質CagAの胃上皮細胞への移行を媒介する4。この結果、慢性炎症が引き起こされ、ピロリ菌が誘発する胃発がんの主要因である核因子-κB（NF-κB）やシグナル伝達物質・転写活性化因子3（STAT3）シグナル伝達の活性化などの炎症性シグナル伝達経路が活性化される5。しかしながら、ピロリ菌は慢性感染を確立し維持するために、例えば樹状細胞（DC）を再プログラムして制御性T細胞（Treg）を誘導する6 7など、対抗メカニズムを進化させてきた。Tregは胃の局所的な炎症反応を相殺し8、アレルギー性喘息からの保護に関与している9。興味深いことに、このようなDCの寛容性再プログラミングは、STAT3の活性化を介して、CagAによって部分的に媒介される7。最後に、感染時に胃内細菌叢の変化が観察されるが、これはピロリ菌感染後の胃がんにつながる有害事象に寄与しているようである10。この考えは、インスリンガストリン（INS-GAS）マウスのような動物モデルを用いた研究によって支持されている。INS-GASマウスは、ピロリ菌に感染していない無菌マウスと比較して、ピロリ菌にコロニー形成され、正常な常在細菌叢を保有している場合、より重篤な胃病理と早期腫瘍形成が認められた11。

ピロリ菌感染は胃に限局しているが、ピロリ菌感染とさまざまな胃外疾患との関連を示す疫学的データが蓄積されている12。その中でも、大腸がん（CRC）のリスクはピロリ菌感染状況と関連することが報告されている13。

本研究では、ピロリ菌特異的な腸内ホメオスタシスの変化が、CRCモデルマウスおよびヒトサンプルにおいて大腸発癌に寄与し、ピロリ菌除菌により可逆的であることを明らかにした。これらの知見は、胃癌や大腸癌の予防プログラムにおいてピロリ菌の状態を評価するための基礎となる。

研究結果
ピロリ菌は大腸腺腫症モデルマウスにおいて腸管発癌を促進する
ピロリ菌感染が下部消化管における腫瘍の発生を促進するかどうかを調べるため、Apc +/minマウスとApc +/1638Nマウスに異なる期間感染させた（オンライン補足図1A,B）。予想に反して、Apc +/min マウスは感染に対して非常に感受性が高く、12週間のピロリ菌感染後も60％しか生存しなかった（図1A）。Apc +/min 感染マウスでは、小腸と結腸の腫瘍負荷が非感染対照マウスに比べて増加した（図1B,C）。同様の結果がApc +/1638Nマウスでも観察され、感染後に2倍の腫瘍が発生し、小腸でより大きな腫瘍が認められた（オンライン補足図1C）。特に、Apc +/1638Nマウスでは、結腸腫瘍はH. pylori感染マウスでのみ検出された（オンライン補足図1C）。これらの観察結果は、ピロリ菌感染が腫瘍の発生しやすいマウスの腸および大腸腫瘍の発生を促進する一方、これらのマウスの胃にのみ感染することを示している（オンライン補足図1B）。

補足資料
[gutjnl-2022-328075supp001.pdf]
図1
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図1
ヘリコバクター・ピロリはApcマウスモデルにおいて腸発癌を促進する。(A）H.ピロリ感染マウスと非感染Apc+/minマウスを比較したカプランマイヤー生存曲線。(B）ピロリ菌感染マウス（n=18）と非感染マウス（n=10）の小腸と結腸の腫瘍数。(C）ピロリ菌感染マウスおよび非感染マウス（コントロール（Cont. Apc+/minマウス。各記号は3つの独立したプール実験から得られた1匹の動物を表す。棒グラフは中央値を示す。統計学的有意性はMann-Whitney U検定または対応のないt検定で決定した。

ピロリ菌感染は腸で炎症反応を誘導する
宿主のT細胞免疫応答の操作はピロリ菌感染を特徴づけるものであり、胃発癌の主なメカニズムの一つである。腸管免疫の変化がApc変異マウスの感染で観察された腫瘍負荷の増加に関係しているかどうかを評価するために、まず感染時のApc +/minおよびApc +/1638Nマウスの小腸におけるリンパ球浸潤を分析した（オンライン補足図1A）。上皮内CD3+ T細胞の小腸および結腸への動員はピロリ菌感染により増加し（図2Aおよびオンライン補足図2A）、これはT細胞のフローサイトメトリー解析によっても確認された（オンライン補足図2B,C）。さらに、感染によりCD8+ T細胞が増加し、CD4+ T細胞が減少することが明らかになった（オンライン補足図2D）。さらに、Foxp3+ Treg細胞の存在量とタンパク質レベルは、フローサイトメトリーにより検出されたように、感染していない対照と比較して、感染マウスの小腸で減少した（図2Bおよびオンライン補足図2E）。

補足資料
[gutjnl-2022-328075supp002.pdf]
図2
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図2
Helicobacter pylori感染は腸において炎症反応を誘導する。(A）ピロリ菌感染マウスと非感染Apc+/minマウスの12週間感染後の大腸CD3+染色の代表的写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。小腸および結腸組織1mm2あたりの陽性細胞の定量化を示す。3つの独立した実験のプールデータ。(B）12週間感染後のH. pylori感染マウスおよび非感染Apc+/minマウスから単離した腸管固有層リンパ球のフローサイトメトリー解析。CD4+T細胞のFoxP3+細胞の頻度を、生細胞、単一細胞、CD45+およびCD3+でゲーティングして示す。つの独立した実験のプールデータ。(C) H. pylori感染マウスおよび非感染C57BL/6マウスの24週感染後の胃、小腸および結腸組織切片の代表的なCD3+染色。mm2あたりの上皮内細胞の定量化を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。つの独立した実験のプールデータ。(D) CD4+T細胞のFoxP3+細胞の頻度を示す。細胞は生きた単一細胞、CD45+およびCD3+でゲーティングされた。つの独立した実験のプールデータ。(E）多重化チップサイトメトリーで染色した結腸組織の概要。大腸組織の多重化チップサイトメトリーの自動画像処理により、ピロリ菌陽性および陰性C57BL/6マウスにおけるCD4+ T細胞の特性を決定。従来のT細胞（Tconv）、制御性T細胞（Treg）および上皮内制御性T細胞（IE Treg）の頻度を示す。スケールバーは500μm。マルチプレックスチップサイトメトリーで染色した大腸組織の代表写真。核内FoxP3+、CD4+CD3+、CD45+染色で定義されるFoxP3+細胞。大きなスケールバーは100 µm、小さなスケールバーは10 µmに対応。つの実験の代表データ。(F) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)としてプロットされた注釈付き免疫細胞、さらなる解析のためのクラスターがハイライトされている（1=CD4 Treg, 2=CD8 and CD8 TRM）。(G)教師なしクラスタリングとUMAPとしてのTregクラスタの注釈、n=217細胞。Tregs、活性化Tregs；pTregs、末梢誘導Tregs；tTregs、胸腺由来Tregs。(H)ピロリ菌感染マウスと非感染マウスの小腸および大腸から得られた活性化Treg細胞を比較した、Tregエフェクター遺伝子とTh17分化遺伝子の遺伝子セットスコア。統計的有意性はKruskal-Wallis検定で決定した。各記号は、少なくとも2回の独立した実験（n=6-10マウス/群/実験）からプールした1匹/1細胞、または1細胞データの場合は2匹/群を表す。バーは中央値を示す。特に断りのない限り、統計的有意性は正規分布の場合はStudentのt検定、そうでない場合はMann-Whitney U検定で決定した。

ピロリ菌感染による腸管腫瘍の発生を促進する根本的なメカニズムを、腫瘍が発生しやすい背景とは別にさらに調べるために、野生型C57BL/6マウス（WT）に24週間感染させ、免疫応答を解析した（オンライン補足図2F）。ピロリ菌感染WTマウスの小腸および大腸では、非感染コントロールと比較して、上皮内CD3+ T細胞の増加も観察された（図2C）。胃で観察されたバランスのとれた免疫表現型（図2Cおよびオンライン補足図2G）とは対照的に、これはFoxp3+ Treg細胞の減少を伴っていた（図2Dおよびオンライン補足図2G）。マルチプレックス・チップサイトメトリーにより、Treg細胞の全体的な減少が裏付けられ、さらに感染した大腸組織では、Treg細胞が固有層内にコンパートメント化されていることが明らかになった（図2E）。

次に、ピロリ菌溶解液でラミナプロプリアのCD4+ T細胞を再刺激し、ピロリ菌に対する免疫応答の主要な担い手の1つであることが以前に報告されている炎症性サイトカインIL-17Aの放出を測定することにより、これらのT細胞のピロリ菌に対する特異性を確認した1。

ピロリ菌に12週間感染したApc +/min マウスおよび同腹のWTコントロールから、腸および大腸組織のCD45+免疫細胞を単離し、ソートし、非感染コントロールと比較した（オンライン補足図2I）。

教師なしクラスタリングにより、転写プロファイルに従って16のクラスタが同定され、それらはUniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）15を用いて可視化され（図2Fおよびオンライン補足図2J）、既知のマーカー遺伝子に基づいて注釈付けされた（オンライン補足図2K）。

Treg細胞コンパートメントの特徴をさらに明らかにするために、Treg細胞をサブクラスター化し、注釈をつけた。その結果、活性化Treg細胞（act. Tregs）、高RORγt発現で特徴づけられる末梢由来Treg細胞（pTregs）、GATA3発現で特徴づけられる胸腺由来Treg細胞（tTregs）の3つのサブクラスターが得られた16 17（図2Gおよびオンライン補足図2L）。次に、Tregエフェクタースコア18（図2Hおよびオンライン補足図1）を計算したところ、感染行為においてTh17分化遺伝子が有意に増加していることがわかった。このことは、ピロリ菌感染がTreg細胞を潜在的に病原性のあるFoxp3+ IL-17A+ T細胞に再プログラムすることを示している。

補足資料
[gutjnl-2022-328075supp004.pdf]
最後に、感染マウスにおけるT細胞の細胞動態を理解するために、スプライシングされたメッセンジャーRNAとスプライシングされていないメッセンジャーRNAの比率に基づいて個々の細胞の将来の状態を予測するRNA速度ベクトルを計算した19。これまでの知見と同様に、CD4クラスターを見ると、感染ApcマウスではCD4 Treg細胞に向かって投射されるCD4細胞の数が少ないことが明らかになった（オンライン補足図2M）。

以上の結果から、ピロリ菌感染マウスは、小腸および結腸においてピロリ菌特異的な炎症性免疫応答を誘導し、Treg細胞の消失とFoxp3+ IL-17A+ T細胞への分化によって特徴づけられることが示された。

発癌シグナル伝達経路の活性化と杯細胞の消失がピロリ菌感染に対する腸上皮反応を特徴づける。
WTマウスの大腸腺腫症性ポリポーシス（APC）変異とは無関係に、腸管免疫細胞においてピロリ菌によって誘発される変化を考慮し、上皮におけるピロリ菌感染の発癌促進作用を媒介すると考えられるシグナル伝達経路への影響を解析した。そこで、我々のscRNAseqデータ（オンライン補足図2I）（データセット）に含まれるApc+/minマウスのEPCAM+上皮細胞のトランスクリプトーム・プロファイルを評価した14。教師なしクラスタリングにより、転写プロファイルに従って15のクラスタが明らかになり、それらはUMAPとして可視化され（図3Aおよびオンライン補足図3A）、既知のマーカー遺伝子に基づいて注釈付けされた（オンライン補足図3B）。

補足資料
[gutjnl-2022-328075supp003.pdf]
図3
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図3
発癌シグナル伝達経路の活性化と杯細胞の消失がヘリコバクター・ピロリ感染に対する腸上皮反応を特徴づける。(A) 教師なしクラスタリング後の注釈付き上皮細胞をUniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）空間にプロットしたもの。さらなる解析のためのクラスターが強調表示されている（1=腸細胞）。(B) H. pylori感染マウスと非感染マウスの腸管細胞を比較したSTAT3シグナル伝達遺伝子の遺伝子セットスコア。統計的有意性はKruskal-Wallis検定で決定した。(C）ピロリ菌感染マウスおよび非感染C57BL/6マウスの小腸および結腸組織の代表的なpSTAT3、Ki67および過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色。mm2あたりの陽性細胞の定量を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。つの独立した実験のプールデータ。(D）H.ピロリ感染マウスと非感染Apc+/minマウスおよびApc+/1638Nマウスの大腸pSTAT3染色の代表的写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。mm2あたりの陽性細胞の定量化を示す。つの独立した実験のプールデータ。(E) H. pylori感染マウスと非感染Apc +/minおよびApc +/1638Nマウスの大腸PAS染色の代表的写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。mm2あたりの陽性細胞の定量化を示す。3つの独立した実験のプールデータ。各シンボルは、少なくとも2つの独立した実験（n=6-10マウス/グループ/実験）からプールされた1匹/1細胞、または1細胞データの場合は2匹/グループを表す。バーは中央値を示す。特に断りのない限り、統計的有意性は正規分布の場合はStudentのt検定、そうでない場合はMann-WhitneyのU検定で決定した。

細胞タイプの正しい注釈を確認するために、陰窩-絨毛軸に沿った上皮細胞の疑似空間分布を計算した20 21（オンライン補足図3C）。

ここでは特に、CRCの開始と発生に関連するシグナル伝達経路、すなわちSTAT3とNF-κBについて調べた。注目すべきことに、これらのシグナル伝達経路は、炎症によって引き起こされる大腸癌の主要な炎症メカニズムも制御しており、ピロリ菌感染と広く関連している22-24。Jak-STATシグナル伝達経路に関与する遺伝子のスコアを計算したところ、ピロリ菌感染によってWTマウスとApc+/minマウスの腸細胞で有意にスコアが上昇した（図3B、オンライン補足図3Dおよびオンライン補足表1）。STAT3シグナルの増加はWTマウスの幹細胞でのみ検出され、Apc+/minマウスではH. ピロリ菌感染（online supplemental figure 3D）。ピロリ菌H. pylori感染に伴い、Apc変異マウスの幹細胞ではIL-22受容体Il22ra1の発現低下が認められたが、wtマウスや腸細胞では認められなかった（online supplemental figure 3E）。腸管細胞におけるNF-κBシグナルを評価すると、ピロリ菌感染時に高いスコアが観察された（オンライン補足図3Fおよびオンライン補足図1）。

上皮性STAT3の活性化はリンパ球の動員を促進する一方、大腸におけるTreg細胞の浸潤を抑制することが示されている25。24週間ピロリ菌に感染したWTマウス（図3C）およびApc変異マウス（オンライン補足図1A、図3D）の組織サンプルでSTAT3の亢進を確認したところ、Ki67染色（図3C）によって検出されたように、増殖の亢進を伴っていた。

機能的な腸管バリアは杯細胞による粘液の補充に依存していることから、次にその状態を過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色で評価した。その結果、H. pyloriに感染したWTマウス（図3C）およびApc変異マウス（図3E）の小腸および結腸では、非感染の対照マウスに比べて粘液産生細胞の数が減少していることが観察された。

杯細胞に対するピロリ菌感染の影響を詳しく調べるために、杯細胞の分化マーカーに基づいてscRNAseqデータセット中の杯細胞をクラスター化し、アノテーションを行った26。その結果、Tff3の高発現を特徴とする未熟杯細胞、Oasisを高発現する中間杯細胞、Muc2とKlf4を高発現する終末杯細胞が明らかになった（オンライン補足図3G,H）。成熟状態はピロリ菌感染によって明らかに影響を受け、より分化度の低い杯細胞へと切り替わった（オンライン補足図3I）。杯細胞の機能性を評価するため、病原体や炎症27に応答することで知られる抗菌ペプチドReg3bとReg3gをコードする遺伝子の発現を評価した（オンライン補足表1）。これらの遺伝子はピロリ菌感染によって減少することがわかった（オンライン補足図3J）。これらの遺伝子はSTAT3の下流標的であることが知られているので、杯細胞クラスターにおけるSTAT3シグナルを特異的に調べたところ、腸細胞や幹細胞におけるSTAT3シグナルの増加とは対照的に、ピロリ菌感染によってSTAT3シグナルは誘導されなかった（オンライン補足図3K）。これらの所見は、APCの状態とは無関係に、ピロリ菌感染によって誘導される腸管バリアの完全性の低下と一致している。

感染マウスで観察された杯細胞の絶対的な減少を説明するために、杯細胞の細胞動態をRNA速度で調べた。大腸では、ピロリ菌感染により幹細胞クラスターから杯細胞クラスターへの方向性が減少し、同時に大腸細胞クラスターへの突出が増加した（オンライン補足図3J）。小腸と結腸の幹細胞において、分泌系への分化を促進することが知られているAtoh1の発現を評価したところ28、ピロリ菌感染によって発現が著しく低下した（オンライン補足図3K）。これらの所見は、幹細胞が杯細胞よりもむしろ非特異的な大腸細胞へと偏った分化をすることを示している。

これらの結果を総合すると、ピロリ菌は発癌シグナル伝達経路を誘導し、WTおよびApc変異マウスの小腸および結腸の粘液産生杯細胞に有害な影響を及ぼすことが示された。

ピロリ菌感染は粘液を分解する微生物叢の存在を促進し、炎症性および発癌性の微生物叢シグネチャーを形成する。
小腸における微生物叢の変化や特定の細菌種の異常な存在は、CRCの発症に関係している29。ピロリ菌感染によって微生物叢のシグネチャーが変化することが示されていることから、これはピロリ菌が腸管発がんに寄与する新たなメカニズムである可能性がある30。そこで、ピロリ菌感染が小腸および大腸の微生物組成にどの程度影響を及ぼすかを、16S RNA配列決定を行うことによって評価した（データセット）14。その結果、24週齢感染マウスの胃ではヘリコバクター属の存在量が有意に増加していたものの、腸および大腸ではピロリ菌は検出されなかった（オンライン補足図4A）。感染マウスと非感染マウスの盲腸と結腸の微生物叢を分類学的プロファイリングで比較したところ、ピロリ菌感染によって門レベルで明らかな変化が観察された（図4A）。さらに、ピロリ菌感染によって小腸のα多様性が減少する徴候を見出した（オンライン補足図4B）だけでなく、盲腸、便、小腸のβ多様性は非感染マウスと感染マウスで有意に異なっていた（オンライン補足図4C）。アッケマンシア属は24週感染WTマウスで濃縮されていた（オンライン補足図4D、図4B）。Akkermansia属の粘液分解特性を共有する他の種についてデータを探索したところ、Ruminococcus属の増加が認められた（図4Bおよびオンライン補足図4D）。ピロリ菌感染時のApc変異マウス（オンライン補足図1A）でも、両菌種の存在量が高かった（図4C,D）。

補足資料
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ヘリコバクター・ピロリ感染は粘液を分解する微生物叢の存在を促進し、炎症性および発がん性の微生物叢シグネチャーを形成する。(A)ピロリ菌感染マウスと非感染C57BL/6マウスの盲腸と結腸の16S rRNA配列決定サンプル（n=6-8マウス/群）における系統分類学的相対頻度。2～3回の独立した実験の代表的な1回の実験データ。(B) H. pylori感染マウスおよび非感染C57BL/6マウス（n=6-8マウス/群）のceacum、便、小腸および大腸におけるAkkermansia属およびRuminococcus属のAmplicon Sequence Variants（ASV）の特徴数。2～3回の独立した実験の代表的な1実験のデータ。(C)H.ピロリ感染マウスおよび非感染Apc+/minマウス（n=4-5 mouse/group）のceacum、便、小腸および大腸のRuminococcus属の特徴数（ASV）。2～3回の独立した実験の代表的な1実験のデータ。(D)H.ピロリ感染マウスおよび非感染Apc +/1638Nマウス（n=4-5 mouse/group）のceacum、便、小腸および結腸のAkkermansia属の特徴数（ASV）。2〜3回の独立した実験の代表的な1実験のデータ。(E)ピロリ菌感染(H. pylori)マウスおよび非感染(Cont.)WTマウスから便の移植を受けた無菌野生型(WT)マウスの腸管CD3+染色の代表的な写真を、移植後12週目に解析して示した。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。小腸および結腸組織1mm2あたりの陽性細胞の定量を示す。1回の実験のデータ。(F)ピロリ菌感染(H. pylori)および非感染(Cont.)WTマウスから便移植を受けた無菌WTマウスから単離した腸管固有層リンパ球のフローサイトメトリー解析。CD4+T細胞のFoxP3+細胞と(G)FoxP3+T細胞のRORγt+細胞の頻度を、生きた単一細胞、CD45+、CD3+、CD4+でゲーティングして示す。1回の実験のデータ。(H）ピロリ菌感染（H. pylori）および非感染（Cont.）WTマウスから便の移植を受けた無菌WTマウスの腸内STAT3+染色の代表的な写真を、移植12週間後に解析して示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。小腸および結腸組織1mm2あたりの陽性細胞の定量を示す。1実験のデータ。平均値とSDを示す棒グラフ、または各記号は1匹（n=5-6マウス/群）を示す。バーは中央値を示す。統計的有意性は、正規分布の場合はStudent's t-test、そうでない場合はMann-Whitney U testで決定した。

変異型APCに依存しないH. pylori誘発微生物叢シグネチャーの機能的影響を調べるため、感染および非感染特異的病原体フリー（SPF）マウスから無菌WTマウスへの便移植実験を行った（オンライン補足図4E）。その結果、ピロリ菌感染マウスから便を受け取ったWTマウスでは、腸および大腸上皮へのT細胞浸潤が増加し（図4Eおよびオンライン補足図4F）、微生物31に誘導されることが知られているFoxp3+ Treg細胞の減少（図4F）およびRORγt+ Treg細胞の量の減少（図4G）が明らかになった。さらに、H. pylori感染マウスの便を受け取ったWTマウスの腸では、STAT3シグナルの亢進が観察された（図4Hおよびオンライン補足図4G）。H.ピロリによる微生物叢の変化が腸管発癌に寄与していることを最終的に評価するために、SPF非感染マウスとH.ピロリ感染Apc +/1638Nマウス、およびWT同腹子から無菌Apc +/1638Nマウスへの便移植実験をさらに行った（オンライン補足図4H）。H.ピロリ菌感染マウスの便レシピエントにおける腫瘍数の増加が認められ、これはWTマウスですでに明らかであったが、Apc +/1638Nバックグラウンドではさらに増加した（オンライン補足図4I）。

以上より、ピロリ菌は下部消化管の微生物叢を変化させ、WTマウスとApc変異マウスの両方において粘液分解性微生物叢を優先させ、炎症性および発癌性の微生物叢を誘導する。

H.ピロリ誘発大腸発癌は除菌によって予防される
H.ピロリによる腸管腫瘍形成は、炎症反応と発癌シグナルの活性化との相互作用と、微生物叢の変化とによって特徴づけられる。微生物叢非存在下での炎症の寄与を明らかにするため、Apc+/1638Nマウスを無菌条件下で感染させた（オンライン補足図5A,B）。その結果、SPFマウスと同様の免疫変化、すなわち小腸と結腸におけるCD3+ T細胞の浸潤の増加とTreg細胞の減少が観察された（図5A、オンライン補足図5E,B）。一方、無菌マウスではSTAT3シグナルの活性化はほとんど認められず、ピロリ菌感染による杯細胞の減少も認められなかった（オンライン補足図5C-E）。重要なことは、コントロールマウスとピロリ菌に感染した無菌Apc +/1638Nマウスの間で腫瘍数に有意差が認められなかったことである（図5C）。ピロリ菌によって誘発された微生物叢の変化が腫瘍の表現型に強く寄与していることを示しており、小腸および結腸におけるピロリ菌誘発発癌は、炎症性免疫応答、微生物叢の変化、発癌シグナル伝達の相互作用が関与する多因子プロセスであることを示唆している。そこで次に、クラリスロマイシン、メトロニダゾール、オメプラゾールからなる3剤併用療法32でマウスを処理することにより、ピロリ菌の除菌が発がんプロセスを抑制できるかどうかを調べた。これは、ピロリ菌の除菌に感染患者にも用いられている「イタリア式3剤併用療法」を反映したものである（図5Dおよびオンライン補足図5F）。重要なことは、抗生物質の除菌後、腫瘍の負担は非感染対照と同じレベルであったことである（図5E）。腸管免疫応答の根本的な変化が、ピロリ菌感染によって直接誘導されたものであり、変異Apcとは無関係であることを明らかにするために、C57Bl/6マウスに対するピロリ菌除菌の効果を分析した（図5Dおよびオンライン補足図5F）。Treg細胞の割合は、投与4週後の根絶マウスでは当初減少していたが、投与12週後にはFoxP3+ T細胞の割合が回復していることが観察された（図5G）。感染マウスでは、特異的なIL-17A/CD4+ T細胞応答が観察され、これは除菌治療後にいったん消失したが、回復に時間がかかると再び出現した（図5H）。このことは、除菌マウスにおいても、与えられた抗原との出会いと応答に基づいて、ピロリ菌に対する応答の特異性を裏付けている。重要なことは、感染除去によってSTAT3の活性化とPAS陽性細胞数が正常化したことであり（図5Iおよびオンライン補足図5H）、ピロリ菌がこれらの変化に特異的に関与していることが確認された。

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図5
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図5
ヘリコバクター・ピロリ誘発腸発癌は除菌により予防される。(A）ヘリコバクター・ピロリに感染したマウスと感染していないApc+/1638Nマウスの1mm2あたりの小腸および大腸上皮内CD3+細胞の定量を示す。2回の独立した実験のプールデータ（n=8 mouse/group）。(B) H. pylori感染マウスと非感染Apc +/1638NマウスのCD45+およびCD3+、生細胞、単細胞でゲーティングしたCD4+ T細胞のFoxP3+細胞の頻度を含む。代表的な擬似カラープロットを示す。2回の独立した実験のプールデータ（n=8マウス/群）。(C) H. pylori感染マウスおよび非感染Apc +/1638Nマウスの腸腫瘍数および腫瘍の代表写真（丸印）を示す（n=8匹/群）。(D）C57BL/6およびApc +/1638Nマウスのピロリ除菌療法の実験セットアップ。(E）非感染マウス、抗生物質投与マウス、ピロリ菌感染マウスおよびピロリ菌除菌Apc +/1638Nマウスの腫瘍数と小腸腫瘍の代表写真。1実験のデータ（n=2-3マウス/群）。(F) H. pylori感染マウスおよびH. pylori根絶C57BL/6マウスの小腸組織から得られたCD3+染色の代表写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。mm2あたりの陽性細胞の定量を示す。1実験のデータ（n=5-6マウス/群）。(G)腸管前膜リンパ球のフローサイトメトリー解析により、FoxP3+CD4+T細胞の頻度が明らかになった。1実験のデータ（n=5-6マウス/群）。(H) 腸管lamina propriaリンパ球のフローサイトメトリー解析により、全ピロリ菌溶解液で再刺激したCD4+ T細胞のIL-17A放出が明らかになった。細胞は生きた単一細胞、CD45+およびCD3+でゲーティングされている。1回の実験のデータ（n=5-6マウス/群）。(I)ピロリ菌感染C57BL/6マウスとピロリ菌駆除C57BL/6マウスの腸管組織から採取したpSTAT3と過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色の代表的な写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。mm2あたりの陽性細胞の定量を示す。1実験のデータ（n=5-6マウス/群）。各記号は1匹を表す。バーは中央値を示す。2群間の統計学的有意性は、正規分布の場合はStudentのt検定、それ以外の場合はMann-WhitneyのU検定で決定した。2群以上の群間では、正規分布の場合はTukeyの多重比較検定を用いた通常の一元配置分散分析を、それ以外の場合はダンの多重比較検定を用いたクラスカル・ワリス検定を適用した、*p<0.05、***p<0.001。

以上の結果から、ピロリ菌は腸および大腸の免疫応答を形成し、腸・大腸微生物叢および上皮恒常性に重大な変化を誘導することにより、大腸発癌を直接促進することが示された。ピロリ菌の除菌は、大腸においてもピロリ菌の腫瘍促進作用を阻止し、CRCの負担を軽減する新たな戦略の可能性を提供する。

ピロリ菌はヒトの大腸ホメオスタシスを変化させる
我々のマウスモデルから、ピロリ菌は様々な細胞・分子レベルで腸管・大腸のホメオスタシスに影響を及ぼし、最終的に腫瘍の発生を促進する可能性があることが示された。これらの影響がヒトでも観察されるかどうかを調べるため、ヒト大腸組織サンプル154例のコホートにおける免疫シグネチャーを分析した（オンライン補足表2）。免疫応答と胃の組織学的特徴に基づき、ピロリ菌の状態に応じて、現在（活動中）感染している患者と除菌している患者に標本を層別化した。その結果、H. pyloriに感染している患者および除菌された患者は、感染していない患者と比較して、大腸においてCD3+ T細胞の高い浸潤を示した（図6A）。内視鏡で採取した大腸生検を用いて、さらにフローサイトメトリーでT細胞応答の特徴を調べたところ、現在感染している患者の大腸粘膜ではCD3+ T細胞が多い傾向が明らかになった（オンライン補足図6A）。対照的に、CD4+とCD8+のサブセットはピロリ菌の状態に影響されなかった（オンライン補足図6B）。注目すべきは、大腸粘膜のFoxP3+細胞の数が現在感染しているグループで最も少なかったのに対し、除菌された患者は陰性コントロールと同等であったことである（図6C）。Tregの全体的な消失はChipCytometryで確認され（図6B）、さらにH. pylori感染者の大腸サンプルではTregの上皮内局在がほとんど消失していることが示された（図6Bおよびオンライン補足図6C）。

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図6
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図6
ヘリコバクター・ピロリはヒトの大腸ホメオスタシスを変化させる。(A）現在ピロリ菌に感染している患者、除菌された患者、非感染患者の大腸組織の代表的なH&E、CD3+、pSTAT3、過ヨウ素酸シッフ（PAS）写真を示す。四角は拡大表示。白のスケールバーは200μm、黒のスケールバーは20μmに対応する。mm2あたりの総CD3+、上皮内STAT3、PAS陽性細胞の定量化を示す。(B）マルチプレックスチップサイトメトリーで染色したヒト結腸組織の代表写真。ピロリ菌陰性組織とピロリ菌陽性組織について、核内FoxP3+、CD4+、CD3+およびCD45+染色で定義されるFoxP3+細胞を示す。大きなスケールバーは100 µm、小さなスケールバーは10 µmに対応する。大腸組織における多重化チップサイトメトリーの自動画像処理により、ピロリ菌陽性者および陰性者におけるCD4+ T細胞の特性が決定される：従来型T細胞（Tconv）、制御性T細胞（Treg）および上皮内制御性T細胞（IE Treg）の頻度が示されている。(C)ピロリ菌現在感染者、除菌者、非感染者の大腸生検のフローサイトメトリー解析を行った。CD4+T細胞のFoxP3+細胞の頻度（生細胞、単一細胞、CD45+およびCD3+でゲーティング）を示し、H. pylori現在感染者と陰性者の代表的な擬似カラープロットを含む。(D）ピロリ菌感染患者と除菌患者、およびピロリ菌感染患者と非感染患者の間のβ多様性を示すBray-Curtis非類似度。統計的有意性は、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて決定した。各記号は1人の患者を表し、平均値とSDを棒グラフで示した。統計的有意性は、正規分布の場合はTukeyの多重比較検定を用いた通常の一元配置分散分析で、そうでない場合はダンの多重比較検定を用いたKruskal-Wallis検定で決定した。*p<0.05、***p<0.01、***p<0.001、***p<0.0001。

次に、上皮コンパートメントに注目したところ、マウスで得られた知見や除菌実験と一致して、現在感染している被験者の大腸では、pSTAT3陽性上皮細胞の数が多く、粘液産生細胞の消失が同時に認められ、これは除菌した患者では減弱していた（図6A）。

最後に、患者の便における微生物の変化を評価したところ、ピロリ菌感染者とピロリ菌陰性者の間でβ-多様性に差が認められたが（p=0.062）、ピロリ菌除菌者とピロリ菌陰性者の間では差が認められなかった（p=0.552）（図6D）。一方、α-ダイバーシティ（online supplemental figure 6D）とファーミキューテス対バクテロイデーテス比（online supplemental figure 6E）については、3群間で有意な変化は認められなかった。比較マイクロバイオーム・プロファイリングにより、CRCと関連しているPrevotellaceaeとPeptostreptococcalesが、ピロリ菌陽性患者において有意に豊富であることが明らかになった（オンライン補足図6F,G）。

これらの結果は、ピロリ菌感染時にマウスモデルで同定された免疫および上皮シグネチャーがヒトでも観察され、さらに大腸発がんに寄与しうる微生物叢組成の変化を伴うことを裏付けている。さらに、ピロリ菌が除菌された患者において観察された表現型の減弱は、ピロリ菌がCRCの独立した危険因子であることをさらに支持すると同時に、危険性のある患者にCRC予防の選択肢を提供するものである。

考察
疫学的データは、ピロリ菌感染とCRCの高リスクおよび高侵襲性との関連を示しており、そのORは1.9であり34、このORは喫煙、アルコール、肥満度などの他の既知の危険因子のORよりも高い34。我々はApc変異マウス株（Apc +/minおよびApc +/1638N）をヒトCRCの代用モデルとして用い、ピロリ菌感染マウスにおいて腫瘍数が約2倍に増加することを観察した。驚くべきことに、この増加は両モデルで通常腫瘍が最も多く見られる小腸で観察され、特に結腸で顕著であった。このことから、われわれは小腸と結腸におけるピロリ菌誘発発癌の潜在的機序を解読することになった。

ピロリ菌感染が他の臓器に及ぼす影響については、慢性的なピロリ菌感染が喘息疾患から防御する制御性免疫シグネチャーを付与する肺について最もよく理解されている35。これらの観察結果とは対照的に、我々は小腸と結腸でピロリ菌抗原特異的な炎症性Th17を介した反応を観察したが、これは胃や肺で起こるようなTreg細胞の増加によって釣り合うものではなかった。ピロリ菌に対する免疫応答は腸のパイエル板から起こる2。このことは、ピロリ菌特異的T細胞が腸や大腸の粘膜部位にもホーミングする理由を説明するかもしれない。興味深いことに、IL-17はピロリ菌陽性の胃炎や胃がん患者36や、RORC、IL17、IL23、STAT3を含むTh17シグネチャーが予後不良と関連するCRCで増加していることがわかった37。さらに、下部消化管では、TregがTh17分化マーカーをアップレギュレートするように再プログラムされていることもわかった。特にCRCでは、Foxp3+/IL17+ T細胞の存在が、慢性大腸炎患者の粘膜と末梢血、および大腸腫瘍で増加していることが報告されている39。Foxp3+/IL17+細胞は、骨髄由来単核球におけるCD44や上皮細胞接着分子EPCAMなどのいくつかのCRC関連マーカーの発現を増加させることにより、腫瘍開始細胞の発生を促進することが示された40。したがって、ピロリ菌によって惹起される炎症性Th17反応、特にTreg細胞のTh17表現型への分化は、腫瘍の発生を促進する主要なメカニズムの一つを構成している可能性がある。このことは、T細胞のホメオスタシスの変化が大腸発癌における重要な出来事であり、腫瘍の発生と進行を促進し、CRC患者の治療効果を決定することを示す文献と一致している41。

APCをコードする遺伝子の変異は、TP53やKRASの変異と並んで、散発性CRCを引き起こす最も頻度の高いドライバー変異である42 43。STAT3、NF-κB、WNTシグナルなどの炎症・増殖シグナル伝達経路は、上皮細胞や免疫細胞由来のシグナルによって活性化され、慢性炎症を引き起こすが、これはCRCに寄与するメカニズムとして知られている24。44 慢性炎症性腸疾患患者では、CRCのリスクが著しく上昇し、そのリスクは罹病期間とともに上昇し、20年後には8.3％、30年後には18.4％となる45。メカニズム的には、Th17細胞による免疫シグナル伝達の他に、炎症性シグナル伝達経路の活性化、微生物叢の変化が、大腸炎関連癌の発症に寄与している46。

小腸でピロリ菌によって局所的に誘導された強い炎症反応は、NF-κBとSTAT3経路の活性化を伴っていた。STAT3シグナルの活性化は、腫瘍の発生・進展と強く関連しており、組織内の活性化STAT3のレベルは、CRC患者の腫瘍浸潤、腫瘍、リンパ節、転移ステージ、全生存率の低下と相関している47。さらに、上皮性STAT3の活性化は、腸におけるTreg細胞のリクルートに重要なケモカインの発現をダウンレギュレートすることが報告されている25。したがって、ピロリ菌感染時には、腸および大腸上皮細胞におけるSTAT3の活性化がTregのリクルートの喪失に寄与し、それによって腸組織の悪性化をサポートすると推測したくなる。さらに、Apc+/minマウスでは、IL-22レセプターの発現低下により、幹細胞におけるSTAT3シグナルの消失によって腫瘍の進行と転移が特徴付けられた。

重要なことは、ピロリ菌の除菌後にSTAT3レベルの低下と正常化が観察され、その結果、腫瘍負荷が正常化したことである。特筆すべきは、除菌のために、ヒトにも適用されている治療レジメンを用いたことである。

興味深いことに、微生物によるIL-17A産生誘導は、Apc+/minマウスにおける大腸癌の発生と進行を助長することが示されており、これはSTAT3シグナルを介して媒介された52。実際、無菌条件下でマウスを飼育した場合、ピロリ菌感染によるSTAT3の活性化と腫瘍の発生は少なかったが、完全に正常化したわけではなく、微生物叢の変化が表現型に関与しているが、それだけが原因ではないことを示している。

このような腸内細菌叢の乱れは、CRCの発症と進行に寄与することが示されている29。ピロリ菌は、胃の局所的な微生物叢、および腸や大腸の遠隔地の微生物叢に影響を与えることが知られている30。54 炎症に起因する微生物叢の調節異常が大腸腫瘍の形成と進行を促進することが示されており55 、細菌刺激や病原体関連分子レセプターに応答して、c-Jun/JNKやSTAT3シグナル伝達経路などの炎症促進経路が活性化され、Apc+/minマウスにおいて腸腫瘍の増殖を促進することが示されている50。このことは、H. pylori感染SPFマウスの便を無菌マウスに移植した結果、H. pylori感染マウスの便を受け取ったレシピエントでは、FoxP3+ Treg細胞および微生物によって誘導された（FoxP3+RORγt+）Treg細胞の存在量が低下し、STAT3が誘導され、最終的には非感染マウスの便を移植した場合と比較して腫瘍の発生が加速されたという我々の知見からも支持された。これらのデータを総合すると、ピロリ菌が誘導する炎症性および発癌性の微生物シグネチャーが、腸腫瘍の増殖に関与し、かつその増殖に不可欠であることが示された。

一方、ピロリ菌に感染したヒトのサンプルでは、CRCに関連する細菌群、PrevotellaceaeとPeptostreptococcalesが検出された29。アッカーマンシアの存在と消化器疾患との間に逆相関があることを立証した研究もあるが56、アッカーマンシアはCRC患者で増加することが報告されており、これは腫瘍におけるある種のムチンの過剰発現が原因である可能性が高い57。このような杯細胞の減少は、大腸内視鏡検査を受けたピロリ菌感染患者の臨床サンプルでも観察された。このように、ピロリ菌感染は2つの異なるメカニズムによって、細菌の侵入を阻止する健全なバリアを維持するのに不可欠な腸管粘液の完全性を破壊する。今回観察されたような、通常は炎症シグナルを抑える制御性T細胞応答が十分でない場合、「健康な」マイクロバイオームと無傷の粘膜の相互作用によって腸内で注意深く均衡が保たれていたホメオスタシスが、ピロリ菌感染によって惹起される炎症シグナルの均衡を保てなくなり、発癌が可能になる。ピロリ菌を除菌すると、杯細胞が再び出現して腸の恒常性が回復し、腸管免疫シグネチャーが正常化した。

重要なことは、ピロリ菌感染患者の大腸生検を分析したところ、発癌促進シグナル伝達経路の活性化、Treg細胞の著しい減少、CD3+細胞の増加など、マウスで見られたのと全く同じ変化が観察されたことである。除菌患者における表現型の減弱は、今回の知見の臨床的意義を強調し、ピロリ菌感染が単なる大腸発癌の危険因子である以上に、大腸における発癌性ニッチを積極的に促進するものであり、ピロリ菌の除菌によって予防できる可能性があること、したがって感染者におけるCRC発症リスクを低下させる可能性があることを示している。しかし、ピロリ菌感染とCRCの相関を示した研究では、抗生物質治療の効果については触れていない。ピロリ菌除菌がCRC発症に及ぼす影響を明らかにするためには、このようなコホートを今後の研究に含めることが重要である。

まとめると、我々の研究は、ピロリ菌感染が腸および大腸腫瘍の発生を促進するという確かな実験的証拠を提供し、その根底にあるメカニズムについての洞察を提供するものである。ピロリ菌のスクリーニングと除菌は、CRC予防戦略のための潜在的な方策であることを示唆する。

補足資料
[gutjnl-2022-328075supp007.pdf]
補足資料
[gutjnl-2022-328075supp009.pdf]
データの利用可能性に関する声明
データは公開のオープンアクセスリポジトリで入手可能である。データは合理的な要求があれば入手可能。生シングルセルRNAシーケンスおよび16S rRNAシーケンスデータは、NCBI BioProjectデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA808836/）のBioProjectアクセッション番号PRJNA808836にリンクして寄託されている。

倫理声明
公表に関する患者の同意
該当なし。

倫理承認
この研究はKlinikum rechts der Isar #322 /18Klinikum Bayreuth #241_20Bcにより承認された 。参加者は、この研究に参加する前に、インフォームド・コンセントを得た。

謝辞
実験的サポートをしてくれたMaximilian Koch、Karin Taxauer、Martin Skerhut、Teresa Burrellに感謝する。ヒトの生検を提供してくれたKlinikum rechts der IsarのKlinik und Poliklinik für Innere Medizin IIのJulia HorstmannとColoBAC研究のチームに感謝する。ミュンヘン工科大学ZIEL Institute for Food & HealthのCore Facility Microbiomeによる16S rRNA配列決定サービス、Dharmesh SinghおよびNyssa Cullinに感謝する。無菌マウスについては、ミュンヘン工科大学ZIEL Institute for Food & HealthのCore Facility Gnotobiologyに感謝する。

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補足資料
補足データ
このWebのみのファイルは、著者から提供された電子ファイルからBMJ Publishing Groupが作成したものであり、内容の編集は行っていない。

データ補足1
データ補足2
データ補足3
データ補足4
データ補足5
データ補足6
データ補足7
データ補足8
データ補足9
脚注
RM-LとMGは同等に貢献した。

研究分担者 AR、RM-L、MG は本研究を発案した。AR、AD、RM-Lは実験のデザインと解析を行った。SJは、シングルセルRNAシークエンシングとチップサイトメトリーのコードとサポートを提供した。VEとAWは実験に貢献した。SJとDHBは方法論的専門知識を提供した。AD、SJ、RM-L、DHBはデータの解釈に貢献した。MV、MM、MQはヒト生検を提供した。KPJはマウスモデルを提供し、論文の校閲を行った。DH、DHB、LDは論文の批評的修正を行った。ARとRM-Lは論文を執筆した。AR、RM-L、MGが論文の校閲を行った。MGは資金を獲得し、論文の保証人である。著者全員が論文を読み、査読した。

資金提供 この研究はDFG（ドイツ研究財団）SFB1371/1-395357507（プロジェクトP09およびプロジェクトP04）の助成を受けた。

競合利益 なし。

患者および公衆の関与 患者および公衆は、本研究のデザイン、実施、報告、普及計画には関与していない。

証明および査読 委託ではなく、外部査読を受けた。

補足資料 本コンテンツは著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性がある。また、査読を受けていない可能性もある。議論されている意見や推奨事項はすべて著者のものであり、BMJが承認したものではない。BMJは、本コンテンツに依拠することから生じるすべての責任および義務を否認します。コンテンツに翻訳されたものが含まれる場合、BMJは翻訳の正確性および信頼性（現地の規制、臨床ガイドライン、用語、薬剤名、薬剤投与量を含むがこれに限定されない）を保証せず、翻訳および翻案その他から生じる誤りおよび／または脱落について責任を負わない。

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