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インスピレーションを与える科学Cell Pressジャーナル
細胞宿主微生物
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論文|第32巻第4号、p527-542.e9、2024年4月10日

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相反する食事、マイクロバイオーム、代謝産物のメカニズムが、遺伝的に影響を受けやすい宿主における炎症性腸疾患を制御する

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00060-X


ガブリエル・ヴァスコンセロス・ペレイラ 10
マリー・ブドー 10
マティス・ウォルター
キャサリン・A・イートン
マヘーシュ・S・デサイ 11
エリック・C・マーテンス 11, 12
すべての著者を表示

脚注を表示するオープンアクセス掲載:2024年3月20日DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.03.001
PlumXメトリクス

ハイライト

食物繊維を欠乏させた腸内細菌叢はIl10-/-マウスにおいて致死的な大腸炎を引き起こす

粘液溶解性腸内細菌は粘液を弱め、炎症性免疫反応を促進する

細菌性IgAコーティングの変化とNK細胞の増加が炎症に先行する。

排他的経腸栄養は細菌のイソ酪酸を促進し、炎症を抑える。
概要
炎症性腸疾患（IBD）は、自然発生的な腸の炎症によって特徴づけられる慢性疾患であり、先進工業国の集団で増加している。宿主の遺伝と相まって、食事と腸内細菌がIBDに大きく関与していると考えられているが、そのメカニズムはまだ解明されていない。IBD関連サイトカインであるインターロイキン-10を欠損させたマウスにおいて、食物繊維を欠乏させた腸内細菌叢が大腸粘液の劣化を促進し、致死的な大腸炎を引き起こすことを示した。炎症は、ナチュラルキラー細胞の増殖といくつかの細菌の免疫グロブリンAコーティングの変化から始まる。致死性大腸炎は、粘液の薄い領域で最初に炎症を引き起こすムチン分解菌の活性増加に対するTh1免疫応答によって引き起こされる。食物繊維を含まない経腸栄養食も粘液浸食を誘発するが、同時に抗炎症性細菌の代謝産物であるイソ酪酸を増加させることによって炎症を抑制する。我々の知見は、IBDに関与する分類群ではなく微生物の機能に注目することの重要性と、食事が介在する機能の中には疾患を促進する機能に対抗しうるものがあることを強調している。
図抄録
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キーワード
マイクロバイオーム
炎症性腸疾患
粘液
食物繊維
はじめに
炎症性腸疾患（IBD）は、胃腸（GI）管における自然発生的な炎症期間を特徴とし、腸管抗原、特に通常は無害な共生腸内微生物に対する不適切な免疫応答を引き起こす基礎的な遺伝子変異を有する人に発症する1。また、素因となる遺伝子が存在する場合でも、必ずしもIBDが発症するとは限らないことから、宿主の遺伝や腸内微生物以外にも重要な「誘因」が必要であることが示唆されている3。
工業化に伴う食生活の変化（食物繊維の減少、加工食品、乳化剤、糖類の増加）は、IBDの発症を促進する潜在的な誘因として浮上してきており6,7,8,9、その根本的なメカニズムも明らかにされつつある7,9。腸内に生息する微生物の生理は、食事、特に上部消化管での消化を逃れて大腸に到達し、微生物の栄養となる食物繊維多糖類の影響を受け続けている10,11,12。低食物繊維、高糖質、その他「欧米化」食を与えたマウスを用いたいくつかの研究では、ムチン分解菌の活性の増加、粘液の厚さの減少9,13,14,15,16,17,18、粘液透過性の増加19など、粘液バリアの完全性の低下と相関するマイクロバイオームの変化が示されている。
われわれは、IBD関連サイトカインであるインターロイキン-10（IL-10）を欠損したマウスを用いて、食物繊維とムチン分解性腸内細菌が炎症の発症に寄与しているかどうかを調べた。ヒトでは、IL-10またはその受容体サブユニットのいずれかが欠損すると、乳幼児や小児にIBDが早期に発症する20。従来のIL10-/-マウスでは、自然炎症が発生するが、その程度はマウスのコロニーによって異なり、Enterococcus faecalisやHelicobacter spp.などの病原菌の存在によって悪化する21 このように、Il10-/-マウスの炎症には腸内細菌が必要であるが、病原性を持たない常在菌が存在する場合の疾患進行のメカニズムは不明である。
われわれの研究は、IBDの発症において、微生物の機能がプラスとマイナスの影響に焦点を当てるべきであるという考えを浮き彫りにしている。粘液分解のようなこれらの機能の一部は遺伝学的に複雑であり、分類学的あるいはメタゲノム学的データから予測することは困難であるため、ヒトでの研究に先立って、IBDに寄与する個々の機能をメカニズムレベルで研究できる簡便な系を使用する必要がある。
研究結果
宿主の遺伝的感受性、低食物繊維、腸内細菌の組み合わせがIl10-/-マウスの大腸炎を悪化させる
我々は以前、野生型（WT）無胚葉マウスに、塩基配列が決定され代謝学的に特徴づけられたヒト腸内細菌の14種（SM14）を含む合成微生物叢をコロニー形成させると、食物繊維フリー（FF）食を与えたマウスでは大腸粘液のびらんが生じ、Citrobacter rodentium感受性が上昇することを明らかにした13。注目すべきは、同じSM14をコロニー形成し、食物繊維の豊富な（FR）食を与えたマウスでは粘液浸食が起こらないことである。これは、腸内細菌による食物繊維の代謝が、ムチンを分解する種の存在量と活性を減少させるためである13。遺伝的にIBDに罹患しやすいマウスにおいて、食餌および微生物叢に起因する粘液浸食と、それに伴う宿主組織への細菌の接近の増加が、疾患を促進するかどうかを調べるため、炎症に最も抵抗性であると報告されているC57BL/6J背景を選択し、無菌のIl10-/-マウスにSM14を導入した21。7-10週齢の成体Il10-/-マウスにFR食を与えてコロニー形成させ、コロニー形成14日後に一部のマウスをFF食に切り替え、60日まで体重をモニターした（図1A）。FR食を与え続けたマウス（n = 14）は体重を維持または増加させた。対照的に、FF食に切り替えたマウスは、食餌切り替え後1-2週間で体重が減少し始め、60日までに89%の死亡率を示した（n = 27）。組織学的には、FF食を与えたマウスの盲腸では好中球浸潤、粘膜びらん、潰瘍形成、浮腫がみられたが、FR食を与えたマウスではみられなかった（図1B）。これらのマーカーは回腸と結腸では低かった（図1C）。いずれの餌を与えたSM14結腸WTマウスでも、盲腸炎症は発症しなかった（図1D）。リポカリン-2（LCN-2）-好中球、炎症を起こした上皮細胞、マクロファージ23に由来する炎症の指標-を糞便内腔で測定したところ、FF食を与えたSM14コロニー化Il10-/-マウスにおける重度の炎症を支持する追加データが得られた（図1E）。食餌（FRおよびFF）、コロニー形成（SM14および無菌）、および宿主の遺伝子型（WT、Il10-/-）の個々の変数を個別に操作した実験では、重篤な炎症と体重減少は3つの条件下でのみ発症するという結論が支持された： IL-10欠乏、SM14コロニー形成、FF食（図1D、1E、S1A-S1D）。
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図1IL10-/-マウスにおける低繊維駆動性炎症
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SM14でコロニー形成したIl10-/-マウスをFF食に切り替えると、繊維分解菌（B. ovatusおよびE. rectale）が減少し、既知の4種類のムチン分解菌のうち2種類、A. muciniphilaおよびB. caccaeの存在量が増加することを特徴とする細菌組成の変化が急速に誘導された（図S1E）。同様の傾向はFF食を与えたWTマウスでも観察されたが、Il10-/-マウスでは大腸菌とバクテロイデス・テタイオタミクロンのレベルが有意に高かった（図S1FおよびS1G）。予想通り、Il10-/-マウスにFF食を与えると、粘液の厚みが減少した（図S1H-S1K）。我々は、このような保護粘液の侵食は、上皮と細菌との接触を増加させ、制御不能なIl10-/-免疫系を増加させることにより、IBDの発症に重要であるという仮説を立てた。この考えを支持するために、細菌サイズの蛍光ビーズを用いたex situ粘液透過性アッセイ24を行ったところ、FF-fed Il10-/-マウスはFR-fedマウスに比べて、大腸粘液透過性が高く、1μmサイズのビーズが宿主上皮に近接していることがわかった（図1F、1G、S1L、S1M）。この粘液透過性の増加は、SM14を与えたWTマウスではそれほど顕著ではなかった（図1Fおよび1G）。
IL-10の機能障害に関連するヒトの疾患は、しばしば小児の早期発症または超早期発症のIBDとして現れる20。このことを念頭に置いて、私たちは新生児期に自然な微生物叢の移入ができるようにモデルを改良し、同じく出生時にコロニー形成される従来の特異的病原体フリー（SPF）マウスと直接比較できるようにした。我々は、FR食を与えた無菌Il10-/-成体親マウスをコロニー形成させ、その仔マウスが出生時から母親のSM14に暴露されるようにした。離乳前の仔マウスでは、食物繊維がないことと、ミルクオリゴ糖がムチンのO-糖鎖と共通に結合していることから、SM14はFF飼料を与えた成体マウスと同様の組成となった（図S1N）25,26。FF飼料で離乳させた仔マウスは、離乳後約39日（dpw）から体重が減少し始め（図1H）、84dpwまでに100％死亡した（図1I）。ほとんどの実験では、79dpw（ミシガン大学の施設では100日齢）でFR食群とFF食群を採取したが、この場合、FFマウスの死亡率は約82％であり、FR食に離乳したマウスはすべて生存した（図S1O）。FRを与えた別グループのマウスは、129dpw（合計150日）飼育した場合、どちらの飼料を与えたWTマウスと同様に100％の生存率を示した（図1I）。FF食で離乳した仔マウスの体重減少は、体重減少と同時期（約39dpw）に始まった糞便中LCN-2の増加と対応していた（図1J）。
興味深いことに、FF食を与えた従来のSPF微生物叢を持つIL10-/-マウスは、SM14をコロニー形成したマウスほど体重が減少しなかった（図1H）。FF食を与えたSM14コロニー化マウスと比較すると、SPFマウスは79dpwで糞便LCN-2が低く（図1K）、組織学的損傷も少なかった（図S1P）。しかしながら、FF食を与えたSPFマウスは、SM14コロニー化マウスより有意に減少が少ないとはいえ、粘液の厚さの減少を示した（図1L）。
食物繊維の回復が炎症を抑制する
FR食とFF食は、食物繊維以外にもいくつかの点で組成が異なる（表S1）。食物繊維の寄与をより直接的に調べるため、FF食に含まれるグルコースの7.5％を、オーツ麦、小麦、リンゴから採取した同量の食品グレードの純粋な食物繊維に置き換えたバージョンを作成した。高糖質は、Il10-/-マウスを含め、炎症を促進することが示されており、この影響は、糖質の一部を宿主によって小腸で消化されるデンプンに置き換えることで軽減される9。食物繊維添加食の糖質を減らす対照として、消化性の高いデンプンを7.5％含む食餌を作り、遊離グルコースを、上部消化管消化によって宿主が利用できるグルコースポリマーに置き換えた。デンプンではなく、3つの供給源のいずれかから7.5%の食物繊維を摂取させると、LCN-2（図1M）だけでなく、体重減少および病理組織学的所見も有意に減少した（図S2AおよびS2B）。すべてのグルコース（44％）を消化可能なデンプンに置き換えた場合でも、SM14でコロニー形成された成体マウスは発病した（図1M、S2AおよびS2B）。この高デンプン食は、デンプン質食品、タンパク質、脂肪に富んでいると予想される繊維質の乏しいヒトの食事により近く、なおかつ炎症を促進することから、このモデルでは腸内細菌叢への遊離糖の直接供給は主要な要素ではないことが示唆される。食物繊維に含まれると予想される多糖類をよく分解するB. ovatusは主要な反応菌のひとつであり、相対的な存在量が2～3倍増加し、この増加はムチンを分解するAkkermansia muciniphilaとBacteroides caccaeを犠牲にして生じた（図S2C～S2G）。
疾病を促進するFF食をすでに与えていたマウスに食物繊維を回復させることで炎症が抑制されるかどうかを調べるため、コロニー形成した成体マウスを30日または40日後（FF食に切り替えてから16日または26日後）にFR食に戻した。FF食に戻したマウスの両群とも、致死的な体重減少はみられず（図S2H）、60日後のLCN-2レベルと組織像は、FF食で維持したマウスよりも低かった（図1Nと1O）。興味深いことに、糞便中のLCN-2を経時的に測定したところ、両群とも食物繊維が回復した後に炎症のピークを迎え、その後減少に転じた。このことは、低食物繊維が宿主-微生物ホメオスタシスの崩壊を引き起こし、炎症は遅発性で、最終的にはリセットされることを示している（図1P）。
粘液層の状態は炎症発症の重要な決定因子である。
ムチン分解菌の疾患促進作用をより直接的に評価するために、ムチンオリゴ糖で増殖できないことが以前に示された10種（「SM10」）のみを含む、より単純な合成微生物叢でIL10-/-成体マウスをコロニー形成させた。ムチン分解菌を除去すると、粘液の菲薄化も減少した（図2CおよびS2I）。注目すべきは、SM10をコロニー形成したマウスは依然としていくらかの炎症を示していたことである（図2B）。ムチン分解菌の不在は、調節不全に陥ったIl10-/-免疫系の炎症活性化を遅らせるが、完全には阻止しないという考えと一致して、136日間（コロニー形成合計150日間）FF食に切り替えたSM10コロニー形成マウスは、FF食SM14マウスと比較して有意に良好な生存率（50％）を示した（図2D）。
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図2食餌誘導性炎症の中心をなす粘液の完全性
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SM10マウスに単一のムチン分解菌を追加しても、60日後にSM14マウスで観察されたのと同じレベルのLCN-2は誘発されず、複数の菌種が相乗的に作用している可能性が示された（図2A）。60日後の体重減少およびLCN-2の低下にもかかわらず、B. thetaiotaomicronまたはA. muciniphilaのいずれかを唯一のムチン分解物質として存在させると、60日後の盲腸において、完全なSM14と統計的に同じ組織学的炎症が誘発された（図2Bおよび2E）。ムチンを分解するB. thetaiotaomicronをSM10に戻して150日間行った実験では、致死的体重減少が有意に促進され（図2D）、盲腸でより悪化した組織学的炎症を引き起こした（図2F）。このように、この常在菌はIl10-/-宿主において条件付き病原体のように働く。興味深いことに、SM+Btを60日以上コロニー形成したマウスでは、LCN-2が上昇することなく、盲腸の組織像が上昇した（図2G）。最後に、低食物繊維がムチン分解菌の一般的な増殖を促進するという考えと一致して、SM10と単一のムチン分解菌でコロニー形成したマウスはすべて、そのムチン分解菌の増殖を示した（図S2J-S2O）。これは、SM14をコロニー形成したマウスが低繊維に反応してAkkermansia muciniphilaとB. caccaeの拡大のみを示したのとは対照的であり（図S2J）、いくつかのムチン分解菌が他のムチン分解菌に勝っていることを示唆している。
食物繊維食は、ムチン分解細菌を阻止する役割とは無関係の機序で炎症を抑制する可能性がある。FR食における粘液の保護的役割の別の試験として、Il10-/-Muc2-/-ダブルノックアウトマウスを飼育し、SM14をコロニー形成させ、FR食またはFF食を与えた。これらのマウスはすぐに体重が減少し、食餌に関係なく犠牲にする必要があり（図2H）、両群とも重度の炎症を示した（図2I-2L）。興味深いことに、MUC2が一様に除去されると、DKOマウスの炎症は下部腸全体に及んだが、盲腸よりも結腸でより重症であった（図2K-2M）。盲腸の粘液は結腸に比べて薄く、パッチ状であることが知られているので28、このことは、SM14で結腸したIl10-/-マウス（すなわち、MUC2を持つマウス）の盲腸で炎症が最初に起こることを意味すると解釈される。なぜなら、この部位は細菌密度が高く、粘液がパッチ状であるため、粘液バリアが最初に破綻する場所だからである（小腸も粘液は薄いが、細菌ははるかに少ないことに注意）。
我々はさらに、DKOマウスを活用して、Il10-/-および欠損した粘液バリアという状況下で、異なる系統の細菌（例えば、パターン認識レセプターに対するリガンドの種類が異なる）がどのように炎症を引き起こすかを測定した。この系では、様々な常在細菌が炎症を刺激しうるという結論を支持するものとして、2つの異なるバクテロイデーテス（B. thetaiotaomicronとB. uniformis）、A. muciniphila（疣贅蝸牛）、Eubacterium rectale（ファーミキューテス）の単コロニー化が、LCN-2のバリエーションはあるものの、すべて強い炎症を引き起こすことが観察された（図2N-2Q）。
ヒトの腸内共生細菌の中には、マイクロバイオーム間で移行可能な病原性を持つものがある。
FF食を与えたSPFマウスはSM14コロニーマウスほど深刻な炎症を発症しなかったので（図1Hと1K）、SPFコロニーマウスとSM14コロニーマウスの母親から生まれた仔マウスを離乳時に混合し、互いのマイクロバイオームに暴露させる同居実験を行った。SM14コロニーを形成したIl10-/-仔マウスをSPFマウスと同居させると、FF給餌に反応して観察された体重減少の表現型が抑制された（図3A）。しかし、LCN-2（図3B）や組織学的検査（図3C）で測定されるceal inflammationは減少せず、むしろわずかに増加した。SPFの母親から生まれた同居マウスは、より多様な反応を示し、これらのマウスの一部は、FFを与えたSM14コロニー化マウスと同程度の重症度の炎症を発症した（図3Bおよび3C）。糞便中のLCN-2の時間経過を解析したところ、同居SPFマウスと非同居SPFマウスの間にはより大きな違いがあり、同居SPFマウスはFF飼育SM14マウスとほぼ同じ挙動を示した（図3D、紫色の実線）。
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図3離乳後のSPFマウスとSM14コロニーマウスの同居は病気を悪化させる
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16S rRNA遺伝子の塩基配列決定から、SM14の少なくとも6つのメンバーが、同居させたSPFマウスで検出され、多くの場合、一過性に、あるいは炎症が発症した時期の終わりに近い時期に検出された（図3E-3GおよびS3A-S3I）。これらの侵入細菌の中で最も顕著であったのは、ヒト常在菌である大腸菌HS株であった。HS株は、同居SPFマウスにおいて、炎症発症前の28dpw頃に出現し、徐々に増加し、最終的にはほとんどのマウスで10％を超えるレベルに達した（図3E、紫色の実線）。ムチンを分解するSM14菌のうち2菌（A. muciniphilaとBa. intestinihominis）は、マウス個体間でばらつきがあり、より低いレベルに達したものの、同様の傾向を示した（図3Fと3G）。他の2つの細菌（C. aerofaciensとB. uniformis）は、炎症が増加した頃（約48dpw）に一過性の増加を示し、その後これらの細菌は減少した（図S3DとS3E）。大腸菌HSを週1回、SM14菌に曝露していないSPFマウスに投与しても、大腸菌HSが炎症増加の唯一の原因であるという仮説を支持することはできなかった（図S3JおよびS3K）。これらの結果を総合すると、我々の食餌主導型モデルの妥当性は、より複雑な群集にまで拡大され、SM14細菌の1つ以上が条件付き病原性を持っていることがさらに示唆された。
排他的経腸栄養に関連する特定の腸内細菌と代謝産物は、粘液浸食にもかかわらず炎症を防ぐ
病気を促進するFF食の特筆すべき特徴は、その主要栄養素組成が、いくつかのIBDの治療に臨床的に用いられている経腸栄養(EEN)食に似ていることである(表S1)。30。食物繊維を欠いたEEN食が我々のgnotobiotic Il10-/-モデルにおいて炎症を促進するかどうかを調べるため、SM14コロニーを形成した仔マウスを市販のEEN食に離乳させた。このEEN食は通常液体として摂取されるが、今回は凍結乾燥し、ペレット状にして滅菌した。15匹のマウスの平均体重の軌跡から、低繊維質のEEN食は、FF食ほどひどくはないが、ある程度の体重減少を促進するという結論が支持された（図4A）。頭頸部LCN-2測定と組織学的検査から、個体によって疾病にかなりのばらつきがあることが明らかになり、あるマウスは健康なFR食マウスに似ており、あるマウスは疾病を起こしたFF食マウスに似ており、あるマウスはその中間であった（図4Bと4C）。炎症が少ないにもかかわらず、EENマウスは粘液の厚さの減少を示したが、これは繊維の欠如から予想されたことであった（図4D）。短鎖脂肪酸と分岐鎖脂肪酸（SCFAsとBCFAs）を測定したところ、EEN食を与えたマウスでは、BCFAsの1つであるイソ酪酸の量が43.2倍から723.0倍（平均133.4倍）増加しており（図4E）、BCFAsの生産量が増加することで炎症が抑制される可能性が示唆された。
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図4EEN食はイソ酪酸産生を介して部分的に炎症を改善する。
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イソ酪酸は、よく研究されている抗炎症性SCFAである酪酸の異性体であるが、これは増加しなかった（図4E）。イソ酪酸は、特定の腸内細菌によるL-バリン発酵に由来する31。他の2つのBCFA（2-メチル酪酸およびイソバレレート）は、それらがL-ロイシンおよびL-イソロイシンに由来するアミノ酸がEEN製剤に使用された大豆および乳タンパク質中に同程度の存在量32であるにもかかわらず、増加しなかった（図4E）。このことから、イソ酪酸の増加は、3 種類の BCFA すべてを増加させるはずのバルクの食餌性タンパク質発酵の増加に起因するものではないことが示唆される。イソ酪酸または酪酸（35 mM）を疾患促進FF飼料を与えたマウスの飲料水に添加すると、体重減少（図4F）だけでなく炎症（図4Gおよび4H）も減少し、これらの分子のいずれかが、食餌および微生物によって誘導された損傷を相殺できることが明らかになった。
EENの給餌はSM14に有意な変化を促し、特にE. rectaleの相対量が211-278倍（平均255.6倍）に増加した（図4I、赤いアスタリスクの付いた列を比較）。このファーミキューテは酪酸を産生することが知られているが、L-バリンを添加した培地で13種のSMの培養上清を測定した結果、E. rectaleは試験した条件下ではイソ酪酸を産生しないことが明らかになった。むしろ、イソ酪酸は4種のバクテロイデス類全てとM. formatexigensによって産生された（図4J）。それにもかかわらず、E. rectaleの存在量の大幅な増加がイソ酪酸産生と機能的に関連しているかどうかを調べるために、E. rectaleを欠くSM14（「SM14マイナスE. rectale」）を保有する両親から生まれた新生児マウスを繁殖させ、EEN食を与えた。イソ酪酸産生におけるE. rectaleの役割と一致して、E. rectale欠損マウスはイソ酪酸を産生できなかった（図4K）。これらのマウスは79dpwで40％の死亡率を示したが（図4L）、EEN/SM14群と比較して、糞便中のLCN-2レベルや組織学的な有意な増加は認められなかった（図4Mおよび4N）。これらの所見を総合すると、EENの摂食は、より炎症性の高いFF食と同様の粘液減少を誘発するにもかかわらず、変動はあるものの、炎症を減少させることが明らかになった。
ムチン分解細菌は、食物繊維の欠乏によって誘発される炎症性免疫反応を、時間および場所に依存して媒介する。
腸管炎症の発症は、自然免疫反応と適応免疫反応を含む複雑なプロセスであり、Th1/Th17細胞の重要な役割は、従来型/SPFマウスのIl10-/-大腸炎モデルで報告されている21。それにもかかわらず、特定の微生物がどのように免疫経路に影響を及ぼすのか、また、どのように反応が経時的に進展するのかは、あまり明らかになっていない。我々は、上述のSM14とSM10（非ムチン分解性群集）のコロニー形成実験を、別の系統のC57BL/6JのIl10-/-マウス（マウス施設：ルクセンブルク大学）を用いて繰り返し、検証したところ、SM14でコロニー形成した成体マウスと離乳後のFF飼育マウスの両方で、SM10ではなく、同様の体重減少が観察された（図S3L-S3N）。Il10-/-マウスのFF-fed SM14（より速い大腸炎）およびSM10コロニー形成（より遅い大腸炎）における大腸炎表現型の時間的変化を考慮すると、我々のモデルは、微生物トリガー（すなわち、ムチン分解物の有無）だけでなく、食物繊維欠乏時の微生物ムチン採食の増加に関連する炎症経路の領域性（盲腸対結腸）の寄与を調べるユニークな機会を提供する。
FFでSM14をコロニー形成させたマウスでは、FRと比較して、盲腸でLCN-2の増加が35dpwの時点で検出され、この食餌効果はSM10でコロニー形成させたマウスや無菌状態のマウスでは観察されなかった（図5A）。FF食で離乳させたSM14マウスは、79dpwの時点でSM10マウスよりも高い糞便中（大腸の代用）LCN-2を示し、食物繊維欠乏時のムチン分解菌の炎症性役割を支持した（図5A）。ナチュラルキラー（NK）細胞の拡大は、35dpwになるとすぐにFFを与えたマウスの盲腸で検出され、この拡大はSM10-およびSM14-コロニー化マウスで同様であった（図5B、左パネル；フローサイトメトリーソーティングのスキームについては図S4Aを、フローサイトメトリー実験の生殖細胞なしのIl10-/-およびSM14-コロニー化WTコントロールについては図S4B-S4Iを参照）。盲腸で観察されたパターンとは対照的に、NK細胞は35dpwになるとすぐに、FRおよびFFで飼育したSM14コロニー化マウスの大腸で拡大したが、SM10コロニー化マウスの大腸では拡大しなかった（図5B、右パネル）。このことはさらに、粘液が厚く、接触を増加させるために分解が必要な大腸では、ムチン分解細菌が反応を惹起する上でより重要であることを示唆している。また、食餌-宿主遺伝子型相互作用によって駆動される領域特異的な宿主応答も観察された。FF飼育のGF Il10-/-マウスは、SM14またはSM10をコロニー形成したWTマウスではなく、FR飼育のコントロールと比較して、79dpwの時点で盲腸ではNK細胞の増加を示したが、結腸では見られなかったからである（図S4B）。
図5ムチン分解
図5低繊維誘導性免疫応答を介するムチン分解細菌
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NK細胞は35日目に多く、その後減少したが、T細胞の動員は時間とともに増加し、SM10-およびSM14-コロニー化Il10-/-マウスの盲腸と結腸の両方で、一般に79dpwに最高レベルに達した（図S4CおよびS5A）。SM10-およびSM14-コロニー化Il10-/-マウスの両方の盲腸において、FF食は35dpwまでにCD4+およびCD8+ T細胞集団を増加させ、CD4+ T細胞は食餌とは無関係に79dpwまでにさらに増加した（図5Cおよび5D）。しかしながら、CD4+ T細胞は、FFを与えたGF Il10-/-マウスの陰窩にも経時的に蓄積した（図S4D）。一方、CD8+ T細胞は、SM14をコロニー形成したWTマウスの陰窩および大腸と同様に、GF Il10-/-マウスの陰窩でもFFの摂食によって誘導された（図S4E）。これらの結果は、食物繊維の欠乏が複数の経路を通じてT細胞集団のリクルートを誘導し、そのすべてがムチン分解細菌、微生物叢、IL-10の欠乏によって制御されているわけではないことを示唆している。
従来のマウスのIL10-/-大腸炎に関する記述21と一致して、SM10-およびSM14-コロニーを形成したマウスは、一般に経時的にTh1およびTh17細胞の浸潤を示し（図5Eおよび5F）、Th2細胞の変化は少なかった（図S5B）。IL-10欠損にもかかわらず、Foxp3＋制御性T細胞（Treg）のリクルートも、SM14 Il10-／-マウスのFF摂食中に高かった（図S5C）。興味深いことに、Tbet、RORγt、またはGata3を発現するTregサブセットは、同じ傾向を示さなかった（図S5D〜S5F）。Tbet+Treg細胞の存在量は、炎症性Th1細胞と同じ傾向を示し、FF餌を与えたSM14結腸マウスではより高レベルであったが（図S5D）、Gata3+ TregはFF餌を与えた結腸で増加した（図S5F）、 非常に抑制的なRORγt+ Treg集団は、Il10-/-マウスの結腸では35日後、盲腸では79日後に減少し（図S5E）、炎症反応を促進した。Th17細胞については、盲腸と結腸の両方において、この浸潤はFF食マウスではFR食マウスに比べて高く、SM14コロニー化マウスではSM10コロニー化マウスに比べて高かった（図5F）。対照的に、FF食はSM14コロニー化した大腸のTh1レベルを増加させたが、SM10コロニー化した大腸では増加させなかった（図5E）。
糞便組織におけるサイトカインタンパク質の測定から、成体としてSM14でコロニー形成された食物繊維欠乏Il10-/-マウスでは、IBD関連マーカーIL-1β、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α、およびIFN-γの増加が明らかになった（図S6A-S6F）。さらに、免疫細胞プロファイルの機能的な裏付けを得るために、出生時にコロニー形成したマウスの35dpwと79dpwのケカと腸間膜リンパ節におけるTh1型とTh17型のサイトカインの転写レベルを比較した。SM14でコロニー形成されたIL10-/-マウスでは、FF食によりTh1サイトカイン（IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-12）およびTh17サイトカイン（IL-17F、IL-22、IL-23、TGF-β）、ならびにムチン誘導性サイトカインIL-13の発現が増加した（図5G-5IおよびS6G-S6R）。SM14 Il10-/-マウスのFF摂食中のFoxp3+制御性T細胞（Treg）の拡大（図S5C）は、IL-10とは無関係であることから、TGF-βのような他の制御性メディエーターによって駆動されるメカニズムが示唆される。興味深いことに、SM14コロニーを形成したマウスの糞便では、Th1とTh17の両方のサイトカインが35dpwで誘導されたが、79dpwではTh1サイトカインのみが維持された（図S6G-S6N）。これらのサイトカイン応答は、SM10をコロニー形成させたケカでは、SM14をコロニー形成させたマウスと比較して、よりゆっくりと発達する傾向があり、Th1およびTh17サイトカインの両方が、FFを与えたSM10コロニー形成マウスでは79dpwまでに増加した（図S6G-S6N）。ナイーブT細胞が活性化および極性化される結腸排出腸間膜リンパ節（MLN）では、Th17関連サイトカインであるIL-17FおよびIL-22は、SM10およびSM14コロニー化マウスの両方で、FF給餌によりFRと比較して増加した（図5GおよびS6Q）、 一方、Th1偏光性サイトカインであるIFN-γ、IL-6およびIL-12は、SM14コロニー化マウスでのみ増加し、Th1応答を発現するためのムチン分解細菌への依存性と一致した（図5H、5IおよびS6P）。以上の結果から、IL10-/-マウスでは、ムチン分解細菌による大腸粘液の劣化が、時間的および腸管部位特異的に、抗微生物応答だけでなく病原性Th1応答の誘導を促進することが明らかになった。
IgA-微生物叢相互作用の変化は炎症に先行する
IgA産生は腸における一般的な抗微生物反応であり、ヒト33およびマウスモデルにおける大腸炎時には通常上昇する34。初期炎症で観察されたLCN-2の傾向（図5A）を反映して、SM14コロニーを形成したIl10-/-マウスをFFで飼育すると、35日後の盲腸および79日後の糞便において、可溶性IgA力価がFRと比較して上昇したが、SM10コロニーを形成したマウスでは上昇しなかった（図6A）。しかし、長時間のFF給餌（79dpw）により、盲腸と結腸の両方で血漿およびIgA産生細胞が枯渇し、この損失はSM14でコロニー形成されたFF給餌WTマウスでも観察された（図S7AおよびS7B）。分泌されたIgAのレベルが上昇した（図6A）ことを考えると、これは驚くべきことであるが、高繊維食と比較してゼロ繊維食を与えたWTマウスの小腸で血清IgAの力価が低下し、IgA+ B細胞が減少したことを示した以前の研究と一致している35。FF給餌後のIgA産生細胞の減少と並行して、IgG産生B細胞の割合は、SM14コロニー化Il10-/-マウスの盲腸と結腸の両方で、35dpwと79dpwの時点で増加していた（図S7CとS7D）。ムチンを分解する細菌の存在下でTh1サイトカインが大量に産生されることと一致して、FFの摂食によってIgG産生細胞の割合が増加したのはSM14-結腸だけで、SM10-結腸では増加しなかった（図S7D）36。
図サムネイルgr6
図6食物繊維の欠乏はIgAと細菌の相互作用を変化させる
キャプション
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以前の研究34と一致して、79dpwの時点で、IgAでコートされた細菌の総量は、FF飼育マウスの方がFR飼育マウスよりも多かった（図6B）。内腔IgAの増加（図6A）とともに、このFF食による総IgAコーティングの増加は、SM10コロニー化マウスでは観察されなかったが、SPF Il10-/-マウスおよびSM14コロニー化WTマウスでは観察されたことから、ムチン分解細菌によるメカニズムが支持された（図6CおよびS8A）。興味深いことに、IgAでコートされた細菌の分析から、FR給餌マウスには2つの異なるコート集団が存在することが明らかになった：低コーティングの大きな集団と高コーティングの小さな集団であり、両集団はFF給餌に対して異なる反応を示した（図6D）。低コーティング細菌の割合はFF飼育マウスで増加したが、高コーティング細菌はFF飼育マウスでは21日目にはほとんど完全に消失した（図6D-6FおよびS8B）。さらに、SM10コロニーを形成したFFマウスでは、SM14コロニーを形成したFFマウスと同様に、21dpwになるとすぐに高被覆細菌が減少し、低被覆細菌は79dpwまでにわずかに増加しただけであった（図6E、6F、S8C）。すなわち、ムチン分解菌とは無関係に起こる高被覆の急速な消失と、ムチン分解菌に部分的に依存し、IgAの分泌増加に関連すると考えられる低被覆および総被覆の後期の増加である。興味深いことに、SM14-colonized Il10-/-マウスの粘液減少ではなく大腸炎を抑制したEEN食は、FFを与えたマウスと比較して、21dpwの時点でIgAでコーティングされた細菌の割合を増加させ、高コーティングの集団を維持した（図S8D）。
全体的なIgAコーティングのパターンが変化したことから、個々のSM14細菌のIgAコーティングを調べた。高度にコーティングされた細菌が早期に消失したのと同様に、SM14メンバーのIgAコーティングの変化も、FF摂食21日目にして現れた（図6GおよびS8E）。SM14メンバーのうち、A. muciniphila、D. piger、E. coliおよびC. aerofaciensは、Il10-/-マウスをFFで飼育した場合、一方または両方の時点でIgAコーティング指数（ICI）値の減少を示した（図6GおよびS8E）。WTマウスでは、このFF食によるIgAコーティングの減少は、A. muciniphilaではそれほど深刻ではなかったが、D. pigerとC. aerofaciensではより顕著であり、IL-10の欠乏が種に依存して常在菌のIgAコーティングに影響を及ぼすことが明らかになった。対照的に、E. rectaleはFR給餌マウスで低いICIを示し、これはFF給餌により増加した（図6G）。
考察
IBDの病態生理は複雑で変化に富んでいるが、その一因は、IBDの発症に影響を及ぼすことが知られている、あるいはそのように仮定されている環境、微生物、食餌の誘因に、多くの異なる遺伝的要因が組み合わさっているためである。今回検討した食事誘発性炎症モデルは、Il10-/-に関連した炎症に関与する因子をメカニズムレベルで検討できるケーススタディであると同時に、宿主の遺伝的、微生物叢的、食事的変数を操作して疾患発症に及ぼす影響を検討できる、より一般的な実験パラダイムでもある。自然発生的で遺伝的な腸内炎症の例が次々と明らかになる中38,39,40、これらのマウスモデルを無菌／ノトビオティックな条件下で、決められた食事とともに研究することは、これらの複雑な疾患に関する基本原理を明らかにする可能性を秘めている。
我々の知見から支持される重要な概念は、細菌の相反する機能が疾患の転帰に影響を及ぼすということである。低繊維によって誘発される粘液浸食は有害であるが、そのほとんどはヒトのSM14群集の一部のメンバーが病原性を持ち、その炎症促進作用をSPFマウスに移す可能性があると考えられる。EEN摂食中も粘液浸食は起こるが、イソ酪酸産生によって相殺される。イソ酪酸産生は食餌の影響を受け、またE. rectaleの影響を受ける。従って、これらのデータは、EENに陽性反応を示す患者がイソ酪酸の増加も示すかどうかを調べるための、ヒトにおける今後の研究のための実用的な仮説を提示している。実際、この研究の弱点のひとつは、イソ酪酸産生が、ヒト糞便をコロニー形成させた無菌Il10-/-マウスのような、より複雑な微生物叢との関連で調べられていないことである。このような将来的な実験では、E. rectaleの存在に基づいてドナーのサンプルを層別化し、この種の存在が産生と相関するのか、あるいは他の細菌がE. rectaleが果たすまだ知られていない役割の代用となり得るのかを明らかにすることが重要であろう。E.rectale依存性のイソ酪酸産生を促進する成分を特定するために、EEN配合物を分解することも、EEN配合物の最適化につながる可能性がある。
盲腸から始まり結腸に伝播するFF食誘発性病態の地域性は、繊維欠乏微生物叢の影響を受ける粘液の性質によるものと思われる。盲腸の緩い粘液は、食物繊維が豊富な条件下ではすでに微生物叢と宿主との接触をより多く可能にしている。このため、食物繊維を欠乏させた微生物叢の影響は、微生物叢のムチン分解活性によって厚い粘液層が劣化してから接触が増える結腸よりも、盲腸の方が早く感知される。興味深いことに、Th1反応もTh17反応も微生物叢によって制御されることが知られているが、Th1反応は、サイトカイン（図S6）および免疫細胞プロファイル（図5）によって明らかにされるように、盲腸と結腸の両方において、Th17反応よりもムチン分解細菌に依存していた。このことは、Th1応答が細胞傷害性の組織損傷を引き起こす一方で、Th17応答も上皮保護機能をサポートすることから、ムチン分解菌の免疫原性役割を支持する。
炎症性細胞プロファイリングとともに、免疫応答における役割があまり理解されていないTregサブセットの浸潤も報告した。TbetやRORγtを発現するTreg細胞は、それぞれ炎症性Th1細胞やTh17細胞のカウンターレギュレーターとして提唱されている。拡大するGata3+ Tregが2型炎症細胞を特異的に制御する役割はまだ不明であるが、結腸では79dpwまでに、組織修復に必要なTregのリザーバーを構成している可能性がある43,44。最後に、Tregの一般的な拡大にもかかわらず、抑制性の高いRORγt+サブセットの早期（35dpw）欠損とIL-10の欠乏が、FFを与えたSM14マウスにおいてTh1/Th17反応の繁栄を可能にしていると考えられる。Treg細胞は、IL-10欠損のためにこの大腸炎モデルではほとんど見過ごされてきたが、今回の結果は、食物繊維と微生物叢によって制御される免疫抑制の別のメカニズムを支持するものであり、さらなる注意が必要である。
IgAは粘液中に最も多く含まれるタンパク質のひとつである45。IgAの分泌は重要な抗微生物メカニズムであり、IgAコーティングは潜在的に大腸病原性の高い細菌を同定することが提唱されている46。我々の結果は、食物繊維の欠乏が、IgA産生形質細胞の消失とともに、IgA-微生物叢相互作用の早期破壊を引き起こす可能性を示唆している。
IBDと呼ばれる多因子疾患の発症に関しては、多くの疑問が残されている。宿主の遺伝は、IL-10シグナルを欠く小児への幹細胞移植を例外として、修復が困難な永続的な形質である47が、マイクロバイオーム、特に食事は、疾患を遅延させたり、逆転させたりするために操作可能な因子である48。その根拠は、ムチン分解のような代謝経路は多様な細菌に存在し、粘液の浸食において同様の役割を果たす生物もいれば、そうでない生物もいるからである。これとは対照的に、同じ種の菌株でも、粘液分解をはじめとする主要な代謝能力が異なる場合があり、バクテロイデスの菌株間で大きく異なることが知られている49。IBD発症に対するマイクロバイオームの影響を、微生物が示す特定の行動や代謝産物によって引き起こされる一連の正負の刺激の累積と考えるならば、粘液浸食のような有害な事象を減らしながら、有益なプロセス（酪酸やイソ酪酸など）を最適化することが可能なはずである。
STAR★メソッド
主要資源表
試薬またはリソースソース識別子
抗体
eF450-conjugated anti-mouse B220/CD45R (RA3-6B2) eBiosciences Cat#48-0452-82; RRID:AB_1548761
BV650 標識抗マウス B220/CD45R (RA3-6B2) BD Cat#563893; RRID:AB_2738471
APC 標識抗マウス CD138 (281-2) Biolegend Cat#142506; RRID:AB_10960141
eF506 標識抗マウス CD19 (1D3) eBiosciences Cat#69-0193-82; RRID:AB_2637306
BV711 標識抗マウス CD3 (17A2) Biolegend Cat#100241; RRID:AB_2563945
FITC 標識抗マウス CD335/NKp46 (29A1.4) Biolegend Cat#137606; RRID:AB_2149150
BV605標識抗マウスCD4 (RM4-5) Biolegend Cat#100548; RRID:AB_11125962
BV780-conjugated anti-mouse CD45 (30-F11) BD Cat#564225; RRID:AB_2716861
PE-Cy5 標識抗マウス CD8 (53-6.7) Biolegend Cat#100710; RRID:AB_312748
PE-eF610 標識抗マウス EOMES (Dan11mag) eBiosciences Cat#61-4875-82; RRID:AB_2574614
eF450-conjugated anti-mouse FoxP3 (FJK-16s) eBiosciences Cat#48-5773-82; RRID:AB_1518812
PE 標識抗マウス GATA3 (16E10A23) Biolegend Cat#653804; RRID:AB_2562723
FITC 標識抗マウス IgA (mA-6E1) eBiosciences Cat#11-4204-83; RRID:AB_465222
FITC 標識抗マウス IgA（ポリクローナル） Southern Biotech Cat#1040-02; RRID:AB_2794370
PerCP-Cy5.5 標識抗マウス IgD（11-26c.2a） Biolegend Cat#405710; RRID:AB_1575115
PE 標識抗マウス IgE (RME-1) Biolegend Cat#406908; RRID:AB_493291
PE-Cy7 標識抗マウス IgG (Poly4053) Biolegend Cat#405315; RRID:AB_10662421
PE-Cy5 標識抗マウス IgM (R6-60.2) BD Cat#553409; RRID:AB_394845
APC 標識抗マウス RORgt (AFKJS-9) eBiosciences Cat#17-6988-82; RRID:AB_10609207
PE-Cy7 標識抗マウス Tbet (4B10) Biolegend Cat#644824; RRID:AB_2561761
ウサギ抗マウス IgA Novus Biologicals, Bio-Techne Cat#NB7506; RRID:AB_524451
マウスIgAアイソタイプコントロール UNLB Southern Biotech Cat#0106-01; RRID:AB_2714214
ホスファターゼアルカリ標識ヤギ抗マウス IgA Southern Biotech Cat#1040-04; RRID:AB_2794372
リン酸塩タブレット Sigma Cat#S0642-200 TAB
マウス BD Fc ブロック™（ラット抗マウス CD16 および CD32） BD Pharmingen Cat#553141; RRID:AB_394656
抗 FITC マイクロビーズ Miltenyi Biotec 130-048-701; RRID:AB_244371
ムチン 2 抗体 (H-300) Santa Cruz Biotechnology SC-15334; RRID:AB_2146667
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG Invitrogen A11008; RRID:AB_143165
細菌およびウイルス株
Akkermansia muciniphila： DSM 22959、タイプ株 DSMZ Cat#DSM 22959
バクテロイデス・カッカエ DSM 19024、タイプ株 DSMZ Cat#DSM 19024
バクテロイデス・オバタス DSM 1896、タイプ株 DSMZ Cat#DSM 1896
バクテロイデス・テタイオタミクロン： DSM 2079、タイプ株 DSMZ Cat#DSM 2079
バクテロイデス・ユニフォーミス ATCC 8492、タイプ株 ATCC Cat#ATCC 8492
バルネシエラ・インテスティニホミニス（Barnesiella intestinihominis）： YIT11860 DSMZ Cat#DSM 21032
クロストリジウム・シンビオサム： DSM 934、タイプ株、2 DSMZ Cat#DSM 934
Collinsella aerofaciens： DSM 3979、タイプ株 DSMZ Cat#DSM 3979
Desulfovibrio piger： ATCC 29098、タイプ株 ATCC Cat#ATCC 29098
大腸菌 HS ATCC N/A
Eubacterium rectale： DSM 17629、A1-86 DSMZ Cat#DSM 17629
Faecalibacterium prausnitzii： DSM 17677、A2-165 DSMZ Cat#DSM 17677
Marvinbryantia formatexigens： DSM 14469、タイプ株、I-52 DSMZ Cat#DSM 14469
Roseburia intestinalis： DSM 14610、タイプ株、L1-82 DSMZ Cat#DSM 14610
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
酢酸 100％ Carl Roth Cat#6755.1
クロロホルム、99.8+%、分析用認定 AR、アミレンで安定化、 Fisher Chemical Fisher Scientific Cat#10122190
メタノール Carl Roth Cat#4627.6
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1, v/v, pH 8.05) Thermo Fisher Scientific Cat#15593031
塩化ナトリウム、≥99.5 %、p.a.、ACS、ISO Carl Roth Cat#3957.1
TRIS、PUFFERAN® ≥99,9 %、p.a. Carl Roth Cat#4855.2
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 Carl Roth Cat#X986.2
ドデシル硫酸ナトリウム Fisher Scientific Cat#BP166
イソプロパノール、 エクストラピュア、 SLR、 Fisher Chemical Fisher Scientific Cat#10477070
エタノール VWR Cat#1.08543.0250
RNAprotect 組織試薬 QIAGEN Cat#76106
TRIzol™ 試薬 Fisher Scientific Cat#15596018
炭酸-炭酸水素緩衝液 Sigma Cat#C3041
Invitrogen™ ランダムプライマー Fisher Scientific Cat#10646313
Thermo Scientific™ DNase I、RNase フリー Fisher Scientific Cat#10649890
Invitrogen™ SuperScript™ IV Reverse Transcriptase Fisher Scientific Cat#15317696
Invitrogen™ Platinum™ Taq DNA ポリメラーゼ Fisher Scientific Cat#10358742
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase フリー蒸留水 Fisher Scientific Cat#12060346
Invitrogen™ SYBR™ Green I Nucleic Acid Gel Stain、DMSO 中 10,000 倍濃縮液 Fisher Scientific Cat#10710004
Invitrogen™ dNTP セット (100 mM) 溶液 Fisher Scientific Cat#10083252
Invitrogen™ RNaseOUT™ 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 Fisher Scientific Cat#10154652
Tween-20 Sigma Cat#P1379
トリズマ塩基 Sigma Cat#T1503
トリズマ-アセテート Sigma Cat#T1258
塩化カリウム、CELLPURE® ≥99 % Carl Roth Cat#HN02.2
ウシ血清アルブミン Sigma Cat#A9647
ゾンビ NIR™ フィクサブル・バイアビリティー色素 BioLegend Cat#423105
ウシ胎児血清 Gibco Cat#10500 - 064
塩化マグネシウム (MgCl2 × 6H2O) Sigma Cat#M9272
正常ヤギ血清 Imtec Diagnostics Cat#0060-01
ギブコ™ ヤギ血清、ニュージーランド原産 フィッシャー Cat#11540526
HEPES Buffer、正常食塩水中 1 M ストック Westburg Cat#LO BE17-737E
SYTO™ 60 赤色蛍光核酸染色 Invitrogen Cat#S11342
パラホルムアルデヒド Sigma Cat#441244
パラフィン Sigma Cat#18512
キシレン、98.5% 以上、ACS 試薬、キシレン＋エチルベンゼン、Honeywell™ Riedel-de Haën™ Fisher Scientific Cat#15692690
クエン酸ナトリウム Fisher Cat#S279
Invitrogen™ ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI, P36931 Fisher Scientific Cat#11549306
Invitrogen™ SYTO™ 9 緑色蛍光核酸染色 Fisher Scientific Cat#10237582
塩化ナトリウム、≥99.5 %、p.a., ACS, ISO Carl Roth Cat#3957.1
リン酸カリウム、一塩基性 Carl Roth Cat#P018.1
酢酸ナトリウム三水和物 Carl Roth Cat#HN05.1
硫酸マグネシウム Carl Roth Cat#P027.1
塩化カルシウム二水和物 Carl Roth Cat#HN04.2
ピルビン酸ナトリウム塩 Carl Roth Cat#8793.1
L-グルタミン酸 Carl Roth Cat#1743.1
炭酸水素ナトリウム Carl Roth Cat#HN01.2
エチレンジアミン四酢酸 Sigma Cat#EDS
揮発性遊離酸ミックス Sigma Cat#CRM46975
13C-短鎖脂肪酸便混合物 Sigma Cat#SBR00035-1mL
3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩 Sigma Cat#N21804
EDAC 塩酸塩 Sigma Cat#341006
HPLC グレードのピリジン Sigma Cat#270407
LC-MS グレードのアセトニトリル Sigma Cat#34851
LC-MS グレードの水 Sigma Cat#270733
LC-MSグレードギ酸Sigma Cat#5438040450
寄託データ
Co-house 16s rRNA NCBI PRJNA1088095
重要な市販アッセイ
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN Cat#69506
バッファATL QIAGEN Cat#19076
プロテイナーゼ K QIAGEN Cat#19133
RNeasy Mini Kit QIAGEN Cat#74106
マウスリポカリン-2/NGAL デュオセット ELISA R&D Biosystems Cat#DY1857
ZymoBIOMICS™ 微生物群集 DNA スタンダード Zymo Research Cat#D6306
ラミナプリア解離キット Miltenyi Biotec Cat#130-097-410
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscences Cat#00-5523-00
BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences Cat#554714
実験モデル 生物／系統
マウス B6.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium N/A
野生型マウス C57BL/6J Germ-Free Mouse Facility - University of Michigan and University of Bern/A
マウス C57BL/6J Muc2-/- アルバート・アインシュタイン大学 N/A
マウス C57BL/6J Il10-/- Muc2-/- 本研究 N/A
マウス C57BL/6J Il10-/- 無菌マウス施設 - ミシガン大学 N/A
オリゴヌクレオチド
サイトカイン Il5 順位 TGAGGCTTCCTGTCCCTACT Eurogentec
サイトカイン Il5 Reverse CCACACTTCTCTTTGGCGG Eurogentec
サイトカインIL6 フォワード TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Eurogentec
サイトカインIL6 逆行 TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Eurogentec
サイトカイン Il10 順位 CTGCCTGCTCTTACTGACTGG Eurogentec
サイトカイン Il10 逆行 TGGGAAGTGGGTGCAGTTATT Eurogentec
サイトカインIL12p40 フォワード TGTGGAATGGCGTCTCTGTC Eurogentec
サイトカイン Il12p40 Reverse GCCTTTGCATTGGACTTCGG ユーロジェンテック
サイトカイン Il13 順位 CCTGCTGCTTGCTTGCCTT Eurogentec
サイトカイン Il13 逆行 GGTCTTGTGATGTTGCTCA Eurogentec
サイトカイン Il17f フォワード GGTAGCAGCTCGGAAGAACC ユーロジェンテック
サイトカイン Il17f 逆方向 TGGAATTCACGTGGACAGA Eurogentec
サイトカイン Il22 順位 TCGTCAACCGCACCTTTATG Eurogentec
サイトカインIL22 逆行 CCCGATGAGCCGGACA Eurogentec
サイトカインIL23 フォワード TGGAGCAACTTCACACCTCC Eurogentec
サイトカインIL23 逆行 GGGCAGCTATGGCCAAAAAG Eurogentec
サイトカイン Il33 順位 CGTTCTGGCCTCACCATAAGA エオジェンテック
サイトカインIL33 逆方向 CCGTGGATAGGCAGAAGT Eurogentec社
サイトカインIfng 順方向 ATGAACGCTACACTGCATC Eurogentec社
サイトカインIfng 逆位 CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC Eurogentec社
サイトカインTnfaフォワードAGCCCACGTCGTAGCAAACユーロジェンテック
サイトカインTnfa 逆行 GATAGCAAATCGGCTGACGG 欧州Gentec社
サイトカインTgfb フォワード TGATACGCCTGAGTGGCTGTCT ユーロジェンテック
サイトカインTgfb 逆位 CACAAGAGCAGTGAGCGCTGAA ユーロジェンテック
Hsp90 フォワード CAGAAGGCTGAGGCAGACAA ユーロジェンテック
Hsp90 Reverse ATCATGCGGTAGATGCGGTT Eurogentec社
合成微生物叢 14種プライマー Desai et al.13 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
SoftMax Pro 7 ソフトウェア Molecular Devices N/A
FlowJo BD Biosciences N/A
BacSpace Earle et al.14 N/A
Zen 3.0 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A
mothur v1.42.3 Schloss et al.50 N/A
Imaris Oxford Instruments Imaris N/A
Agilent Masshunter Workstation ソフトウェア LC/MS データ収集 (6400 シリーズトリプル四重極 MS 用) バージョン B.08.02 Agilent Technologies N/A
その他
酸洗浄ガラスビーズ（212-300 mm） Sigma-Aldrich Cat#G1277
嫌気チャンバー、ビニール製タイプ A およびタイプ B Coy Laboratory Products N/A
384 ウェルマイクロプレート Greiner Cat#781061
SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダー Molecular Devices Cat#ABS PLUS
gentleMACS ディソシエーター Miltenyi Biotec 130-096-427
NovoCyte Quanteon フローサイトメーターシステム 4レーザー ACEA Biosciences / Agilent 2010097
70μm濾過ふるい Clear Line 141379C
QuadroMACS™セパレーター Miltenyi Biotec 130-090-976
LSカラム Miltenyi Biotec 130-042-401
ツァイス アポトーム ツァイス 中止品
顕微鏡 Axio Examiner KMAT Carl Zeiss Microscopy GmbH 491406-9880-010
ビーズアッセイ用灌流チャンバー Gustafsson et al.24 N/A
FluoSphere™ カルボン酸ビーズ, 1 μm, 赤 580/605 Invitrogen F8821
スクリューキャップチューブ、1.5 ml、無菌、白色キャップ Greiner 716261
マイクロチューブ、PP、2 ml、スクリューキャップ Greiner 723261
ステンレスビーズ、5 mm QIAGEN 69989
白色PCRプレート（25枚） Bioplastics AB70659
レッチェ ミキサーミル MM 400 フィッシャーサイエンティフィック 10573034
レッチェ PTFEアダプターラック フィッシャーサイエンティフィック 10122852
CFX96TM リアルタイムシステム（C1000 サーマルサイクラー） Biorad 1855195
Implen™ NanoPhotometer™ N60 マイクロボリューム UV-VIS 分光光度計（N60-Touch） Fisher Scientific 15442203
Agilent Technologies Triple Quad 6470 LC/MS システムは、1290 Infinity II LC フレキシブルポンプ (クォータナリポンプ) で構成されています。
1290 Infinity II マルチサンプラ、1290 Infinity II マルチカラムサーモスタット（6 ポートバルブ付き）、6470 トリプルクワッド質量分析計 Agilent Technologies リファレンス
Waters Acquity UPLC BEH TSS C18カラム（2.1 x 100mm、1.7μm）カラム Waters N/A
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リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトである Eric Martens (emartens@umich.edu) までご連絡ください。
材料の入手可能性
本研究に関連する菌株およびデータは、主担当者に要請すれば、関係者が入手可能である。
データおよびコードの利用可能性

この研究で使用可能なすべてのデータは、要求があれば主担当者が共有する。

本論文ではオリジナルのコードは報告しない。

本論文で報告されたデータの再解析に関する追加要請は、要望に応じて主担当者から受けることができる。
実験モデルと被験者の詳細
動物モデル、コロニー形成食、サンプル処理
ミシガン大学での動物実験は、ミシガン大学動物飼育使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：IACUC）により承認されたプロトコールに従い、免許を持った獣医師が監督した。無胚芽B6.129P2-IL10tm1Cgn/JZtmマウス（Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium, Hannover, Germany）および野生型C57BL/6J（University of Bern, Switzerland）は、ルクセンブルク大学の動物施設で飼育され、ルクセンブルク大学の動物実験倫理委員会およびルクセンブルク大公国の農業・ブドウ栽培・農村開発省（Ministre de l'Agriculture, de la Viticulture et du Development rural du Grand-Duché du Luxembourg (LUPA 2020/20)）によって承認されたプロトコールを実施した。生後7～10週齢の無菌のオスとメスをコロニー形成し、これらのマウスはいずれも過去の実験や治療に関与していない。マウスは単独で、あるいは適切な性別、群数、食餌実験群に分けられた。餌とオートクレーブ滅菌蒸留水は自由摂取とした。マウスの体重を測定し、下痢、脱出、一般的な健康状態について少なくとも週1回モニターし、体重減少を経験し始めた動物では毎日のモニターに増やした。C57BL/6Jバックグラウンドに交配したMuc2-/-マウスは、Leonard Augenlicht（Albert Einstein University）から入手した。Il10-/- Muc2-/-ダブルノックアウト（DKO）の作製には、Il10-/- Muc2+/-を作製するまで、シングルKOマウスを交配してダブルヘテロ接合体マウスを得た。完全なダブルKOマウスは、長期の飼育期間中に無菌状態で自然脱腸を起こしたため、すべての実験に使用したダブルKOマウスの作製には、Il10-/- Muc2+/-マウスを使用した。遺伝子型判定は、耳パンチ（Transnetyx）からDNAを抽出することにより行った。マウスは6-8週目に合成微生物叢を経口投与され、既述のように食餌変更を行った。合成微生物叢細菌は、経口投与用の群集形成に先立ち、それぞれの培地13または改変YCFA培地51で増殖させた。細菌は、混合ガス（85％N2、10％H2、5％CO2）を用いて、光学密度（吸光度600 nm）が0.5～1.0になるように維持した嫌気性雰囲気下で培養した。各細菌を等量混合し、密封したスクリューキャップチューブに分注した。各マウスに、実験に応じて0.2 mlの特定の群集を、2～3日間連続して、調製したての接種液で経口投与した。開始時の体重の20%以上が減少したマウスを人道的終点とし、これらのマウスを体重減少および生存曲線における致死数としてカウントした。動物の安楽死は、現地で承認されたプロトコールに従い、5分間のCO2 窒息後に頸椎脱臼を行うか、直接頸椎脱臼を行った。消化管は自己融解を防ぐために速やかに回収し、切片を分離した。各動物の盲腸および結腸内容物は液体窒素で急速冷凍し、さらに使用するまで-80℃で保存した。
FR飼料（Lab Diet 5013）およびFF飼料（Envigo-Teklad TD.130343）については既報13。EEN飼料はNestle Nutren 1.5を使用し、凍結乾燥後、Envigo rodent dietsに送付してペレットに成型し、袋詰めして使用前にガンマ線照射した。リンゴ（Vitacel AF401）、オート麦（Vitacel HF600-30）および小麦（Vitacel WF200）繊維は、J. Rettenmaier（Schoolcraft, MI, USA）から入手し、FF飼料中のグルコース量が対応するように減少するように、7.5% w/wでFF飼料に添加した。可溶性高消化性デンプンはCargill社（Gel Instant 12412）から提供された。
方法の詳細
DNA抽出
糞便および糞便サンプルからのDNAは、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, USA)を用いたビーズ打ちフェノール：クロロホルム抽出法を用いて単離した。つまり、サンプルを10-50 mgの間で秤量し、酸洗浄したガラスビーズ（212-300 mm; Sigma-Aldrich、米国）、500 μlの緩衝液A（200 mM NaCl、200 mM Tris、20 mM EDTA、210 uL SDS（20%w/v、フィルター滅菌済み）、および500 μlのフェノール：クロロホルム（Thermo Fisher Scientific、米国、Cat#15593031）と合わせた。サンプルは、Mini-Beadbeater-16（Biospec Products、米国）またはビーズビーター（RETSCH MM 400 Mixer Mill、Cat#10573034）を用いて30Hz、室温で3分間破砕した後、遠心分離した（10,000rpm、4℃、3分間）。水相を回収し、穏やかに反転させて等容量のフェノール：クロロホルムと混合し、遠心分離した（10,000rpm、4℃、3分間）。残りの水相を回収し、500μlのクロロホルムと混合し、穏やかに反転させて混合し、遠心分離した（10,000rpm、4℃、3分間）。回収した水相を1容量のイソプロパノールと1/10容量の3M酢酸ナトリウムと混合し、-80℃で20分間保存してDNAを沈殿させた。サンプルを遠心分離（15,000rpm、4℃、20分）し、上清を捨て、70％エタノールで洗浄し、風乾した後、ヌクレアーゼを含まない水に懸濁した。サンプルDNA抽出物は、DNeasy Blood & Tissue Kitを用いて、製造元のプロトコールに従ってさらに精製した（QIAGEN）。
RNA抽出、逆転写およびqPCR
新鮮な回腸、盲腸および遠位結腸組織をRNAprotect™ Tissue Reagent（QIAGEN）に移し、4℃で1週間保存した。その後、RNAprotect™を除去し、さらに使用するまで組織を-80℃で保存した。凍結組織を1mlのTRIzol試薬（Invitrogen™）に移し、ビーズビーター（RETSCH MM 400 Mixer Mill、Cat#10573034）上で5mmの金属ビーズを用いて30Hzで8分間ホモジナイズした後、13,000rpm、4℃で3分間遠心した。上清を回収し、200μlのクロロホルムと十分に混合し、室温で2～3分間インキュベートした後、13,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。水相を回収し、500μlのイソプロパノールと転倒混和し、室温で10分間インキュベートした後、13,000rpm、4℃で10分間遠心分離した。ペレットを1mlの70％エタノールで洗浄し、10,000rpmで5分間遠心した。上清を捨て、ペレットを37℃で5-10分間乾燥させ、50μlのヌクレオチドを含まない水で再懸濁し、56℃で15分間インキュベートした。最後に、サンプルをThermo Scientific DNase1, RNase-free Protocolに従ってDNaseで処理し、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてメーカーの指示に従ってRNAを精製した。最終RNA濃度はNanodrop分光光度計を用いて定量した。
糞便中のリポカリン-2（LCN-2）の測定
凍結した糞便および糞便サンプルを用いて、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によりリポカリン-2タンパク質（LCN-2）の存在を定量した。あらかじめ凍結しておいたサンプル（糞便：-80℃、糞便：-20℃）を新しいチューブに入れ、5～5mgの間で秤量した。秤量中、サンプルはドライアイス上で保管した。サンプルを1mLのPBS（pH7.4）に懸濁し、30秒間ボルテックスし、4℃で一晩静置してホモジナイズした。その後、試料を広範囲にボルテックスして均一な溶液にした。LCN-2レベルを測定するために、DuoSet mouse lipocalin-2/NGAL ELISA kit (R&D Biosystems, USA)を使用した。定量は製造元のプロトコールに従った。
糞便中の可溶性IgAの測定
可溶性 IgA 濃度を測定するため、384 ウェルマイクロプレート（Greiner 社、Cat#781061）に 10 ng/well のウサギ抗マウス IgA（Novus Biologicals 社、Bio-Techne NB7506）を 20 μl/well の炭酸-炭酸水素緩衝液（Sigma 社、Cat#C3041）中で一晩コートした。Washing Buffer（1％ Tween-20、154 mM 塩化ナトリウム、10 mM Trisma-base）で4回洗浄した後、Blocking Buffer（15 mM Trizma-acetate、136 mM 塩化ナトリウム、2 mM 塩化カリウム、1％（w/v）BSA［ウシ血清アルブミン］）を75μl加えた。室温で 2 時間後、ウェルを再度洗浄した。検体均一溶液と標準液（マウス IgA アイソタイプコントロール UNLB、Southern Biotech、Imtec Diagnostics、Cat#0106-01）を希釈バッファー（15 mM Trizma-acetate、136 mM 塩化ナトリウム、2 mM 塩化カリウム、0.1%(w/v) Tween-20、1% BSA）で希釈し、20 μl/ウェル、室温で 90 分間プレート内でインキュベートした。洗浄後、希釈バッファーで1/1000に希釈したホスファターゼアルカリ標識ヤギ抗マウスIgA（Southern Biotech, Imtec diagnostics, Cat#1040-04）を20μl/ウェル加え、室温で90分間インキュベートした。最終洗浄後、40μl/ウェルの基質（10mLの基質バッファー（1mM 2-amino-2-methyl-1-propanol, 0.1mM MgCl2 × 6H2O）に溶解した1リン酸錠（Sigma, ref S0642-200 TAB）を加えた。プレートを37℃で60分間インキュベートした後、ELISAプレートリーダー（SpectraMax ABS Plus Microplate Reader、Molecular Devices社製、ソフトウェア）を用いて405 nmの吸光度を測定した： ソフトウェア：SoftMax Pro 7 Software、Molecular Devices）を用いて405 nmの吸光度を測定した。IgA濃度は、調製した標準曲線を用いて各試料について測定した。
短鎖および分岐鎖脂肪酸の定量
短鎖および分岐鎖脂肪酸（SCFAs）標準混合物はSigma社から入手した（Cat#CRM46975）。13C-短鎖脂肪酸便混合物（Sigma, Cat#SBR00035-1mL）を内部標準（IS）として使用した。分析試薬グレードの3-ニトロフェニルヒドラジン（3NPH）-HCl（Cat#N21804）、EDAC-HCl（Cat#341006）；HPLCグレードのピリジン（Cat#270407）；LC-MSグレードのアセトニトリル（Cat#34851）、水（Cat#270733）、ギ酸（Cat#5438040450）もSigma-Aldrichから購入した。作業標準溶液は、10 mMのストック溶液から、新たに調製した水中50%(v/v)のアセトニトリルを用いてnMの範囲まで連続希釈を行うことにより作成した。化学的誘導体化プロトコールは、Han et al.52から改変した。簡単に言うと、20μLの作業標準溶液またはサンプルを、40μLの50%アセトニトリル水溶液中の200mM 3NPH、同じ溶媒中の120mM EDAC-6%(v/v)ピリジン溶液、および4μLのISと混合し、Verexガラスバイアルに入れた。混合物を40℃で30分間反応させた。反応後、10%アセトニトリル中の0.1%ギ酸溶液96μLを加えて反応をクエンチした。その後、反応溶液30μLを新しいHPLCバイアルに移し、各溶液の2μLアリコートをLC-MS/MS装置に注入した。各修飾 SCFA は、Agilent Optimizer 2.0 を通して、検出のために Agilent MS で最適化されました。最適化されたすべての SCFA 情報を組み合わせ、LC-MRM MS メソッドを作成しました。各 SCFA の保持時間は、2 つのトランジションから決定されました。次に、MRM MSメソッドを、最終的なLC-MS/MS取得メソッドのすべてのRTとMS情報を持つダイナミックMRM MSまたはdMRM MSメソッドに変換した。
LC-MS/MS 分析は、Agilent Technologies Triple Quad 6470 LC/MS システム (1290 Infinity II LC Flexible Pump (Quaternary Pump)、1290 Infinity II Multisampler、1290 Infinity II Multicolumn Thermostat with 6 port valve、6470 triple quad mass spectrometer) で実施しました。キャリブレーション、化合物の最適化、およびサンプルデータの取得には、Agilent Masshunter Workstation ソフトウェア LC/MS データ取得 for 6400 シリーズ トリプル四重極 MS (バージョン B.08.02) を使用します。
カラムにはWaters Acquity UPLC BEH TSS C18カラム（2.1 x 100mm、1.7μm）を使用し、移動相（A）は0.1%ギ酸水溶液、移動相（B）は0.1%ギ酸アセトニトリル。グラジエントプログラム：移動相(B)を15%で1分間保持し、19分で55%まで上昇させ、20分で99%まで上昇させ、2分間保持した後、初期状態に戻し、4分間保持した。カラムは40℃に保たれ、2μlのサンプルが0.3ml/分の流速でLC-MSに注入された。6470 MS のキャリブレーションは、Agilent ESI-Low Concentration Tuning Mix を用いて行いました。ソースパラメーター：ガス温度300℃、ガスフロー5 l/min、ネブライザー45 psi、シースガス温度250℃、シースガスフロー11 l/min、キャピラリー-3500 V、デルタEMV -200 V。各化合物のdMRMトランジションとその他のパラメータは別シートに記載した。デルタ保持時間プラスマイナス1分、フラグメンター40eV、セル加速器5eVをメソッドに組み込んだ。データ解析は、Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis for QQQ B.10.00 で統合しました。結果は、さらなる解析のためにCVSファイルにエクスポートされた。
大腸固有層細胞抽出およびフローサイトメトリー解析
製造元の指示に従い、Lamina Propria Dissociation KitおよびgentleMACS Dissociators（Miltenyi Biotec社、ドイツ）を用いて、盲腸および大腸のlamina propria細胞を抽出した。消化後、細胞をPB緩衝液（PBS、pH7.2、0.5 % BSA入り）に再懸濁し、計数した。転写因子の発現を伴うT細胞およびNK細胞の解析には、Foxp3/Transcription Factor Staining Bufferキット（eBioscences、Cat#00-5523-00）を以下の抗マウス抗体とともに用いた： BV605標識抗CD4（Biolegend, RM4-5; 1/700）, BV650標識抗B220（BD Biosciences, RA3-6B2; 1/88）, BV711標識抗CD3（Biolegend, 17A2; 1/88）, BV780標識抗CD45（BD Biosciences, 30-F11; 1/88）, FITC標識抗CD335/NKp46（Biolegend, 29A1. 4；1/100）、PE-Cy5標識抗CD8（Biolegend、53-6. 7；1/700）、eF450標識抗FoxP3（eBiosciences社製、FJK-16s；1/200）、PE標識抗GATA3（Biolegend社製、16E10A23；1/44）、PE-eF610標識抗EOMES（eBiosciences社製、Dan11mag； 1/100）、PE-Cy7標識抗Tbet（Biolegend、4B10、1/44）、APC標識抗RORgt（eBiosciences、AFKJS-9、1/22）。B細胞解析および免疫グロブリン発現には、BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit（BD Biosciences - 554714）を以下の抗マウス抗体とともに使用した： eF450-conjugated anti-B220/CD45R（eBiosciences, RA3-6B2; 1/700）, eF506-conjugated anti-CD19（eBiosciences, 1D3; 1/88）, BV711-conjugated anti-CD3（Biolegend, 17A2； 1/88）、BV780標識抗CD45（BD Biosciences、30-F11；1/88）、APC標識抗CD138（Biolegend、281-2；1/100）、FITC標識抗IgA（eBiosciences、mA-6E1；1/700）、PerCP-Cy5. 5標識抗IgD（Biolegend、11-26c． a；1/200）、PE標識抗IgE（Biolegend、RME-1；1/44）、PE-Cy5標識抗IgM（BD Biosciences、R6-60.2；1/100）、PE-Cy7標識抗IgG（Biolegend、Poly4053；1/44）。簡単に説明すると、150万個の細胞をPBSで2回洗浄した後、Zombie NIR™ Fixable Viability dye（BioLegend、Cat#423105）で15分間染色し、その後FACS Buffer（PBSと5％ウシ胎児血清）で2回洗浄し、メーカーの指示に従って固定した。その後、細胞をMouse Fc Block™ （ラット抗マウスCD16およびCD32；BD Pharmingen社、Cat#553141）と15分間、抗体ミックスと30分間、4℃でインキュベートした。Mouse Fc Block™と抗体は、固定キットに付属の透過化バッファーで希釈した。最後に、細胞をそれぞれの透過化バッファーで2回洗浄し、National Cytometry Platform（ルクセンブルグ）のNovoCyte Quanteon Flow Cytometer System（アジレント）で取得するためにFACS Bufferに再懸濁した。データはFlowJoで解析された。
細菌のIgAコーティングとソーティングの分析
凍結した糞便サンプルを1mlの氷冷PBS中で均一化し、100×g、4℃で3分間遠心した。上清を70μmの篩で濾過し、10,000×g、4℃で5分間遠心した。ペレットを1mlの氷冷PBSに懸濁し、ナノドロップ分光光度計でOD600を検出し、菌量を以下のように計算した： 2 OD600 = 109 菌。細菌を10,000×g、4℃で5分間再度ペレット化し、500μlの染色バッファー（5％ヤギ血清入りPBS）に再懸濁した。氷上で20分間インキュベートした後、1×109個の細菌を1mlの氷冷PBSで洗浄し、100μlの染色バッファー中4μgのFITC標識抗マウスIgA抗体（Southern Biotech）で4℃で30分間染色した。その後、細胞を1回洗浄し、1mlのPBSで再懸濁し、100μlの細菌をペレット化し、さらに分析するまで凍結保存した。残りの細菌を遠心分離し、90μlの染色バッファーと10μLの抗FITC MicroBeadsに再懸濁した。4℃で15分間インキュベートした後、細菌を洗浄し、500μlの染色バッファーに再懸濁し、QuadroMACS™ Separator（Miltenyi Biotec社製）を用いてIgA+画分とIgA-画分を選別するためのLSカラムにアプライした。IgAコート画分とIgA非コート画分を遠心分離し、乾燥ペレットを-80℃で保存した。Kau index37を用いたIgAコーティングの指標を評価するために、ペレットからDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV4領域をPCR増幅して塩基配列を決定し、IgA+画分とIgA-画分の分類学的組成を他のサンプルについて記載したように割り当てた。細菌の総IgAコーティングのFACS分析および選別画分の純度のために、凍結ペレットを氷上で解凍し、1mlの染色用緩衝液で洗浄した。すべてのサンプルが同時にソーティングされたわけではないので、バッチ間の染色をリフレッシュし調和させるために、細菌を100μlの染色バッファー中0.5μgのFITC標識抗マウスIgA抗体（Southern Biotech）で30分間再度染色した。洗浄工程の後、細菌細胞を200μlのDNA染色液（1:4000 SYTO™60 Red Fluourescent Nucleic Acid Stain [Invitrogen]、0.1 M HEPES、0.9 % NaCl、pH 7.2）中で20分間インキュベートした。最後に、細菌をPBSで2回洗浄し、4％PFAで20分間固定した後、再度洗浄し、NovoCyte Quanteonフローサイトメーターシステム（Agilent）で分析した。データはFlowJoで解析した。IgA親和性の解析のために、細菌を3M NaSCNを含む200μlのPBSで4℃、800rpmで15分間処理した後、ブロッキングを行い、上記のようにFITC標識抗マウスIgA抗体で染色した。
粘液の測定
結腸を結腸-cecum接合部から肛門まで切開し、直ちに新鮮なメタカルン固定液（メタノール：クロロホルム：氷酢酸、60：30：10 v/v）で固定した。小腸の遠位部は盲腸の半鈍端とともに、作りたてのメタカルン固定液で固定した。固定した組織は3時間メタカルン固定液に浸し、さらに24時間新鮮な固定液に交換した。ケカの残りの半分を液体窒素で瞬間凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。
スライドをキシレン（Sigma-Aldrich, USA）に5分間浸漬して脱パラフィンし、さらにキシレンで5分間インキュベートした。その後、スライドを100%エタノールで5分間2回脱水した。その後、スライドをMilli-Q水で素早く洗浄し、抗原回収液（10 mMクエン酸ナトリウム、pH 6.0）に浸漬して抗原を回収した。浸漬した切片を90℃で10分間加熱し、室温で20分間冷却した。スライドをすばやくMilli-Q水に3回浸し、ブロットして余分な液を除去した。液体を保持しやすくするため、PAPペンを用いて組織領域の周囲に描画した。切片をブロッキングバッファー（Tris緩衝生理食塩水（TBS; 500 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.4）中の1:10ヤギ血清（Sigma, USA））で組織を覆い、室温で1時間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体染色では、ブロッキングバッファーで1:200に希釈したMucin 2抗体（H-300）（Santa Cruz Biotechnology, USA）で組織を覆い、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドをTBSで5分間ずつ3回洗浄した。二次抗体染色は、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Thermo Fisher Scientific, USA）の1:200希釈液をブロッキングバッファーに浸し、暗所、室温で1時間、組織を覆って行った。組織切片をTBSで5分間2回洗浄し、静かにブロッティングした後、DAPI入りProLong Gold Antifade試薬（Invitrogen,USA）で覆い、カバースリップで覆い、マニキュアで密封した。スライドは室温で24時間暗所保存した後、イメージングまで4℃で保存した。切片の粘液層は、Zeissアポトームを用いて糞便ペレットを横切って撮影し、画像をつなぎ合わせて1枚の画像とすることで可視化した。粘液層の測定は、Earleらの14の記載に従ってBacSpaceを用いて行った。
腸組織切片の組織学的検査
組織学的病変の程度は、訓練を受けた病理学者（K.A.E.）が、Bugniら53の採点システムを改変したものを用いて、盲検下で半定量的に採点した。炎症、上皮損傷、上皮過形成および異形成、ならびに粘膜下層浮腫の有無を、以下の表に従って1～4の尺度で採点した。各カテゴリーの得点を合計して総得点とした。盲腸と結腸は別々に採点した。
スコア 0 1 2 3 4
炎症 正常 粘膜固有層または粘膜下層にPMNまたは形質細胞が散在している 粘膜および/または粘膜下層の炎症が合体している 広範な粘膜下層の炎症がある 重度のびまん性経粘膜炎症がある
上皮の損傷 なし 局所的な腺の拡張および/または表面上皮の減弱、および/または内腔の剥がれ落ちた細胞群 局所的な広範な腺の拡張および/または表面上皮の減弱、内腔の多数の剥がれ落ちた細胞 粘膜びらん 粘膜潰瘍
過形成／異形成 正常 過形成および／または過形成 細胞性および／または腺性の異形成が存在する N/A N/A
粘膜下層浮腫 なし 現在 N/A N/A
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粘液浸透性アッセイ
大腸粘液の浸透性は Gustafsson ら24 の記載に従って評価した。簡単に述べると、大腸を氷冷酸素添加 KREBS Buffer（116 mM NaCl、1.3 mM CaCl2、3.6 mM KCl、1.4 mM KH2PO4、23 mM NaHCO3、および 1.2 MgSO4; Carl Roth）で洗浄し、腸間膜軸に沿って開腹した。縦筋層を鈍的剥離で除去し、遠位粘膜を灌流チャンバーに挿入した。基底側チャンバーには、酸素添加したKREBS Glucose Buffer（10 mMグルコース、5.7 mMピルビン酸ナトリウム、5. 1mMのグルタミン酸ナトリウムを含む）、アピカルチャンバーは酸素添加KREBSマンニトールバッファー（10mMのマンニトール、5.7mMのピルビン酸ナトリウム、5.1mMのグルタミン酸ナトリウムを含むKREBSバッファー）で満たされた。暗所、室温で10分間インキュベートした後、FluoSphere™カルボキシレートビーズ（1μm、赤色580/605、Invitrogen、Cat# F8821）を上に塗布し、暗所、室温で5分間組織上に沈降させた。その後、アピカルチャンバーを静かに数回洗浄し、余分なビーズを除去した。顕微鏡で可視化する前に、チャンバーを暗所で10分間インキュベートした。各組織について、下部の上皮から上部のビーズまでXYスタックで4-7枚の共焦点画像を、切片間を5μm間隔で撮影した。その後、Imarisソフトウェアで画像を解析し、ビーズの外側の境界と上皮の間の距離と、最も内側のビーズと上皮の間の距離を比較することにより、透過性を計算した。
16S rRNA遺伝子ベースの群集分析
PCRおよびライブラリー調製は、ミシガン大学マイクロバイオームコア（University of Michigan Microbiome Core）またはルクセンブルク統合バイオバンク（Integrated Biobank of Luxembourg、IBBL、Dudelange、Luxembourg）のいずれかで、Kozichら54の記述に従って行った。正規化し、アンプリコンサイズを評価したサンプルは、Illumina MiSeqを用いて塩基配列を決定した。生配列はmothur v1.42.350を用い、コントロールも含めて解析した： シーケンス中はPBSコントロール、エラー解析にはZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard（Cat#D6306）を用いた。配列は、コンタミネーション解析およびSPF実験のために、参照SILVAデータベースバージョン132にアライメントされた。さらに、gnotobioticマウスの配列は、14の細菌メンバーそれぞれの16S V4 rRNA遺伝子配列を含むカスタムリファレンスデータベースにもアライメントされた。
定量と統計解析
すべての統計解析は、GraphPad Prism（バージョン9.4.0）を用いて行った。図1C（一元配置分散分析、Holm-Šídákの多重比較検定によるポストホック検定）、図3B（片側Studentのt検定、Wilcoxon検定）を除き、すべてのデータは二元配置分散分析、Benjamini and HochbergのOriginal FDR法によるポストホック検定を用いて分析した、 図4Mおよび4N（片側Studentのt検定およびWilcoxon検定）、図6G（多重非対t検定およびBenjamini、KriegerおよびYekutieliの2段階線形ステップアップ手順によるポストホック検定）、図6A、6C、6Eおよび6F（二元配置分散分析およびBenjamini、KriegerおよびYekutieliの2段階線形ステップアップ手順によるポストホック検定）。すべてのデータは平均値±SEMで表した。∗p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊p＜0.001；＊＊＊p＜0.0001；一方、「ns」は有意でない比較を示す。各実験に使用した正確な動物数（n）および使用した統計検定の詳細は、それぞれの図の説明文に示した。
謝辞
ご協力いただいたミシガン大学Germfree and Microbiome Cores、Muc2-/-マウスをご提供いただいたLeonard Augenlicht、繊維サンプルをご提供いただいたBill Krueger（J. Rettenmaier）に感謝する。Kenneth Rainin Foundation（Innovator Award、E.C.M.）およびUS NIH（R01s DK118024、DK125445からE.C.M.、P01 HL149633からC.A.L.、T.M.S.、E.C.M.）に感謝する。ルクセンブルク国立研究基金（FNR）のCORE助成金（C15/BM/10318186およびC18/BM/12585940）およびM.S.D.へのBRIDGES助成金（22/17426243）、MEDICE Arzneimittel Pütter GmbH & Co. KG（ドイツ）およびTheralution GmbH（ドイツ）は、M.S.D.への官民パートナーシップFNR BRIDGES助成金（22/17426243）による資金提供を受けた。M.B.は欧州委員会のHorizon 2020 Marie Skłodowska-Curie Actions individual fellowship (897408)の支援を受けた。M.W.は、米国・ベルギー・ルクセンブルグ教育交流委員会からフルブライト客員研究員の助成を受けた。E.T.G.はFNR PRIDE（17/11823097）の支援を受けた。オープンアクセスを目的とし、助成金契約から生じる義務を果たすため、著者は本投稿から生じるすべてのAuthor Accepted ManuscriptバージョンにCreative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0)ライセンスを適用している。
著者の貢献
構想、G.V.P.、M.B.、M.W.、C.A.、T.M.S.、C.A.L.、G.Y.C.、K.A.E.、M.S.D.、およびE.C.M.、方法論、G.V.P.、M.B.、M.W.、A.D.S.、E.T.G.、S.W.、M.S.D.、およびE.C.M.、検証、M.B.、A.D.S、 およびM.S.D.、正式分析、G.V.P.、M.B.、E.T.G.、調査、G.V.P.、M.B.、M.W.、C.A、 B.C.D.、N.A.P.、S.S.、A.C.、M.S.、L.Z.、Q.Y.、K.K.、J.F.、A.D.S.、資源、T.D.-D.、L.K.、M.S.D、 E.C.M.およびA.B.、データキュレーション、G.V.P.、M.B.およびM.W.、執筆-原案、G.V.P.、M.B.、M.S.D.およびE.C.M.、執筆-校閲および編集、G.V.P.、M.B.、M.W.、A.D.S.、E.T.G.、S.W.、A.B.、 M.S.D.、E.C.M.、可視化、G.V.P.、M.B.、M.S.D.、E.C.M.、監督、M.S.D.、E.C.M.、プロジェクト管理、M.S.D.、E.C.M.、資金獲得、G.V.P.、M.B.、M.W.、M.S.D.、E.C.M.。
利益申告
E.C.M.は米国January, Inc.でコンサルタントおよび諮問委員会委員を務める。M.S.D.はTheralution GmbH（ドイツ）でコンサルタントおよび諮問委員会委員を務める。
補足情報
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資料S1. 図S1-S8
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表S1. STAR Methods、実験モデルおよび被験者の詳細に関連する、本研究におけるマウス飼料の栄養および成分比較
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スコープス (1343)
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グーグル奨学生
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ボノームB.
リューQ.
ティアン Y.
ウォルターズ W.
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ハオ F.
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食餌乳化剤カルボキシメチルセルロースの無作為化対照摂食試験により、腸内細菌叢とメタボロームへの有害な影響が明らかになった。
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スコープス(102)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
カーン S.
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ゴッドフリー V.
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ラマチャンドラン R.A.
カンタレル B.L.
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食餌性単糖は腸内微生物の生態系を変化させ、マウスの大腸炎を促進する。
Sci. Transl. Med. 2020; 12eaay6218
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スコープス (158)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
デビッド L.A.
モーリスC.F.
カーモディ R.N.
グーテンバーグ D.B.
バトンJ.E.
ウルフ B.E.
リン A.V.
デブリン A.S.
ヴァルマ Y.
フィッシュバッハM.A.
ほか
食事はヒトの腸内細菌叢を迅速かつ再現性よく変化させる。
Nature. 2014; 505: 559-563
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スコープス (6629)
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クロス
グーグル奨学生
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腸内細菌の生態学と生理学における多糖類の重要な役割。
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スコープス (165)
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グーグル奨学生
パーラーB.K.
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食事とヒトの健康の関係における腸内細菌叢の役割。
Annu. Physiol.
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スコープス(34)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
デサイ M.S.
シーカッツA.M.
コロパトキンN.M.
カマダ・N.
ヒッキー C.A.
ウォルター M.
プードロ N.A.
北本 慎二
テラポン N.
ミュラーA.
他
食物繊維の不足した腸内細菌叢は大腸粘液バリアを分解し、病原体感受性を高める。
Cell. 2016; 167: 1339-1353.e21
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スコープス (1677)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
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ビリングスG.
シガールM.
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PubMed
アブストラクト
全文
全文PDF
グーグル奨学生
パリッシュA.
ブドー M.
グラント E.T.
ウィリエム S.
ノイマン M.
ヴォルター M．
クレイグ S.Z.
デ・スキスキオ A．
コスマA.
ヒューネヴァルトO.
他
アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）は繊維質欠乏マウスにおいて食物アレルギーを悪化させる。
Nat. Microbiol. 2023; 8: 1863-1879
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麹菌
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ノイマンM.
スタイムルA.
グラント E.T.
ウォルター M.
パリッシュA.
ウィリエム S．
ブレナー D．
マルテンス E.C.
デサイ M.S.
特異的病原体フリーマウスにおける食物繊維の欠乏は、腸粘膜病原体Citrobacter rodentiumに対する感受性を促進する。
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スコープス (27)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クッファ P.
ピカード J.M.
キャンベル A.
山下真由美
シャウス S.R.
マルテンス E.C.
シュミット T.M.
井ノ原直彦
ヌニェス G.
カルーソR.
食物繊維欠乏食は、腸内病原体のニッチと代謝の制御を介して大腸炎を抑制する。
細胞宿主微生物。2023; 31: 2007-2022.e12
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スコパス (3)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
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クジーク O.
フォルスベリ E.
シウズダックG.
プファンC.
ハーボールド C．
ダイムス H．
ロイ A.
ワース B．
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食物繊維欠乏食は、マウス大腸マイクロバイオームの微細な空間構造を乱す。
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スコープス（70）
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グーグル奨学生
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本澤義人
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グーグル奨学生
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スコープス (168)
PubMed
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グーグル奨学生
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プードロ N.
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活動性クローン病の管理で使用される61種類の経腸栄養剤の分析-食事による疾患の誘因に関する新たな知見。
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スコープス（87）
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グーグル奨学生
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スコープス (516)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
升 毅
金沢由紀夫
角田陽子
下山雄一郎
小野寺雅人
内藤哲也
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他。
免疫グロブリン亜型コート細菌は炎症性腸疾患の疾患活動性と相関する。
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スコープス (11)
PubMed
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グーグル奨学生
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スコープス (60)
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グーグル奨学生
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食物繊維および細菌SCFAは、多様な細胞経路を介して口腔内耐性を増強し、食物アレルギーから保護する。
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PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
カストロ・ドピコT.
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スコープス (119)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
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リュー J.
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スコープス (261)
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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全文
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グーグル奨学生
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要旨
全文
全文PDF
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全文
全文PDF
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グーグル奨学生
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PubMed
クロス
グーグル奨学生
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概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
カラカ N.E.
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グーグル奨学生
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論文で見る
スコープス (272)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
プードロ N.A.
ウルスK.
クロフォードR.
ピラーニ A.
アザーリー T.
ヒメネス R.
テラポン N.
アンリサット B.
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
シュロスP.D.
ウェストコット S.L.
リャビンT.
ホール J.R.
ハルトマン M.
ホリスター E.B.
レスニウスキー R.A.
オークリーB.B.
パークス D.H.
ロビンソンC.J.
他
Mothurの紹介：微生物群集を記述し比較するための、オープンソース、プラットフォーム非依存、コミュニティ支援型ソフトウェア。
Appl. Microbiol. 2009; 75: 7537-7541
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スタイムルA.
デ・スキスキオA.
ノイマンM.
グラント E.T.
ペレイラ G.V.
大野弘幸
マルテンス E.C.
デサイ M.S.
宿主-微生物間のクロストークを研究するための、合成ヒト腸内細菌叢を持つgnotobioticマウスモデルの構築。
Star Protoc. 2021; 2: 100607
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スコープス (10)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハン J.
リン K.
セケイラ C.
Borchers C.H.
液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法によるヒト糞便中の短鎖脂肪酸定量用の同位体標識化学誘導体化法。
Anal. Chim. Acta. 2015; 854: 86-94
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スコープス (338)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
メイラ L.B.
ブグニJ.M.
グリーンS.L.
リー C.W.
パン B.
ボレンシュタイン D．
リックマン B.H.
ロジャース A.B.
モロスキ-エルクルC.A.
マクファラインJ.L.
他
慢性炎症によるDNA損傷はマウスの結腸発癌に寄与する。
J. Clin. Invest. 2008; 118: 2516-2525
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パブコメ
グーグル奨学生
コジッチ J.J.
ウェストコット S.L.
バクスターN.T.
ハイランダー S.K.
Schloss P.D.
MiSeq Illuminaシーケンスプラットフォームにおけるアンプリコンシーケンスデータ解析のためのデュアルインデックスシーケンス戦略とキュレーションパイプラインの開発。
Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79: 5112-5120
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日本農芸化学会
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2024年3月20日
受理 受理：2024年3月1日
改訂版受理 2023年12月18日
受理：2023年12月18日 受理：2023年6月30日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.03.001

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図1Il10-/-マウスにおける低線維性炎症
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図2食餌誘導性炎症の中心は粘液の完全性である。
図のサムネイルgr3
図3離乳後のSPFマウスとSM14コロニーマウスの同居は病気を悪化させる
図4EEN食は炎症を改善する
図4EEN食はイソ酪酸産生を介して部分的に炎症を改善する
図サムネイルgr5
図5ムチン分解細菌が低繊維誘導性免疫応答を媒介する
図5ムチン分解細菌が低繊維誘導性免疫応答を媒介する
図6食物繊維の欠乏はIgAと細菌の相互作用を変化させる
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