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腸内細菌分離株を駆虫薬イベルメクチンとモキシデクチンに曝露すると、増殖抑制と適応という抗生物質様表現型が生じる

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.01.17.575993v1.full


Julian Dommann, Jennifer Keiser, Julian Garneau, Alison Gandelin, Carlo Casanova, Peter M. Keller, Somphou Sayasone, Pascale Vonaesch, ORCID Profileを見るPierre H. H. Schneeberger
doi: https://doi.org/10.1101/2024.01.17.575993
この論文はプレプリントであり、査読の認証を受けていません。
00000017
要旨全文情報/歴史メトリクスプレビューPDF
要旨
イベルメクチンとモキシデクチンは、その幅広いスペクトラム活性により、獣医学およびヒトの医療において広く使用されている駆虫薬である。しかし、イベルメクチンは腸内細菌の増殖を阻害することが最近明らかになった。イベルメクチンもモキシデクチンもマクロライドに類似した構造を持つことから、これらの駆虫薬の抗生物質スペクトラムを明らかにし、マクロライドや他の抗生物質ファミリーに対する交差耐性の発現に及ぼす潜在的な影響を明らかにする必要がある。ここでは、腸内で頻繁に検出されるさまざまなクレードを代表する59の細菌分離株を、濃度の異なるイベルメクチンおよびモキシデクチンと16〜72時間インキュベートした。さらに、これら2種類の駆虫薬の濃度を徐々に増加させながら、10株の細菌を繰り返し投与し、異なる抗生物質および駆虫薬の濃度に対する感受性を調べた。その結果，2種の駆虫薬の抗菌活性は，力価および用量依存性から観察されるように，試験した抗生物質と同等であった。試験管内での細菌による駆虫薬への挑戦は駆虫薬感受性の低下をもたらした。さらに、駆虫薬への適応は、3種のマクロライド、リンコサミド、フルオロキノロン、テトラサイクリンおよび2種のカルバペネム系抗生物質に対する抗生物質感受性の低下と関連していた。観察された細菌感受性プロファイルの変化は、繰り返し駆虫薬に曝露されたことに関連しており、それが原因である可能性が高い。したがって、蠕虫とマラリアの駆除のためにイベルメクチンとモキシデクチンをそれぞれ現在および将来的に大量に投与することは重大な懸念事項であり、潜在的なオフターゲット効果を注意深く監視する必要がある。

背景
土壌伝染性蠕虫（Soil-transmitted helminths：STHs）は、宿主の消化管内の種特異的なニッチに寄生する寄生性真核虫の複数種からなるグループである。世界保健機関（WHO）がリストアップしている顧みられない熱帯病の中でも、STH感染症は有病率（15億以上）と疾病負担の点で群を抜いており [1, 2]、主に就学前や学齢期の子どもが罹患し、認知や身体発育の障害など、深刻な長期的健康状態につながる可能性がある。長期的な対策としては、水質、衛生環境、衛生状態の改善が挙げられるが、短期的な対策としては、罹患率を下げるために駆虫薬に頼ることになる [3-5]。現在の最前線の治療薬には、メベンダゾールとアルベンダゾール（ALB）という2種類のベンズイミダゾールがある [6] 。しかし、治癒率は種によって異なり [7, 8]、三日寄生虫感染症では両薬剤の単回投与レジメンの治癒率は低い [7, 9, 10]。新薬のパイプラインはまだほとんどないため、現在は再利用された動物用医薬品 [11] と併用療法 [7, 8] に焦点が当てられている。

イベルメクチン（IV）とモキシデクチン（MX）は、そのような再利用薬の代表例である。マクロライド系抗生物質群を代表する化学構造である16員環の大環状ラクトン環が、IVとMXの両剤を特徴づけている。エリスロマイシン（EM）、クラリスロマイシン（CH）、アジスロマイシン（AZ）などのマクロライド系抗生物質は、細菌のタンパク質合成を阻害し[12]、一般的にグラム陽性菌感染症の治療に使用される。対照的に、IVとMXは多くの寄生虫に対して幅広い活性スペクトルを有しているため、抗寄生虫薬として頻繁に投与されている。MXは最近、ヒトのオンコセルカ症の治療薬として承認され[13]、Strongyloides stercoralis [14, 15]、ALBとの併用でT. trichiura [16]に優れた効果を示すことが示された。一方、IVはフィラリア感染症に広く使用されている駆虫薬であり、T. trichiura感染症に対する治療効果を高めるためにALBと組み合わせた併用療法に使用されており [17]、この適応は最近WHOの必須医薬品モデルリストに追加された [18]。

経口投与された薬剤は小腸や大腸を通過する際、吸収される前に多くの微生物との相互作用を受けるため、腸内細菌叢は初回通過代謝の関連部位となっている [19] 。腸内微生物の汎ゲノムには、宿主の150倍もの遺伝子が含まれているため、遺伝的多様性が際立っており、投与された化合物のバイオアベイラビリティや有効性に影響を及ぼす直接的・間接的相互作用の可能性が大きい [20] 。

その逆もまた然りで、薬物やその代謝物は細菌の増殖を促進したり阻害したりする可能性がある。したがって、抗生物質以外の薬剤を経口投与すると、腸内細菌の増殖が阻害され [21] 、腸内細菌叢の恒常性が乱される可能性がある。IVとMXの分子構造から、様々な腸内細菌がこれらの薬剤に感受性を示す可能性があると考えられる。実際、最近の研究で、T. trichiura感染症に対するIV-ALB併用療法を受けた参加者において、治療前の腸内細菌組成と治療成績との間に関連があることが判明した［22］。治療の失敗は、Prevotella copri、Streptococcus salivarius、Faecalibacterium prausnitziiなどの腸内細菌種と関連していた。さらに、反復的なIV/MX曝露は、細菌の感受性プロファイルに影響を及ぼす可能性があり、その結果、交差耐性腸内細菌が分離されたり、IV/MX治療の有効性が阻害されたりする可能性がある。

われわれの知る限り、腸内細菌分離株に対するIV/MXの抗菌活性に関するデータは限られている [21, 23]。細菌感受性プロファイルとIVやMX治療との間に因果関係があれば、畜産業におけるIVやMXの広範な使用や、蠕虫感染症やマラリア感染制御のための流通・投与の増加に照らして、重大な懸念が生じるであろう [24-26]。したがって、これら2つの駆虫薬の潜在的な標的外効果を予測することは極めて重要である。そこで我々は、広く使用されているこれら2種類の駆虫薬について、in vitroで広範な腸内細菌分離株に対する抗菌特性を、特に他の抗生物質との交差反応という観点から詳細に明らかにすることを目的とした。

試験結果
IV/MXは広範な腸内細菌分離株のin vitro増殖を阻害する
IV/MXが腸内細菌の増殖を阻害するかどうか、またどの程度阻害するかを調べるため、分類学的に幅広い腸内細菌分離株を異なる濃度のIV/MXでインキュベートし、一連のin vitro実験を行った。具体的には、10属（Actinomyces属、Bacteroides属、Blautia属、Clostridium属、Dorea属、Enterococcus属、Escherichia属、Lactobacillus属、Staphylococcus属、Streptococcus属）の好気的および嫌気的に増殖した細菌59種（補足表1〜3）を用いた。分離株の選択に関する詳細な根拠は、方法のセクションに記載されている。経口投与後、IV/MXは蠕虫感染の標的組織である腸管に直ちに到達するため、腸内の生理的濃度レベルは約5μMと推定される [21]。そこで、分離株を1µM、5µM、10µMのIVとMXでインキュベートした（補足図1～10）。分離株と個々のアッセイ間で増殖曲線を比較するために、Gencayら[27]が発表した曲線下面積（AUC）比の概念を採用した。すなわち、ある濃度のIVまたはMX存在下でのAUCを、対応するコントロール曲線のAUCで割った。

全体として、薬物濃度1µMのIV/MXは、試験したいずれの細菌の増殖にも悪影響を及ぼさないようであった（図1Aおよび1B）。好気的に培養した分離株の種間比較から、Enterococcus属の分離株は、試験したすべての濃度において、IVおよびMXの存在下で増殖遅延を示さないことが明らかになった（図1A）。対照的に、Actinomyces属およびStreptococcus属の分離株は、5μMおよび10μMのIVおよびMX存在下で感受性を示した。嫌気性菌では、バクテロイデス属、ラクトバチルス属、スタフィロコッカス属の分離株は、IVとMXのいずれの存在にも影響されなかった（図1B）。反対に、Blautia属、Clostridium属、Dorea属、Streptococcus属ではAUC比の低下が観察された。Streptococcus salivarius (01)とStreptococcus parasanguinis (01)は好気的および嫌気的に培養し、いずれもIV/MXに感受性を示した。好気的に培養された分離株の種内比較から，薬剤感受性は薬剤に依存していることが明らかになった。例えば、S. pneumoniae（02）は、S. pneumoniae（01）およびS. pneumoniae（03）と比較して、IVまたはMXに対する感受性が低かった（AUCIV10μM：0.84、AUCMX10μM：0.47）（AUCIV10μM：0.47、AUCMX10μM：0.1、AUCIV10μM：0.1、AUCMX10μM：0.1）。嫌気性では、種内感受性の違いも観察された。実際、Dorea属の1/3株（D. longicatena（01）；AUCIV5µM：<0.1）およびClostridium属の1/5株（C. baratii（02）；AUCMX10µM：<0.1）は、IVまたはMXのいずれかによって阻害された。

図1.
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図1.
イベルメクチン（IV）およびモキシデクチン（MX）に対する腸内細菌分離株の感受性：
(A）好気的に培養した分離株のIVとMXに対するAUC比（濃度1µM、5µM、10µM）。(B）嫌気的に培養した分離株のIVとMXの1µM、5µM、10µM濃度のAUC比。(C) 3つの濃度（1µM、5µM、10µM）にわたって可視化した25のMX感受性分離株のAUC比。同じ分離株に属する値は点線で結んである。色付けは分離株の属によって選択した。ボックスプロットのひげは95％信頼区間を示す。(D)3つの濃度（1µM、5µM、10µM）で可視化したIV感受性分離株19株のAUC比。同じ分離株の値は点線で結んである。色付けは分離株の属によって選択した。ボックスプロットのひげは95％信頼区間を示す。(E, F)感受性のある単離株のFold change (FC)比。FCは1-（AUCIV/AUCMX）として計算した。l - FC > 0はIVに対する感受性の高さを示し、1 - FC < 0はMXに対する感受性の高さを示す。図は、好気性培養（E）と嫌気性培養（F）で層別化されている。

図1Cおよび1Dの定量的値（AUC比）から定性的値（「感受性」；「感受性なし」）へ移行するために、暫定的なAUC比カットオフ値0.8を採用し、分離株を「感受性あり」と「感受性なし」に層別化した。分離株を3つの濃度で一対比較した結果、薬剤投与量とAUC比の間に逆相関が認められた（用量依存性；表1-2）。

暫定的なカットオフによると、25/59株がMXに対して感受性があり、19/59株がIVに対して感受性があると考えられた。IVとMXの両方で、薬物濃度が高いほどAUC比が低くなる一般的な傾向があるが、5μMまたは10μMのIVまたはMXの存在下では、AUC比は属や種によって大きく異なる。最後に、いくつかの分離株で薬剤特異的な反応からなる表現型も観察された。例えば、S. anginosus (01)とS. dysgalactiae (01)(図1Aと1E)をMXとインキュベートすると、同じ濃度のIVと比較してAUC比が低くなる。対照的に、A. odontolyticus (01)、A. odontolyticus (02)およびD. longicatena (01)は、IVに対する感受性が高いようである。また、IVとMXの濃度が等しい場合、MXの方がAUC比が低い（図1Aおよび1B）。

IV/MXのin vitroにおける効力は、いくつかの抗生物質と同等である。
次に、2 種類の駆虫薬の効力を試験管内で抗生物質と比較することにした。IV と MX は大環状ラクトン系薬剤に属するため，3 種類のマクロライド系抗生物質 EM，CH，AZ を比較対象とした。クリンダマイシン（CL）はリンコサミド系抗生物質であり、マクロライド系抗生物質と作用機序（MOA）を共有している。フルオロキノロン系抗生物質のシプロフロキサシン（CX）、テトラサイクリン（TC）、カルバペネム系抗生物質のメロペネム（MP）とイミペネム（IP）は作用機序が全く異なるため、比較対象とした。そこで、一次スクリーニングで同定されたStreptococcus属8株とActinomyces属3株からなる駆虫薬感受性細菌のサブセットを、IV/MXとのインキュベーションと同様の大きさをシミュレートするために、1μM、5μM、10μMの濃度で選択した抗生物質（EM、CH、AZ、CL、CX、TC、MP、IP）とインキュベートした。IVおよびMXとは対照的に、試験した抗生物質は1μMでAUC比の低下を引き起こした（補足図1、KW；p = 1.186e-08）。しかし、5μMまたは10μMのIV/MXとのインキュベーションでは、試験した抗生物質と同程度の範囲のAUC比となった（KW; p = 0.03708およびKW; p = 0.8284）。S. dysgalactiae (01)は5μMでは例外で、IVとMXの両方で高いAUC比を示した（補足図2、AUCIV5μM：1.06、AUCMX5μM：0.95）。同様に、S. dysgalactiae（01）のみが、10μMの濃度でIVに対して高いAUC比を示した（図2、AUCIV10μM：0.96）。S. oralis（02）とS. pneumoniae（03）の場合、10µMのIVとMXは、試験したすべての薬剤で最も低いAUC比を示した（AUCIV10µM：0.07、AUCMX10µM：0.07、AUCIV10µM：0.06、AUCMX10µM：0.06）。全化合物間の一対Wilcoxon順位和検定の結果は、補足表5-7にある。さらに、すべてのマクロライド（IV、MX、EM、CH、AZ）およびリンコサミド（CL）化合物の存在下における11株のAUC比に基づくピアソン相関（補足表8～13）を各試験濃度について行った。その結果、すべての試験濃度においてマクロライド系抗生物質（EM、CH、AZ）同士の相関は認められたが、駆虫薬（IV、MX）とマクロライド系抗生物質（EM、CH、AZ）またはリンコサミド系抗生物質（CL）同士の相関は認められなかった。

図2.
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図2.
イベルメクチン（IV）とモキシデクチン（MX）のin vitro効力：
lOµMのIV、MX、EM、CH、AZ、CL、CX、TC、MPまたはIP存在下での11の細菌分離株のAUC比。点線は、分離株の理論上の増殖阻害なし（AUC比＝1）を示す。棒の色は化合物の主な使用例に対応する。黒＝駆虫薬、白＝抗生物質。

細菌分離株は、駆虫薬に挑戦した後、IV/MXおよび抗生物質の選択に適応した。
IVおよびMXは広範囲の分離株で細菌の増殖を阻害するため、感受性細菌分離株がIVおよびMXの反復亜阻害暴露に適応できるかどうか、またこの適応がこれらの分離株の抗生物質感受性プロファイルを変化させるかどうかを試験することを目的とした。S.salivarius（01）、S.parasanguinis（01）、S.pneumoniae（02）、S.mitis（01）、S.dysgalactiae（01）の5つの細菌分離株と、それらのチャレンジドカウンター（付録"-IVc "または"-MXc"）を、前述のようにIV/MXおよび抗生物質とインキュベートした（補足図13～17）。これらのインキュベーションの第一の焦点は、抗生物質感受性に対するプレチャレンジの効果を実証することのみであったため、1μM以上の濃度で増殖が測定できなかった場合は、亜致死量（すなわち0.1μMまたは0.01μM）を選択した。

オリジナルの分離株とチャレンジした分離株のIVとMXのAUC比を比較すると、3つの表現型が観察された（図3）。第一に、駆虫薬にチャレンジするとIVとMXのAUC比が増加することがわかった。例えば、S. salivarius (01-IVc) (AUCIV10µM: 0.73; AUCMX10µM: 0.60)は、S. salivarius (01) (AUCIV10µM: 0.68; AUCMX10µM: 0.51)と比較した。また、S. salivarius (01-MXc)では、S. salivarius (01)と比較して、10μMの駆虫薬存在下でのAUC比が異なっていた（AUCIV10μM：0.77；AUCMX10μM：0.91）。この表現型は、S. pneumoniae (02-IVc)とS. pneumoniae (02-MXc)、S. mitis (01-IVc)とS. mitis (01-MXc)、最後にS. dysgalactiae (01-IVc)とそれぞれの未チャレンジのオリジナル分離株と比較して共通している。対照的に、S. parasanguinis (I01)では、同じ駆虫薬で再チャレンジした場合にのみAUC比が増加するという異なる表現型が観察された。例えば、S. parasanguinis（01-IVc）（AUCIV10μM：0.96；AUCMX10μM：0.25）は、S. parasanguinis（01）（AUCIV10μM：0.79；AUCMX10μM：0.26）と比較して、IV存在下では高いAUC比を有するが、MX存在下では低いAUC比を有する。同様に、S. parasanguinis（01-MXc）（AUCIV10μM：0.75、AUCMX10μM：0.74）は、MX存在下でS. parasanguinis（01）と比較して高いAUC比を示したが、IV存在下では低い比を示した。最後に、S. dysgalactiae（01-MXc）（AUCIV10µM：0.84；AUCMX10µM：0.19）は、IVおよびMXインキュベーションの両方で、S. dysgalactiae（01）と比較して低いAUC比を示す、第3のユニークな表現型を示す。

図3.
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図3.
駆虫薬への挑戦に対する細菌分離株の適応：
異なる濃度のIV、MX、EM、CH、AZ、CL、CX、TC、MPまたはIPの存在下での、10種の挑戦的細菌分離株とその元の分離株のAUC比。点線は、分離株の理論上阻害されない増殖（AUC比＝1）を示す。棒の色は挑戦的な状態に対応している。白＝元の分離株、黒＝IVにチャレンジした分離株、灰色＝MXにチャレンジした分離株。各挑戦単離株について、最高値を示した化合物を強調表示した（黒三角）。

抗生物質感受性に対する駆虫薬チャレンジの効果を比較するために、各化合物について、元の分離株のAUC比をチャレンジした分離株のAUC比で割った値の変化倍率（FC）を用いた。(1-FC)≧0.1のとき、抗生物質感受性に影響があると考えた。MXに曝露した後、S. salivariusのMPおよびIPに対する感受性の変化が観察され（01）、IPに対する感受性の変化が最も大きかった（｜1-FCIP1μM｜ = 0.20）。これらの変化は、CL（｜1-FCCL0.01µM｜=0.10）を除き、IVへの曝露後には観察されなかった。S. parasanguinis（01-IVc）では、CH、AZ、CXの存在下で感受性の変化が観察された。S. parasanguinis (01-MXc)については、CLを添加しても同様のパターンが観察された。S. parasanguinis (01-IVc)とS. parasanguinis (01-MXc)については、CHの存在下で最も高い倍数変化が観察された（｜1-FCCH0.01μM｜ = 0.18および0.21）。試験したS. pneumoniae分離株のMXへの長期暴露は、試験したすべての抗生物質に対する感受性の低下と関連していた（最高倍率変化：｜1-FCIP1μM｜ = 0.89）。IVへの曝露後も同様の結果が観察されたが、抗生物質CXに対する感受性は、曝露されなかった分離株と同様であった（最高変化倍率：｜1-FCIP1μM｜＝0.82）。S. mitis（01-IVc）の場合、CXとTCを除くすべての抗生物質に対する感受性が低下し、この低下はMP（｜1-FCMP1μM｜＝0.82）で最も高く、その結果、チャレンジした分離株の増殖はほとんど阻害されなかった。S. mitis（01-MXc）では、抗生物質感受性はCH（｜1-FCCH10μM｜＝0.78）で最も低かったが、EMとTCでは変化しなかった。S. dysgalactiae (01)では、曝露後に観察された変化のいくつかは逆転していた。つまり、駆虫薬に曝露されなかった分離株は、駆虫薬に曝露された分離株よりも別の抗生物質に対して感受性が低かった。例えば、MXに暴露された株は、3種類のマクロライド系抗生物質（EM、CH、AZ）およびCLに対する感受性の増加と関連していた（最高倍率：｜1-FCCH5μM｜＝0.75）。これは、IVでチャレンジされた分離株には当てはまらず（最高変化倍率：｜1-FCTC10μM｜＝0.45）、この分離株における異なる適応メカニズムを示唆している。CXおよびTCに対する感受性は高いが、MPおよびIPに対する感受性は変化しなかった。

考察
IVの抗菌性については、これまでにいくつかの研究が報告されている [28-30]。本研究では，IV および近縁化合物である MX の抗菌性を，臨床および市販の両方から分離された 10 属 59 株の腸内細菌に対して系統的に試験した．マクロライドまたはリンコサミド耐性がIV/MXに対する感受性と関連しているかどうかを調べるため、リンコサミドおよびマクロライド耐性の臨床分離株（20/59株）を対象とした。さらに、ラオスでの研究で得られた便検体から濃縮した臨床分離株（27/59株）も、その広範な臨床的背景から対象とした。最後に、分類学的範囲を広げるため、市販株（12/59株）も対象とした。その結果、IVとMXはともにin vitroにおいて、幅広い細菌分離株の増殖を用量依存的に阻害し、その効力は同等であることがわかった。マクロライド系およびリンコサミド系抗生物質は、細菌のリボソームの50Sサブユニットに結合することにより、グラム陽性菌に対する静菌活性または殺菌活性を発揮する。IVとMXについては、細菌に対するMOAはまだ特定されていない。しかし、今回のデータから、IVとMXのMOAはマクロライド系抗生物質やリンコサミド系抗生物質とは異なると推測できる。第一に、マクロライド系抗生物質EM、CH、AZおよびリンコサミド系抗生物質CLに対する細菌分離株の感受性プロファイルが、IVとMXとで異なることが観察された（補足表8-13）。第二に、マクロライドまたはリンコサミド耐性分離株であるS. pneumoniae（02）、S. dysgalactiae（01）およびS. mitis（01）の細菌感受性プロファイルに、駆虫薬に挑戦した後の変化が観察され、冗長なもの（同じMOA）とは対照的に、さらなる適応（異なるMOA）が示された。

我々は、試験管内での感受性の低下と関連したIVおよびMXへの適応を示した。われわれの研究の欠点は、試験管内での積極的な挑戦が、実際の静脈内投与やMXの適用と比較できない可能性があることである。STH感染を制御するために、MDAは通常年に1～2回実施される。Maierらによると、8mgのMXと200µg/kgの静脈内投与（すなわち、蠕虫感染症に使用される標準用量）では、推定腸内濃度はそれぞれ4.2μMまたは4.6μMとなる[21]。しかし、最近、アノフェレス属の雌の蚊に対する媒介蚊駆除薬として静脈内投与が検討されており、より頻繁で高用量の投与が導入される可能性がある [25, 31]。さらに、最近のMORDOR試験では、マクロライド系抗生物質AZを年2回、2年間投与すると、すでに腸内細菌叢でマクロライド耐性が増加することが示された [32, 33]。

S. salivarius (01)、S. pneumoniae (02)、S. mitis (01)については、幅広い適応表現型が観察され、駆虫薬にチャレンジした結果、いずれの駆虫薬に対しても感受性が低下した。対照的に、S. parasanguinis (01)の駆虫薬への挑戦は、対応する駆虫薬に対してのみ感受性の低下をもたらし、S. salivarius (01)、S. pneumoniae (02)、S. mitis (01)が採用した潜在的に広いメカニズムとは対照的に、薬剤特異的なメカニズムを示唆した。興味深いことに、マクロライドおよびリンコサミド耐性分離株であるS. pneumoniae (02)では、IV-およびMX-チャレンジした分離株の両方が、試験したすべての抗生物質クラス（マクロライド、リンコサミド、テトラサイクリン、フルオロキノロン、カルバペネム）に対する感受性を低下させたことから、駆虫薬チャレンジは幅広いスペクトラム効果を発揮するようであった。さらに、このような駆虫薬とマクロライドまたはリンコサミド耐性との間の広域相互作用は、S. mitis（01-IVc）、S. mitis（01-MXc）およびS. dysgalactiae（01-IVc）でも観察された。したがって、臨床的に重要な菌種におけるAMRの発生と維持を理解するためには、耐性メカニズムのさらなる解明が不可欠である。これは特に、致死的な下気道感染症を引き起こす6大原因のひとつであるS. pneumoniaeに当てはまる [34]。S.pneumoniaeは主に上気道に生息しているため、その主要なニッチでは、高濃度のIVやMXに接触する可能性は低い。しかし、マイクロバイオームを介した耐性遺伝子の動的な移動が最近証明されており [35]、IV/MX MDAの場合に考えられるシナリオであろう。また、他の常在菌種がAMR遺伝子のリザーバーとして働き、ヒト体内におけるAMRの持続に寄与している可能性があるため、この相互作用を調査することも重要である。蠕虫感染症やその他の感染症のリスクにさらされている集団は、南半球ではしばしば重複している。例えば、サハラ以南のアフリカでは現在、AMRに関連した死亡がほとんどを占めている [34]。そこでは、駆虫薬が細菌のAMRにさらに寄与している可能性がある。さらに、東南アジアとインドは、蠕虫の蔓延 [36] と抗生物質の使用 [37] のホットスポットであり、抗生物質と耐性菌の間に記述された力学の潜在的環境を提供している。従って、抗生物質耐性菌に対する駆虫薬の幅広い効果は無視できないものであり、今後さらに研究を進める必要がある。

我々の研究にはいくつかの限界がある。第一に、細菌におけるIVとMXの作用機序とそれに対応する適応機構を分子レベルで明らかにしたわけではない。今後の研究では、ゲノム解析とトランスクリプトーム解析を行い、このギャップを埋めることを目指す。さらに、我々の実験では長期的な適応については検証していない。したがって、記述された適応は一過性のものである可能性がある。この欠点も今後の実験で解決されるべきである。

すなわち、i）IVとMXに暴露されると、表現型の適応が起こること、ii）適応のメカニズムは多様で、薬剤特異的なものと広域的なものの両方が含まれること、iii）IV/MXに適応すると、他の抗生物質に対する感受性の低下もさまざまな程度で起こること、である。IV/MXはいずれも、いくつかの感染症と闘う上で重要な化合物であることに変わりはない。しかしながら、IV/MXの台頭は、腸内細菌分離株が繰り返し駆虫薬に曝露されることにより、広範な交差耐性表現型が誘発され、重要な抗生物質治療が妨げられる可能性があるという深刻な懸念を引き起こす。

方法
分離細菌の由来
マクロライドまたはリンコサミドに耐性を持つ細菌20/59株をInfectious Diseases Institute（スイス、ベルン）から入手した。リンコサミドはマクロライドと作用機序が同じであるため、耐性機序はしばしば重複する[38]。したがって、マクロライド耐性またはリンコサミド耐性が、さらにIV/MXに対する感受性と関連しているかどうかを調べるために、これらの分離株を対象とした。リンコサミド耐性株は、Streptococcus属5株とActinomyces属3株であった。 Streptococcus属は、口腔微生物叢に頻繁に存在するグラム陽性常在菌であるが、特に小腸に多い[39]。しかし、ストレプトコッカス属にはマクロライド耐性のメカニズムがいくつか同定されており、その主なものは薬剤の流出、標的の変更、薬剤の不活性化などである [40-42]。さらに、最近の研究では、特にStreptococcus salivariusがALB-IV併用療法の失敗と関連していた[22]。一方、放線菌はアベルメクチン産生菌（Streptomyces avermitilis）の近縁種である。したがって、IVやMXのような誘導体とのユニークな共培養表現型を持っている可能性が高い。マクロライド耐性分離株はS. pneumoniae分離株（n＝12）のみであった。S. pneumoniaeは主に肺に存在するが、上部および下部消化管全体にもよく見られ、致死的な下気道感染症を引き起こす6大原因の1つである[34]。ラオスで実施された最近の研究（NCT03527732）から、臨床便検体から分離された27/59の細菌を対象とした。ラオスはIVとMXの両方を含む臨床試験の主要な実施地であり、蠕虫蔓延のホットスポットの真っただ中にあるため、対応する細菌分離株は広範な臨床背景を反映している可能性が高い。便検体からの細菌分離は、スイスのAllschwilにあるSwiss TPH（18/59株）、またはスイスのローザンヌにあるローザンヌ大学のJulian Garneau博士とAlison Gandelin博士によって行われた（9/59株）。濃縮された臨床分離株は、Blautia属、Clostridium属、Dorea属、Enterococcus属、Escherichia属、Streptococcus属であった。いくつかの常在菌はAMR遺伝子のリザーバーとして働き、ヒト体内におけるAMRの持続に寄与する可能性があるため、IV/MXとの相互作用を調べることは極めて重要である。そこで、分類学的範囲をさらに広げるために、市販の12/59株（Bacteroides、Blautia、Dorea、Lactobacillus、Staphylococcus、Streptococcus）を対象とした。市販の分離株はGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)から購入した。さらに、後述する手順で、駆虫薬にチャレンジした分離株を10株作製した。上記の理由により、我々はStreptococcus属を選択した。さらに、リンコサミド耐性株（S. mitis、S. dysgalactiae）、マクロライド耐性株（S. pneumoniae）、市販株（S. salivarius、S. parasanguinis）を加え、これらの異なる遺伝子型における駆虫薬チャレンジの表現型を明らかにした。挑戦的細菌分離株の概要を補足表4に示す。

臨床分離株の濃縮と同定
臨床便サンプルはラオスの最近の研究（NCT03527732）から入手した[40]。各サンプルについて、50～100mgの便を安全キャビネット（好気的条件）内で500μlのBHI＋5％酵母でホモジナイズした。遠心分離（1分、15000rcf）後、上清80μlを対応する濃縮培地10mlに加え（補足表2参照）、37℃の5％CO2インキュベーターで一晩静置した。以下の培地を使用した： Brain heart infusion broth (BHI; Thermo Fisher Scientific, CM1135), yeast extract (Thermo Fisher Scientific, LP0021B), inulin (Thermo Fisher Scientific, 457100250), dehydrated Todd-Hewitt broth (TH; Thermo Fisher Scientific, CM0189), modified gifu anaerobe medium (mGAM; HyServe, 05433), dehydrated Schaedler broth (Thermo Fisher Scientific, CM0497B) and Lennox broth (LB; Thermo Fisher Scientific, 12780052). 翌日、各培養液をBHI＋5％酵母で1：1000に希釈し、10μlをBHI＋5％酵母寒天培地（Thermo Fisher Scientific, CM1136）プレート上にストリークした。ストリークした寒天プレートは、37℃の5％CO2インキュベーターで一晩放置した。翌日、個々のコロニーを無作為に摘み取り、新鮮なBHI＋5％酵母に再接種した。この場合も、培養は37℃の5％CO2インキュベーターで一晩放置して増殖させた。最後に、各単離株の20％グリセロールストックを調製し、-80℃で保存した。分離された細菌を同定するため、5％ヒツジ血液（Thermo Fisher Scientific, PB5039A）を加えたコロンビア寒天培地プレートに、対応するグリセロールストックをストリークした。コロニーは37℃、5％CO2インキュベーター内で一晩放置して増殖させた。翌日、MALDI-TOF分析をInstitute of Medical Microbiology（チューリッヒ大学、スイス）で行い、分離株を同定した。簡単に説明すると、単一コロニーを滅菌爪楊枝を用いてMALDI-TOFスチールターゲットプレートにロードする。プレート上の各コロニーは1μlの25％ギ酸で処理され、続いて1μlのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮（CHAC）マトリックスで処理される。サンプル調製後、プレートをMicroflex MALDI-TOF装置にセットし、スペクトル測定（Bruker Daltonics）とその後の同定を行う[43]。

細菌分離株の培養
細菌のグリセロールストックは-80℃で保存した。分離株を培養するには、まずグリセロールストックを氷上で解凍した。その後、解凍したグリセロールストック10μlを10mlの培地で培養を開始し、37℃で培養した。すべての細菌分離株の培養には、BHI＋5％酵母のみを使用した。すべての分離株の培養期間は24時間～72時間であった。嫌気培養はビニール製嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products社、米国ミシガン州）を用い、N2 85％、CO2 10％、H2 5％の混合ガスで行った。植菌した分離株は、37℃の嫌気性インキュベーター内で培養した。好気性菌の接種は安全キャビネット（SKAN Berner, Elmshorn, Germany）内で行った。接種した好気性分離株は、5% CO2インキュベーター（Binder, Tuttlingen, Germany）内で37℃で培養した。培養後の細菌培養物を保存するため、100μlの培養物を精製水中の100μlの40%グリセロール溶液（Thermo Fisher Scientific, 17904）に添加した。得られた20％グリセロールストックは凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。

細菌による駆虫チャレンジ実験
S.salivarius（01）、S.parasanguinis（01）、S.pneumoniae（02）、S.mitis（01）およびS.dysgalactiae（01）の5つの細菌分離株を、最終濃度20μMまで濃度を増加させた駆虫薬（IV、MX）でチャレンジし、IVまたはMXにチャレンジした分離株S. salivarius (01-IVc)、S. salivarius (01-MXc)、S. parasanguinis (01-IVc)、S. parasanguinis (01-MXc)、S. pneumoniae (02-IVc)、S. pneumoniae (02-MXc)となった。pneumoniae（02-MXc）、S. mitis（01-IVc）、S. mitis（01-MXc）、S. dysgalactiae（01-IVc）およびS. dysgalactiae（01-MXc）であった（補足表4）。簡単に説明すると、各単離株はまず、5μMのIVまたはMXを添加した液体増殖培地（BHI＋5％酵母）で24時間培養した。24時間後、増殖した培養液100μlを2倍の駆虫薬濃度（すなわち10μM）を添加した新しい増殖培地に継代し、再び24時間培養した。このサイクルを、最終的に20μMの挑戦的濃度に達するまで繰り返し続けた（3サイクル）。分離株が増殖しなかった場合は、さらに24時間放置した（総培養時間＝48時間）。S. dysgalactiae（01）は20μMのMXで、acti_odo_02は20μMのIVで培養した。S. pneumoniae (02)とS. mitis (01)については、最終MX濃度10μMのみが到達可能であった（2サイクル）。すべての分離株と各サイクルの各ラウンドについて、20％グリセロールストックを調製した。グリセロールストックは、さらに使用するまで-80℃で保存した。分離株の同一性を確認し、長い培養期間によって混入した可能性のあるコンタミネーションを除外するために、最終的にチャレンジした分離株は、Flongleフローセル（FLO-FLG114）上のONT Native Barcoding Kit（SQK-NBD114.24）を使用して、ONT MinIONプラットフォーム上で16S rRNA遺伝子の配列決定を行った。得られた配列は、全長16Sデータベースを備えたEmu [44]を用いて同定した。

駆虫薬または抗生物質とのin vitroインキュベーションアッセイ
この研究を通して、細菌分離株は様々な駆虫薬（IV, MX）または抗生物質、すなわちエリスロマイシン（EM; Lubio, ORB322468）、クラリスロマイシン（CH; Lubio, HY-17508）、アジスロマイシン（AZ； ルビオ、ORB322360）、クリンダマイシン（CL；ルビオ、HY-B0408A）、テトラサイクリン（TC；ルビオ、HY-B0474）、シプロフロキサシン（CX；ルビオ、HY-B0356A）、メロペネム（MP；ルビオ、A5124）およびイミペネム（IP；ルビオ、ORB1308410）。インキュベーションは、Hidex Senseプレートリーダー（Hidex Oy, Turku, Finland）を用いた光学密度測定（λ = 600nm、OD600）を容易にするため、96ウェルプレートフォーマットで行った。OD600は37℃で16～72時間、30～60分ごとに測定した。薬物溶液は以下のように調製した： まず、対応する薬物量をOhaus Adventurer AX124分析スケール（Ohaus, Nänikon, Switzerland）で±0.1mg秤量し、規定量の溶媒に溶解して5000μMの作業溶液（WS）を調製した。CL、CX、TC、IPの溶解には、UltraPure™ DNase/RNaseフリーの蒸留水（Thermo Fisher Scientific、10977-035）を用いた。IV、MX、EM、CH、AZおよびMPの溶解にはジメチルスルホキシド（DMSO；Sigma-Aldrich、41640）を用いた。2500μMと500μMのWSは、5000μMのWSを希釈して得た。作業溶液は毎週新しく調製し、凍結融解の回数を制限しながら-20℃で保存した。WSは中間段階であり、BHI+5%イーストで希釈し、目的の最終濃度（12.5μM、6.25μM、1.25μM）の1.25倍にする必要があった。培養の前に、細菌単離株を前述のように培養した。チャレンジド単離株の場合、IVまたはMXのいずれか20μM、S. pneumoniae（02-MXc）およびS. mitis（01-MXc）の場合は10μMを添加し、以前の培養環境を再現した。増殖した細菌培養物をBHI+5%酵母で1:200に希釈した後、対応する1.25倍の薬剤溶液と合わせた。チャレンジド単離株の培養の場合、希釈は1:20'000であった。したがって、最終的な薬剤濃度は1倍となり、DMSO濃度は0.2％で一定となった。各培養中、分離株ごとに2つのコントロールを加えた： 高濃度で細菌の増殖を阻害することが知られているDMSO [45]に溶解する必要がある薬剤もあるため、DMSOコントロール（0.2% DMSO中の分離株）を各プレートに加えた。もう1つのコントロールは陽性コントロール（PC）で、これは分離株を増殖培地のみに添加したことを意味する。28/59株は酸素を許容しないか（厳密な嫌気性菌）、嫌気性条件下で濃縮されたため、嫌気性条件下で培養した。同様に、29/59株を好気性条件下で培養した。残りの2/59株（S. salivarius、S. parasanguinis）については、両条件で培養し、得られる表現型が異なるかどうかを調べた。

細菌DNA抽出
液体培養物から細菌DNAを抽出するために、DNeasy PowerSoil Pro kit（QIAGEN, 47016）を使用し、100μlの細菌培養物を用いて、キットに含まれるメーカーの標準プロトコールに従った。最終DNA濃度は、1x dsDNA HS Assay kit（Thermo Fisher Scientific, Q33231）を用いて、QuBitTM 4蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific, Q33238）を用いて測定した。溶出液はさらに使用するまで-20℃で保存した。

細菌16S rRNA配列決定のためのライブラリー調製
細菌16S rRNAシーケンシングは、MinION Mk1Cプラットフォーム（Oxford Nanopore Technologies, United Kingdom of Great Britain）で行った。すべてのサンプルは、1-24 16S barcoding kit（Oxford Nanopore Technologies、SQK-16S024）に付属する製造元の説明書に従って処理した。簡単に説明すると、QuBitTM 4蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific, Q33238）と1x dsDNA HS Assay kit（Thermo Fisher Scientific, Q33231）を用いて全サンプルのDNA濃度を測定した。サンプルはUltraPure™ DNase/RNaseフリーの蒸留水（Thermo Fisher Scientific、10977-035）を用いて希釈し、最終インプットが25ng DNAとなるようにした。次に、サンプルをバーコード化し、CFX Opus 384 Real-Time PCR system (Biorad, Cressier, Switzerland)で増幅した。その後、DynaMagTM-2マグネットチューブスタンド（Thermo Fisher Scientific, 12321D）およびHulaMixerTM（Thermo Fisher Scientific, 15920D）と組み合わせたAMPure XP試薬（Beckman Coulter, A63881）を用いて、バーコード付きアンプリコンを多段階でクリーンアップした。最後に、シーケンスライブラリーをプールし、フロングルフローセル（Oxford Nanopore Technologies, FLG-001）を用いてシーケンスを行った。シーケンシングは約24時間行った。

アガロースゲル電気泳動
1-24 16S barcoding kitプロトコルの増幅ステップの後、ゲル電気泳動を行い、16S rRNA遺伝子の増幅の成功を可視化した。分析グレードのアガロースパウダー（Promega, V3121）を用いて、1x Tris-acetate-EDTA（Thermo Fisher Scientific, B49）中の1%アガロース溶液を調製した。GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific, SM1331）とサンプルを6x DNA Loading Dye（Thermo Fisher Scientific, R0611）と5：1の割合（サンプル：色素）で合わせた。ゲル電気泳動は1xTAE中、100Vで25分間行った。最終染色のため、ゲルをGelRed®核酸ゲル染色液（Biotium, 41003）に20分間浸した。UV イメージングは、Lourmat Quantum ST5 Imager（Vilber, Collégien, France）を用いて行った。画像はVisionCaptソフトウェア（v15.0）を用い、2～3秒の露光時間で撮影した。

データ解析
細菌増殖曲線と曲線下面積（AUC）比のデータをMicrosoft Excel 2016で作成し、OriginPro 2022b (OriginLab Corporation, Northhampton MA, United States)を使ってプロットした。AUC比を計算するために、R4.1.3を搭載したRStudioでRパッケージgrowthcurver [42] (v0.3.1)を使用した。AUC比計算に使用したオリジナルの成長曲線はすべて補足資料にある。

統計
IV/MX培養における用量依存性を検定するため、IV/MX感受性分離株のAUC比値に対して、R4.1.3を搭載したRStudioで、一対Wilcoxon順位和正確検定（2つの濃度のAUC比対を検定；p値調整法＝BH）およびクラスカル・ワリス検定（3つの濃度にわたる対応するAUC比を検定；自由度＝2）を適用した（表1-2）。それぞれの培養濃度について、抗菌薬の効力が抗生物質に匹敵するかどうかを検定するために、11の細菌分離株のデータを用いてクルスカル・ワリス検定（自由度＝1）を利用した（図2、補足図1-2）。駆虫薬と抗生物質化合物の一対比較のP値（補足表5-7）は、ウィルコクソン順位和正確検定（p値調整法＝BH）により求めた。IV/MXまたはマクロライド/リンコサミド系抗生物質存在下における11の細菌分離株のAUC比のピアソン相関行列およびp値は、Microsoft Excel 2016で計算した。

インライン表示
表1.
静脈内培養における用量依存性：
インキュベーション濃度1µM、5µM、10µM（IV = イベルメクチン）のIV感受性細菌分離株のAUC比について実施したペアワイズWicoxon順位和検定（W）およびクラスカル・ワリス（KW）検定のP値。

インライン表示
表2.
MXインキュベーションにおける用量依存性：
インキュベーション濃度1µM、5µM、10µM（MX = モキシデクチン）のMX感受性細菌分離株のAUC比について実施したペアワイズWicoxon順位和検定（W）およびクラスカル・ワリス（KW）検定のP値。

データの入手
本研究で得られたシーケンスデータ（16S rRNA遺伝子シーケンス）は、NCBI Short Read ArchiveにアクセッションPRJNA1053597で寄託されている。

著者貢献
J.D.：研究デザイン、研究計画、プロジェクト監督、実験作業、統計解析、図表作成、論文執筆、論文編集。J.K.：試験デザイン、研究デザイン、プロジェクト監督、資金獲得、論文編集。S.S.：研究計画、研究デザイン、プロジェクト監督、現地実施。J.G.およびA.G.：実験作業（臨床分離株の濃縮）、論文編集。C.C.、P.M.K.、P.V.：論文編集。P.H.H.S.：試験デザイン、研究デザイン、プロジェクト監督、論文編集。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

謝辞
臨床試験NCT03527732を円滑に進めてくれたラオスTPHIチーム、地元当局、実地調査チーム、試験参加者に感謝する。MALDI-TOF-MSによる便から分離された18の細菌コロニーの同定を快諾してくれたDiana Albertos Torres（スイス、チューリッヒ大学、医療微生物学研究所）に感謝する。European Research Council (No. 101019223)の資金援助に感謝する。

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• bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv (submit.medrxiv.org)が開設されたことに伴い、Clinical Trials および Epidemiology のサブジェクトカテゴリーは新規投稿を締め切りました。臨床試験の結果を報告する新規論文は、medRxivへの投稿が必須となりました。ほとんどの疫学論文もmedRxivに投稿されるべきですが、もし論文に健康に関する情報が含まれていない場合、著者は他のbioRxivの主題カテゴリー（例えば、遺伝学や微生物学）に投稿することもできます。

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