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大腸菌プラスミドームがクローンゲームを地図化する

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.10.14.562336v1.full

Sergio Arredondo-Alonso、Anna K. Pöntinen、João Alves Gama、Rebecca A. Gladstone、Klaus Harms、View ORCID ProfileGerry Tonkin-Hill、View ORCID ProfileHarry A. Thorpe、Gunnar S. Simonsen、Norwegian E. coli BSI Study Group、View ORCID ProfileØrjan Samuelsen、Pål J. Johnsen、Jukka Corander
doi: https://doi.org/10.1101/2023.10.14.562336
この論文はプレプリントであり、査読認証を受けていません。
00000083
概要全文情報/歴史メトリクスプレビューPDF
要旨
大腸菌はヒトの主要な病原体であり、歴史上最も広く研究されている微生物であるが、プラスミドとして知られる染色体外エレメントの解明は未だ不十分である。われわれはロングリード技術を用い、20年にわたる長期的な調査から、2,000株を超える大腸菌の分離株について、プラスミドーム全体とそれに対応する宿主染色体の高分解能塩基配列を決定した。染色体DNAと染色体外DNAを分離することで、宿主の系統とそのプラスミドの共進化の軌跡を集団規模で再構築することができ、既成のドグマに反してプラスミドの進化は著しく制約されていることが示された。我々は、いくつかのプラスミドが何世紀にもわたって系統内に存続していることを発見し、主要な抗生物質耐性、競争、病原性決定因子を持つプラスミドにおける最近の垂直的・水平的進化事象の高解像度マップを提供する。また、離れた系統における表現型の収斂的進化を示す、染色体およびプラスミド主導の成功戦略のゲノム的証拠を提示し、in vitro実験により、クローンの成功におけるバクテリオシン産生プラスミドの重要性を検証する。本研究は、プラスミド生物学と細菌の進化戦略を理解し、病原体に対する将来の介入策を開発するための一般的な示唆を与えるものである。

はじめに
大腸菌が初めて単離され、命名された19世紀後半から、バイオエンジニアリングの応用においてユビキタスな役割を果たし、現在も世界的に公衆衛生上の負担の中心を占めている今日に至るまで、大腸菌の歴史は、定義された細菌種としての基礎的な微生物学的発見で彩られている。腸管外病原性大腸菌（ExPEC）は、健康なヒトの腸内に普遍的にコロニーを形成し、ヒトの体内でジキル博士とハイド氏の両方の役割を果たすことから、生態進化学と疫学研究の両分野で特に関心を集めている(1)。ExPECの集団は多様性の高いクローンで構成されているが、感染症の大部分を占めるのは特定の系統であり(2)、抗生物質耐性の出現と増加によってこの問題はさらに悪化している。疫学的調査により、ExPECの興味深い特徴が明らかになってきた。パンデミック系統が長い時間スケールで安定的に維持されていること、そして臨床サーベイランスで成功した新しいクローンが出現し、その多くが食中毒と関連していることである(2-5)。新しいクローンは通常、初期には急速に拡大するが、その後わずか数年で抑制され、集団は別の平衡へと移行し、かなりの系統の多様性を維持するようになる。偏りのない縦断的なゲノム調査によって、一過性の平衡の崩壊は負の頻度依存選択（NFDS）の特徴を持つことが証明され（6-8）、さらなるモデル化研究によって、この選択は核となるゲノム変異ではなく、付属ゲノム要素に作用していることが示唆された（9）。

プラスミドは、1950年代に大腸菌において抗生物質耐性の伝達物質および競合阻害決定因子として最初に報告され(10-13)、アクセサリーゲノムの動態において重要な役割を果たしている。プラスミドが成功したクローンの出現と拡散に重要な役割を果たしてきたという強力な証拠があるにもかかわらず（14-17）、プラスミドームの構造、プラスミドとExPEC宿主の水平的・垂直的な進化動態はほとんど解明されていない。これは、完全なプラスミド配列をタイプするためのスケーラブルな計算機的アプローチがほとんどないためであり、また、大規模な縦断的ロングリードシーケンス研究がないため、プラスミドームの構造や特定のプラスミドの流行をしっかりと理解することが妨げられている。このような背景から私たちは、ExPECのプラスミドーム全体を解明し、それに関連する進化的・疫学的傾向を明らかにするために、2,045の大腸菌分離株からなる大規模な代表的縦断的コレクション(7)にロングリード配列決定技術を採用することにした。このコレクションは、クローン背景、抗菌薬耐性プロファイル、その他の遺伝子型や表現型の特徴に関係なく含まれる分離株で構成されており、プラスミドームの進化、拡大、持続性の研究に理想的である。

我々のアプローチにより、合計4,485の環状化プラスミド配列が得られ、推論された進化速度と年代を経た系統樹により、主要なExPECクローンへのプラスミドの出現／獲得時期を推定した。その結果、離れた遺伝的背景においてプラスミド主導の収斂進化が複数見られたことから、プラスミドが宿主集団における初期のクローン形成とその後の流行維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに我々は、細菌の集団構造を形成する役割を果たすと提唱されているバクテリオシンの変異マップを構築し（12, 13）、集団ゲノミクスと実験的アプローチを組み合わせることで、プラスミドにコードされるマイクロシンVが、クローン形成の成功と安定した集団平衡の維持に寄与していることを同定した。

結果
プラスミドームの解明
226の異なる配列型（ST）に属する2,000株以上の分離株のロングリード配列からプラスミドームを推定したところ、4つの最も一般的なパンデミッククローン（ST69、ST73、ST95、ST131）が血流感染の約半数（1,438/3,254、44.19%）を引き起こしていた（図1A、図S1A、Methods）。ハイブリッドアセンブリーアプローチの結果、1,999ゲノムの高度に連続したアセンブリーが得られ、N50染色体長の中央値は4.98 Mbp、平均L50染色体数は1.09であった（図S1B）。染色体長は主要クローン間で有意に異なり（図S1C、p値 < 0.05）、ST69とST73はST95とST131に比べて染色体サイズが大きかった。合計5,417のコンティグがプラスミド由来と同定され、ここではまとめてプラスミドームと呼ぶ。分離株あたり観察されたプラスミド配列の全長と数は、他の主要クローンと比較してST73で有意に少なかった（p値 < 0.05）（図S1D）。この所見は、ST73がより低いプラスミド負荷を頻繁に持ち、低い結合頻度と高い適合性コストによって実証されていることを示す以前の報告を裏付けるものである（18, 19）。

図1.
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図1.
最も一般的な4つのパンデミックExPECクローン（ST69、ST73、ST95、ST131）に存在するプラスミド配列の、mge-clusterによって計算された埋め込み空間におけるタイピングと可視化。A) 1,999のExPEC分離株の最尤系統樹と関連するハイブリッドアセンブリー。4つのパンデミックExPECクローンに対応する分離株は異なる色で示され、系統における位置が示されている。ST131の場合、分離株は関連するクレードに従って区別された。B)4,147個の環状プラスミド配列をタイプ分けして可視化するためにmge-clusterで作成した非線形埋め込み空間。これらから、3,734個がプラスミドタイプ（pT）に割り当てられ（丸い形）、一方413個は未割り当てのままであった（菱形）。各ポイントはプラスミドを持つ分離株のST（またはST131クレード）に従って色分けされ、そのサイズはプラスミドの長さに比例している。独立したmge-クラスター（pT）を構成しないが、F2:A1:B-/B63に対応する明確なpMLST型を持つ未割り当てのプラスミド配列群の位置を黒星で示した。

ハイブリッドアセンブリーから同定された環状プラスミド配列（n = 4,485）をタイプ分けするために、最近開発した方法であるmge-clusterを適用した(20)。4,485個のプラスミドのうち、mge-clusterは大部分（3,734個；83.26%）をプラスミドタイプ（pTs）と呼ばれる23の重複しないグループに分類した（図1B）。残りのプラスミドのうち、413個（9.21%）はタイプに割り当てられず（図1B）、338個（7.54%）の配列は品質管理後にフィルターで取り除かれた（Methods）。円形でないプラスミド配列（n = 932）を定義された型に割り当てた結果、394の配列が23のpTに割り当てられた（表S1）。可能であれば、タイプは既存のプラスミド標識スキーム（表S2に要約）に基づいて注釈付けされ、さらに参照プラスミドとの関連付けが行われた。

驚くべきことに、発見された13種類のプラスミド（平均長さ70kb以上）のうち、1種類を除くすべてが抗菌剤耐性（AMR）、競合、病原性遺伝子のいずれかと関連しており、宿主細胞にとって重要な形質の運搬役としての大型プラスミドの役割が明らかになった（表S2）。プラスミドームの構造（図1B）を、最近明らかになった大腸菌のプラスミド配列と比較すると（20）、非常に高い一致度が見られた（調整ランド指数0.94）。さらに、公開プラスミドの解析ではpT11とpT14が統合されたため、両者の間に大きな食い違いが生じた。これらの結果を総合すると、プラスミドの進化は以前考えられていたよりもはるかに制約を受けており、有利な遺伝子を広める安定したビークルとして機能するプラスミドバックボーンは限られていることが示唆される。

長い（＞70 kb）プラスミド配列に対応するプラスミドタイプは、封じ込め指数(21)で測定すると、高い遺伝子共有度を示す傾向があった（図S2）。一方、より小さい（＜10 kb）プラスミドタイプの中には、複製機構に関わる遺伝子のみを共有するものもあった（図S2）。プラスミドタイプ間の遺伝子共有を詳しく調べるために、遺伝子含有量の多いほとんどのタイプの代表的な配列間で遺伝子シンテニー解析（最小同一性0.8）を行った（図2）。pT6、pT14、pT21を含むプラスミドタイプのサブセットには、シデロフォア、プラスミドコンジュゲーションに必要な遺伝子、あるいはAMR/ビルレンス遺伝子カセットに対応する大きなゲノムブロックが共通して存在した。シンテニー（最小同一性0.99）の遺伝子間のリンクを作るためにストリンジェンシーを上げると、IncFプラスミド転移領域は他のゲノムブロックよりも全体的に多様化し、転移領域が高度に保存されたままであることから、pT6/pT14とpT10/pT11のペアのプラスミドは、それぞれのペア内で同じ祖先プラスミドから進化した可能性が高いことが観察された（図S3）。このことは、各組のプラスミド配列のアラインメントを用いて組換えのない系統樹を再構築することで確認した（図S4）。その結果、pT6はpT14から、pT10はpT11から生じたことがわかった。

図2.
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図2.
主な大型プラスミド（pT）のシンテニー解析と可視化。各pTについて、クラスターに存在する最も優勢な特徴を表すプラスミド配列（配列IDでタグ付け）を選択した（表S2に要約）。遺伝子間のリンクを引くために、最小同一性閾値0.8を考慮したclinkerを用いて遺伝子シンテニー解析を行った。病原性遺伝子はシンテニープロットで同定され、文献または参照プラスミドに従ってその名前が示され、キュレーションされた。各pTの横には、mge-clusterで作成した埋め込み空間におけるpTの位置を示した。

平均サイズの小さいプラスミドタイプのいくつか（pT17、pT18、pT19、pT20）は、しばしばバクテリオシン遺伝子を持ち、多様な遺伝的背景で見つかった（図1B、図S5）。注目すべきは、これらの遺伝子／プラスミドはいずれもクローン拡大の証拠を示さなかったことである。

中心的プラスミドの進化史と獲得年表
タイピング解析により、特定のプラスミドタイプが非常に優勢で、4大クローンの成功に寄与した可能性があるかどうかを調べることができた。これらのプラスミドがいつ獲得されたかを理解するために、BactDating (22)を用いて4つの最も一般的なSTの進化速度と系統樹を推定し、さらにCaveDive (23)を用いて拡張の可能性を検出した。我々は中型から大型のプラスミド（>10 kbp、表S2）に注目した。なぜなら、これらのプラスミドは宿主細菌の増殖を促進する機能をコードしている傾向があるからである。

ST95では、pT14（38％）、pT3（24％）、pT11（22％）が高頻度に検出され、このうち後者2つは系統樹上ではほとんど重複していなかった（図3A）。pT3はI-プラスミド複合体(24)に属する共役IncB/O/K/Zプラスミドに相当し、しばしばアミノグリコシド(aph(6)-Id, aph(3'')-Ib)、スルホンアミド(sul2)、β-ラクタム(blaTEM-1)耐性遺伝子をコードしており(表1)、腸内細菌科の他の細菌種でも頻繁に報告されている(24)。pT14は、以下の特徴を持つ結合型IncFプラスミド（F24:A-:B1）に相当する： i)マイクロシンcolVをコードするcvac遺伝子と別のコリシン（コリシンIa、cia遺伝子）の存在(25, 26)、ii)iroBCDEN（サルモチェリンオペロン）、iucABCD、iutA（エアロバクチンオペロン）を含む鉄獲得に関与する複数のシデロフォア系、 および鉄輸送系sitABCD(27)、iii)外膜タンパク質Tコード遺伝子ompTおよびヘモリシンコード遺伝子hlyF、iv)ABC輸送系etsABC、およびv)補体系に対する耐性を付与するiss遺伝子(28)。pT14はpcolV様プラスミド（参照プラスミドpECOS88）として構築された。Johnsonら(29)が概説しているように、pcolV様プラスミドは尿路感染症（UTI）や髄膜炎に関連しており、鉄獲得機構、血清耐性、ヒト尿中での増殖、バクテリオファージ耐性などの表現型と関連している。pT3とpT14はともにST95のクレード間に広く分布しており、1768年（95％CI、1721-1806年）にさかのぼるST95の最近共通祖先（MRCA）で導入されたことが示唆された（図3A、表S3）。ルートから続く主要な分岐（n=436/442分離株）は、1823年（95% CI, 1789-1851）に起こったと推定される拡大イベントとして検出された。

図3.
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図3.
4つの主要なExPECクローンの日付入り系統樹と、それらに関連する優勢なプラスミドタイプ（pT）の最も可能性の高い獲得／導入。A) fimH/O/HタイピングとpT3、11、14の有無に基づくクレードを示したST95の系統樹。B)). B) fimH/O/HタイピングとpT 10の有無に基づくクレードを示したST69の系統樹。C) fimH/O/HタイピングとpT 4、11、13の有無に基づくクレードを示したST73の系統樹。C）既存の命名法（A、B、B0、C0、C1、C2）、fimH/O/Hタイピング、pTs 6、10、11、12、13、22の有無に基づいてクレードを示したST73の系統樹。また、pMLST F2:A1:B-/B63（図1の★印）を持つプラスミドの有無も示した。

ST95の系統樹は以前、菌株の血清型（O-HタイピングとfimH対立遺伝子の組み合わせ）と相関する5つの別個のクレードに分割されている(30)。fimH41:O1/O2:H7（図3A）に代表されるST95のクレードは、1884年頃（95％信頼区間1817-1937）に獲得されたと思われるpT11に相当する、pT14を置き換えたような明確なIncFプラスミドを持っている（表S3、図3A）。これは、尿路病原に寄与するsenB遺伝子クラスターを持つ共役プラスミド（F29:A-:B10）である。このプラスミドは以前pUTI89様プラスミドと呼ばれ、参照プラスミドpUTI89およびpRS218に酷似している(31, 32)。pUTI89様プラスミドは、マウス尿路感染モデルにおいて、感染の急性期に大腸菌のフィットネスを高め、結合を増強し、膀胱上皮細胞への浸潤を促進し、免疫回避特性を提供することが示されている(31)。さらにこのプラスミドは、in vitroとin vivoの両方のモデルを用いて、新生児髄膜炎を引き起こす大腸菌の病原性に重要な役割を果たしていることが証明されている(32)。

ST69の系統樹の基底部は、大きなプラスミドを持たない分離株であり、このようなプラスミドがこの系統の初期の進化において中心的な役割を果たさなかったことを示唆している（図3B）。しかし、ST69クレードの1つ（fimH27:017/015:H18/H4）は、1989-1990年（95％信頼区間、1986-1992年）頃にpT10を獲得した（表S3、図3B）。この獲得は、ツリーの2ノード前（1987年、95％信頼区間、1984-1990年）に起こった主要な拡大イベントの中に入れ子になっていた。pT10は、pT11（図S4）から、4種類の抗菌薬と重金属（水銀）に対する耐性を持つAMRカセットを付加して生じた（図2）。これらは、参照プラスミドp1ESCUMを含むpUTI89類似のプラスミドであり、このST69の亜集団は、pT11に属するプラスミドの文脈で上述したST95の亜集団と同様に、尿路結石を引き起こす能力を拡張している。

一般に推定されるプラスミドームサイズが小さいことと一致して、ST73は少数の分離株（181/560、32％）においてのみ大きなプラスミドタイプを保持している。これらのうち、優勢なpT4（有病率18％、F51:A-:B10）（図S6）はST73に複数回導入されている。fimH10:O6:H1クレードへの最初のpT4獲得から約80年後（1900年、95％CI 1877-1919年）に、このプラスミドがアンピシリン耐性の増加を示すblaSHV-1を獲得した後、1983年（95％CI 1977-1989年）にpT4の1回の導入で拡大イベントが起こった（表S3、図3C）。このプラスミドタイプは、pT10（pUTI89-like）と類似の遺伝子シンテニーと含有量を共有し（図2、図S2）、同じ病原性形質（senB遺伝子クラスター）をコードしており、分離株の泌尿器病原性の増強に寄与している可能性が高い。pT4はまた、aadA1（アミノグリコシド系）、sul1（スルホンアミド系）、場合によってはblaSHV-1（β-ラクタム系）など、いくつかのAMR遺伝子を含んでいた。このクローンの一般的な感受性傾向にもかかわらず、これはST73の特定のサブクレードが、特定のプラスミドタイプを組み込むことによって多剤耐性（MDR）になりうることを示している。

ST131については、3つの主要なクレードが文献に広く記載されている；クレードST131-A（fimH41:O16:H5）、クレードST131-B（fimH22:025:H4）およびクレードST131-C（fimH30:025:H4）であり、これらはさらにクレードC1（H30-Rとも呼ばれる）とC2（H30-Rx）に細分される（図3D）。ショートリードに基づく先行研究(15, 33)と一致して、各クレードについて、特定のプラスミドタイプとの明確な関連が観察された（図3D、図S6）。

ST131-Aでは、pT10（F29:A-:B10、pUTI89様）とpT13（有病率22％）が高い有病率（49％）を示した（図S6）。以前に示したように、pT10はUTI表現型およびST69亜集団の拡大と関連しており、これはST131-Aのデータでも再現されている。これらのプラスミドの分布から、pT13はST131-AのMRCA（1984年、95％信頼区間1978-1989年）に存在し、その後1988年頃（95％信頼区間1980-1993年）にpT10（pUTI89様プラスミド）に置き換わったことが示唆される（表S3、図3D）。pT13のpT10への置換に対応する分岐は、1992年頃に起こったと推定されるクローン拡大イベントとして示された（95％CI、1988-1996）。

ST131-BはST95で観察されたのと同様のプラスミド分布をたどった。pT6は、2つのコリシン遺伝子（マイクロシンV、cvaC遺伝子；コリシンIa、cia遺伝子）、複数のシデロフォア系（サルモチェリン、エアロバクチン）、複数の病原性遺伝子（iss、hlyF、ompT）の存在を特徴とするpcolV様プラスミドに相当する（図S6）。さらに、pT6は複数のAMR遺伝子をコードしており、これがpT14と異なる特徴である。このプラスミドがST131-Bに導入されたのは1955年頃（95％信頼区間、1944-1963）と推定された（表S3、図3D）。ST131-Bのもう1つの亜系はpT11（F29:A-:B10）（有病率45％）を保有しており、これはST95にも見られ、1957年から1981年（95％CI、1946-1986年）の間に獲得された（表S3）。

pT12はST131-C2（F36:A4:B1/B58）（有病率35％）に存在し（図S6）、その基底サブクレード（C0）にも存在した（図3D）。このプラスミドタイプは、テトラサイクリン耐性をコードするAMRカセット（tetA）と、場合によってはdfrA17（トリメトプリム）、aadA5（アミノグリコシド）、sul1（スルホンアミド）、mph(A)（マクロライド）を保有する追加カセットを含んでいた（図2）。注目すべきことに、このプラスミドはST131-Bに見られたpT6やpT14とは異なり、バクテリオシン産生遺伝子を保有していなかった。F2:A1:B-と表示されたプラスミド配列はST131-C2にも高率（39％）で存在し、CTX-M15対立遺伝子を含んでいた。これらのプラスミド配列は密接に関連していたが（図1）、クラスターを定義するのに必要な最小サンプル数には存在しなかったため、タイプは割り当てられなかった。参照プラスミドpJJ1886_5はmge-clusterアルゴリズムによってこのグループ分けに組み込まれた。これらの配列は、ST131-B（クレードB0）の祖先系統にF2:A1:B63として存在しており、INCFIBレプリコンはST131-C2において後に失われたことを示している（図3D）。対照的に、ST131-C1では、参照プラスミドpG150に関連するpT13（F1:A2:B20）が高い頻度（90％）で見られた（図S6）。その分布は、このプラスミドがST131-C1のMRCAに存在したことを示唆している（表S3）。このプラスミドはsenB遺伝子群をコードし、特にblaTEM-1やblaCTX- M-27（β-ラクタム系）、あるいはaac(3)-IID（アミノグリコシド系）を含む複数の非固定型AMR遺伝子を頻繁に保有している。

細菌の競合におけるプラスミドの役割
検出された大型プラスミドタイプの大部分は、AMRや細菌の競争力といった有益な形質をコードしている。AMRはクローン形成の成功の主要な決定要因ではないようなので（7）、NFDSの動態にさらに光を当てるために、プラスミドにコードされたバクテリオシンの細菌競争における役割を調べることにした（9）。バクテリオシンをコードする遺伝子をスクリーニングした結果、これらの遺伝子はプラスミドに存在することが最も多く（図S5、図S7）、例外はST73分離株の染色体に通常存在するマイクロシンH47をコードするmchBであった（図S6）。プラスミドにコードされたバクテリオシンが最も頻繁に見つかったのは、cvaC（マイクロシンV）とコリシンIa（pECS88_04とも呼ばれる）（図S5）で、それぞれST131-BとST95に関連するpT6とpT14（図2、図S7）に典型的に共存していた。クローン競合におけるマイクロシンVとコリシンIaの役割を明らかにするために、それらの活性を実験的に調べた。

マイクロシンV遺伝子群は4つの遺伝子から構成されている（図4A）：毒素をコードするcvaC、毒素産生細胞を保護するペプチドをコードする免疫遺伝子cvi、そして毒素を分泌する輸送系をコードする遺伝子cvaAとcvaBである（13）。マイクロシンVの産生は鉄の制限によって誘導され、標的細胞ではCirシデロフォアレセプターによって認識される(13)。鉄制限条件下で増殖させると、ST95プラスミドを保有する3株とST131-Bプラスミドを保有する1株の培養上清は、大腸菌実験株MG1655の増殖を強く阻害した（図4B）。殺傷効果は用量依存的であり、バクテリオシン活性と一致したが、目に見えるプラークが見られなかったことから、バクテリオファージを介した殺傷は否定された。誘導がない場合、ST95分離株27-61（表S4）は、おそらく2つのバクテリオシンのうちの1つの基底発現のために、より弱い阻害域を生じた。さらなる対照として、バクテリオシン生成プラスミドを保有していないST131-B分離株27-56は、鉄制限条件下で増殖したにもかかわらず、阻害を生じることができなかった（図4B）。31-16株と31-17株（図4）がさらなる対照株となった（Methods参照）。マイクロシンVが機能的であることが証明されたので、主要な4つの疾患関連STに属する大腸菌51株と、常在菌モデルとしてのST10株に対して、その活性範囲を試験した。予想されたように、上述の4つのバクテリオシン産生分離株は、対応する4つのバッチのマイクロシンVのいずれにも感受性がなかったが、残りの47分離株のうち39株は感受性であった（図S8、表S4）。感受性の分離株は、より濃縮されたバクテリオシンバッチ（分離株23-46および27-61によって産生された）でのみ阻害が観察されたいくつかのケースを除き、一般に4つのバッチすべてによって阻害された。全体として、ST69およびST131分離株は感受性であったが、他のSTに属する分離株はより不均一な挙動を示した。未誘導27-61株および誘導27-56株（コリシニン生成プラスミドを欠く）の上清は、予想通り臨床分離株に対して阻害効果を示さなかった。これらの結果を総合すると、pTs 6と14は機能的なマイクロシンV遺伝子クラスターをコードしており、その産物は遺伝的背景の異なる様々な大腸菌分離株の増殖を阻害することが示された。

図4.
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図4.
バクテリオシン感受性アッセイの概略図。A) プラスミド6型（ST131クレードB）およびプラスミド14型（ST95）のバクテリオシン生成プラスミドの説明。これらの典型的なpcolV様プラスミドは、マイクロシンVとコリシンIaの2つのバクテリオシン遺伝子クラスターをコードする。濃い矢印は毒素遺伝子（cvaC, cia）、薄い矢印は免疫遺伝子（cvi, iia）を示す。対照株はプラスミドを持たないか（ST131クレードB株27-56）、あるいは単一のバクテリオシンのみをコードするプラスミドを持つ（ST131 B株31-16はコリシンIa、ST95株31-17はミクロシンV）。B）マイクロシンVに対する大腸菌MG1655の感受性。マイクロシンVの産生は、鉄の制限（キレート剤2,2'-ビピリジルの添加で実験的にシミュレート）によって誘導される。抗菌活性は、斑点領域での増殖阻害（希釈に依存し、個々の斑点は形成されない）によって示される。C) コリシンIaに対する大腸菌MG1655の感受性。コリシンIaの産生はSOS誘導によって誘導される（UV照射で実験的に刺激）。バクテリオシノゲン活性はBと同様に示される。

コリシンIa遺伝子クラスターは2つの遺伝子からなる（図4A）：毒素をコードするciaA（と呼ばれる）と免疫をコードするiia。このコリシンはSOS誘導（遺伝毒性ストレスに対する応答）により発現され、その受容体もCirである(26)。上記と同じプラスミドを保有する4株をUV照射してSOS応答を誘導し、その結果コリシンIaを産生させた。この4種の培養上清は大腸菌MG1655の増殖を用量依存的に阻害し、ファージ斑は観察されなかった（図4C）。マイクロシンVについて示したように、誘導されていないST95分離株27-61はより弱い阻害域を生じ、一方、コリシン生成プラスミドを保有していない誘導ST131-B分離株27-56は阻害を生じなかった。つの上清を我々の分離株に対して試験したところ、51株中6株のみが感受性を示した（図S8、表S4）。分離株27-56（誘導、プラスミドなし）および27-61（非誘導）の上清は阻害しなかった。したがって、pTs 6および14は機能的なIa遺伝子クラスターをコードするが、このバクテリオシンはマイクロシンVと比較して活性が限定的である。

考察
プラスミドは一般に、細菌ゲノムの急速な進化の究極の手段であると考えられているが、同時に宿主細胞に寄生するエレメントとみなされることもある(10-12, 34)。われわれの解析から、大腸菌の大型プラスミドはほとんどの場合、細菌の競争、病原性、抗生物質耐性に該当する形質と関連しており、寄生というよりむしろ宿主細胞に有用なサービスを提供していることが示された。小さなプラスミドの多くにも、有益と思われるバクテリオシン産生系が組み込まれていることがわかり、それらは集団の系統に散在していた。

共存するプラスミドコード化バクテリオシンは2種類（マイクロシンVとコリシンIa）のみで、十分な頻度があり、異なる遺伝的背景においてクローン拡大の証拠を示したことから、コロニー形成競争において主要な役割を果たし、安定した集団平衡の維持に寄与していることが示唆された。菌株間競争におけるこれらの役割をさらに検討するため、この系を欠く集団で頻繁に観察されるクローンの大部分を阻害するマイクロシンVの能力を実験的に確認した。同様に、我々のコレクションでは、単一の優性染色体バクテリオシン、マイクロシンH47のみが同定され、これらのバクテリオシンの特徴は、以前S. pneumoniae集団で発見された、長期にわたる安定した集団均衡の維持に寄与するバクテリオシンの多様性とは対照的であった（35）。注目すべきは、ST10分離株の2株が、このバクテリオシン産生系を欠くにもかかわらず、マイクロシンVに耐性を示したことである。このことは、新生児のコロニー形成率と血流感染で観察されたコロニー形成率を系統的に比較することによって、最近集団レベルで定量化された、ST10の常在コロニー形成能力とその低い病原性（36）とよく一致している（37）。ST10集団のサブセットがなぜマイクロシンVに耐性を維持するのかは現在のところ不明であり、これらの阻害メカニズムの効果回避についてさらなる調査が必要である。

我々のデータセットのユニークな特徴により、特定のプラスミドタイプの獲得と安定した維持に関連して、離れた系統間で収束的な表現型進化を示す複数の事象を検出することができた。上述のST95とST131-Bで観察されたプラスミドベースのバクテリオシン産生系に加えて、これら2つの離れた系統には、pT11のプラスミドを保持する他のクレードが存在する。pT11は、泌尿器病原体形成の典型的な病原性形質をコードする、広く研究されている参照プラスミドpUTI89に相当する(31)。いずれの主要な系統においても、これらのクレードはcolV型プラスミド（pTs 6, 14）を保持するクレードと重複していなかった。colV型プラスミドは鳥類ニッチおよび鳥類病原性大腸菌（APEC）株と強く関連していることが判明している（25, 38）。ST131-Bは、食中毒性尿路病原体として、特に家禽肉の摂取との関連が広く指摘されている（39, 40）。これらの証拠から、ヒトを宿主として循環しているST95とST131-Bの両系統は、プラスミドに関連した形質によって、ヒトと鳥類に適応したサブクレードに安定的に分かれており、後者は食中毒を介した鳥類のニッチからの恒常的なスピルオーバーを反映していると考えられる。興味深いことに、ST131-BでcolVが獲得されたと推定される時期は1950〜60年代であり、これは第2次世界大戦後、多くの国々で家禽類の生産が急速に増加した時期と一致する。このことは、特定のプラスミド由来の形質を持つ大腸菌が、このニッチで急速に拡大する機会を提供した可能性がある。

先に述べた観察結果と同様に、ST69とST131-Aは、pUTI89病原性プラスミドから生じ、さらに耐性カセットを獲得した、共有プラスミド内容によって規定されるクレードを示した。これは、異なる系統群（D, B2）に属する2つの系統において、プラスミドに関連した収斂的な表現型進化を例証するものである。ST69はもともとカリフォルニアの集団発生で検出され(41)、その後の疫学調査で1990年代後半に出現し、その後10年以内に世界的に流行したことが示唆された(42)。我々の年代分析によると、プラスミドが獲得されたのは1987年から1992年の間の狭い期間であり、最終的に特異的な病原性とAMR特性を持つこのクローンの世界的な拡散につながった。さらに、我々の結果が示すように、この進化の過程は、ST131-Aサブクレードによる同じプラスミドの並行獲得と密接に関連しており、このサブクレードは、急速な拡大(7, 8)と世界的な蔓延を伴う極めて類似した疫学的特徴を持っている。大腸菌の成功した系統におけるこれら2つの進化の軌跡は、肺炎桿菌における病原性亢進と多剤耐性の収束と同じ特徴を持っている。これらは最初、重複しない形質として同定されたが(43)、後の研究により、特定の遺伝的背景においてプラスミド主導で両者が融合したことが指摘された(44, 45)。

プラスミドを媒介として、遠く離れた遺伝的背景で収斂進化を遂げた複数の事例を観察した結果、プラスミドが新しいクローンをまず定着させ、その後宿主集団の中で固有に維持するための重要な手段として機能していることが示唆された。しかしながら、公開されている大腸菌のプラスミドームと、我々の調査の一環として配列決定された4,000以上のプラスミドとの比較から得られた証拠は、新規のプラスミドタイプがほとんど発見されなかったことから、この種内でのプラスミド進化が比較的制約されていることを示唆している。このことはさらに、新規クローンは最終的な成功への道筋において、どのプラスミドバックボーンに依存して形質を獲得するかを選択する自由が制限されていることを示唆している。プラスミドの進化と維持のメカニズム的モデリングを含む今後の研究によって、クローンの成功が最終的に依存する要因についてさらに明らかになる可能性がある。

材料と方法
ロングリード配列決定のための分離株選択
広範なNorwegian Surveillance System for Resistant Microbes (NORM) ExPEC集団(7)のアクセサリーゲノムと移動性遺伝要素（MGEs）を解明するため、2,045分離株（2,045/3,254、62.85%）をロングリードのOxford Nanopore Technologies (ONT) シークエンシング用に選択し、続いてハイブリッドアセンブリー用に選択した。この選択は2段階の戦略に従って行われた。まず、得られたゲノムがNORMコレクションに内在するアクセサリーゲノムの多様性を代表していることを確認するため、1,085株（1,085/2,045、53.06%）を、そのクローン複合体に関係なく、不偏統計的アプローチ（46）を用いて選択した（図S1A）。簡単に説明すると、3,254個のイルミナアセンブリー（7）に対して、Panaroo（バージョン1.2.3）（47）によって計算されたオルソログ遺伝子の存在/非存在行列を考慮した。これらから、k-meansアルゴリズムを用いて、Jaccard距離を考慮してt-sneで計算された次元を縮小したマトリックス上で1,085の分離株を選択した。

次に、4つの主要なExPECクローン（ST73、ST95、ST131、ST69）に注目し、第1段階で選択されなかった残りの分離株（960/2,045、46.94％）の塩基配列を決定した。これにより、4つの主要なExPECクローンにおける特定のプラスミド型の有病率を直接推定することができた。

DNA単離とONT配列決定
2,045株のロングリードシーケンスは、ONTリードに基づくハイスループットマルチプレックスアプローチを用いて行った(46)。すべての分離株は、MacConkey寒天3号（Oxoid Ltd., Thermo Fisher Scientific Inc. 個々のコロニーを1.6mLのLB（Miller）ブロス（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）中で37℃、一晩増殖させた。MagAttract R HMW DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、最終溶出量が100μLになるように細胞ペレットからゲノム高分子DNAを抽出した。NanoDropOne spectrophotometer（Thermo Scientific）およびQubit dsDNA HS assay kit（Thermo Fisher Scientific）を用い、CLARIOstar microplate reader（BMG Labtech, Ortenberg, Germany）で出力濃度とDNAの完全性を測定した。その後、ロングリードシーケンス用にサンプルを400 ngに調整した。ONTライブラリーは、SQK-LSK109(-XL)またはSQK-NBD110-96バーコーディングキットを用いて、それぞれ24バーコーディングおよび96バーコーディングで調製し、サンプルあたり40fmolをFLO-MIN106フローセルにロードした。シーケンシングは、MinKNOW Coreバージョン3.6.0～4.2.5を使用し、GridION（Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）で72時間行った。ベースコールおよびデマルチプレックスは、Guppyバージョン3.2.8～4.3.4を用い、24バーコーディングでは高速ベースコール、96バーコーディングでは高精度ベースコールを行った。

ハイブリッドアセンブリー
ONTロングリードは、https://github.com/arredondo23/hybrid_assembly_slurm で公開されているハイブリッドアセンブリーパイプライン(48)を用いて、既存のショートリードデータ(7)と結合した。このパイプラインは主にUnicycler（バージョン0.4.7）に基づいており、（ほぼ）完全なゲノムの生成を自動化するように設計されている。

合計で1,999ゲノム（1,999/2,045、97.75%）のハイブリッドアセンブリを得ることができた。Unicyclerから得られた各コンティグの長さ、円形度、深さに関する情報を抽出し、下流の解析に利用した。ハイブリッドアセンブリーを個々のコンティグに分割し、circlator（バージョン1.5.5）（49）をfixstartコマンドで使用して各コンティグの開始位置を回転させた。

各コンティグは、mlplasmids (species 'Escherichia coli') (version 2.1.0)とgeNomad (command end-to-end) (version 1.5.0)の予測(50)の両方を考慮して、染色体由来、プラスミド由来、ウイルス由来（バクテリオファージ）のいずれかに分類された。まず、コンティグのサイズが500kbpより大きいか、mlplasmidsの染色体確率が0.7より高く、geNomadの染色体スコアが0.7より高い場合に、コンティグを染色体とラベルした。第二に、コンティグは最小mlplasmids plasmid probabilityが0.3、geNomad plasmid scoreが0.7であればplasmidとラベルされた。これらの設定は、大腸菌モデル(51)を用いたmlplasmidsについて以前に報告された偽陰性予測の数を補正するために用いられた。第3に、前の基準のいずれにも当てはまらないコンティグは、最小geNomadウイルススコア0.7であればウイルス由来と分類した。第四に、残りのコンティグは未分類とした。

ハイブリッドアセンブリーから得られた各コンティグをアノテーションするために、Escherichia属とcoli種を用いたProkka（バージョン1.14.6）（52）を検討した。Abricate（バージョン1.0.1）（https://github.com/tseemann/abricate）とplasmidfinder（53）、ecoli_vf（https://github.com/phac-nml/ecoli_vf）、ecoh（54）のデータベースを組み合わせて、プラスミドレプリコン配列、大腸菌既知の病原性因子（コリシン遺伝子を含む）、大腸菌O-H血清型予測の存在（最小同一性およびカバー率80%）をそれぞれ割り当てるために使用した。AMRFinderPlus（バージョン3.10.18）(55)では、フラグに--plusを使用し、生物としてEscherichiaを使用して、AMR、ストレス応答および病原性遺伝子を同定することも検討した。プラスミドのレプリコン配列の有無、リラクサーゼの有無、mate-pair形成のタイプ、コンティグの予測移動度は、MOB-suiteのモジュールmob_typer（バージョン3.0.3）を用いて計算した（56, 57）。プラスミド多座配列タイピング(pMLST)は、https://bitbucket.org/genomicepidemiology/pmlst (53)にあるpmlst.pyスクリプトを用いて、IncF, IncA/C, IncHI1, IncHI2, IncI1, IncN, pbssb1-familyスキームを用いて計算した。IncFスキームのアノテーションがあるプラスミドについては、過去の文献と関連付けるためにFAB式を報告した。

mge-clusterによるプラスミド由来の配列のタイピング
mge-cluster(バージョン1.1.0)(20)を用いてプラスミドのタイピングスキームを開発するために、環状プラスミド配列を検討した。まず、cd-hit-est (version 4.8.1) (58, 59)を用いて、配列同一性閾値0.99、アラインメントカバレッジ0.9、長さの違いカットオフ0.9で、環状プラスミド配列セット内の冗長性を除去した。Cd-hit-estは合計2,560のクラスターを計算し、そこから1つの代表配列を選んだ。この非冗長プラスミド配列セット（n=2,560）は、unitig filtering varianceを0.01、perplexity値を30、クラスターを定義する最小閾値を30配列として、mge-clusterの-create操作モードの入力とみなされた。得られたmge-clusterタイピングモデルはhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.24305392.v1、新しいプラスミド配列で提示されたクラスタリングシステムの再利用が可能である。cd-hit-estでフィルターされた冗長なプラスミド配列（n=1,925）を埋め込み、mge-clusterの操作モード--existingを用いて、得られたクラスタに割り当てた。各mge-clusterについて、平均プラスミド長の2標準偏差だけ異なる配列はすべて廃棄した。この基準は、プラスミドタイプ(pTs)と呼ばれる同じmge-clusterに同じサイズのプラスミドだけが含まれるようにするためである。

23のmge-clusterに含まれる円形プラスミド配列をsourmash（バージョン4.8.2）でスケッチし（k=31,scaled=1000,noabund）(21)、compareコマンドと-containmentフラグを用いて封じ込めマトリックスを計算した。この行列は、特定のスケッチが2番目のスケッチに含まれる割合に対応する封じ込め値を含んでいる。封じ込め値はmge-cluster内とcluster間で平均された。

記述されたプラスミドクラスターをよく研究されたExPECプラスミドと関連付けるために、mge-clusterの--existing操作モードを使用して、以下の参照プラスミドにmge-clusterを割り当てた： CP000244 (pUTI89), CP007150 (pRS218), CU928146 (pECOS88), CU928148 (p1ESCUM), DQ381420 (pAPEC-O1-ColBM), EU330199 (pVM01), LQHK01000003 (pG150_1) and NC_022651 (pJJ1886_5). これらの参照プラスミドは、すでに研究され文献で報告されている病原性遺伝子（hlyF遺伝子やompT遺伝子など）の存在をさらに同定するために使用された。

さらに、非円形配列のセット（n=932）も、操作モード--existingを用いて、結果として得られたmge-clusterモデルに割り当てたが、ここでもコンティグサイズがクラスタ平均プラスミド長の標準偏差2以内の場合にのみ、mge-clusterによって与えられた割り当てを考慮した。(20)で推定されたパブリックドメインの大腸菌プラスミドームの構造は、最後に-existing操作モードを使用して両者をマージすることにより、本研究で得られたプラスミドームの構造と比較された。結果として得られたプラスミド配列の2つのパーティションを、データの2つのパーティション間の一致性の標準的な尺度である調整ランド指数（adjusted Rand Index）を用いて比較した。この結果、値は0.94（最大1.0）であり、2つのパーティション間の唯一の大きな不一致は、公開されたプラスミド配列の以前の解析でマージされたままであったpT11とpT14の細分化から生じた。

プラスミドのシンテニーと系統解析
最も関連性の高いpT(4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 22)について、mge-clusterによって報告されたメンバーシップ確率値が1.0で、クラスタの最も一般的なpMLSTアノテーションとAMR/ビルレンス遺伝子の内容を代表するプラスミド配列(図2)を選択した(表S2)。これらの配列の開始位置は、circlator（バージョン1.5.5）を用いてfixstartコマンドでIncFIBレプリコンに変更した。デフォルト設定のClinker（バージョン0.0.21）を用いて遺伝子シンテニー解析を行い、遺伝子間のリンクを描くために最小配列同一性0.8（図2）および0.99（図S3）を考慮して、どのゲノムブロックがpTsc間で共有されているかを可視化した。

pTs6,14および10,11の環状プラスミド配列を用いて、組換えなしの系統樹を行った。これらのpTのペアからコアゲノムアラインメントを作成するために、snippy（バージョン4.6.0）（60）を用い、pT6,14と10,11の配列をそれぞれ参照ゲノム30134_6#129_2（pT14）と30224_1#245_5（pT11）にマップした。得られたコアゲノムのアラインメントは、snippyのモジュール（snippy-clean_full_aln）を用いてポリッシュした。Gubbins(バージョン3.1.3)(61)を用いて、100ブートストラップレプリカ、50アルゴリズム反復、RAxML(62)をモデルフィッティング用アプリケーションとして、その他のデフォルト設定(ヌクレオチド置換モデルとしてGTRGAMMA)を用いて、pTの組換えのない系統樹を計算した。

4つの主要ExPECクローンの系統樹の年代測定
4つの主要なExPECクローンをそれぞれその系統に属する参照ゲノムにマッピングし、Gubbins v2.4.1（61）を用いて組換えを除去した。Gubbinsの出力はRパッケージBactDating v1.1.1に供給され、3つのレプリケートと1つのランダム化されたチップデイトで行われた。これらは、Additive Relaxed Clock (ARC)モデル(22)を用いて、10,000,000バーンインで1000状態ごとにサンプリングされた100,000,000世代のマルコフ連鎖モンテカルロ(MCMC)連鎖を実行した。3つの複製MCMC連鎖は、coda Rパッケージ(63)を用いて、mu、sigma、alphaについて約1のゲルマン診断で収束したとみなされた。最初の複製モデルの有効サンプルサイズ（ESS）が200より大きいかどうかをcoda RパッケージのeffectiveSize関数（63）を用いて評価し、真の日付モデルがランダム化日付モデルより優れていると判断した。RのCaveDiveパッケージv0.1.1を使用して、日付の入った系統樹の可能性の高い拡張イベントを検出した(23)。明確なプラスミドの取得日または導入日を報告するために、本文中に信頼区間（CI）の下限と上限を示した。例えば、pT11はST95によって1846年（95% CI 1817-1870）から1922年（95% CI 1904-1937）に獲得された（表S2）。これは本文中では1884年（95％CI 1817-1937）頃に獲得されたと報告されている。

バクテリオシン活性の測定
プラスミドを保有する分離株23-46、27-20、27-61（ST95）および28-33（ST131クレードB）を、0.2mM 2,2'-ビピリジル（鉄の利用性を制限するため；Sigma-Aldrich）を添加した10mLのライソジェニーブロス（LB；LB Broth、Miller、Difco）中で、通気しながら37℃で20時間培養し、マイクロシンVの4つの独立したバッチを作製した。その後、培養液を遠心分離（4000rpm、10分間）し、濾過（0.2μmポリエーテルスルホンフィルター；VWR）し、4℃で保存した。対照として、プラスミドを含まないST131クレードB単離株27-56を同じ条件で処理し、単離株27-61は誘導なしでさらに処理した（2,2'-ビピリジルは添加しなかった）。

コリシンIaのバッチを生産するために、上記の4つのプラスミド保有分離株を10mLのLB中で37℃、通気しながら一晩（15〜16時間）培養し、遠心分離（4000rpm、10分間）した後、ペレットを10mLのPBSに再懸濁した。この懸濁液にUV照射（波長254nm）を36mW/cm2/秒の線量で10秒間行った。これらの照射懸濁液から500μLを9.5mLのLBに接種し、37℃で4時間、通気しながら培養した（光再活性化を防ぐためにアルミホイルで覆った）。その後、培養液を遠心分離し（4000rpm、10分間）、ろ過し（0.2μmポリエーテルスルホンフィルター；VWR）、4℃で保存した。対照として、プラスミドを含まない単離株27-56を同じ条件で処理し、単離株27-61は誘導なしでさらに処理した（UV照射なし）。

大腸菌MG1655と同様に、NORM分離株51株（表S4）を96ディープウェルプレート中の1mL LB中で、37℃で一晩、通気しながら増殖させた。15mLのLB寒天培地（LB with 0.75% agar; Sigma-Aldrich）に、0.1mM 2,2'-ビピリジル（鉄の利用を制限し、コリシン受容体Cirの発現を促進する）を添加したものに、一晩培養した各菌15μLを接種して、インジケータープレートを調製した。各バクテリオシンおよびコントロールバッチ10μLをインジケータープレートにスポットし、乾燥後30℃で一晩インキュベートした。これらのアッセイは独立に3回行った。大腸菌MG1655をさらにバクテリオシンバッチの10倍希釈液に曝露して、特徴的な用量依存性阻害を検証し、ファージ活性を除外した。

感受性のNORM分離株のほとんどはマイクロシンVのみに感受性を示したが、コリシンIaに感受性の6株は両方のバクテリオシンに感受性を示した。上清には両方のバクテリオシンが含まれている可能性があり（少なくとも一方は低濃度で自然産生されるようであるため）、標的細胞において共通のレセプターを持つことから、それぞれのバクテリオシンに対するこれらの菌株の感受性を明確に試験するために、さらなる対照を加えた。ゲノムデータから、いくつかの分離株はバクテリオシンの一方のみをコードしていると予測されたので、そのうちの2株（分離株31-16と31-17）をさらなる対照に用いた。これら2つの分離株は、上述のように、各バクテリオシンに対する特異的誘導の有無にかかわらず処理した。ST95分離株31-17はマイクロシンVのみをコードし、鉄制限条件下で増殖させた場合にのみ阻害を生じた（図4B）。あるいは、ST131-B分離株31-16はコリシンIaのみをコードし、SOS誘導により強いレベルではあるが、常に阻害を生じる（図4C）。このことから、自然に産生される菌はコリシンIaであることがわかる。この株は31-17の上清に対して感受性があり、マイクロシンV遺伝子の欠損（免疫遺伝子の欠如）を検証している。これら2つの上清をそれぞれ上記の6株に対して試験したところ、いずれも6株すべてに対して阻害性を示した（図S10、表S4に表示）。

データの入手可能性
表S1に示した4,759塩基のプラスミド配列は、パーマネントfigshareリンク https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24302884.v1 で公開されている。

図と表の凡例
図S1.
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図S1.
1,999のExPECゲノムについて得られたハイブリッドアセンブリーのゲノム統計。A) STごとに利用可能なアセンブリーの総数を示す棒グラフ。B) 染色体として分類されたコンティグのみを考慮したN50指標（塩基対単位）のボックスプロット。C). 染色体として分類されたコンティグを考慮した長さの合計（塩基対）のボックスプロット。D) プラスミドに分類されたコンティグ（プラスミドームと呼ぶ）の長さの合計（塩基対単位）のボックスプロット。

図S2.
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図S2.
mge-clusterで定義された23のプラスミドタイプ（pT）のSourmash封じ込め解析。含有率の値は0（pTはゲノム領域を共有していない）から1（y軸に示したpTのゲノム領域全体がx軸に示したpTに存在する）まで。

図S3.
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図S3.
遺伝子間のリンクを描くために0.99という厳しい最小同一性閾値を考慮した、主な大型プラスミドタイプ（pT）のクリンカーシンテニーの可視化。病原性遺伝子はシンテニープロットで同定し、その名前を示し、文献または参照プラスミドに従ってキュレーションした。各pTの横には、mge-clusterで作成した埋め込み空間におけるpTの位置を示した。

図S4.
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図S4.
プラスミドタイプ（pT）6, 14（パネルA）と10, 11（パネルB）のペアのプラスミド配列に基づく組換えなしの系統樹。

図S5.
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図S5.
ExPEC系統におけるコリシン遺伝子の有無の分布（図1Aに示す）。各コリシンは、その遺伝子が染色体、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージ）、未分類のコンティグのいずれにコードされているかによって色分けした。

図S6.
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図S6.
つのパンデミックExPECクローンに存在する大きなプラスミドタイプ（pT）のバープロット分布。ST131の場合、プラスミド分布はそのクレード（A、B、C1またはC2）に従って分割された。

図S7.
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図S7.
プラスミドタイプ(pT)とコリシン遺伝子の関連を示す積み重ね棒グラフ。場合によっては、コリシン遺伝子はmge-clusterでは未割り当てのプラスミド配列上に存在し、a-1ラベルで表される。

図S8.
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図S8.
NORM分離株のバクテリオシン感受性。バクテリオシン感受性について実験的に試験した51株の大腸菌NORM分離株の系統樹を剪定したもの（右）。マイクロシンVとコリシンIaに対する感受性は、ヒートマップではそれぞれ青で示され、黄色はバクテリオシン不感受性（効果が検出されない）を示す。典型的なpcolV様溶菌プラスミドを保有する株は灰色で示した。

補足表S1. 本原稿で検討したプラスミド配列（n=4,759）（環状4,174、非環状585）の品質管理フィルター後の報告。各配列は'Sequence'カラムに基づいて一意に識別される。プラスミドを保有する菌株の識別子（'Genome'）と、関連する分離年、ST、および（該当する場合は）ST131クレードを示す。各プラスミドについて、配列を23の重複しないグループ（'mge_cluster(pT)'）にタイプ分けするためのmge-clusterの操作モードと、関連するtsne座標（'mge_cluster_tsne1D'および'mge_cluster_tsne2D'）を提供する。さらに、Plasmidfinderによって各プラスミドで見つかったレプリコン、そのpmlstアノテーション（該当する場合）、AMRFinderPlusによって報告されたAMR遺伝子とそのクラス、およびecoli_vfデータベース（大腸菌の既知の病原性因子のキュレーションデータベース）を使用してAbricateによって報告された病原性遺伝子を報告する。

補足表S2. 各プラスミドタイプ（pT）について推定されたプラスミドの特徴のまとめ。各タイプに割り当てられた配列の数は、最初にそのタイプに属すると予測されたが、報告された平均プラスミド長の2標準偏差以上の差がある配列をフィルタリングした後に報告されている。報告された平均長さは、各タイプの円形配列のみを考慮して計算された。優勢なレプリコン、pMLSTおよび予測される移動度は、与えられた型に割り当てられたプラスミドに対する多数決に対応して報告される。報告された病原性遺伝子のリストは、Abricateに存在するecoli_vfデータベースで報告された遺伝子に基づいて独自に作成された。完全な概要と多様性解析については、補足表S1を参照。

補足表S3. 4つのExPECクローンの中で最も一般的なプラスミドタイプの取得日。pT3およびpT14（ST95）の場合、これらはクローンのMRCAによって導入されたため、取得日は1つである。報告された各日付について、BactDatingによって与えられた95％信頼区間（CI）を示す。

補足表S4. 実験に使用した株。各菌株について、内部コレクション番号およびNORM配列識別子（またはラボ株の代替識別子）を示す。NORMゲノム配列で同定された特徴（プラスミドpColV、バクテリオシン遺伝子、シデロフォアシステム）は、存在（+）または非存在（-）で示す。マイクロシンV（col V）およびコリシンIa（col Ia）に対する実験的感受性は、感受性（S）または不感受性（I）で示した。

謝辞
The Norwegian E. coli BSI Study Groupを形成する協力者： Nina Handal（Akershus University Hospital）、Nils Olav Hermansen（Oslo University Hospital, Ullevål）、Anita Kanestrøm（Østfold Hospital）、Hege Elisabeth Larsen（Nordland Hospital）、Paul Christoffer Lindemann（Haukeland University Hospital）、Iren Høyland Löhr（Stavanger University Hospital）、 Åshild Marvik（Vestfold Hospital）、Einar Nilsen（Molde Hospital and Ålesund Hospital）、Marcela Pino（Oslo University Hospital, Rikshospitalet）、Elisabeth Sirnes（Førde Hospital）、Ståle Tofteland（Sørlandet Hospital）、Kyriakos Zaragkoulias（Nord-Trøndelag Hospital Trust）。Genomic Support Centre Tromsø, UiT The Arctic University of NorwayによるOxford Nanoporeシークエンシングの支援、François Cléonによる優れた技術支援に感謝する。

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2023年10月14日掲載
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• bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv (submit.medrxiv.org)が開設されたことに伴い、Clinical Trials と Epidemiology のサブジェクトカテゴリーは新規投稿を締め切りました。臨床試験の結果を報告する新規論文は、medRxivへの投稿が必須となりました。ほとんどの疫学論文もmedRxivに投稿されるべきですが、論文に健康に関する情報が含まれていない場合、著者は他のbioRxivの主題カテゴリー（例えば、遺伝学や微生物学）に投稿することもできます。

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