ヒト毛包ダニ： 共生生物となる外部寄生生物
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ヒト毛包ダニ： 共生生物となる外部寄生生物
https://academic.oup.com/mbe/article/39/6/msac125/6604544?login=false
Gilbert Smith, Alejandro Manzano-Marín, Mariana Reyes-Prieto, Cátia Sofia Ribeiro Antunes, Victoria Ashworth, Obed Nanjul Goselle, Abdulhalem Abdulsamad A Jan, Andrés Moya, Amparo Latorre, M Alejandra Perotti ... もっと見る著者ノート
分子生物学と進化, 39巻, 6号, 2022年6月, msac125, https://doi.org/10.1093/molbev/msac125
発行：2022年6月21日
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概要
ほとんどのヒトは、皮膚の毛包に一生ダニを飼っている。毛包性ダニはヒトに寄生し続ける唯一の後生動物である。我々は、毛包虫（Demodex folliculorum）が宿主を傷つける義務的寄生生物から義務的共生生物への過渡期にあたることを提唱する。ここでは、この移行期がダニのゲノムと生理に与えた重大な影響について述べる。ゲノム配列の解析から、D. folliculorumの宿主との恒常的な共生が、弛緩的な選択と遺伝的ドリフトによってゲノムを広範囲に縮小させ、その結果、汎節足動物の中でこれまで確認されている中で最も少ない数のタンパク質をコードする遺伝子を持つに至ったことが明らかになった。共焦点顕微鏡観察により、この遺伝子の減少は細胞数の極端な減少と一致していることが明らかになった。各歩脚を形成する3つの節を動かすには、1個の無核の筋肉細胞で十分である。寄生虫の細胞数の減少は発生初期に始まると考えられてきたが、我々は成虫末期よりも最終発生段階（ニンフ）の方が細胞総数が多いことを確認し、成虫あるいは究極の発生段階から減少が始まることを示唆した。これは、節足動物種が還元的、寄生的、あるいは内共生的なライフスタイルを採用する最初の進化的ステップである。体細胞核は二倍体の段階で複製不足を示す。新しい眼球構造や光受容体、そしてヒト特有の宿主メラトニンによる昼夜リズムが初めて提唱された。DNA修復遺伝子の喪失と極端な内縁関係により、このダニ種は進化の行き詰まりを迎えたのかもしれない。
Hox遺伝子、絶滅、ヒトマイクロバイオーム、ゲノム侵食、光受容体、概日リズム
問題のセクション 発見
副編集長 アマンダ・ララクエンテ
はじめに
有袋類からアルマジロ、コウモリ、ブタ、イヌ、げっ歯類、霊長類などの有胎盤類まで、多種多様な動物から100種以上の毛包性ダニが形態学的に報告されている。しかし、家畜、特にイヌやネコでは、ほとんどの健康なイヌにも存在するにもかかわらず、疥癬は死に至ることがある（Ravera et al.） ヒトは2種の毛包性ダニを保有している可能性がある： Demodex folliculorumは毛包の内底部に集団で生息し、Demodex brevisは皮膚の皮脂腺に単独で生息する。ダニは鼻翼、額、外耳道、乳首に最も多く生息している。ヒトにおけるその有病率はおそらく90％以上であり、ダニの数が多く、したがって発見が容易であることは、宿主の年齢が高く、宿主の毛穴が大きいことと関連している。しかし、ヒトにおけるダニの密度は、20～30歳の間の皮脂分泌によってピークに達する（Foleyら、2021年）。ほとんどのヒトにおいて、D. folliculorum（以下Demodex）は全く無害であるが、一部の人ではこのダニに関連した臨床疾患が現れることがある（Thoemmesら 2014; Pormannら 2021）。デモデクスの存在下で特定の人に病態が現れる理由は、現在ある症例で解明されている。慢性デモデキシー症は、デモデックスに対するヒトの免疫応答における機能獲得型突然変異と関連づけることができる（Martinot et al.）
我々の仮説では、ヒトを宿主とするデモデックスは現在、寄生虫から義務的外部共生生物あるいは義務的従属栄養生物へと進化している。この研究の目的は、義務性外部共生生物あるいは義務性従属栄養生物になるためのデモデックスの進化の初期に遺伝子欠損が起こったことを示すことである。これには前例があり、例えばヒトの真菌であるニューモシスチス・ジロベシイは、遺伝子欠損によって義務的従属栄養生物となった（Cisse et al.） 新しい生活史への適応という仮説は、デモデックスの感染力と感染力、分子と細胞の複雑性の減少、ヒトの皮膚に生息するための形態学的・生理学的変化に反映されている。
結果と考察
デモデックスは主に母性遺伝する
寄生虫は主に水平感染すると考えられている。デモデックスのミトコンドリアDNA断片の塩基配列を決定した後、ダニの遺伝について調査した。デモデックスは主に母親から子孫に伝播する（補足図S1、Supplementary Material online）。夫婦や家族におけるデモデックスの伝播を解析したところ（補足図S1、オンライン版補足資料）、子供と孫はメスの系統にのみクラスターを形成していたのに対し、同居しているメスとオスは乖離した系統を形成していた。授乳中は乳首の温度と水分レベルが上昇するため、母から子へのダニの移行が促進され、両極性感染を彷彿とさせる。ヒトの外陰部や陰茎からも少数のデモデックスが検出されているが、感染におけるその役割はまだ解明されていない。帝王切開による出産と哺乳瓶による排他的哺育はおそらく感染を防ぎ、その結果、ダニをまったく持たないか、あるいは最小限のダニしか持たない子供が生まれる可能性がある。湿潤哺育や交差哺育は、遺伝した血統を破壊する可能性が高い。今回の結果は、血縁関係のない人々の間でデモデックスが水平伝播する可能性を否定するものではないが、現在のところ伝播は主に垂直伝播であることを示している。ヒトにおけるこの垂直伝播により、ダニが自由に伝染する必要はなくなった。デモデックスの系統の隔離は、地理的な地域を越えてより大規模に見られ、ヒトの宿主が別の場所に移っても持続する（Palopoli et al.） デモデックスの卵から成虫までのライフサイクルはおよそ2週間で、成虫はさらに1～2週間生きると想定されている。デモデックスの平均ライフサイクルを3週間と仮定し、ヒトの平均世代数を22～33年とすると、垂直伝播までに382～574世代のダニが存在することになる。ヒトの平均寿命が72.6歳であることを考えると、ダニが宿主とともに死ぬまでに1,262世代を経ることになる。この世代数から、その後のヒトの世代間でデモデックスの遺伝的変異がどの程度予想されるか、また、デモデックスがどれくらいの頻度で感染のボトルネックに曝されるかを大まかに知ることができる。
授乳中に乳首を介して感染するのはデモデクス・ダニだけではない。寄生動物では、少なくとも4種の真虫、数種の条虫、および回虫、鉤虫、糸状虫、肺虫を含む約20種の線虫が、脊椎動物を宿主として母乳を介して垂直感染するように進化してきた（Lyons 1994; Shoop 1994; Chermette 2004; Foster et al. 2009; Boehm et al. 2015; Bezerra-Santos et al.） 同様に、ほとんどの羽毛シラミは両生類のシラミと同様に垂直感染する（Brooke 2010; Leonardi et al.） 羽ダニについても同様である（Donaら 2017, 2018, 2019; Matthewsら 2018; Mironovら 2020）。アザラシやアシカのような両生類を宿主とするデモデックス種は、水平伝播の能力も失っている可能性がある。
外部寄生性の羽毛シラミの垂直伝播は、白亜紀から古第三紀の大量絶滅イベントの後に始まった可能性が高く、垂直伝播のみが寄生虫の安定した進化の軌跡であることを示している（de Moya et al.） しかし、ヒトを宿主とするデモデックスの垂直感染は安定した軌跡ではないかもしれない。ヒトの母系でデモデックスが隔離されたことにより、D. folliculorumのゲノムは退化し、進化の過程で種の存続が疑問視されるようになった可能性がある。
毛包虫のゲノム
Demodexの核およびミトコンドリアゲノムとトランスクリプトームの配列決定、アセンブル、解析が行われた。核ゲノムのアセンブリー長は51.5 Mbp。241のスキャフォールドに分割され、スキャフォールドN50は488kb、スキャフォールドL50は31である。GC含量は31.3%で、ゲノムは9,707個のタンパク質をコードしていた（補足表SI 3および4、オンライン補足資料）。節足動物に基づくゲノムの完全性の推定 [Bencmarking Universal Single Copy Orthologs (BUSCO)]により、デモデクスゲノムは包括的（97.4%完全）であり、985個の完全なシングルコピー遺伝子、18個の完全な重複遺伝子、15個の断片化遺伝子、48個の欠損遺伝子を持つことが示され（補足図SI 1、オンライン補足資料）、ゲノム解析が強化された。9,707個のタンパク質のうち、8,131個をオルソグループに割り当てることができた。46遺伝子を表す6つのオルソグループのみがデモデックスに特異的であった。大まかな推定では、偽遺伝子の数は100をわずかに上回り、コーディング遺伝子の約1.1%に相当した。平均イントロン長は514 bp（中央値79 bp）、遺伝子あたりの平均イントロン数は2.83、平均エクソン長は382 bp（中央値180 bp）、コーディング配列間の平均距離は2,429 bp（中央値1,293 bp）であった。比較はオンライン補足資料の補足表SI 6を参照。ゲノムには164のリピートファミリーが存在し、ゲノムの7.2%を占めた（補足表SI 5、オンライン補足資料）。
ゲノムアセンブリの質を最大限に高めるためには、配列決定に使用したデモデックスは単一の宿主、単一の系統のダニに由来することが不可欠である。一塩基変異、インデルのような集団間のゲノムの違いや、コピー数変異（遺伝子量効果）、より大きな欠失や挿入、重複、逆転、染色体内転座、染色体間転座のような再配列を含む構造変異についての情報は得られない。これらの構造的変異は、ヒトの場合、一塩基変異やインデルに比べて遺伝子発現に最大53倍もの影響を及ぼす（Chiang et al.） 現在では、ヒトゲノムはそれぞれ20,000以上の構造変異によって異なっていると推定されている（Ho et al.） これをデモデックスに当てはめると、337以上の構造変異があることになる。DNA配列決定に用いたダニが約250頭であることを考えると、約85,000個の構造変異があれば、今回のようなゲノムアセンブリは不可能である。ゲノムサイズが51.5 Mbpしかないことを考えると、予想される構造変異の数は、広範な近親交配とコピー数変異の減少により、もっと少なくなるはずである（補足図SI 1、補足資料オンライン（BUSCO評価）も参照）。
我々の研究では、緩やかな選択と遺伝的ドリフトが、デモデックスのゲノムを非常に小さくしたと主張している。1つのゲノムを基に解析することで、特定の環境や地理的地域における方向性のある選択と適応の最近の影響を、遺伝的ドリフトとして誤って解釈する可能性がある（Coop et al.）
ヒトゲノムの場合、味覚や嗅覚に関連するレセプター遺伝子のコピー数が大規模に増加したのは、負の淘汰からの緩和とそれに伴う中立進化によるものだと推測されている（Nguyen et al.） デモデックスの場合は逆である。
より多くのデモデクス系統のゲノムを解読することで、一方では性的隔離（Zhang et al.
デモデックスのミトコンドリアゲノムは長さ14,164bp、GC含有率30.0％で、13のタンパク質、2つのrRNA、22のtRNAをコードしている（Palopoli et al.） ヌクレオチド組成［A 6,209（43.8％）、C 3,072（21.7％）、G 1,178（8.3％）、T 3,705（26.2％）］はシャルガフのパリティ法則に従っていない（Fariselli et al.） 我々は、後処理された3つの一次ポリシストロン転写産物を同定した。これはアカリ属におけるシストロンの最初の報告である（補足図S3、オンライン補足資料）。3つのポリシストロンが存在することは、節足動物にとって祖先的な状態である可能性が高い（Francoso et al.）
デモデックスは節足動物で同定されたタンパク質コード遺伝子の数が最も少ない。
自由生物種のゲノムレパートリーの進化には、（部分的な）ゲノム重複によるゲノムの拡大が起こり、急速に複雑化するサイクルと、効率的な資源利用（合理化）のための自然淘汰や、環境や人口動態の変化に起因するランダムな遺伝的ドリフトによってゲノムの縮小が起こるサイクルが長く続くと予想される（Wolf and Koonin 2013; Fernandez and Gabaldon 2020; Guijarro-Clarke et al.） 水平感染するミクロスポルディア寄生虫のゲノムは、非適応的な過程を経た同一宿主における水平感染と垂直感染が混在する寄生虫種のゲノムよりも小さい（Haag et al.）
伝播様式が水平伝播から垂直伝播に変わると、有効な個体群サイズが減少し、自由生活動物における効果的な選択が減少する可能性がある（Yongzhen et al.） より効果的でない選択は、トランスポーザブルエレメントとゲノムサイズの増加を引き起こし（Lefebureら2017; Chenら2020; de Albuquerqueら2020）、寄生虫と共生生物の会合が非常に密接になるまで、トランスポーザブルエレメントは再び消失し、ゲノムサイズと遺伝子数は最大の減少を示す。
デモデックスは、これまでに同定された中で最も少ないコーディング遺伝子数（9,707個）、汎節足動物の中で2番目に小さいゲノム（51.6 Mbp）を示した（補足表SI 3、オンライン補足資料）。32.5Mbpという最小の汎節足動物ゲノムは、植物寄生生物であるトマトカブリダニAculops lycopersici（Greenhalgh et al. デモデクスとアキュロプスは、汎節足動物以外のほとんどの無脊椎動物群の中で、配列決定されたゲノムが最も小さい。例えば、Porifera, Amphimedon queenslandica, 166.7 Mbp; Placozoa, Trichoplax sp. H2, 94.9 Mbp; Ctenophora, Mnemiopsis leidyi, sea walnut, 155.9 Mbp; Xenacoelomorpha, Hofstenia miamia, three-banded panther worm, 949.9 Mbp）。唯一の例外を除いて、Demodexより小さいゲノムはすべて高度に寄生性の種に属し、中でも最も小さいのは直腸性環形動物でヒラムシに寄生するIntoshia variabili（15.3Mbp）、リボンワームに寄生するIntoshia linei（41.6Mbp）、そして粘菌類で魚類に寄生するKudoa iwatai（31.2Mbp）である。例外は線虫に見られ（例えば、Rhabditophanes sp. KR3021はコンティグベースのゲノムアセンブリが47.3 Mbpの自由生活線虫である）、他の多くの寄生線虫は配列決定されたゲノムが小さく、中でもバナナ根線虫Pratylenchus coffeaeのゲノムは最小である（38.2 Mbp）。
ほとんどの動物系統で寄生がゲノムサイズを小さくすることが示されているが、宿主と寄生虫の相互作用の強さと依存性が決定的である。この状況はアカアシ類において顕著である。アカリ属の種は、アシナガバチ目（Acariformes）と寄生虫目（Parasitiformes）に分けられる。寄生虫目では、すべてのマダニ（Ixodida）が吸血寄生虫であり、すべてのアカリの中で最大のゲノムを示す。マダニは寄生する一方で、しばしば複数の宿主種を示し、宿主から離れてかなりの時間を過ごす。しかし、デモデックスはもはや宿主から離れない。ダニのゲノムサイズの中でも、イエダニのそれは際立っている。これらの種のゲノムサイズが小さいのはボトルネックの結果であると提唱されており、それは鳥類に寄生する系統に由来すると報告されているためで、寄生生活から自由生活への稀な移行を表している（Klimov and OConnor 2013; Xu et al.）
デモデックスのゲノムは侵食されつつある
動物寄生虫におけるゲノムサイズの縮小は、遺伝子の消失、反復エレメントの消滅、遺伝子間領域とイントロンの長さの減少によって引き起こされる（補足表S1とSI 6、オンライン補足資料）（Slyusarev et al.） 最後の予測はA. lycopersiciには当てはまらない。A. lycopersiciは同定されたゲノムの中では最も小さいが、イントロンの長さの中央値はDemodexやSarcoptes scabieiの2倍以上である。A.lycopersiciは、草食から植物寄生への移行期を迎えていると考えられる（Grbić et al.）
節足動物では、トランスポーザブル・エレメントの負荷はゲノムサイズと相関している（Wu and Lu 2019）。われわれの解析では、アカリホソダニの縮小ゲノムは顕著な反復要素の少なさを示し、節足動物の中で最も少ない数を示した。ゲノム中の繰り返しの割合と繰り返しの多様性（繰り返しファミリーの数）の両方が、他のクモ形類やより広いアウトグループに比べてアカダニ類では減少しており、繰り返しの総数は最小のD. folliculorumゲノムの7%からTetranychus urticaeゲノムの12%までである（補足表SI 5、オンライン補足資料）。例えば、Ixodes scapularisゲノムは最も多くのリピートファミリーを含んでおり、調査したダニ・ダニの中でリピートの割合が最も高い（41%）。これはT. urticaeに属する最大のAcariformeゲノムにも当てはまり、リピート含量は寄生虫のGalendromus occidentalisゲノムに匹敵する。興味深いことに、キイロショウジョウバエのゲノムは、同程度のゲノムサイズのクモ類よりも高い多様性とリピート密度を示している。アカリフォームゲノムが小さいほどリピート数が減少するのは、突然変異率の増加、遺伝的ドリフト、植物のような短鎖干渉RNAによるサイレンシングによって説明できるかもしれない（Li and Gu 2018）。Demodexはコード領域と非コード領域の両方で減少を示している。アノテーションされたコード配列間の平均距離は、他のクモ形類やショウジョウバエよりも、すべてのAcariformes種で短く、平均イントロン長も短い（補足表SI 5および6、オンライン補足資料）。
コドンの使い方の偏りは、ある配列に自然選択がどの程度作用したかを示すことができる。有効コドンの数（Nc）は、調査したアカシロコビネズミ科の4種で最も少ないことがわかった（補足図SI 4、オンライン補足資料）。バックグラウンド変異を補正した後では、この偏りは減少し、調査したすべての種で同様のレベルが観察された。コドン使用量をゲノム全体のGC含量と比較したところ、Ncは正の相関を示したが、補正後のNcは正の相関を示さなかった。したがって、ここで見られたコドン使用の偏りは、コドンの嗜好性（選択）によるものである可能性は低く、2位および／または3位にアデニンまたはチミンを含むコドンの頻度が高くなる突然変異の偏りによるものである可能性が高い。例外はDermatophagoides farinaeで観察され、バックグラウンドの突然変異の補正にかかわらず、遺伝子全体に強いコドンの偏りが見られた。
Demodexの進化における遺伝子ファミリーの大きさの変化を調べるために、15種のクモ形類とアウトグループにわたる遺伝子のオルソロジーを決定し、合計14,072のオルソグループを同定した（補足表SI 4、オンライン補足資料）。Demodexの割り当て率は84%で、どのオルソグループにも割り当てられなかった遺伝子は1,576個のみであった。ツリー全体にわたる遺伝子ファミリーの平均的な拡大は、デモデックス、S. scabiei（疥癬ダニ）、Varroa jacobonsi（ハチダニ）にA. lycopersiciを加えた3種においてのみマイナスであった（図1）。デモデックスは、A. lycopersiciを含む15種の中で、遺伝子数が最も少なく、プロテオームが最も小さいとともに、遺伝子ファミリーのサイズの平均減少という最も強いシグナルを示した。最大の遺伝子損失は、ライフサイクルを通じて単一の宿主と密接に関連している同じ3種で観察された。Demodexにつながる枝では、合計820の遺伝子ファミリーで遺伝子損失が見られ、損失が増加の4.3倍であった。また、28の遺伝子ファミリーで急激な縮小が見られたが、7つの遺伝子ファミリーでは顕著な拡大が見られた。Demodexでは、236の遺伝子ファミリーの機能が完全に失われた（オルソログなし）（図2、補足表SI 12、オンライン補足資料）。
図1.
クモ形類における遺伝子ファミリーのサイズ進化。数字は遺伝子ファミリーの拡大（+）と縮小（-；赤）、急速に進化したファミリーの数（濃い緑；P < 0.05）、種ごとの平均拡大（黒）を示す。枝は、正味の収縮（薄緑）と拡大（水色）を示すためにハイライトされている。別のIQtreeトポロジーも検討した（補足図SI 7、オンライン補足資料）。色は各用語でアノテーションされた遺伝子数を示す。
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クモ形類における遺伝子ファミリーのサイズ進化。数字は遺伝子ファミリーの拡大（＋）と縮小（-；赤）、急速に進化したファミリーの数（濃い緑；P < 0.05）、種ごとの平均拡大（黒）を示す。枝は、正味の収縮（薄緑）と拡大（水色）を示すためにハイライトされている。別のIQtreeトポロジーも検討した（補足図SI 7、オンライン補足資料）。色は各用語でアノテーションされた遺伝子数を示す。
図2.
Demodex (A)とAcariformes (B)で失われた遺伝子ファミリーの機能。遺伝子オントロジー（GO）用語は、Demodexでは濃縮された機能を持つと同定された遺伝子（FDR < 0.1）、およびAcariformesでは「DNA修復」とアノテーションされた遺伝子（濃縮検定では有意な用語は得られなかった）について、意味空間に存在する形で示されている。GO用語は冗長な用語を取り除くためにフィルターにかけられ、大まかな類似性によってグループ化された（破線、太字で命名）。DemodexとAcariformesについて、急速に進化する遺伝子ファミリーの機能（収縮と拡大）を補足図S2（オンライン補足資料）に示す。
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Demodex目（A）とAcariformes目（B）の失われた遺伝子ファミリーの機能。遺伝子オントロジー（GO）用語は、Demodexでは濃縮された機能を持つと同定された遺伝子（FDR < 0.1）、およびAcariformesでは「DNA修復」とアノテーションされた遺伝子（濃縮検定では有意な用語は得られなかった）について、意味空間に存在する形で示されている。GO用語は冗長な用語を取り除くためにフィルターにかけられ、大まかな類似性によってグループ化された（破線、太字で命名）。DemodexとAcariformesについて、急速に進化し、縮小・拡大している遺伝子ファミリーの機能を補足図S2（オンライン補足資料）に示す。
Acariformesの最終共通祖先（LCA）は、全体的に遺伝子が減少しているシグナルを示しており、現存する種が誕生する前の早い時期にゲノムの減少が起こった可能性を示唆している。我々の系統における最後の共通祖先は、アカシロコビ類の真のLCAを表していない可能性があることに注意すべきである。しかし、これらのデータから、ゲノムサイズの小さいアカシロコビ類の進化の初期には、遺伝子の大幅な消失が一般的であり、その後の遺伝子ファミリーのサイズの変化（消失であれ、増加であれ、ほとんど変化なしであれ）は、より種特異的な方法で後に起こったことが示唆される。例えば、ヒトを宿主とするD. folliculorumでは遺伝子の消失が続いたが、D. farinaeでは消失と増加がよりバランスよく起こった。
寄生虫目における遺伝子ファミリーのサイズ変化の評価でも、遺伝子消失のシグナルが見られ、その後、種特異的な変化が見られた。例えば、V. jacobsoniは全体的な遺伝子損失を示したが、捕食性ダニのG. occidentalisはよりバランスのとれた利益と損失を示した。クモとサソリの種は、その歴史を通して遺伝子ファミリーサイズの大きな増加を示したが、これはクモのゲノムサイズの進化に関する以前の知見を反映しており、祖先の全ゲノム重複イベントがこのグループにおけるゲノムサイズの増加を促進したことを示唆している（Schwager et al.） さらに、我々のデータは、遺伝子ファミリーの拡大が種特異的に継続したことを示唆しており、これらのグループにおける後の系統特異的タンデム重複の観察結果と一致している（Schwager et al.） 全体として、ライフサイクルを通じて単一の宿主と密接に関連する種（すなわち、D. folliculorum、S. scabeii、V. jacobsoni）で最大の遺伝子損失が観察された。
遺伝子ファミリーの進化解析では、著しい急速な進化変化を示すファミリーが同定された（P値 <0.05）。D. folliculorumでは、合計28の遺伝子ファミリーが急速な収縮を示した（補足図S2およびSI 6、オンライン補足資料）。遺伝子ファミリーのコンセンサス機能を用いた機能濃縮では、4つの有意なスリムGOタームが示された： 「生殖"、"ストレス応答"、"免疫系プロセス"、"脂質代謝プロセス "であった（FDR < 0.1、補足表SI 9、オンライン補足資料）。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)のオーソロジーアノテーションには、脂質代謝、生殖、免疫反応を含む様々な異なる生物学的背景において、細胞内の分子を消化する役割を果たすオルガネラであるリソソームに関連する6つの遺伝子が含まれていた。より具体的な（スリムでない）GO用語には、「多細胞生物の生殖」、代謝クラスの広範なカテゴリー、刺激に対する反応に関連するいくつかの用語が含まれた。生殖」とアノテーションされた遺伝子ファミリーには、カテプシンの3つのサブファミリー（B、L、K；それぞれK01363、K01365、K01371）、リパーゼ（リソソーム酸性リパーゼ、K01052を含む）、アセチルコリンエステラーゼ、プロテアーゼが含まれた。アセチルコリンエステラーゼはマダニの唾液中に存在し、コードする遺伝子ファミリーはマダニ種で拡大している（Kim, Tirloni, et al. 機能用語 "Reproduction "はいくつかのリソソーム遺伝子に関連しているようで、代謝や免疫に関わるリソソームの複雑性の低下と生殖プロセスとの関連を示唆している。興味深いことに、"Reproduction "でアノテーションされた遺伝子群のうち、著しく収縮していたのは、減数分裂停止雌1（MARF1）グループで、そのメンバーは減数分裂の制御と卵子内のトランスポーザブルエレメントの制御に重要な役割を果たしている。この遺伝子ファミリーの縮小は、デモデックスゲノムにおけるトランスポーザブルエレメントの出現の減少に関係しているのかもしれない。デモデックスで有意な拡大を示した遺伝子ファミリーは7つだけであり、したがって濃縮検定は行わなかった（補足表SI 2、オンライン補足資料）。
Acariformesの枝で急速に進化する遺伝子ファミリーを調べたところ、遺伝子の消失が見られ、49のファミリーが有意な縮小を、31のファミリーが有意な拡大を示した（補足図S2、補足表SI 10-13）。S2、補足表SI 10-13、オンライン補足資料）。エンリッチメントテストの結果、縮小は2つの有意なGOタームと関連していた： 「生殖」と「運動」である。より具体的なGO用語としては、"成体寿命の決定"、"変態"、"消化"、"精子貯蔵 "で機能するいくつかの発生遺伝子が含まれた。Acariformesで同定された契約発生遺伝子ファミリーには、ホメオボックス遺伝子のANTPクラス、標準的なHox遺伝子、ParaHox遺伝子、SuperHox遺伝子などを含む大きなクラスターが含まれていた（Ferrier 2016）。9と15の遺伝子ファミリーがそれぞれ "Reproduction "と "Locomotion "でアノテーションされ、そのうち6つは両方の用語でアノテーションされた。繁殖力と運動量は、代謝とフィットネスのトレードオフを介して相互に関連することが多く、これら6つの重複遺伝子は、脂質およびタンパク質代謝と発生に関連する特異的な機能を示した。急速な拡大は5つの重要な用語と関連していた： 「細胞分化"、"細胞発生過程"、"解剖学的構造発生"、"発生過程"、"脂質代謝過程"。具体的な用語としては、炭水化物、ステロイド、乳酸、脂肪酸、アミノ酸に関する代謝過程、酸化還元過程などが挙げられた。
減少したゲノムの機能喪失を調べるため、ヒトの卵胞ダニに特異的な喪失を同定するデモデックスと、より一般的なアシナガバチ類の両方で遺伝子ファミリーの喪失を調べた。合計236の遺伝子ファミリーが、Demodexではオルソログを示さなかったが、他のすべての評価されたAcariforme種では存在した。これらの遺伝子は、リボソームの生合成、翻訳項を介した遺伝子発現、細胞形態形成に関与するリボソームの構成要素を広く記述する19のGOスリムタームに富んでいた。より具体的な用語としては、転写や翻訳に関連する機能、特にRNAスプライシングやDNA/タンパク質修飾（メチル化やタンパク質のユビキチン化など）、DNA修復などが挙げられた。同定された発生学用語には、「発生成長」、「上皮細胞形態形成」、「幼生リンパ腺造血」などがあった。
Acariformesは、他のすべてのクモ形類と比較して、271の遺伝子ファミリーを失っていた。機能濃縮では、この遺伝子群に有意に過剰発現している機能は同定されなかった。しかし、DNA代謝関連用語はリストの中で最も有意な用語であった（P < 0.05）。したがって、これらのGO用語を持つ遺伝子は、染色体構成関連GO用語、DNA組換え、修復など、より具体的な機能を同定するために探索された。
ゲノム減少のメカニズムとしての緩和選択
弛緩選択は進化の革新を促すか、機能の喪失と系統の絶滅を予感させる（Wertheim et al.） アカシロコビトス進化の過程で、淘汰は激化するよりも緩和する頻度が高いことが観察された（図3）。有意なグループのRELAX K値は、467個のK値全体と比較して、弛緩した選択（K < 1）に偏っており、75％の遺伝子が遺伝子消失が起こった枝で弛緩した選択を示した（それぞれP値 <0.05、調整P値 <0.1で83と74）；補足図S4、補足表SI 14、オンライン補足資料。このことは、遺伝子ファミリーの拡大を経験した種と比較して、アカシロコビト類の進化の過程で選択が強化されるよりも緩和されることの方が多かったことを示唆している。
図3.
クモ類やサソリ類と比較した場合、クモ類では淘汰の緩和が淘汰の強化よりも一般的である。(A)アシナガバチ類における選択の緩和（K < 1；メイン）と選択の強化（K > 1；挿入）を示す遺伝子のω値（非同義／同義置換：dN/dS）の密度プロット。括弧内は遺伝子数。(B)アシナガバチ類における選択緩和下の遺伝子の機能。詳細は図2による。有意な選択検定（調整後P < 0.1、赤棒）および全検定（青棒、挿入図）におけるRELAXパラメータKの分布については、補足資料オンラインの補足図S4を参照。
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クモ類やサソリ類と比較すると、クモ類やサソリ類では、強化選択（純化選択）よりも緩和選択の方が一般的である。(A)クモ目、サソリ目における選択の緩和（K < 1;メイン）と選択の強化（K > 1;挿入）を示す遺伝子のω値（非同義置換／同義置換：dN/dS）の密度プロット。括弧内は遺伝子数。(B)アシナガバチ類における選択緩和下の遺伝子の機能。詳細は図2による。有意な選択検定（調整後P < 0.1、赤棒）および全検定（青棒、挿入図）におけるRELAXパラメータKの分布については、オンライン補足資料の補足図S4を参照。
緩やかな選択下にある遺伝子の生化学的・生理学的機能は、変化したり失われたりする可能性がある。74のrelaxed遺伝子の機能濃縮解析から、21の有意なGO用語が見つかった（補足表SI 15および16、オンライン補足資料）。これらには、mRNAのプロセシングやタンパク質の修飾、核酸、アミノ酸、カルボン酸を含む一次代謝に関連する機能が含まれていた。これらの遺伝子ファミリーのより特異的な機能としては、スプライソソームを介したalternative splicing、ユビキチン化やアセチル化などのタンパク質修飾、遺伝子発現や細胞周期の制御を含む制御用語があった。選択の有意な強まりを示した24の遺伝子（調整P値＜0.1、K＞1）は、どの機能項においても有意に濃縮されていなかった。
淘汰の緩和は遺伝子の消失に一役買う可能性があるので、淘汰が弱まったシグナルを示す遺伝子、急激な収縮を受けた遺伝子ファミリー、消失した遺伝子の機能は、ある程度の機能的重複を示すと予想される。各グループで有意に濃縮された遺伝子オントロジー用語は、代謝に関連する用語の広い重複を示したが、具体的な代謝のクラスは様々であった。収縮した遺伝子ファミリーの中では、脂質代謝がより顕著であり、失われた遺伝子と緩やかな選択下にある遺伝子では、関連する代謝用語は核酸とアミノ酸に関連するものが多かったが、緩やかな遺伝子では他の有機酸に関連する用語も示された。機能的重複は、失われた遺伝子と緩やかな選択下にある遺伝子の間でより大きく、両者の関連を示唆した。特に、両グループとも遺伝子発現に関連する用語に富んでおり、特にリボソームの生合成（失われた遺伝子10個、弛緩した遺伝子4個）、スプライソソームの構造（失われた遺伝子4個、弛緩した遺伝子11個）、タンパク質の修飾、mRNAのプロセシングが含まれた。このことから、relaxed selectionとゲノムの減少には、ゲノム発現に機能する分子機構（例えばリボソームタンパク質）の複雑さの減少と、転写と翻訳の間に導入される化学修飾の減少が関与している可能性が示唆される。細菌内共生体（例えば、セラチア共生体）でも、分子機構の喪失の類似パターンが明らかにされており、原核生物系と真核生物系における収斂進化を示している（Manzano-Marín and Latorre 2016）。この経路は、栄養的に制限された環境で高い成長率に基づいてゲノムのスリム化を受ける自由生物種で同定された経路とは別のものである（Lamichhaney et al.）
原核生物種では、純化選択がゲノムの縮小に寄与している（Williams and Wernegreen 2012; Albalat and Cañestro 2016; Valadez-Cano et al. 2017）。これは、宿主に利点を与える共生体や、器官形成において観察される（Uthanumallian et al.） 現在までのところ、真核生物の内部共生動物は確認されていない。寄生虫の共生では、（検出可能な範囲での）純化選択は宿主との相互作用に限定される。デモデックスや社会的に寄生するアリでは、ミュラーのラチェットを打ち消す組換えの効果は、近親交配のために著しく低下する（Schrader et al. 2021）。
ATの偏りと生活様式
AcariformesとDemodexはゲノムワイドなATバイアスのパターンを示した（補足図S5、オンライン補足資料）。デモデクスはゲノム全体のGC含量が31.3%であった。ゲノム全体のGC含量の進化に寄与する選択圧は数多く存在し、それは生命のドメインによって大きく異なる。ゲノム内のGC含量は、領域間、コード領域と非コード領域間、さらには遺伝子間でも変化しうる（Wang 2018; Browne et al.） 一般的に、アシナガバチ目の種は他のクモ類と比較して、GC3よりもGC2において、またゲノム全体においてより強いATの偏りを示しており、これらの種におけるATへの突然変異の偏りが選択によって修正されていないことを示唆している（補足図SI 5、オンライン補足資料）。
Klimov and OConnor (2013)による単一遺伝子（Srp54K）の検討から、ATバイアスはクモ形類で一般的であり、生活様式と相関していることが示唆され、宿主に関連する種ではこの遺伝子のATバイアスが増加している。さらに、ATバイアスと宿主との関連性の両方が、より広範なアカシロコビトス属種の樹上で、より派生的な形質であるように見えた。この解析は単一の遺伝子のみを対象としており、複数の選択圧がGC含量を形成しているが、これらの結果は、生活様式に依存した、アカアシ類全体のゲノムサイズと組成のダイナミックな変化を示唆している。
特に、ミスマッチ修復遺伝子の欠損は、共生細菌のゲノム（MutY、vsr、ndkなど）のGC含量に大きな影響を与えることが観察されている（Acosta et al.） 原核生物の世界と同様に、3つのミスマッチ修復遺伝子（MutY、SMUG1、TDG）は、それらと相互作用することが知られている遺伝子と同様に、他のクモ形類と比較してデモデックスでは失われているようである。MutYはアデニンDNAグリコシラーゼで、通常酸化的損傷から生じるアデニン変異の検出と除去を担う。このような変異が修復されずに放置されると、CGからATへの転座を引き起こす（Parker and Eshleman 2003）。SMUG1は、一本鎖および二本鎖DNAからウラシルを除去する一本鎖選択的一機能性ウラシル糖転移酵素である。TDGはG/Tミスマッチ特異的チミンDNAグリコシラーゼで、主にG/Tミスマッチを除去するが、C/TやT/Tミスペアからチミンを除去することもできる。これらのDNA修復遺伝子に加えて、BRCA1、ATM、XRCC1など、発がんに関連してSMUG1と相互作用して役割を果たすと考えられている遺伝子もいくつかある。デモデックスは、BARD1（BRCA1関連遺伝子）、ATM、XRCC3などの同様の遺伝子を失っている。
MutY、SMUG1、TDGの存在はクモ形類の種によって異なるが、S. scabieiもDemodexゲノムもこれらの遺伝子を保有していないようであり、T. urticaeとD. farinaeはそれぞれこれらの遺伝子を1つ（それぞれTDGとMutY）しか保有していない。このことは、多くの内部共生細菌と同様に、D. folliculorum（および他のアシナガバチ目）もゲノム全体でATに偏った突然変異パターンを示す可能性を示唆している。このような変異の偏りがデモデクスゲノムに存在するかどうかを調べるために、RNA配列決定データを用いて変異型のスペクトルを調べた。D. folliculorumで観察された最も一般的な変異型は、AまたはT変異につながるトランスバージョンであった（補足図SI 3および5、オンライン補足資料）。転座の頻度はほぼ均等で、CまたはG変異をもたらす転座の頻度は非常に低く、変異のわずか8％であった。これらのデータは、デモデックスにはAT変異の偏りがあること、そしてこの偏りはアデニン残基とチミン残基の除去を特異的に標的とするDNA修復遺伝子の消失によって引き起こされた可能性が高いことを強く示唆している。AT変異の偏りに寄与する第二のメカニズムは、シトシンが頻繁にメチル化され、その後チミンに置換されることである（Hershberg and Petrov 2010; Mathers et al.） デモデックスではDNAメチル化が失われたため、このメカニズムはATバイアスの増加に寄与しなくなったはずである。
Hox遺伝子の正統的順序からの逸脱
染色体上のHox遺伝子の正統的な順序と、体軸に沿ったそれらの空間的発現は、両側性動物のものから逸脱することはほとんど観察されていない。ヒメツメガエルOikopleura dioicaや捕食性ダニMetaseiulus occidentalisで観察されるように、Hox遺伝子が個々のゲノムセグメントで原子化されても、その発現順序は維持される（Seo et al.） 脊椎動物では、Hox遺伝子の順序の逸脱は知られていない。Demodexでは、Labia（Hox2）がproboscipedia（Hox1）の上流に移動しており、これはカイアシ類のParacyclopina nanaや線虫と共通する特徴である。ダニ目（Acariformes）と寄生虫目（Parasitiformes）のほとんどの系統のダニは、zerknülltとAbdominal-Aを失っており、Demodexは、体の分節に関与するNKX6.1とMEOX1を失った唯一のダニ目として知られている（Bayrakli et al. AbdAと並んでMEOX1が失われていることが、観察された体節形成の欠如を説明しているのかもしれない。T.urticae、M.occidentalis、I.scapularisはlabとpbの標準的な向きを示しているため、これら2つの遺伝子の制御転写の改変は観察されていない。Demodex Hox遺伝子の向きが逆であるため、pb（第2セグメントの同一性）＞lab（第1セグメントの同一性）となり、皮膚毛包への適応が可能になったのかもしれない。2つのHox遺伝子の位置の逆転（図4）は、形態ではなく、転写時間の変化を引き起こす。アカダニ類では、カンザシ節は昆虫の第1触角節と相同（labを発現）であり、ペデパルパルは第2触角節または間節と相同（pbを発現）であると考えられている（Telford and Thomas 1998）。毛包性ダニ類は、特に幼虫の段階で、より発達した（突出した）歩脚と組み合わさって、鋏角の極端な縮小を示す。触角は餌を見つけ、集めるために重要である。転写時間の逆転は、鋏角より口蓋の発達を早めることに有利であり、その結果、餌を見つけるのに必要な脆弱な発達段階の時間を短縮することができる。
図4.
Hox遺伝子の正準順序が崩れたのは、両側性動物ではごくわずかなケースにすぎない。デモデックス、パラサイクロピナ、線虫はpbをlabの上流に位置づける。FolsomiaとLingulaは中央のHox遺伝子が前方のHox遺伝子の前にあり、ウニは中央のHox遺伝子が最も後方にある。外形が途切れているのは遺伝子が失われていることを示し、空白は遺伝子の再配置を示唆する。ダニのAculops lycopersiciは重複のない正規の順序を示している。略号：lab: labia, Hox1l; pb: proboscipedia, Hox2; zen: zerknüllt or zerknüllt-2, Hox3; Dfd： 奇形、Hox4；Scr： 性櫛減少, Hox5; ftz: fushi tarazu, Hox6; Antp: Antennapedia; Ubx： Ultrabithorax；abdA：腹部-A；AbdB：腹部-B： Abdominal-B; Demodex： D. folliculorum (Acariformes); Tetranychus： T. urticae（ダニ目）；Galendromus： G. occidentalis（寄生虫目）；Neoseiulus： N. cucumeris（寄生虫目）；Ixodes： I. scapularis（寄生虫目）；Folsomia： F. candida（昆虫目）、Drosophila： D. melanogaster（昆虫綱）；Paracyclopina： ナナ（甲殻綱）；Caenorhabditis： C.elegans（線虫綱）；Lingula： L. anatina（腕足綱）。
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Hox遺伝子の正統的な順序が破られたのは、両側性の動物ではごくわずかなケースにすぎない。デモデックス、パラサイクロピナ、および線虫は、pbがlabの上流に位置する。FolsomiaとLingulaは中央のHox遺伝子が前方のHox遺伝子の前にあり、ウニは中央のHox遺伝子が最も後方にある。外形が途切れているのは遺伝子が失われていることを示し、空白は遺伝子の再配置を示唆する。ダニのAculops lycopersiciは重複のない正規の順序を示している。略号：lab: labia, Hox1l; pb: proboscipedia, Hox2; zen: zerknüllt or zerknüllt-2, Hox3; Dfd： 奇形、Hox4；Scr： 性櫛減少, Hox5; ftz: fushi tarazu, Hox6; Antp: Antennapedia; Ubx： Ultrabithorax；abdA：腹部-A；AbdB：腹部-B： Abdominal-B; Demodex： D. folliculorum (Acariformes); Tetranychus： T. urticae（ダニ目）；Galendromus： G. occidentalis（寄生虫目）；Neoseiulus： N. cucumeris（寄生虫目）；Ixodes： I. scapularis（寄生虫目）；Folsomia： F. candida（昆虫目）、Drosophila： D. melanogaster（昆虫綱）；Paracyclopina： ナナ（甲殻綱）；Caenorhabditis： C.elegans（線虫綱）；Lingula： L. anatina（腕足動物）。
Acariformes（TetranychusとDemodex）におけるabd-Aの欠如は、体の後部の形態学的修飾の根底にある。節足動物では、Abd-Bの制御の変化が腹部の進化に関与している（Akam et al.） 発生過程において、Abd-Aの発現が停止すると、Abd-Bの発現は前方（A/P軸）に伸長する。Abd-Bがノックダウンされると、その発現は前方へ移動する。したがって、Abd-Bは規則的に前方へのabd-Aの活性を阻害する（Aspiras et al. 2011）。Demodexでは、Abd-Bが正しい方向に存在し、同時にAbd-Aが存在しないことは、（成体では）生殖器の位置が非常に前方にシフトしていることと一致する（図5B）。DemodexのAbd-Bの存在下でのabd-Aの欠如は，Demodecidaeと寄生性Psorergatidaeのユニークな表現型である，前伸腹節上の陰茎の背側位置（前方）に関与している可能性がある（Ah et al.
デモデックスは節足動物の中で最も細胞数が少ない。
自由生活動物が内寄生虫になると、体内の細胞数が減少する（Neves et al. 2009; Isaeva and Rozhnov 2021）。ここでは、節足動物の中で最も数が多い昆虫の自由生活種とデモデックスを比較した。共焦点顕微鏡を用いて、デモデクスとD. melanogasterの核の数を数えた。デモデクスの細胞数はショウジョウバエのそれと比べて500倍以上減少している（図5、補足表SI 17、オンライン補足資料）。
図5.
(A) 共焦点顕微鏡による核の計数（±標準偏差、n = 4）に基づく細胞総数の推定値。(B）雄性デモデクスの背面図。中央の矢印は勃起した陰茎が前方を向いていることを示す。光学顕微鏡写真、バー100μm。(C）デモデックスの背面図、蛍光共焦点顕微鏡写真。核はDAPIで染色されている。矢印は脚4の3つの核を指す。脳の一部は脚4の周囲と下にある（図6AおよびB参照）。
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(A）共焦点顕微鏡による核の計数（±標準偏差、n = 4）に基づく細胞総数の推定値。(B）雄性デモデックスの背面図。中央の矢印は勃起した陰茎が前方を向いていることを示す。光学顕微鏡写真、バー100μm。(C）デモデックスの背面図、蛍光共焦点顕微鏡写真。核はDAPIで染色されている。矢印は脚4の3つの核を指す。脳の一部は脚4の周囲と下にある（図6AおよびB参照）。
節足動物では、成虫の段階であるイゴが常に最も多くの体細胞を示す。ショウジョウバエのようなホロメタボリックな昆虫では、未成熟細胞は蛹期に成熟細胞と入れ替わるが、デモデックスのような他の節足動物種では入れ替わらない。節足動物種が還元的寄生生活へ移行する最初の兆候として、デモデクスは成虫期よりも最後の発育段階（ニンフ）の方が細胞数が多い。進化的な細胞数の減少は、発生初期ではなく最終段階で始まる。細胞総数の極端な減少は、ジセミ類などの寄生動物で観察されているが、この進化経路の初期段階は今回初めて示された。
デモデクスは、真正ハエ（Diptera）からしか知られていない現象である（Supplementary Material onlineの補足図S6）。
デモデクスでは細胞の大きさは一様ではなく、短い脚の細胞は特に大きく、これは遺伝子の欠損と関連した表現型である。Demodexで失われた21の遺伝子は "Cell morphogenesis"（細胞形態形成）とアノテーションされており、Demodexの細胞形態と脚の発達の単純さに関連している。「上皮細胞の形態形成 "は、細胞の形や組織の形態形成に影響を与えるEnabledと関連し（Gates et al. 2009）、いくつかの遺伝子は神経学的な発生や行動の役割とアノテーションされていた（例えば、PPTはグルーミング行動や成体の運動における役割と関連していた）。アカムシの脚の節（ポドメア）の数が極端に減少するのは珍しく、デモデクスで初めて観察された（Mégnin 1877）。デモデクスの成虫とニンフの歩行脚は、3つの可動節と1つの固定節であるコクサ（上腕板）からなり、口吻は2つの可動節と減少したコクサからなる。他のアカアシ類の仲間では、成虫もニンフも脚は最大7つの鞘節を持ち、6つの異なる筋肉がそれぞれの鞘節を動かす（Evans 1992）。一方、デモデックスの脚の脚小節には、それぞれ大きな、単一の、無核の分節性筋細胞がある（図5C）。筋肉が単一細胞に縮小することは、昆虫でも観察されている（Klowden 2013）。3つの無核の筋肉細胞を動力源とする長さ15μmの小型化された脚は、ヒトの皮膚の上を平均時速12mmで歩くことができる（Norn 1970）。デモデキスの3細胞からなる脚は、分裂しなくなった体細胞の最大サイズの典型である。
デモデクスでは、脳を除くすべての組織が細胞数の減少を示す。その脳はアカアシ類で観察される中で最も単純だが、体全体の大きさに対して大きな体積を占めており、ハラーの法則、図6AおよびBのような小型化プロセスを示している（Beutel et al.）
図6.
(AおよびB）デモデックス。細胞数が極端に減少しているにもかかわらず、図5Bの脚の中に3つの核があるにもかかわらず、脳細胞の数が圧倒的に多い。バー：50µm。(C）盲中腸の末端で消化に関与するT細胞の2つの大きな核を丸で囲んだ。挿入図、大きなT細胞核とミトコンドリア細胞シグナルの拡大図。バー：50μm、挿入部5μm。(D）核のすぐ下にある盲後腸管の始まり。(E）核の下の細い後腸管。(F）肛門の後腸管開口部。バー：25µm。蛍光共焦点顕微鏡写真、DNAのDAPI染色。
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(AおよびB）デモデックス。細胞数が極端に減少しているにもかかわらず（図5B参照）、脳細胞の数は圧倒的に多い。バー：50µm。(C）盲中腸の末端で消化に関与するT細胞の2つの大きな核を丸で囲んだ。挿入図、大きなT細胞核とミトコンドリア細胞シグナルの拡大図。バー：50μm、挿入部5μm。(D）核のすぐ下にある盲後腸管の始まり。(E）核の下の細い後腸管。(F）肛門の後腸管開口部。バー：25µm。蛍光共焦点顕微鏡写真、DNAのDAPI染色。
原腸型ダニは不完全な腸（中腸と後腸がつながっていない）を持ち、デモデクス型ダニも同様に適切な中腸を持たない。消化は不釣り合いに大きく、40μmの無核細胞（II型）によって行われ、最大3μmのミトコンドリアを持つ（Desch 1989）（図6C）。後腸は指のような微小な管に縮小し、後端の約3分の1で外側に開いている（Deschら 1970）（図6D-F）。デモデクスには肛門がなく、デモデクスが死ぬと蓄積した老廃物が皮膚の毛穴に流出し、炎症を引き起こすという報告がいくつかあるが、これは正しくない（Laceyら 2011, 2016; Cossins 2016; Moranら 2017; Pormannら 2021）。
デモデックスの光受容と昼夜リズム
鋏角類は複眼を持たないが、眼球や眼斑を持つ種もいる。デモデクスは「上鉤棘」と呼ばれる一対の背前方感光器官を持つ（図7）。レンズはなく、位相差顕微鏡で光吸収を示し、酸性染料でしか染色できない（Desch and Nutting 1978）。Ixodidaと同様に、NeocarusとTetranychusのダニは微小胞子を形成する単純横紋を持たない（Evans 1992）。これらの欠如は、ホヤのオタマジャクシ幼生からのみ知られている毛様体基本（初期）光センサーとの類似性を示唆している（Lamb 2013）。デモデックスの "目 "は、色素を含む大きな細胞から突出した一握りの毛様体光受容体を含む（図7）。
図7.
デモデックスの眼とホヤの基本的な光受容体を比較した模式図。左図：ダニ標本の前端にある眼（棘上棘）の背側位置と、光受容器官の形態案。右図：ホヤの感光器官のシェーマ。Lamb（2013）から引用。
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デモデクス眼とホヤの基本的な光受容器を比較した模式図。左図：ダニ標本の前端にある眼（棘上棘）の背側位置と、光受容器官の提案された形態。右図：ホヤの感光器官のシェーマ、Lamb（2013）から引用。
光色素については、Demodex、D. farinae、S. scabieiのゲノムには特異的なロドプシンのオルソログ（Opn4とRRH）は見つからなかったが、調査した残りの12種ではこれらの色素が同定された。KEGG解析の結果、Demodex光伝達経路の他の遺伝子はすべて存在することが明らかになった。Opn4とRRHのオルソログを欠くこれら3種の動物では、ゲノム中に多数の他のGタンパク質共役型レセプターが存在する証拠が示され、横紋筋の昆虫光受容体Gqとは異なるが、脊椎動物のGt配列や他の両生類の光伝達経路と一致する、分岐したオプシン様遺伝子や経路の存在が示唆された（Lamb 2013）。デモデクスに存在する同様のオプシン様タンパク質が、光の検出に必要な伝達カスケードを開始する。
ヒトが眠っている間、デモデックスは活発に交尾相手を探し、繁殖する。これらのダニはほぼ完全な概日リズム経路を持っているが、TIM（Timeless）は存在しない。そのため、光による日内リセット（Blum et al. 2018）を駆動するCRYによる分解が妨げられ、デモデクスは昼間に眠る。偶然にも、デモデックスのゲノムには、メラトニン合成の律速酵素であるアリールアルキルアミンN-アセチルトランスフェラーゼ（AANAT）が欠如している。しかし、他の寄生虫で観察されているように、デモデックスは宿主のメラトニンを利用している可能性がある（Sack 2009）。興味深いことに、動物におけるメラトニンの3大レセプターであるMT1、MT2、MT3（哺乳類の命名法に従う）のうち、デモデックスはMT1に相同なタンパク質を提示し、MT2を失っているようだが、MT3はまだ合成している。メラトニンレセプターの存在を調べた他のアカムシのほとんどは、MT1に対して明確なヒットを示した。メラトニンはヒトのほとんどの組織で産生され、明け方には非常に高いレベルで存在するため、デモデックスは容易に検出することができる。メラトニンは無脊椎動物の移動と繁殖を誘導する。Demodexが宿主のメラトニンを利用することで、その夜間活動パターンとヒト宿主との完全な同調性が説明できる。
夜行性の習性と一致して、Demodexはヒスチジンの分解に必要な遺伝子など、紫外線防御のための遺伝子を欠いている（補足表SI 18、オンライン補足資料）。hutH遺伝子にコードされるヒスチジンアンモニアリアーゼは、ヒスチジンをウロカナートに変換する。ウロカナートは紫外線を吸収するため、動物によっては天然の日焼け止めとして機能する（Barresi et al.） ヒスタミンへの分解はT. urticaeとG. occidentalisでは可能であるが、Demodexでは不可能である。ヒスチジン分解に関与するヒスチジン代謝経路のもう1つの部分（L-ヒスチジンをL-グルタミン酸に連結する）は、調査したすべてのクモ形類および他のアシナガバチ目（Dong et al. 2018）に存在したが、デモデックスには存在せず、T. urticaeには部分的にしか存在しなかった（補足表SI 18、補足資料オンライン）。この経路のセクションには、その産物がL-ヒスチジンをN-ホルミミノ-L-グルタミン酸に変換する遺伝子hutH、hutU、hutI、およびその産物がL-グルタミン酸をN-ホルミミノ-L-グルタミン酸に変換するftcD（グルタミン酸ホルミノ基転移酵素）が含まれる。
デモデックスは進化の行き止まりにあるのか？
DNA修復遺伝子の欠損は、ゲノムの分解に重要な役割を果たしていると考えられる（Moya et al.） DNAメチル化酵素やミスマッチ修復遺伝子からエキソヌクレアーゼをコードする遺伝子（例えばEXD2）まで、デモデクスゲノムで失われた27の遺伝子が「DNA代謝過程」という用語でアノテーションされている。
デモデックスは緩和選択下にある。緩和選択は突然変異負荷の増加につながり、寿命を制限することが示されている（Cui et al.） この現象が個体の寿命を制限するのであれば、最終的には種の寿命も制限されるのだろうか？緩やかな選択下にあることに加え、デモデックスは多くのDNA修復遺伝子を失っている。ハンセニアスポラ酵母の系統では、DNA修復遺伝子の一部が失われると、進化の加速がはじまることが示された（Steenwyk et al.） 二本鎖DNA切断を修復するための正準非相同末端接合（cNHEJ）遺伝子の喪失は、ウロ索動物Oikopleura dioicaにおいて二本鎖切断を修復するための代替末端接合経路の進化をもたらした（Deng et al.） 自由生活動物における一部のDNA修復遺伝子の消失は、自由生活細菌で観察されたように生存可能なようだが、ゲノムの分解が進む細胞内共生細菌のほとんどは、他の細菌や真菌に置き換わることで絶滅する可能性が高い（Latorre and Manzano-Marín 2016; Boscaro et al. 2018; Chong and Moran 2018; Matsuura et al.） この運命から逃れるために、共生細菌は最大10系統に分裂し、互いに支え合うことができる（Campbell et al.） また、宿主が補完的な共生細菌を獲得することで、失敗した種を存続させることもできる。このような補償メカニズムは動物にはない。病原体としてではなく共生生物として宿主と密接に関わることは、必然的な絶滅への道であることが示されている（Santos-Garcia et al.） 絶滅へのゲノム経路のモデルは細菌において確立されている（Bohlin et al. 次の宿主世代への垂直伝播中にデモデックスが経験する強い集団ボトルネックとそれに伴うドリフトは、ミュラーのラチェット（Allen et al.） デモデックスが垂直感染を伴うヒトとの安定した非病理学的関係に入る時点までに、数学的・統計的帰結としての絶滅はすでに決定されているかもしれない（Bohlin et al.）
材料と方法
D. folliculorumの収集とDNA配列決定
Demodex folliculorumは、ブラックヘッドリムーバーを用いて1人の人間の額と鼻翼から繰り返し採取した。各コレクションには約40匹のダニが含まれていた。バウチャー標本はレディング大学（University of Reading）の生物科学部（School of Biological Sciences）のアカロロジー・コレクション（Acarology collection）にて、上級著者の1人の監督下で保管されている。ダニの採集はレディング大学生物科学部の研究倫理委員会の審査を受けた（承認番号：SBS 11 12 03）： SBS 11 12 03およびSBS 12 13 16。
D.folliculorumの標本は、高倍率の解剖顕微鏡下でさまざまな段階で個体識別され、必要に応じて形態型が分離された。もう1種のヒトスジシマカであるD. brevisは同じ宿主から同定されなかったが、250匹以上のダニ（同じ宿主から採取／抽出した異なるダニに相当）を分析・同定した結果、このことが確認された。D.folliculorumと同定された後、ダニを生理的食塩水中に浸しながら、1 µmのタングステンチップを用いて個体ごとに手作業で洗浄した。DNAはDNaeasy Blood and Tissue kit（Qiagen）を用いて抽出した。
D. folliculorumの数
454シーケンス ∼120
HiSeqシーケンス ∼50
MiSeqシーケンス（mRNA） 約80
ナノポアシーケンス（母体伝播解析） ∼300
共焦点顕微鏡 ∼300
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GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (Cytiva)を用いた6回の独立した全ゲノム増幅反応を行い、454シーケンス用とイルミナシーケンス用に再度混合した。
454 FLX+、FISABIOセンター（Generalitat Valenciana）で3プレート
HiSeq 2000 (2×100 bp) mate-pair sequencing (insert size 3 kbp) （韓国、Magrogen Inc.）
D. folliculorumの採取とRNA配列決定
サンプルは形態からオスとメスに分け、RNA抽出前に洗浄した（上記）。未熟期と卵を含む全個体からなる第3のサンプルは、1つの顔面孔内から採取した。cDNA合成はSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing（Clontech Laboratories）を用い、オリゴ(dT)プライミングで行った。ライブラリー調製はTruSeq DNA Nano kit（Illumina）を用い、350 bpインサートを用いて行った。
MiSeq v2、250 bpペアエンドリード、Edinburgh Genomics（英国）
ミトコンドリア
デモデックスの遺伝を追跡するためのサンプルを、Palopoliら（2015）の概念に従い、Zascavageら（2019）のAlternate Protocol 1を用いて調製、増幅、配列決定した。ATP 6、CoxIII、TRNG、およびND3の大部分をカバーする断片6、1，442bpを、D. folliculorumに適合させたプライマー、F6Df 5′-CAG AAC TCC AAA CTT ACT TGT A-3′、R6Df 5′-TTT CAT TCT ATA ACT ATA ATT A-3′（Ramosら、2009；Zascavageら、2019）を用いて増幅した。配列決定は、Oxford Nanopore Technologies社のMinION Mk1C装置でR9.4.1フローセルを用いて行った。配列はGeneious R10（Biomatters）でアライメントした。Abadiらの結論に従い、Generalized Time-Reversible plus Invariable sites plus Gamma distributionを進化モデルとして使用した（Abadi et al.） 系統復元はMrBayes（Ronquist et al. 2012）を用いて行った。
DNAおよびRNAのアセンブリー
454リードはPyroCleaner v1.3 (Jérôme et al. 2011)を用いて前処理した。100bpより短い配列、または1kbより長い配列で、ベースコール品質スコアが35以上でなく、"N "含量が4%以上のものは廃棄した。アセンブルのために、フィルターした454リードをgsAssembler v2.6 (Roche)を用いてデフォルトのオプションでアセンブルした。このアセンブリーから、ミトコンドリアゲノム配列をcox1遺伝子配列を用いて検出し、アセンブリーから抽出した。bowtie2（Langmead and Salzberg 2012）を用いて、リードをミトコンドリオンにマッピングし（配列の80%以上をマッピングしたリード）、リードファイルから分離した。これらのミトコンドリオンを含まないリードを、gsAssemblerを用いて再度アセンブルした。このアセンブルの結果、総スパンが52,889,837 bpの3,164コンティグが得られた。これらのコンティグをPhymmBL v4.0 (Brady and Salzberg 2011)を用いて、代表的な細菌と古細菌のデータベース(NCBI)、昆虫綱の代表種(Acyrthosiphon pisum, Tribolium castaneum, Atta cephalotes, Drosophila melanogaster)、アカリ属の代表種(Tetranychus urticae)、ホモサピエンスとサッカロミセス・セレビシエに分類した。0.75以上のスコアで節足動物以外の分類群に割り当てられた配列はすべてコンタミとして除去した。
Illumina HiSeq 2000のリードは、Cold Spring Harbor Laboratory PRINSEQ-lite v0.20.4 (Schmieder and Edwards 2011)のHannon labのFASTX-toolkit v0.0.14を組み合わせて前処理した。75bpより短い塩基配列、未定義のヌクレオチド（"N"）を含む塩基配列、またはシーケンスのアーチファクト（fastx_artifacts_filter）に由来する塩基配列は破棄された。3,100個のコンティグと、それにマップされることが判明したイルミナリード（bowtie2を-very-sensitiveアルゴリズムで使用）を、それぞれSSPACE v2.0（Boetzer et al. 2011）およびGapFiller v1.11（Boetzer and Pirovano 2012）を使用したscaffolding（1ラウンド、オプション -k 50 -g 2 -a 0.7 -n 15）およびgapFilling（5ラウンド、オプション -k 50 -g 2 -a 0.7 -n 50）の入力として使用した。この処理の結果、575個のコンティグが306個のスキャフォールドに整列された。これらの306個のスキャフォールドを、イルミナリードとPolisher v2.0.8 (LaButti et al. 2008)を用いて塩基コール補正し、Bowtie 2を用いて454リードとイルミナリードの両方をマッピングしてカバレッジを評価した。カバレッジが第1四分位値（145.4×）を下回ったコンティグは、短く（<1kb）遺伝子を欠くか、細菌汚染の兆候があり242スカフォールドしか残っていない場合は除外した。さらに、makerの出力から細菌遺伝子とベストヒットした遺伝子はすべて、コンタミネーションの可能性（イントロンがないか、細菌遺伝子のみで構成されるコンティグに存在する）をチェックし、1つの小さなコンティグを取り除いた。RNAシーケンスからの情報により、スキャフォールドの数を241に減らすことができた。
生のRNA-Seqリードは、FastQC v0.11.5（Andrews 2010）を用いて品質を評価し、Trimomatic v0.36（Bolger et al. 2014）を用いてアダプターおよび品質トリミングを行い、トリミングされたペアリードおよびトリミングプロセスによってペアリングが解除されたリードを作成した。トリミングは、4 bpのウィンドウ（SLIDINGWINDOW: 4:22）で平均したとき、塩基の品質スコアがQ22の閾値を下回った場合に行い、40 bp以上の長さのリードをトリミングした。アダプタートリミングには、TruSeqおよびSMART-Seqアダプターの除去が含まれ、回文モードで行われました。TruSeqとSMART-Seq調製の相互作用により、SMARTアダプターのコンタミネーション（polyA/Tを含む）が発生することが予想されました。これには、5′および3′アダプターの両方、ならびにRNAテンプレートの5′末端への最大5bpの非鋳型DNAが含まれます。後者のコンタミネーションを考慮し、両端のリードを5 bpクロップした結果、平均リード長は240 bpとなった。リードの品質とアダプターのコンタミネーションをFastQCで評価した結果、トリミングプロトコルの有効性が確認された。
次に、トリミングしたリードを連結し（フォワードとリバース別々に）、Trinity v2.4.0 (Grabherr et al. 2011)を用いてde novoトランスクリプトームアセンブリを行った。まず、7,744,482個のペアリード（合計15,488,964個）を、HISAT2 v2.1.0 (Kim et al. 2015)を用いて、デフォルトパラメータで高品質ゲノムアセンブリにマッピングした。マッピングの結果、全体のアライメント率は92.4%であった。これらのマッピングされたリードを用いて、ゲノムガイドによるde novo Trinityアセンブリを行った結果、21,426個のTrinity「遺伝子」（総転写産物数32,984）が得られた。次に、ペアリングされたリードと、トリミング時にペアリングされなかった7,391,766リードを用いて、デフォルトのパラメータでde novo Trinityアセンブルを行った。この結果、25,535のTrinity「遺伝子」（総転写産物数41,548）が得られた。両方のアセンブリーを用いて、核ゲノムのフィーチャーアノテーションを更新した。
フィーチャーアノテーションの更新はPASA v2.2.0 (Haas et al. 2003)を用いて行われた。簡単に説明すると、BLAT v35 (Kent 2002)とGMAP v2017-01-14 (Wu and Watanabe 2005)を用いて、ゲノムガイドアセンブリと完全de novoアセンブリの両方をゲノムアセンブリにアライメントした。MAKER2によるアノテーションデータベースが作成され、アセンブルされた転写産物から順次更新された。新しいアノテーションバージョンには、5′および3′非翻訳領域（UTR）、遺伝子の代替アイソフォーム、マージまたはスプリット遺伝子（オリジナルのアノテーションと比較）、およびin silico手順では発見されなかった新規遺伝子が含まれた。新規遺伝子は、転写産物がTRANSDECODER (Haas et al. 2013)によって全長であると判定された場合のみ含まれ、アノテーションの更新はゲノムアセンブリにマップされた転写産物のみを含む。更新が完了した（すなわち、更新によってアノテーションが変更されなかった）と判断されるまで、9回のPASA更新が行われた。合計で43%の遺伝子が何らかの形で更新され、9,707遺伝子の最終セットが得られた。これには、インシリコ予測からの99のマージ遺伝子、41のスプリット遺伝子、28の新規遺伝子が含まれた。合計で、7,575個の5′UTRと6,738個の3′UTRが最終的なアノテーションに追加された。
RNA-Seqデータの変異パターンをRnaseqmut v0.6（https://github.com/davidliwei/rnaseqmut）を用いて調べ、HISAT2 v2.1.0を用いてゲノムアセンブリにマッピングされたクオリティトリミングリードから変異を定量化した。変異はカバレッジが10倍以上の位置でコールされ、1リードあたり3ミスマッチを超えないようにした。
アノテーションとエンリッチメント
MAKER2 (Holt and Yandell 2011)を用いて遺伝子アノテーションを行った。
RepeatModeler v1.0.11とRepeatMasker v4.0 (Smit and Hubley 2008; Smit et al. 2013)を用いて、インタースパースドリピートとショートシークエンスリピートを含むゲノム中のリピートをモデル化し、定量化した。ゲノムの特徴数および長さの指標は、各ゲノムの既存の特徴アノテーションから生成され、ほとんどのドラフトゲノムにはUTRなどの特徴が含まれていないため、特にイントロン/エクソンの長さの指標に偏りが生じる可能性があるため、コーディング配列の特徴のみに焦点を当てた。複数のアイソフォームがアノテーションされている場合は、1遺伝子につき1アイソフォームについて、エクソンとイントロンの数と長さの平均値と中央値を計算した。遺伝子アノテーション間の距離には、コード配列とscaffold/contig末端間の距離は含まれない。
全15種にわたるD. folliculorum遺伝子およびオルソグループのアノテーションは、Blast2GO v4.1.9 (Conesa et al. 2005; Götz et al. 2008)およびblastKOALA (Kanehisa et al. 2016)を用いて行った。Blast2GOは、e-valueカットオフを1e-5、残りのパラメータをデフォルトのまま実行し、Biological Processes（BP）、Cellular Component（CC）、Molecular Function（MF）のGene Ontology（GO）用語を得た。BlastKOALAは、種特異的なNCBI分類学識別子を用いて実行した。両プログラムとも、D. folliculorum、T. urticae、Galendromus (Metaseiulus) occidentalisのGO用語とKEGG Orthology (KO)グループを得るために使用された。D. melanogaster遺伝子のGO用語は、BioMart (Kinsella et al. 2011)を用いてEnsembl Metazoaから入手した。各生物種のアノテーションは、Orthofinderからオルソロググループのコンセンサスアノテーションを形成するために使用された。KEGGオルソロググループはKEGGデータベースのオルソログにマッピングされるため（Kanehisa and Goto 2000; Kanehisa 2019; Kanehisa et al. 合計で5,255のオルソグループにKOのアノテーションがあり、3,991は少なくとも2つの種から得られた（すなわちコンセンサスであった）。このうち3,671はKOの割り当てで一致を示し、OrthofinderとblastKOALAの一致率は92%であった。
遺伝子ファミリーテストセットに割り当てられたスリムGO用語の機能濃縮は、Rパッケージ "GOfuncR"（Prüfer et al.） スリムGO用語は、完全な遺伝子オントロジーのサブセットであり、遺伝子機能の広範な概要を提供する。Gene Ontology Consortium (Ashburner et al. 2000; Gene Ontology Consortium 2019)の "Generic GO subset "とOBO_edit (Day-Richter et al. 2007)を用いて、Rパッケージ "GSEABase"(Morgan et al. 2018)を用いて、各オーソグループに割り当てられた特定の用語をBiological Process GO slimsに変換することにより、各オーソグループのGO slim termsを得た。GOスリムは、定義されたテストセットとバックグラウンドセットを使用して機能濃縮テストを実行するために使用された。GOfuncRからの超幾何学的検定は、過剰発現項を決定するために使用され、片側フィッシャーの正確検定と同等である。複数の検定を実行し、その結果、かなりの度合いで偽の発見に遭遇することを考慮するために、デフォルトのGOfuncR FWER（1,000回の並べ替えによるfamily-wise error rate）、およびq値（Rパッケージ「qvalue」）（Storey and Tibshirani 2003; Bass et al. 有意性は、q値またはFWERのいずれかに基づき、10%の受け入れ閾値で考慮した。ほとんどのテストでは、割り当てられたGOタームを持つすべてのオルソグループがバックグラウンドセットとして使用された。緩やかな選択テストの濃縮では、選択テストへの入力グループのフルセット（467のオルソグループ）がバックグラウンドとして使用された。有意に濃縮されたGOスリムが割り当てられたオルソグループの完全なGO用語は、REVIGO (Supek et al. 2011)で機能図を作成するために使用された。REVIGOは長いGO用語のリストを作成し、最も重要でない用語まで縮小する。図は "ggplot2 "パッケージ（Wickham 2016）を用いてRで作成され、各リスト内の用語の頻度を含み、顕著な用語でラベル付けされた。
BUSCOは、真核生物と節足動物のシングルコピーのオルソログセットについて、各ゲノムについてリリースされたキュレートされたタンパク質セットで実行され、アイソフォームがアノテーションされた遺伝子ごとに最長アイソフォームでフィルタリングされた（Waterhouse et al.） BUSCO v2.0は、1)真核生物と2)節足動物で見つかった普遍的なシングルコピー遺伝子のセットと遺伝子アノテーションを比較することにより、遺伝子アノテーションの完全性を評価するために使用された。BUSCOは、代替転写産物がアノテーションされている生物種について、各生物種の遺伝子の最長アイソフォームを用いてタンパク質モードで実行された。
ENCprimeを使用して、コーディング配列セット全体の有効コドン数（Nc）と、バックグラウンド変異パターン（Novembre 2002）によって補正されたコドン使用の指標であるNc′を計算した。補正は研究対象の各遺伝子の第3コドン位置のヌクレオチド頻度を用いて行った。NcとNc′は0から61の間で変化するが、使用されるコドンの数を反映するように幅広くスケールするように設計されている。
遺伝子ファミリーの解析
D. folliculorumの進化における遺伝子ファミリーのサイズの変化を調べるために、Orthofinder (Emms and Kelly 2015)を用いて15種のクモ形類およびアウトグループにわたる遺伝子のオーソロジーを決定し、IQ-TREE (Nguyen et al. 2015; Chernomor et al. 2016; Hoang and Chernomor 2017; Kalyaanamoorthy et al. 2017; Wang et al. 2018; Crotty et al. 2020)を用いて推定された種ツリー上の拡大と縮小をモデル化するために用いた。遺伝子ファミリーの進化を調べるために、CAFE (Computational Analysis of Gene Family Evolution) v4.0 (De Bie et al. 2006)というプログラムを用いて、制約木と非制約木を用いた。
Orthofinder v2.2.3は、高品質の遺伝子アノテーションのために選ばれた15種のテストセットにわたってオルソログ遺伝子を決定するために使用された。15種のセットには、ダニ目（4種）、寄生虫目（4種）、クモ目（2種）、サソリ目（1種）の代表種とアウトグループ種（4種）が含まれている。ダニやダニのゲノムは他にも存在するが、そのほとんどはアノテーションされた遺伝子モデルを持たないか、あるいはこれらの遺伝子モデルはあまり完全ではない。
遺伝子ファミリーの拡大と縮小（遺伝子の誕生と死）はCAFEを用いてモデル化した。CAFEは根付き超対称木を用いて、系統にわたる遺伝子ファミリー内の遺伝子数の進化をモデル化する。CAFEでは2つの木を解析した： 1)単系統のAcariformesとParasitiformesを含む制約付きトポロジー、2)制約なしのツリートポロジー。IQTREEからの樹木は，RパッケージAPE v5（Paradis and Schliep 2019）を用いて根付けされ，時間樹に変換された。根付けはChelicerata/outgroup枝で行い、"chronopl "関数を用いて時間に較正した。分岐は、化石記録の日付とJeyaprakash and Hoy (2009)およびPisani et al. (2004)から以前に推定された分岐の混合から得られた分岐時間の範囲に基づいて較正することができる。トポロジー1）については以下の通りである： 鋏角類／アウトグループの分岐最小値＝679Mya、最大値＝771Mya；昆虫綱／甲殻類の分岐最小値＝608Mya、最大値＝724Mya；リムルス／クモ膜類の分岐最小値＝422Mya、最大値＝528Mya。トポロジー2）については以下の通りである： 鋏角類／アウトグループの分岐最小値＝679Mya、最大値＝771Mya；昆虫綱／甲殻類の分岐最小値＝608Mya、最大値＝724Mya。複数の甲殻類と鋏角類の種を使った最近の系統学的研究では、分岐は630Ma付近と近似され、我々の較正範囲よりわずかに浅い（Schwentner et al.） 深い分岐の較正は難しいかもしれないが、我々の分岐時間の推定値はPisani et al.
OrthofinderのOrthogroupデータを用いて、種ごとに各グループの遺伝子数をカウントし、CAFEに入力するためにフィルタリングを行った。フィルタリングには最大遺伝子クラスターの除去も含まれ、1つの生物種が100以上の遺伝子を持つ場合、オルソグループは除去された。この "大きな "オルソグループのセットは、フィルタリングされたデータセットによって推定されたパラメータを用いて、後で別々に解析された。CAFEは、クレードのLCAで祖先状態の再構築を行うために、系統内で少なくとも2つの遺伝子を必要とする。したがって、可能な限り多くのグループを保持しつつ、目的のクレード（クモ類）に関する有益なデータを提供するためにフィルタリングを行った。Orthogroupは、ダニとマダニに少なくとも2種が含まれ、クモ／サソリ／リムルスのグループには少なくとも2種が含まれるものを保持し、ダニとマダニを含むグループを確実に保持すると同時に、クモ類のLCAに関する情報も確実に保持した。合計で、Orthofinderは14,072のオルソグループを作成した。フィルタリングの結果、7,058個が解析のために保持され、32個が1つの種で100個を超える遺伝子を含む「大きな」オルソグループとみなされた。これらのグループには7,268のデモデックス遺伝子が含まれ、予測されたプロテオームの74.5%に相当する。
CAFE解析は遺伝子ファミリーの進化に関する多くの異なるモデルで実施することができ、モデル化にはゲノムアセンブリやアノテーションエラーなどの原因によるエラー率も含めることができる。最も単純なモデルは、CAFEがグローバルラムダ（遺伝子が失われるか、または増加する単一で複合的な確率）を推定するものである。"lambdamu "コマンドにより、ツリー全体で別々の出生率と死亡率を推定することができる。"Multi "モデルでは、入力された系統樹のユーザー定義の部分について、これらのパラメータを別々に推定することができる。データから推定された誤差率を用いて、いくつかの異なるモデルを検討した。誤差率の推定は、デフォルトのパラメータで付属のPythonスクリプト "caferror.py "を用いて行いました。このスクリプトは、異なる誤差率を用いてCAFEを複数回実行し、尤度スコアに基づいて毎回誤差率を最適化し、誤差率モデルを生成します。この誤差率推定のためのCAFE実行は、各代替木トポロジーのフィルターされたデータを用いて実行され、その後、得られた誤差モデルを用いてCAFEが実行されました。最適化された大域誤差率は、両方の樹木トポロジーで1.22×10-5であった。
CAFEは各樹木トポロジーで別々に実行され、4つの異なるモデルを実行した： 1)単一のλラン、2)単一のλdamu、3)Acariformeの枝に対して別々の確率を持つ複数のλdamu、4)AcariformesとParasitiformeの両方の枝に対して別々の確率を持つ複数のλdamu。パラメータ値と対数尤度の収束を確認するため、各モデルを5回実行した。各木のトポロジー内で、尤度をランク付けして比較した。CAFEは入力データを使って、モデル間の単一尤度比と多重尤度比の差のヌル分布（"genfamily "関数、100回のシミュレーション）をシミュレーションし、このヌル分布を使って、これらのモデル間の推定尤度比がこのヌルから有意に異なるかどうかを検定することができます。単一λの差は、Acariformes、Parasitiformes、および残りの枝を別々の確率で許容する複数λに対して検定した。
種ツリー推論
Orthofinderによって生成されたタンパク質アラインメントを用いて、種ツリーの推論を行った。Orthofinderは合計で1,316のオルソグループを発見し、少なくとも87.5%の遺伝子を全種から含んでいた。このデータセットは連結されたが、パーティショニングされていなかった。高ストリンジェンシーで分割されたデータセットも種樹の探索に使用され、15種全ての配列を含むシングルコピーのオルソグループのみから構成された。この少ない遺伝子ファミリーのセットには356のオルソグループが含まれていた。クモの系統関係の再構築を取り巻く既知の問題は、最尤（ML）解析における飽和効果を考慮するために、急速に進化する遺伝子やアライメント部位をフィルタリングすることが賢明であることを意味する。Sharmaら(2014)は、ヘテロタキー(木の枝間の速度変化)による飽和とLBA(Long Branch Attraction)を減らすために、データセット中の最も進化の遅い遺伝子200個と500個の両方を調べた。樹木の距離は、ペアワイズダイバージェンスが高くなると飽和する可能性があるが、進化速度の高い部位を取り除くことで、この影響を軽減することができる。Sharma et al. (2014)に従い、最も急速に進化した部位や遺伝子を解析から取り除いた。
未分割」データは、IQTREE（Chernomor et al. 2016; Kalyaanamoorthy et al. 2017; Wang et al. 2018; Crotty et al. 2020）によって決定された速度カテゴリーに基づいて、急速に進化する部位を除去するためにフィルタリングされた。LG + H4モデルの下で2つの最も高い割合のカテゴリーに分類された部位は、229,939部位（76,844パーシモンインフォマティブ、55,029シングルトン、98,066不変部位）を含むアラインメントを生成する結果となった。356遺伝子の "partitioned "データセット中のタンパク質配列はMAFFT v7.397 (Katoh and Standley 2013)を用いてアライメントし、配列間のMLペアワイズ距離はIQTREEを用いて求めた。ツリー検索は、まずModelFinder (Kalyaanamoorthy et al. 2017)を用いてBICに基づくトップ進化モデルを検索し、アラインメントの約80%でベースモデルLGをトップモデルとして選択した。最も急速に進化する遺伝子を取り除いた後、残りの遺伝子ファミリーのセットは系統学的解析のための170の遺伝子アラインメントから構成された。各データセット（未分割および分割）をtrimAl (Capella-Gutiérrez et al. 2009)で処理し、"-automated1 "プリセットを用いて、データ中の広範なギャップを除去した。アライメントの連結とパーティションファイルの生成はTriFusion (Fischer et al. 2011)で行った。
未分割データは、部位間の速度不均一性を説明するために使用できるIQTREEの混合モデル（CATモデル）を実行するために使用された（Wang et al.） さらに、IQTREEのヘテロタキー（"H"）モデルを用いて、枝特異的な進化速度を説明することを試みた（Crotty et al.） CATモデル（C10、C30、C50、C60）およびヘテロタキーモデル（H4、H8）を含めるために、"-madd "パラメーターを用いて未分割データのモデル検索を行った。CATモデルとheterotachyモデルの組み合わせも検討された。60の混合率を持つCATモデルが、単独でもヘテロタキーモデルとの組み合わせでも、一貫してトップモデルとなった。C60とヘテロタキーモデルの混合率を変え、1,000の高速ブートストラップ（"-bb "フラグ）を用いてツリー検索を行った。使用したモデルに関係なく、各検索で同じ樹形トポロジーが見つかり、常に非常によく支持され、ほとんどのノードはブートストラップ樹の100%で一貫して支持された。混合率とヘテロタキーモデルを増加させても、枝の長さを減少させる効果はわずかであり、クモ類の多様化はクモ目／サソリ目、アシナガバチ目、寄生虫目の3方向のポリトミーに効果的に減少した。
長い枝が引き寄せられるのは、ある系統の進化速度が速いために、それらの系統が一緒になり、一般的には根の方に引っ張られるときに起こる。アシナガバチ目や寄生虫目の系統樹を復元したところ、このような長い枝と疑わしいトポロジーが得られたが、これはおそらくヘテロタキーが原因である（Jeyaprakash and Hoy 2009; Sharma et al.） 加えて、クモ類の多様化は古くかつ急速なようであるため、サイトの飽和が真のトポロジーやノードの時期の回復を難しくしている可能性が高い。高い変化率を含む上位の進化モデルは、両方のデータセットで一貫してModelFinderによって選ばれており、広範な飽和を示唆している。わずか15種を含む木の中に系統特異的で極端な進化速度が存在することは、回復されたトポロジーのノードがLBAに苦しみ、回復されたグループの枝の長さによって並べられる可能性が高いことを意味する。ここでは、アシナガバチ目、寄生虫目、クモ・サソリの順に枝が長くなり、分岐の順序はアウトグループから先端に向かって枝の長さに従っている。このトポロジーとLBAの問題は、同様のデータを用いたSharmaら（2014）でも見られた。Sharmaら(2014)は、彼らが復元したトポロジーはLBAに苦しんでいる可能性が高いと結論づけた。
我々のデータにおける代替ツリートポロジーの可能性を検証するために、最も進化が遅い170遺伝子の分割データを、IQTREEの無制約ツリーと制約ツリーの両方を用いて評価した。この分割データセットには75,300部位が含まれ、38,713部位がparsimonyで有益、11,918部位がシングルトン、24,699部位が不変であった。4つの代替トポロジーがテストされ、各拘束ツリーには2つの基本的な仮定が設定された： 1）最も可能性の高い復元トポロジーは、上記およびSharma et al. (2014)で提案されているように、長い枝の引き寄せの結果である可能性があること、および2）Limulus polyphemusはクモのアウトグループであること。制約木は、1）「ダニ／ダニ単性」、グループ：L. polyphemusを含むアウトグループ、寄生虫目をグループ化したサソリ目、サソリ／クモ目、2）「クモ／サソリ目、寄生虫目単性」、グループ：L. polyphemusを含むアウトグループ、クモ／サソリ目、寄生虫目をグループ化したサソリ目、クモ／サソリ目をグループ化したサソリ目。また、"spiders/scorpions and Parasitiforme monophylly "では、グループ：L. polyphemusを含むアウトグループ、Parasitiformesを含むクモ・サソリ目、Acariformesを含むアウトグループ、"spiders/scorpions and Acariforme monophylly "では、グループ：L. polyphemusを含むアウトグループ、Parasitiformesを含むクモ・サソリ目、Parasitiformesを含むアウトグループ、"L. polypheus as outgroup "では、L. polyphemusのみをクモ類のアウトグループとして制約し、クモ類内のトポロジーは制約しない。各樹木は、"-sp "オプションを使用し、ModelFinderのトップモデルで実行され、FreeRatesモデルを含むタンパク質モデルを各パーティションで検索し、上位1％のモデルに基づいてパーティションをマージした（後者は、網羅的な検索は計算量が多すぎるため）。その後、各モデルの最終的な木を連結し、IQTREEでそれぞれの尤度を比較した。"AU "法（"-au"）と1,000回の再標本化によって生成された差のP値を用いた。
尤度に基づいて無制約木と比較した結果、次善のトポロジーは、AcariformesとParasitiformesがグループ化され、クモ／サソリがクモ類より下位に位置するトポロジーであった。このトポロジーは、AcariformesとParasitiformesが一緒に制約されたツリー［ツリー(1)］でも、L. polyphemusがクモ類のアウトグループであるという指定を除いてトポロジーが制約されていないツリー［ツリー(4)］でも回復した）。遺伝子ファミリーの進化解析はこの制約木に焦点を当てたが、比較のためにこの木と制約のない木の両方を用いて行った。
Acari系統の進化とXiphosura（カブトガニ）の位置に関する現在のモデル、およびこれらのモデルのサポートについては、Extended Dataのオンライン版Supplementary Materialの補足表S8でレビューしている。ますます多くのカブトガニは、陸上の祖先から海に戻り、もはや甲殻類の基本的な位置を占めていないと考えられている（Ballesteros and Sharma 2019; Noah et al.）
自然選択
小ゲノムダニにおけるゲノムの減少は、自然淘汰の緩和が関与し、時間の経過とともに遺伝子が失われた可能性がある。ゲノム中の遺伝子数の減少に淘汰の一般的緩和が関与しているという仮説を検証するために、RELAXプログラム（Wertheim et al.） RELAXは、非同義変異と同義変異の比率（dN/dSまたはΩ）の違いに基づいて、自然選択の強度の変化（選択の強化または緩和のいずれか）について、ユーザー定義の「Test」と「Reference」ブランチのセットをテストする。アカリホシカダニにおける遺伝子消失における緩和の役割を調べるために、全体的な遺伝子消失のシグナルを持つすべてのアカリホシカダニの枝について選択を検定し、一貫した遺伝子拡大のパターンを示すクモとサソリの枝と比較した。
POTIONパイプラインv1.1.2（Hongo et al. 2015）は、Orthofinderオルソロググループを使用して、テスト用の単一コピー遺伝子を抽出するために、種間でオルソログを整列し、フィルタリングするために使用された。入力データは、正しい翻訳フレームであることを確認した後、クリーニングし、PRANK v170427 (Löytynoja 2014)を使用してアライメントし、POTIONによってフィルタリングし、各配列が3の倍数であり、あいまい文字を含まないことを確認した。さらに、配列の長さが最小150bpを下回る場合、および1つの配列のペアワイズアミノ酸距離が15%を下回る場合は、配列が削除された。パラログが存在する場合は、オルソグループから削除した。dN/dSのロバストな測定値を得るために、オーソグループは11種以下、または1種のParasitiformeを除くクモの一種が欠落している場合は解析から除外した（データセットを最大化するが、クモの一種間の枝数のバランスを保つため）。各グループの対応する枝をテストするために、対応する種が欠落している各オルソグループの編集された種ツリーを使用した。これらの枝は、遺伝子ファミリーの縮小を示す5つのAcariformesの枝と、遺伝子ファミリーの拡大を示す5つのクモ/サソリの枝であった。RELAXの出力には "K "パラメータが含まれ、これはテストブランチとリファレンスブランチの間の選択の強さの違いを示す（K < 1は選択の緩和、K > 1は選択の激化を示す）。RELAXはまた、TestとReferenceのdN/dSを推定し、Kが1に等しい帰無モデル（ブランチ間でオメガに変化がない）と、Kが1に等しくない代替モデルとの間の尤度比検定を行う。尤度比検定のP値は、Rパッケージ "SGoF "v2.3（Carvajal-Rodríguez et al. 2009; Castro-Conde and de Uña-Álvarez 2015）を用いて多重検定を行う際に、誤発見の影響を考慮して調整し、有意閾値は調整Pが10%未満とした。
Hox遺伝子
Hox遺伝子解析に用いた種： D. folliculorum (Acariformes) this work; Teranychus urticae (Acariformes) (Grbić et al. 2011)、Tribolium castaneumのDfdとftzの向きが逆であること、Drosophila melanogasterのHoxクラスターの向きがTribolium castaneumに対して逆であること(Zhang et al. 2019); Sarcoptes scabiei (Acariformes) (Rider et al. 2015; Mofiz et al. 2016); Galendromus (Metaseiulus) occidentalis (Parasitiformes) (Hoy et al. 2016); Ixodes scapularis (Parasitiformes) (Gulia-Nuss et al. 2015); Folsomia candida (Entognatha) (Faddeeva-Vakhrusheva et al. Drosophila melanogaster (Insecta) (Negre and Ruiz 2007); Caenorhabditis elegans (Nematoda) (Aboobaker and Blaxter 2003); Paracyclopina nana (Crustacea) (Kim, Kim, et al. 2016); Lingula anatina (Brachiopoda) (Luo et al. 2015); Strongylocentrotus purpuratus (Echinodermata) (Cameron et al. 2006)。
共焦点顕微鏡観察
デモデックスを繰り返し収集し、DNAおよびRNA配列決定のために調製した。バンガー大学自然科学部の共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM 510（Carl Zeiss製）を用いた。
ショウジョウバエの未成熟期の細胞数を推定するため、核をSYTOX greenとヨウ化プロピジウムで染色した。体の半分を6×4の切片に分け、数を数えた。D.folliculorumでは、体を3つの部分に分割した：ニョソソーマとポドソーマ、ガングリアと上部オピストソーマ、下部オピストソーマ。
D.folliculorum雌の核の倍数性レベルを推定するために、1,400個の核のそれぞれを定量した。倍数体レベルは、ゲノムサイズの推定から得られた蛍光強度の結果に基づいて割り当てられた。すべての雌の標本において、蛍光強度が最も低いものが2Cまたは2倍体であると仮定した。核の蛍光強度から得られた値が2Cの値より大きいものはすべて、次に高い倍数体レベルに割り当てられる。測定はすべての核について行った。結果はCLSMのヒストグラムセクションから読み取った。ZAMITI（Z-Stack、Area of Histogram、Mean intensity、Intensity of cell、Total intensity）の手順が採用された（Shimizu et al.）
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した標本全体の顕微鏡写真を用いて、組織・器官と核の局在を観察した。これらの標本は、構造の保存に役立ち、局在化の背景となる光カルノイ溶液（v/v、60％エタノール／40％氷酢酸）で固定した後、同じUVチャンネル（約300 nm）で可視化するか、560 nmの別のチャンネル（励起用波長）と組み合わせて染色した。
補足資料
補足データはMolecular Biology and Evolutionオンライン版で入手可能。
謝辞と資金提供情報
DNA単離を手伝ってくれたNuria Jiménez Hernándezと、解析のアドバイスをくれたTom Brekkeに感謝する。
本研究は、スペインのMinisterio de Ciencia e Innovaciónの支援を受け、欧州地域開発基金（ERDF）（PGC2018-099344-B-I00 to A.L.）およびスペインのConselleria d'Educació, Generalitat Valenciana（PROMETEO/2018/133 to A.M.）から共同出資を受けた。
BBSRCからのSYNTAX-2010、The Linnean Society (UK)からの共同資金をM.A.P.に提供。
データ提供
生シーケンスリードとゲノムアセンブリーファイルはGenBankプロジェクトのアクセッションにアップロードされている： prjeb13411, dmdxmap.
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著者ノート
Gilbert Smith、Alejandro Manzano-Marín、M Alejandra Perotti、Henk R Braigは同等に貢献した。
© The Author(s) 2022. Society for Molecular Biology and Evolutionの委託によりオックスフォード大学出版局より刊行。
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