フィンランドの就学前児童における腸内細菌叢と生涯抗生物質使用との関連
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掲載：2016年1月26日
フィンランドの就学前児童における腸内細菌叢と生涯抗生物質使用との関連
https://www.nature.com/articles/ncomms10410
カトリ・コルペラ、アン・サロネン、...ウィレム・M・デ・ヴォス 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ第7巻、論文番号：10410（2016） この記事を引用する
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要旨
早期からの抗生物質の使用は、代謝疾患や免疫疾患のリスク上昇と関連しており、マウスを用いた研究では、マイクロバイオームの乱れが原因であることが示されている。しかし、抗生物質が子どもの発育期のマイクロバイオームに与える影響についてはほとんど知られていない。ここでは、系統遺伝学、メタゲノミクス、および個々の抗生物質の購入記録を用いて、2～7歳のフィンランドの小児（N=142；2つの時点でサンプリング）におけるマクロライドの使用が、微生物叢の組成と代謝における長期にわたるシフトと関連していることを示す。このシフトには、放線菌の減少、バクテロイデーテスおよびプロテオバクテリアの増加、胆汁酸ヒドロラーゼの減少、マクロライド耐性の増加が含まれる。さらに、幼少期におけるマクロライドの使用は喘息リスクの増加と関連し、抗生物質による体重増加の素因となる。過体重児と喘息児の微生物叢は異なっている。ペニシリン系抗菌薬はマクロライド系抗菌薬よりも微生物叢に影響を与えない。我々の結果は、臨床診療を損なうことなく、抗生物質を処方する際には腸内細菌叢への影響を考慮すべきであるという考えを支持するものである。
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はじめに
抗生物質は欧米諸国の小児集団で最も一般的に使用されている薬剤である1,2。幼少期の抗生物質使用は、炎症性腸疾患3、過体重4,5,6、喘息7のリスク増加と関連している。マウスの実験的研究では、抗生物質の早期投与は、おそらく腸内細菌叢の変化を介して、代謝性疾患や免疫関連疾患と関連している8,9,10,11。しかし、マウスを用いた研究は、代謝、食事、マイクロバイオームが著しく異なるため、ヒトに外挿することは困難である12。ヒト成人を対象とした試験では、抗生物質の経口摂取が腸内細菌叢に著しい影響を及ぼし、多様性を減少させ、組成を変化させることが示されている13,14。しかし、これらの研究はサンプルサイズが小さい（3～4人）ため限界があり、微生物叢組成の個人差が大きいため複雑である。新生児では、抗生物質投与児と非投与児で微生物叢の初期発達が異なるが15,16、小児における生涯にわたる抗生物質使用と腸内細菌叢との長期的な関連については、現在のところ何もわかっていない。さらに、抗生物質耐性は世界的に公衆衛生上の大きな懸念事項であり、感染症治療においてますます深刻な障害になると予想されている17。早期の抗生物質使用が健康に及ぼす影響をよりよく理解するためには、抗生物質の種類によって腸内細菌叢にどのような影響があるかを検討することが重要である。フィンランドでは、社会保険研究所が、処方薬の購入と慢性疾患による特別償還の資格に関する全国データベースを、患者の個人識別情報とリンクさせて管理している18。ここでは、このユニークなデータベースと糞便マイクロバイオームのパイロシークエンシングを利用して、就学前の子どもの腸内マイクロバイオームと健康に対する抗生物質の短期的・長期的影響を調査した。
我々は、小児期における抗生物質の使用が腸内細菌叢組成の顕著な変化と関連し、それが6ヵ月以上持続することを示している。特にマクロライド系抗菌薬は、腸内細菌叢とその機能を変化させるようであり、我々のコホートにおける腸内細菌叢組成の個人差の最も強い要因であった。幼少期にマクロライド系抗生物質の投与を受けた小児において、生涯の抗生物質使用量全体と肥満度（BMI）との間に正の相関が認められ、喘息のリスクも上昇したことから、マクロライド系抗生物質の使用は、抗生物質による体重増加や小児期以降の喘息を誘発するような形で乳児の微生物叢を変化させる可能性が示唆された。
研究結果
微生物叢組成とマクロライドの使用との相関
我々のコホートは、調査時にデイケアに通っていた2～7歳（中央値5歳）のフィンランド人小児236人で構成されている。1サンプル（27人）または2サンプル（115人；7ヵ月間隔で採取）を提供した142人の子どもから、合計257の糞便サンプルが得られた（補足図1）。糞便サンプルは抗生物質の使用に基づいてグループ分けした（補足表1）。対照群として、2年以上抗生物質を使用したことがなく、生涯の抗生物質使用量の合計が年平均1コース未満であった小児の検体を選択した。他の群の微生物叢組成を対照群のそれと比較した。
ペニシリン系とマクロライド系の適応症は同じで、どちらも主に呼吸器感染症に処方されていたが、マクロライド系の使用は特に微生物叢組成の明らかな変化と関連していた（図1）。M6群（6ヵ月以内にマクロライドに曝露）では、門レベルでも明らかな微生物叢組成の変化が見られた（図1a）。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属を優占種とする放線菌（Actinobacteria）の存在量はこの群で減少し、多くの場合、検出可能以下にまで減少し、グラム陰性菌門のバクテロイデーテス（Bacteroidetes）属とプロテオバクテリア（Proteobacteria）属の存在量が増加した。これらの変化はM12群とM24群ではほぼ解消され、マクロライド投与後1年以内に微生物叢の門レベルのバランスが回復することが示された。ペニシリン使用群（P6、P12、P24）では、門レベルの構成に明確な違いはみられなかった。属レベルの主座標分析（PCoA）により、微生物叢全体の構成を決定する主な要因はマクロライドの使用であることが示された：M6サンプルのほとんどは構成要素1のスコアが低い状態でクラスター化したが、それ以外のサンプルはあまり明確なパターンを示さなかった（図1b）。最後のマクロライドコースからの経過時間は、成分1と相関しており（r=0.36、P<0.001）、このことは、これらの検体のβ多様性が、直近のマクロライドコースからの回復と関連していることを示している。ペニシリンの使用は主成分と強い関連はなかった。同じパターンが2-4歳児と5-7歳児の両方に認められたことから、マクロライド曝露による微生物叢への支配的な影響は年齢に依存しないことが示された。さらに、このパターンは以前の抗生物質曝露の背景に関係なく明らかであった。したがって、マクロライドはベースラインの組成にかかわらず、微生物叢をある状態に設定するようであると結論した。
図1：群ごとに並べた257の糞便サンプルの微生物叢組成。
図1
Cは対照群で、過去2年間抗生物質を摂取しておらず、平均して1年に1コース未満である。Eは早期暴露群で、過去2年間抗生物質を摂取しておらず、平均して1年に1コース以上摂取している。M6は6ヵ月以内のマクロライドコース、M12は6～12ヵ月以内のマクロライドコース、M24は12～24ヵ月以内のマクロライドコースを示す。P6、P12、P24は、それぞれ6ヵ月、6-12ヵ月、12-24ヵ月以内のペニシリンコースを示す。(a) フィラ構成。(b）PCoA解析による属レベルの微生物叢構成。背景色は最後のマクロライドコースからの補間時間を示す。
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抗生物質使用後の長期にわたるマイクロバイオームのシフト
抗生物質の使用、特にマクロライドの使用は、微生物相の長期的な減少と関連しており、コース終了後12～24ヶ月経っても対照サンプルのレベルには達しなかった（図2a）。年齢調整成熟度指数（補足表2）も、2年以内にマクロライドに暴露されたサンプルとP6群では低下しており、微生物叢の年齢に関連した側面は、ペニシリンコース後6-12ヵ月以内に回復したが、マクロライドコースからは2年後でも完全には回復しなかったことを示している（図2b）。
図2：各群における微生物叢の豊富さと年齢に対する成熟度。
図2
(a）種のような系統型の数。(b) 年齢に関連する24属に基づくスコア（補足表2）。アスタリスクは対照群「C」との差の有意性を示す。P<0.05、***P<0.01、***P<0.001、線形モデルを用いて推定。平均値を示し、エラーバーはs.e.値を示す。両パネルともサンプル数は257（補足表1）。
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年齢、BMI zスコア、健康状態（喘息、アレルギー性皮膚炎、または親が報告したアレルギー）をコントロールした後、サンプルの30％以上で検出された48属中18属、14目中7目が、最近の抗生物質使用と有意に関連していた、すなわち、対照群と比較してM6群またはP6群で有意差があった（補足表3、補足図2）。アクチノバクテリア（Actinobacteria）に属する6属のうち4属がマクロライドの使用と関連しており、M6群では1属が10倍増加し（Eggerthella）、3属が4〜10倍減少した（Bifidobacterium、Collinsella、Coriobacteriaceae（未同定））。このうちコリンセラ属は対照群と比較して全群で有意に減少しており、この属が抗生物質の影響を強く受けていることが示唆された。バクテロイデーテス属では、バクテロイデスがM6群で2倍、パラバクテロイデスがM6、M12、P6、P24群で2倍増加した。その他のグラム陰性菌では、プロテオバクテリアがM6群で2倍増加したのが目立ったが、いくつかの属に分散しており、腸内細菌科の細菌が最も有意な影響を受けた（一般化線形モデルでP=0.05）。ペニシリン常用群では、固形化菌の中でGemellales目の細菌が一貫して有意に減少した。Lactobacillales目はすべてのマクロライド使用群で増加した。これは主にレンサ球菌の増加によるもので、ラクトバチルスは減少した。P6およびP12群では乳酸桿菌も減少した。M6群では、Erysipelotrichales目とその属であるEubacterium属が増加した。M6群では、Clostridiales属の未同定の1種、Christensenella属に関連する1種、Anaerostipes属が減少し、Clostridium属とDorea属が増加した。
直近の抗生物質投与コースで層別化することに加えて、生涯の抗生物質曝露による累積的影響（1年間の抗生物質投与コース数）の可能性を検討した。最近の抗生物質使用は生涯使用と相関があった：すべての抗生物質使用群は対照群より生涯使用量が多かった。したがって、最近の抗生物質使用をコントロールした後では、生涯の累積使用量は微生物叢の構成と最小限の関連しか示さなかった。Clostridiales目に属する4属が、生涯のマクロライドの総使用量と有意に正の相関を示した（Blautia, P=0.002; Dorea, P=0.002; Dialister, P=0.004; and Megamonas, P=0.006）。メガモナスはまた、生涯のペニシリン使用とも正の相関があった（P=0.003）。微生物の豊富さは、直近の抗生物質投与コースでコントロールした後では、生涯の抗生物質使用とは関連していなかった。
メタゲノム解析に基づくと、最近マクロライドに暴露された微生物群ではマクロライド耐性が高く、胆汁酸加水分解酵素が減少していた（図3a,b）。培養ベースのマクロライド耐性試験でも同じパターンが明らかになった。マクロライド耐性は、マクロライドコースの後、最初は上昇したが、コース後約6-12ヵ月で低いベースラインレベルに達するまで直線的に低下した（図3a,b）。図3c）。さらに、130の糞便サンプルを用いた定量的PCR（qPCR）ベースのアッセイでは、ermFとermBの量も最後のマクロライドコースからの経過時間と負の相関があることが示された（r=-0.31、ピアソン相関検定でP=0.005）。qPCRで測定したbsh遺伝子の存在量と最後のマクロライドコースからの経過時間との間には明らかな正の相関がみられた（図3d）。
図3：マクロライド耐性と胆汁酸塩ヒドロラーゼの存在量と最後のマクロライドコースからの時間との関係。
図3
破線はモデル適合（線形または多項式）を示し、R2はモデルによって説明される変動を示し、P値（線形モデルを用いて推定）を示す。(a) メタゲノム解析から推定されたマクロライド耐性の可能性、N=14。(b）メタゲノム中の胆汁酸ヒドロラーゼの存在量、N=14。(c)エリスロマイシンを添加して増殖した嫌気性c.f.u.とエリスロマイシンを添加していないc.f.u.の割合として測定したマクロライド耐性、N=80。(d）qPCRに基づく3つの胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子（bsh）の複合相対存在量を、最後のマクロライドコースからの時間の関数として測定、N=37。
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マクロライドの使用と喘息および過体重との関連
早期の抗生物質使用は健康転帰と関連していた。現在または発症中の喘息は、生後2年間の頻繁なマクロライド使用と有意に正の相関を示した：マクロライドコースを2回以上受けた群（N=32）のオッズ比は、受けていない群（N=116）と比較して6.11（95％信頼区間：1.53-26.58、Fisherの検定でP=0.004）であった。また、2歳までに2回以上のマクロライドコースを受けた小児では、生涯の総抗生物質使用量とBMI z-scoreの間に強い相関が認められたが（補足図3）、非曝露小児では認められなかった。
喘息児（N=8）および過体重児（N=9）の微生物叢組成を、マッチさせた健常対照児および正常体重対照児のものと比較した。喘息患者は、有意に存在量の異なる3つの細菌属によって健常対照群と区別された： Blautia、Rothia、Coprobacillusであった（補足図4A）。体重過多の症例は、4つの細菌群によって正常体重の対照群と区別された： Clostridium（Erysipelotrichaceae）、Clostridium（Clostridiaceae）、AkkermansiaおよびEnterococcusである（補足図4B）。
考察
我々の結果は、小児期におけるマクロライドの使用が、腸内細菌叢の組成、機能、抗生物質耐性の長期的な歪みと関連していることを示している。ペニシリン系抗生物質の使用は、微生物叢全体の機能的あるいは組成的な大きな変化とは関連していなかった。
抗生物質を投与された小児では、2年以上抗生物質に曝露されなかった小児と比較して、微生物叢組成に明らかな違いが観察された。ビフィドバクテリウムやバクテロイデスの存在量やマクロライド耐性といった微生物叢のいくつかの側面は、マクロライド投与後12ヵ月以内に正常化した。しかし、コリンセラ、ラクトバチルス、アネロスチペスの存在量や、微生物叢の総豊富度や成熟度は、マクロライド投与後2年間も低下したままであった。従って、抗生物質投与による微生物叢の完全な回復には、平均的な投与間隔（小児は1年に平均1.8±1.5回の抗生物質投与を受けた）よりも長い時間がかかるようである。抗生物質が毎年あるいはそれ以上の頻度で使用される場合、微生物叢が回復する時間がなく、抗生物質に関連した微生物叢組成が持続する可能性がある。
抗生物質を投与された小児は感染症に罹患していたが、抗生物質を投与されなかった小児は細菌感染症に罹患しておらず、抗生物質による治療が必要であった。しかし、マクロライド系抗生物質もペニシリン系抗生物質も、ほとんどが呼吸器感染症に処方されたものであったが、微生物叢の変化は明らかに異なり、正反対でさえあった。さらに、発熱は小児の微生物叢組成を変化させないことが以前に示されている19。このことは、感染症だけでは観察された変化のすべてを説明できないことを示している。最後に、マクロライドの使用とマクロライド耐性との間に強い相関関係があることから、使用された抗生物質との因果関係が示唆される。動物8,9,20および成人ヒト13,14を用いた実験的研究から、抗生物質の摂取が腸内細菌叢を変化させることが示されている。マウスを用いた最近の実験11では、生後早期のマクロライドおよびペニシリン投与が、われわれが観察したのと非常によく似た影響を腸内細菌叢に与えることが示されており、われわれのコホートにおける因果関係も強く示唆されている。
以前のマウス研究では、抗生物質の投与を中止すると微生物叢は回復するが、代謝の変化は持続することが示された10。私たちの結果は、ヒトの小児における対応するパターンを確認するものである。すなわち、幼少期に抗生物質を大量に使用したが、サンプル提供前の少なくとも2年間は抗生物質を使用しなかった小児は、生涯の抗生物質使用量が少なかった小児と同様の微生物叢を有していた。それにもかかわらず、早期からのマクロライドの使用は、体重過多と喘息の素因となった。これらの結果は、幼少期における一過性のマイクロバイオームの乱れであっても、子どもの代謝および免疫学的健康に長期的な影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
我々は、抗生物質の使用記録とBMI zスコアの間に強い正の関連を見出したが、特に幼少期にマクロライド系抗菌薬に曝露された小児群において顕著であった。動物21や低所得国の小児22,23における抗生物質の成長促進効果は、不顕性感染症の減少と関連しているが、腸内細菌叢の役割は1950年代にすでに提唱されていた（文献22）。欧米の小児4,24では、不顕性感染症の減少は、抗生物質の使用とBMI zスコアの関連を説明することはできない。さらに、マクロライド系抗生物質によるプライミングが、抗生物質による体重増加の素因となる理由も説明できない。むしろ、体重増加はマクロライドに関連した微生物叢の変化を介して起こる可能性が高く、この変化はマウスを用いて実験的に証明されたように、過剰な体重増加を促進する11。マウスにマクロライドを早期投与すると、グレリンレベルが低下し、肝遺伝子発現が変化し、マイクロバイオームが食事の変化に適応できなくなる11。すなわち、多様性の減少25、プロテオバクテリア26などのエンドトキシン産生（グラム陰性）菌の増加、ビフィドバクテリウム27、クリステンセネラ28、胆汁酸ヒドロラーゼ産生菌29の減少などである。
胆汁酸代謝は腸内細菌が行う重要な機能のひとつであり、宿主のエネルギー代謝に強い影響を及ぼす30。細菌の胆汁酸塩加水分解酵素は、一次共役胆汁酸を脱共役させ、二次および三次形態へのさらなる細菌による修飾を受けやすくする31。胆汁酸加水分解酵素はヒトの腸内細菌叢32に豊富に存在し、ヒトの消化器系における重要性を示している。修飾された胆汁酸は代謝調節因子として機能し、微生物叢の胆汁酸加水分解酵素活性は、FXR-αおよびTGR5シグナルを介して宿主の体重増加、インスリン抵抗性および血中コレステロールを減少させることが示されている29,33。
これまでの出生コホート研究や大規模な国際研究により、喘息と早期の抗生物質使用34、特にセファロスポリン35やマクロライド36との関連が見つかっている。アレルギー疾患のリスク増加は、乳酸桿菌やビフィズス菌の減少37,38,39、バクテロイデス・フラジリス40やプロテオバクテリア41のコロニー形成、多様性の低さ42など、生後早期の微生物叢特性の逸脱と関連している。これらの特徴はすべて、最近マクロライドを投与された小児にみられたことから、マクロライドの使用は健全な免疫系の発達を阻害する形で微生物叢を変化させることが示唆される。さらに、帝王切開、母乳育児の欠如、出生前および周産期のストレスなど、微生物叢を同様に変化させる他の要因も喘息の素因となる43。具体的な例としては、マクロライド曝露後に観察されるEggerthella属のレベルが10倍に増加することが挙げられる。ほとんどのEggerthella属菌は病原体44であり、炎症反応を促進する可能性がある。動物モデルから得られた実験的証拠によると、幼少期の抗生物質は微生物叢を乱し、それによって免疫系の発達が阻害され、感受性の高い人では気道過敏性につながることが示されている9,45。
結論として、マクロライドの使用は、これまで免疫疾患や代謝性疾患、肥満のリスクと関連してきた微生物叢の特徴と関連していた。さらに、マクロライドの使用は、微生物叢のマクロライド耐性の顕著な増加を促進した。この結果は、マウス実験10,11で得られた以前の結果を確認し、さらにそれを拡張するものであり、マクロライドの使用は小児の発育中の微生物叢に望ましくない影響を及ぼし、健康な免疫系と代謝の発達を損なう可能性があることを示している。
研究方法
研究コホート
我々のコホートは、調査時に同じデイケアセンターに通っていた2～7歳（中央値5歳）のフィンランド人小児236人である。142名の子どもから糞便サンプルの提供を受けた。この子どもたちは、もともとプロバイオティクスの試験のために募集された大規模コホートの一部である46。採用基準および除外基準に関する詳細は、このコホートを発表した原著に記載されている46。保護者から書面によるインフォームド・コンセントを取得し、地域の倫理委員会がこの研究を承認した。子どもたちは研究開始時に健康チェックに参加し、その際に体重と身長を測定した。体重と身長をもとに、疾病管理予防センターから入手したLMSパラメータに従ってBMI zスコアを算出した。アレルギーに関するデータは、両親が記入したアンケートから得た。フィンランドでは母乳育児が非常に奨励されており、母親は最長3年間の休職と雇用保証を得ることができるため、ほぼ全員（95％以上）の子どもが母乳育児を受けていた（少なくとも6ヵ月間は70％以上）。喘息を発症した子どもは全員母乳育児を受けており、1人を除いて全員が6ヵ月以上受けていた。子どもたちはデイケアセンターで毎日3食の食事をとっており、食生活の大部分はほぼ同じであった。さらに、フィンランドの所得格差は他の欧米諸国と比較して低く47、社会経済的な差はかなり小さいことが示唆された。1サンプル（27人）または2サンプル（115人；7ヵ月間隔で採取；補足図1）を提供した142人の子どもから、合計257の糞便サンプルが得られた。このサブ集団は、抗生物質の使用と腸内細菌叢との関連を解析するために利用された。
抗生物質の購入と慢性疾患のデータ
フィンランドでは、抗生物質は処方箋によってのみ入手可能である。抗生物質の購入に関する情報は、医療費を助成しているフィンランドの社会保険機関の記録から得た。出生日から最後の糞便サンプルの提供日まで、研究対象児のために購入したすべての抗生物質に関するデータを収集した。慢性疾患のある人は、購入した薬剤の特別払い戻しを受ける資格があり、その資格情報は国のデータベースに保存されている。我々は、研究コホートで最も一般的な発症慢性疾患である喘息とアレルギー性皮膚炎（2012年末まで）の診断データを収集した。抗生物質は、ペニシリン系（アモキシシリンとクラブラン酸、ペニシリンV）、マクロライド系（アジスロマイシン、クラリスロマイシン）、第一世代セファロスポリン、スルホンアミド・トリメトプリムに分類された。後者の2つの抗生物質群はほとんど使用されなかったため、ペニシリン系とマクロライド系の使用に焦点を当てた。アジスロマイシンとクラリスロマイシンは、それぞれ1994年と1996年にフィンランドの外来診療で使用できるようになった。我々のコホートでは、購入された抗生物質の50％がペニシリン系、24％がマクロライド系、残りがセファロスポリン系とスルホンアミド・トリメトプリム系であった。これらの数値は、フィンランド48や他の国の人口レベルのデータと一致している49。
7ヵ月間の間に親が報告した症状に基づいて、その間に抗生物質を使用した場合の適応を割り出すことができた。呼吸器感染症が最も一般的な明らかな適応であり、88％のコースに関連していた。その他の感染症（主に尿路感染症）は5％、同時に報告された症状がないコースは7％であった。フィンランドの小児消化器感染症はほとんどウイルス性であるため、抗生物質は処方されなかった。研究担当医によると、インターバル期間中にマクロライド系抗生物質を投与された小児は、ペニシリン系抗生物質を投与された小児と症状、抗生物質の適応、症状の重症度、既往歴に差はなかった。マクロライド系抗菌薬は通常、ペニシリンアレルギーの可能性があるため、あるいは投与が容易であることや過去の経験による両親の要望により処方された。
健康状態と抗生物質使用との関連は、236人の小児の全コホートを用いて分析された。抗生物質の使用とBMI z-scoreとの関連はピアソン相関を用いて評価した。生後2年間の抗生物質使用と喘息（N=15）およびアレルギー性皮膚炎（N=5）との関連は、Fisherの検定を用いて評価した。
糞便サンプルの処理
糞便サンプルは自宅で採取され、直ちに研究センターに運ばれ、-70℃で保存された。糞便検体からDNAをPromega Wizard Genomic DNA Purification Kitを用い、記載50の方法で抽出した。DNA濃度はNanoDropで測定し、10 ng ml-1に調整した。
塩基配列決定
細菌組成は、16S rRNA遺伝子のV4-V6領域の454 Titaniumシーケンス（パイロシーケンス51に推奨されているプライマーS-D-Bact-0564-a-S-15/SおよびUniv-1100-a-A-15）を用いて調べた。配列はUchimeプログラム52でキメラをフィルターした。501bpより短いリードはフィルターで除去した。1,000リード未満の4サンプルを廃棄した。リード数を平準化するレアファイ（arefying）は行わなかった。前処理後、257サンプルから合計2,262,107リードが得られた（サンプルあたり平均8,801リード、範囲1,469-14,653リード）。Qiimeバージョン1.8.0(ref. 54)を用いて、de novo operational taxonomic unit (OTU) pickingを行った。Uclust法を用いてOTUをGreengenes 13.8分類群にマッピングした。バッチ効果を避けるため、我々が以前に開発した方法55に従ってデータを正規化した。リード数は、すべての関連モデルにおいて共変量とすることでコントロールした。リード数は、観察された多様性やリッチネスとは関連しなかった（補足図5）。
イルミナHiSeq2000プラットフォームによるショットガンメタゲノムシークエンシングを、7ヵ月のインターバル期間中にマクロライド系抗生物質で治療された小児由来の14サンプルについて実施した。抗生物質レジストームの解析は、以前に詳述したように実施した56。簡単に説明すると、MOCATパイプラインを使用し、イルミナシーケンスリードは、トリミングと品質管理後、一般に公開されているヒト腸内細菌メタゲノムから事前にアセンブルされた3.3M遺伝子配列のカタログにマッピングされた。これらの参照遺伝子の中から、ARDBデータベースでアノテーションされた抗生物質耐性遺伝子ファミリーのメンバーを同定した。これは、まずGenBankから3,496の細菌ゲノムを収集し、データベースをさらに相同遺伝子で補強し、次にNCBI BLASTを用いて、ファミリー割り当てのためのARDBファミリー特異的配列同一性閾値を用い、得られた遺伝子セットの相同遺伝子を参照遺伝子の中から同定することによって行われた。その結果、各抗生物質耐性遺伝子ファミリーのメンバーにマッピングされたリードから得られた配列材料の量を定量することができた。参照遺伝子配列も同様にKEGGデータベースの機能モジュールにマッピングし、異なる代謝経路をコードする遺伝子の相対的な存在量の変化を調べることができた。
培養ベースの抗生物質感受性試験
80の糞便サンプルから細菌を嫌気的に培養し、混合培養として表現型抗生物質耐性解析を行った。菌は希釈系列として、10 mg ml-1 エリスロマイシン（マクロライド系抗生物質）添加または無添加のBrain-Heart Infusion寒天培地（Oxoid）で培養した。37℃で2日間培養後、各プレートでコロニーを数え、耐性コロニーの割合は、抗生物質プレート上のサンプル1gあたりのコロニー形成単位（c.f.u.）数をコントロールプレート上のc.f.u.で除した値として算出した。
リアルタイムPCR解析
メタゲノム解析から、マクロライド耐性の増加とは別に、マクロライドの使用は胆汁酸塩加水分解酵素遺伝子の減少と関連していることが示された。そこで、117人の小児から採取した合計130のDNAサンプルについて、これらの遺伝子の存在量を定量するためにqPCR解析を行った。細菌遺伝子bsh、ermBおよびermFの定量は、補足表4に示したプライマーを用いて行った。ermBおよびermF遺伝子のプライマーは以前に発表されている57。bshプライマーはFirmicutesとBacteroidetesの優占種を対象に設計した。これらの相同性の高い遺伝子の共増幅を避けるため、胆汁酸塩加水分解酵素活性が確認され、ペニシリンVアミダーゼ活性を持たない種に焦点を当てた32。そこで、Bacteroides ovatus、Ruminococcus obeumおよびEubacterium ventriosumがコードするbsh遺伝子を増幅するためのプライマーを、GenBankからBLASTを用いて取得した配列データに基づいて設計した。各アッセイに最適なプライマー濃度とアニーリング温度を決定し、プライマーペアの特異性を融解曲線解析とアガロースゲル電気泳動で検証し、正しい産物サイズを確認した。反応はiCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)を用いて25μlの容量で3連で行った。各反応には、1×HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus（Solis Biodyne、エストニア）、0.5μMの各プライマー、および25ngの糞便DNAが含まれた。増幅プロトコールは、95 °Cで5分間の初期変性、95 °Cで20秒間の変性、20秒間のプライマーアニーリング、72 °Cで30秒間の伸長、80-82 °Cで30秒間のインキュベーションを40サイクル繰り返した。サンプルあたりの平均Ct値（Ct値が0.5以上異なるレプリケートを除外した後）を、標的遺伝子の相対存在量の代用として使用した。
抗生物質使用研究グループ
糞便サンプルは抗生物質の使用に基づいてグループ分けした（補足表1）。対照群（C群）には、最低2年間抗生物質を使用しておらず、生涯の抗生物質使用量の合計が年間1コース未満であった小児のサンプルが含まれた。少なくとも2年間抗生物質を使用しなかったが、生涯の総使用量が多かった（少なくとも平均して1年に1コース）、すなわち、幼少期に抗生物質を頻繁に使用したが、最近は使用していなかった小児は、幼少期群（E群）に割り当てられた。M6群は、サンプル提供前6ヵ月以内にマクロライド系抗生物質を使用した小児のサンプルで構成された。M12群は、検体提供前6-12ヵ月以内にマクロライド系抗生物質を使用した小児の検体から構成された。M24群は、検体提供前12〜24ヶ月以内にマクロライド系抗生物質を使用した小児の検体である。P6群は、検体提供前6ヶ月以内にペニシリン系抗生物質を使用した小児の検体である。P12群は、検体提供前6〜12ヶ月以内にペニシリン系抗生物質を使用した小児の検体である。P24群は、検体提供前12～24ヵ月以内にペニシリン系抗生物質を使用した小児の検体で構成された。
微生物叢に基づいて算出された指標
微生物叢の豊かさは、検出された種レベルのOTU（類似度97％カットオフ）の数として算出した。微生物叢の多様性は、種レベルのデータに基づく逆シンプソン多様性指数として算出した。属レベルのデータとBray-Curtis非類似度を用いてPCoAを実施した。第1主成分と抗生物質使用などの背景変数との関連は、成分空間上の変数値の逆距離重み付け補間によって可視化した。微生物叢成熟度指数は、健康な子どもと健康上の問題を抱える子どもを区別することが以前に示されており58,59、対照群と早生群における有意に年齢に関連する属レベルの分類群のみを用いたPCoAからの第一主座標として算出した（補足表2）。微生物の豊富さ（分類群数）の群間差は負の二項モデルを用いて評価し、微生物叢の成熟度（正規分布）の差は分散分析を用いて評価した。
抗生物質の使用と細菌属の関連
負の二項分布による一般化線形モデル（RのライブラリMASSの関数glm.nb）を用いて、対照群と比較して抗生物質使用群で有意に異なるか、またはマクロライドまたはペニシリンの生涯総コース数（生涯年数あたり）と有意に線形に関連する、抗生物質使用と関連する個々の細菌分類群を同定した。不必要なP値検定や信頼性の低い結果を避けるため、サンプルの30％以上で検出された48属のみに注目した。まれな属の検出量は偶然にかなり影響される可能性が高く、そのため一般的な属の検出量よりも信頼性が低い。主な関心事は、異なるグループ（補足表1）の微生物叢組成がどのように異なるかを評価することであった。しかし、交絡因子の可能性をコントロールするために、すべてのモデルに以下の共変数を含めた：シーケンスリード数、子供の年齢、子供のBMI zスコア（これは家庭でのライフスタイルや食生活を反映していると思われる）、健康状態（親が報告または診断したアレルギー、診断された喘息、既知の疾患なし）、生涯抗生物質使用（抗生物質使用群を比較する場合）または抗生物質使用群（生涯抗生物質使用の累積効果を評価する場合）。多重検定の補正にはFDR（False Disovery Rate）補正P値60を用いた。上記のすべての変数をコントロールした後、存在量が対照群と有意に異なる（FDR補正P値＜0.15）細菌分類群は、抗生物質使用の影響を受けている可能性があると考えられた。
微生物と健康との関連解析
喘息症例の微生物叢組成に明確な特徴があるかどうかを調べるため、現在喘息または発症中の全症例（N=8）、および年齢と抗生物質使用歴をマッチさせた健常対照群各2例（N=16）からサンプルを選択した。微生物と過体重の関連を解析するため、BMI z-score＞2の全症例（N=9）と、年齢と抗生物質使用歴の一致した正常体重対照者（N=16）各2人（可能な場合）からサンプルを選択した。体重過多の2人については、マッチする対照例は1例のみであった。喘息との関連解析では、2つのサンプルが入手可能な場合、1つ目と2つ目の時点のサンプル間の平均微生物叢組成を算出した。過体重の解析では、体重と身長は研究開始時に1回だけ記録されたため、最初の時点のサンプルのみを使用した。喘息または過体重の症例と健常または正常体重の症例とを最もよく区別する細菌群を見つけるために、まず喘息または過体重を応答変数とし、各属レベルの細菌群を説明変数として別々に二項モデルを当てはめた。これらのモデルから得られたP値を識別可能性の指標とし、P＜0.2の細菌群をすべて選択してさらなる解析を行った。これらのグループを1つのモデルの説明変数として組み合わせた。次に、AICに基づくステップワイズ・モデル選択を用いて、喘息・過体重例と健常者・正常体重例とを最もよく識別する細菌群のセットを求めた。
すべての統計解析は、序列化と多様性解析にはvegan62、負の二項モデルにはMASS63のパッケージを使用し、Rプログラム（文献61）を用いて行った。
追加情報
アクセッションコード： 報告されたメタゲノム・データと16S rDNAアンプリコン配列は、European Nucleotide Archive (ENA)にPRJEB11685という研究名で寄託されている。
この記事の引用方法 Korpela, K. et al.フィンランドの就学前児童における腸内マイクロバイオームと抗生物質の生涯使用との関連。Nat. Commun. 7:10410 doi: 10.1038/ncomms10410 (2016).
アクセッションコード
アクセッション
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謝辞
配列処理に協力してくれたJarmo Ritari、qPCR解析を実施してくれたLaura Degerstedtに感謝する。本研究の一部は、フィンランドアカデミーからの助成金137389、141140、1272870、オランダ科学研究機構からのスピノザ賞および重力助成金（024.002.002）、欧州研究会議（ERC 250172）（W.M.de.V.）、ヘルシンキ生物医学博士課程（K.K.へ）およびアレクサンダー・フォン・フンボルト財団（K.F.へ）の支援を受けている。
著者情報
著者および所属
ヘルシンキ大学細菌学・免疫学教室、免疫生物学研究プログラム、Haartmaninkatu 3, PO Box 21, Helsinki, 00014, Finland
カトリ・コルペラ、アン・サロネン、ウィレム・M・デ・ヴォス
フィンランド、トゥルク、Peltolantie 3、20720、社会保険機関調査部
ラウリ J. ヴィルタ
フィンランド、00370、ヘルシンキ、Meijeritie 4、ヴァリオ社、研究開発部
リイナ A. ケッコネン
欧州分子生物学研究所、私書箱1022.40、ハイデルベルク、69012、ドイツ
クリストファー・フォルスルンド＆ピア・ボーク
ヘルシンキ大学獣医バイオサイエンス学部、私書箱66、ヘルシンキ、00014、フィンランド
ウィレム・M・デ・フォス
ワーヘニンゲン大学微生物学研究室、Dreijenplein 10, HB Wageningen, 6703, The Netherlands
ウィレム・M・デ・フォス
貢献
K.K.、A.S.およびW.M.de.V.が研究をデザイン、K.K.およびR.V.が糞便サンプルの処理および採取、K.K.が培養に基づく抗生物質感受性試験を実施、K.K.およびA.S.がqPCRプライマーをデザイン、K.K.がすべての統計解析を実施、L.V.が薬剤登録解析を監修、K.F.およびP.B.がメタゲノムを決定、K.K.、A.S.およびW.M.de.V.が論文を執筆。
共著者
Willem M. de Vosに連絡。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する経済的利益はないと宣言している。
補足情報
補足情報
補足図1-5、補足表1-4、補足参考文献 (PDF 699 kb)
権利と許可
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転載と許可
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この記事を引用する
Korpela, K., Salonen, A., Virta, L. et al. 腸内細菌叢はフィンランドの就学前児童における抗生物質の生涯使用と関連している。Nat Commun 7, 10410 (2016). https://doi.org/10.1038/ncomms10410
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受領
2015年6月23日
受理
2015年12月03日
掲載
2016年01月26日
DOI
https://doi.org/10.1038/ncomms10410
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Xuanji LiAsker BrejnrodSøren Johannes Sørensen
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