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野生型微生物叢を持つ実験用マウスは強いアレルギー免疫応答を生じる

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.28.437143v1.full

Junjie Ma, Cajsa H. Classon, Julian M. Stark, Muzhen Li, Huey-Jy Huang, Susanne Vrtala, Stephan P. Rosshart, Susanne Nylén, Jonathan M. Coquet
doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.28.437143
この論文はプレプリントであり、査読の認証を受けていません。
00000037
要約全文情報/歴史メトリクスプレビューPDF
要旨
アレルギー性疾患は、遺伝要因と環境要因の組み合わせによって引き起こされる。衛生仮説は、幼少期の微生物曝露がその後のアレルギー疾患の発症を妨げると仮定している。しかし、微生物がアレルギー疾患の発症を抑制するという明確な証拠はまだ得られていない。最近開発された「野生化」マウスは、豊富で多様な常在菌を持ち、病原性を持つ野生特有の微生物のレパートリーに遭遇する。ここでは、野生児のアレルギー性炎症の発症を、多様な微生物への曝露を欠いた遺伝的に同一のマウスのそれと比較することにより、衛生仮説を検証した。その結果、野生個体はイエダニに対してより強いアレルギー性炎症を起こし、アレルギー性T細胞応答は同族ペプチド抗原だけでなく、自然免疫サイトカインによっても駆動されることがわかった。これらの結果から、微生物の含有量と多様性の高さは、アレルギー性免疫反応を抑制するのではなく、むしろ増強することが示唆される。

一文要約 豊富で多様な微生物曝露に直面したときの強いアレルギー性炎症

本文
アレルギーの発症率は、過去100年の間に驚くべき速さで上昇している(1)。一部の先進国では、5歳までに約30％の小児が鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息に罹患している(2)。一卵性双生児間の一致率は約50％であることから、アレルギー疾患に対する感受性には遺伝的要因が重要な役割を果たしている。ゲノムワイド関連研究では、主要組織適合クラスII分子をコードするHLA-D対立遺伝子など、アレルギーの発症に関与する遺伝子座がいくつか特定されている(3)。

しかし、20世紀におけるアレルギー疾患の顕著な増加は、遺伝的要因だけでは説明できない。1989年、Strachanは、数人の兄姉のいる子供が花粉症を発症する割合が、兄姉のいない子供に比べてかなり低いことを観察した(4)。彼は、これは年上の兄弟から年下の兄弟への微生物移行によるものであると提唱し、この知見は、その後10年間にわたる家族の人数と兄弟関係に関する同様の研究によって裏付けられた(5)。Strachanの所見は俗に衛生仮説として知られるようになり、喘息やアトピー性皮膚炎など他のアトピー性疾患にも外挿されるようになった。

Strachanの観察を裏付けるように、農場で育った子供たちは、都市環境で育った子供たちに比べて喘息の発症率が約半分であることが判明した（6-8）。農場環境のサンプリングにより、畜舎でのエンドトキシン暴露の増加と生乳の摂取が、小児の喘息発症率を低下させる要因であることが確認された（9-11）。その後、エンドトキシン曝露は、汎発性アレルゲンによる活性化に対して気道上皮を鈍感にし、喘息に関連する気道炎症を軽減することが示された(12)。衛生仮説は、20世紀におけるアレルギー疾患の増加に対するもっともらしい説明のひとつではあるが、環境および家庭での微生物曝露を測定したいくつかの研究では、曝露とアレルギーとの間に直接的な逆相関を示すことはできなかった(13-17)。微生物環境がアレルギー疾患に及ぼす影響について、十分にコントロールされた調査が引き続き必要である。

アレルギーの前臨床研究は、特異的病原体フリー（SPF）条件下で飼育されたマウスの使用に大きく依存している。これらの研究により、アレルギー免疫応答は、Tヘルパー2（Th2）細胞と呼ばれる適応型2型リンパ球と、それに類似した自然リンパ球（ILC2）集団によって媒介されることが決定的に証明された。微生物暴露がアレルギーを抑制する主なメカニズムは、免疫応答をTh2細胞介在性応答から逆転させることであると提唱されている。

実験用マウスは遺伝子が明確に定義されており、遺伝子操作の可能性がある一方で、SPF条件下で飼育されたマウスは、自然界に存在する幅広い病原体と接触することはなく、自然界で一般的に見られる、豊かで多様な、自然に共進化したマイクロバイオームにコロニー形成されることもない(18, 19)。

最近のいくつかの研究では、SPF条件下で飼育されたマウスは、自由生活をしているヒトの免疫反応を忠実に再現できないことが示されている(19-22)。野生マウス、ペットショップマウス、あるいは糞便の移植や同居によって野生化させたSPFマウスを用いた研究では、これらのマウスは従来の実験室用SPFマウスよりも、インフルエンザ、細菌、腫瘍、寄生虫に対してより効果的な反応を示し、ヒトの状況をよりよく反映していることが指摘されている（19, 20）。このように、微生物環境は衛生仮説の中心的な考え方であるが、微生物的に制限された従来の実験用SPFマウスだけを用いても、環境因子がアレルギー疾患に果たす役割を十分にモデル化することはできない。衛生仮説の文脈では、SPFマウスに見られる常在微生物および病原性微生物のレパートリーの制限は、むしろ免疫系の発達を歪め、ヒトの免疫系がどのように機能するかについて誤った仮定を導く可能性がある。

従来の実験用マウスと野生マウスとの直接的な比較は、遺伝的な相違によって複雑なものとなるため、Rosshartたちは最近、一般的なC57BL/6マウスの胚を野生マウスの代理母に移植し、いわゆる「ワイルドリング」マウスを作製するシステムについて報告した(18)。ワイルドリングマウスは、劇症腸内細菌叢、皮膚微生物叢、膣微生物叢を獲得し、自然界に存在する病原体の代表的な種類を持ち、野生マウスの幅広い免疫機能の多くを獲得することがわかった。従って、従来のSPFマウスと野生児のアレルギー性炎症の発生を比較することにより、十分に管理された標準化された実験室条件下で、衛生仮説の強力さを検証することが可能である。

この概念実証研究において、われわれは衛生仮説を直接検証することを目的とし、同じ微生物への曝露を奪われたSPFマウスと比較して、常在性および病原性の微生物レパートリーが豊富で多様な野生個体が、一般的なアレルゲンへの感作およびその後のアレルギー性炎症の発症から保護されるかどうかを検証した。

Rosshartらによって発表されたように、野生個体は、腸、皮膚、雌の生殖管を含むすべての上皮バリア部位において、細菌、古細菌、ウイルス、真菌だけでなく、原虫、ダニ、ミミズなどの他の真核生物の負荷が高く、多様性が高いという特徴がある(18)。この研究に使用した野生個体と従来のSPFマウスの具体的な衛生基準は、表S1にある。野生児のマイクロバイオームが生後8週間のマウスから採取したT細胞に及ぼす影響をまず分析した（図S1-3）。注目すべきことに、野生児の胸腺はサイズと細胞数が減少しており（図S1）、野生児の細菌叢が胸腺の退縮を促していることが示された。脾臓、縦隔リンパ節（medLN）および肺組織を含む末梢臓器では、エフェクター（CD44+）CD4およびCD8 T細胞が高頻度に存在し、Th1、Th2およびTh17細胞の数はすべての区画で増加していた（図S2-3）。このように、野生個体ではSPFマウスと比較して、末梢リンパ器官および非リンパ組織においてエフェクターT細胞がより多く存在している。

図S1.
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図S1.
活性化された表現型のT細胞は野生児マウスに多く存在する。
(A）SPFマウスと野生化マウスの胸腺におけるCD8対CD4発現の代表プロット。数字は示されたゲートの細胞の頻度を示す。(B) 棒グラフは、SPFマウス（青）と野生化マウス（赤）の胸腺におけるCD4+-CD8+、CD4+-CD8-、CD4-CD8+、CD4-CD8-細胞の総細胞数と数を示す。(C）SPFマウスと野生化マウスの胸腺における二重陰性（CD4-CD8-）細胞のCD25対CD44発現の代表プロット。異なる発生段階の分布をまとめた円グラフ。(D）棒グラフはSPFマウス（青）と野生化マウス（赤）におけるDN1-DN4細胞の総数を示す。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。各点は1匹のマウスを表し、各群n=5、平均値とSEMが描かれている、*P < 0.05、**P < 0.01。

図S2.
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図S2.
野性化したマウスの末梢臓器には、抗原を経験したT細胞のプールが存在する。
SPFマウスと野生化マウスから脾臓、肺、medLNを採取した。(A）左：SPFマウスと野生化マウスの脾臓におけるCD8対CD4発現の代表プロット。中：ゲートされたCD3+CD4+T細胞集団におけるCD44対Foxp3の発現を示す代表プロット。右：SPFおよび野生化脾臓のゲーティングされたCD3+CD8+T細胞集団におけるCD44およびCD49dの発現。(B～D）SPFマウスと野生化マウスの脾臓（B）、肺（C）、medLN（D）におけるCD4、CD8 T細胞、およびCD4ナイーブ（CD3+CD4+CD44-）の棒グラフ定量化、 エフェクター（CD3+CD4+CD44+Foxp3-）、Treg（CD3+CD4+Foxp3+）、CD8ナイーブ（CD3+CD8+CD44-CD49d-）、TVM（CD3+CD8+CD44+CD49d-）、T™（CD3+CD8+CD44+CD49d+）細胞。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。各ドットは1匹のマウスを表し、各群n=5、平均値とSEMが描かれている、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

図S3.
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図S3.
野生児は末梢臓器においてより多くのサイトカイン産生T細胞サブセットを保有している。
(A）脾臓のゲーティングされたエフェクターCD44+CD4+Foxp3-T細胞におけるIL-17対IFN-γおよびIL-13対IL-5発現の代表プロット。(B）脾臓、肺および縦隔リンパ節におけるTh1（IFN-γ+）、Th2（IL-5+および/またはIL-13+）、Th17（IL-17+）細胞集団の棒グラフ定量化。(C）脾臓のゲーティングされたCD8 T細胞におけるCD44対IFN-γ発現の代表プロット。(D) PMAおよびイオノマイシン存在下で3時間刺激した後のSPFマウスおよび野生マウスの脾臓、肺、および縦隔リンパ節におけるIFN-γ+ CD8+細胞の数 n=5、すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。*p < 0.05、**p < 0.01。

インラインで見る
表S1.
野生個体と従来の特異的病原体フリーマウスの衛生基準。
*野性マウスの衛生水準は、IDEXX BioAnalytics社の "Mouse 3R Comprehensive Serology Panel "および "Mouse 3R Quarantine Annual SOPF PCR Panel "の2つの独立した方法を用いて決定した。アッセイはプールされたサンプルに対して実施され、2つの独立した方法のうち少なくとも1つによって微生物が同定された場合、その微生物は存在するとみなされた。**従来のSPFマウスの衛生水準は、マウス業者（Taconic Biosciences社）が評価・報告した。

ハウスダストマイト（HDM）は、喘息患者が一般的に感受性が高く、喘息増悪の引き金となりうるほぼユビキタスなアエロアレルゲンである(23-25)。HDMアレルギー性喘息患者では、HDMはTh2細胞からIL-4、IL-5、IL-13を含むサイトカインの産生を誘導し、IgEと結合して肥満細胞の脱顆粒を促進し、気道の炎症と粘液沈着を促進する(26)。野生化マウスがHDMに対してアレルギー反応を起こすかどうかを調べるために、マウスをHDMで感作（1μg HDM、0日目）およびチャレンジ（10μg HDM、7-11日目）し、気道炎症のピークである15日目にいくつかのパラメータについて分析した（図1A）。気管支肺胞洗浄液（BAL）、肺組織および肺排液medLN中の組織学的分析と白血球の計数により、野性化マウスの気道、肺実質およびmedLNに強い炎症があることが示された（図1B、図S4A）。フローサイトメトリーによる細胞浸潤の定性分析では、HDMを投与した野生マウスの肺組織の好酸球、T細胞、B細胞、好中球、マクロファージが有意に増加していた（図1C-D、図S1C）。野生児肺の炎症状態の亢進に加えて、粘液分泌性杯細胞もSPFマウスと比較してHDM投与野生児で顕著であった（図1E）。HDMはまた、HDMの支配的なアレルゲンタンパク質のひとつであるDer p 2に対して強い血清IgG1およびIgE反応を誘導した（図1F）。従って、野生児は従来のSPFマウスで観察されたのと同等かそれ以上のレベルで、肺の炎症、気道の杯細胞形質転換、および全身の抗体応答を発症する。

図S4.
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図S4.
WildlingマウスはHDMに対して強固な病原性応答を示す。
(A）HDMの鼻腔内投与の模式図。1μgのHDMによる感作と10μgのHDMによるチャレンジ。(B）PBS/HDMで処置したSPFマウスまたは野生マウスの代表的なヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色肺組織。上皮の厚さ、気道炎症および合計（上皮＋気道炎症）スコアを算出した。スライドは盲検下で採点した。PBS n=4、HDM n=6。(C）好酸球（Siglec-F+CD11c-）、肺胞マクロファージ（Siglec-F+CD11c+）、T細胞（Siglec-F-CD11c-B220-CD3+）、B細胞（Siglec-F-CD11c-CD3-B220+）、好中球（Siglec-F-CD11c-B220-CD3-Gr-1+）のゲート戦略を示すBALの代表プロット。4つの比較すべてに一元配置分散分析およびボンフェローニの多重比較検定を用いた。**p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。

図1.
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図1.
WildlingマウスはHDM投与後、強固なアレルギー性炎症を発症した。
(A)HDMの気道への投与法と15日目の解析。(B～D）気管支肺胞洗浄液（BAL）、肺実質およびmedLNにおける細胞浸潤の計数。(E）粘液分泌細胞についての肺のPAS-D（Periodic Acid Schiff-Diastase）染色。気道は盲検下で採点した。(F) Dermatophagoides pteronyssinusのDer p 2アレルゲンに特異的な血清IgG1およびIgE。一元配置分散分析およびボンフェローニの多重比較検定を用いた。A～Dでは、PBS投与マウスn=4、HDM投与マウスn=13。Eでは、PBS n=4、HDM n=6。Fでは、PBS n=8、HDM n=18-19。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

肺の好酸球増加と粘液産生は、Th2細胞応答がワイルドリングマウスで増強されている可能性を示した。T細胞は、細胞表面に発現する非常に多様なT細胞抗原受容体（TCR）を介して活性化され、MHC分子に結合して提示される同族ペプチドを認識する。HDM由来のペプチドによる活性化後、CD4 T細胞はIL-33の受容体（サブユニットST2とIL1RAPからなる）を発現し、肺でIL-5とIL-13を分泌するTh2細胞に分化する可能性がある(27)。HDMに対するTh2細胞の分化は、3つの方法で測定された。1）非特異的な分裂促進刺激であるPMAとイオノマイシンを用いる方法、2）全ハウスダストマイト抽出物を用いる方法、3）PE標識したMHC I-Abの四量体にDer p 1 217-227 CQIYPPNVNKIを負荷したもの（Der p 1:I-Ab四量体）を用いる方法である(28)。BAL、肺組織およびmedLNからの白血球の分裂再刺激は、HDMを投与したSPFマウスと比較して、野生化マウスの気道、肺またはmedLNにおいて、IL-5および/またはIL-13を産生するTh2細胞が約8倍増加することを示した(図2A-B、図S5A)。野生児のBALまたは肺組織におけるTh2細胞数は、Th1（IFN-γ+）またはTh17（IL-17+）細胞の数をはるかに上回り、BAL中のゲートエフェクターCD4 T細胞の約40％がIL-13を産生していた（図2A-B）。肺またはmedLNの白血球をHDM全抽出物で一晩再刺激したところ、IL-5とIL-13を産生するTh2細胞も野生児の方が有意に多かったことから（図2C、図5B）、HDM特異的Th2細胞応答はSPFマウスに比べて野生児の方が大きいことが示唆された。最後に、HDMを投与した野生児の肺組織には、HDMを投与したSPFマウスと同程度のDer p 1:I-Ab四量体反応性細胞が全体的に認められた（図2D、図5C）。しかし、野生児のDer p 1:I-Abテトラマー反応性細胞は、SPFマウスと比較してTh2細胞（ST2+）の頻度が高く、Treg（Foxp3+）の頻度が低かった（図2D、図5C）。注目すべきは、PBSを投与したコントロールの野生児マウスは、Der p 1:I-Ab四量体反応細胞をほとんど保有しておらず（図2D）、組換えDer p 2に対する明らかな血清抗体結合を示さなかったことである（図1F、図S4D）。このことから、劇症微生物環境は、一般的なアレルゲンに対するde novo T細胞およびB細胞応答の生成を阻害するのではなく、増幅し、気道の強固なアレルギー性炎症として現れることが示唆される。

図S5.
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図S5.
HDMに対するTヘルパー細胞応答の特徴。
(A) PMAとイオノマイシン、または一晩のHDMによるmedLN刺激後のTh1、Th2、Th17細胞の絶対数。(B）HDMで再刺激したmedLNにおけるIL-13対IL-4発現の代表プロットと、それに対応するIL-4+IL-13+CD4 T細胞数のグラフ。(C）SPFマウスおよび野生化マウスの肺におけるエフェクター（CD44+）Der p 1:I-Ab四量体反応性を同定するためのゲーティングスキーム。主図2Dでは、Der p 1:I-Abテトラマー+ CD44+CD4+T細胞中のTreg、Th1、Th2細胞の頻度を示す。一元配置分散分析（One-way ANOVA）とボンフェローニの多重比較検定が、4つの比較すべてに用いられた。PBS n=4、HDM n=13。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

図2.
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図2.
HDM投与後、野生児ではTh2細胞応答が増強される。
(A）PMAとイオノマイシンで刺激した後の、ゲーティングされたCD4 T細胞におけるCD44対Foxp3（左側）、ゲーティングされたエフェクターTヘルパー細胞（CD4+CD44+Foxp3-）におけるIL-13対IL-5（中央）、IL-17対IFN-γ（右）の発現の代表プロット。(B）PMAとイオノマイシンによる刺激後のTh1（IFN-γ+）、Th2（IL-13+および/またはIL-5+）、Th17（IL-17+）Tヘルパー細胞の計数。(C）HDM抽出物で一晩刺激した後のTh1、Th2およびTh17細胞の数。(D）肺実質における総Der p 1:I-Abテトラマー＋細胞およびそのサブセットの計数。一元配置分散分析（One-way ANOVA）とボンフェローニの多重比較検定（Bonferroni's multiple comparisons test）を多重比較に用いた。Dでは、PBSマウスは細胞数が少ないためサブセットの頻度が省略されたため、Studentのt検定を用いた。PBS n=4、HDM n=13。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

HDMに対するアレルギー性炎症は主にTh2細胞によって媒介される。真菌抽出物を含むタンパク質分解活性の高いアレルゲンは、IL-33のようなILC2を活性化するアラーミンの放出につながる上皮細胞損傷を誘導することが知られている。IL-33やその他の自然サイトカインに反応して、ILC2は増殖し、IL-5やIL-13を大量に産生し、アレルギー性炎症を誘導する(29)。操作していないワイルドリングマウスの肺と骨髄では、SPFマウスと比較してILC2が有意に少なかった（図3A-B）ことから、アラーミンに対する応答が低下している可能性が示唆される。SPFマウスと野生化マウスの自然刺激に対する反応を解析するために、遺伝子組換えIL-33（図3C、図S6）またはカビAlternaria alternata（AA）の抽出物（図S7）を3日間連続でマウスに経鼻投与した。SPFマウスと野生児マウスは、初回気道チャレンジ後2日目と4日目に、肺と気道への好酸球の浸潤が同程度に亢進した（図3C、図S7A）。これは、SPFマウスと野生児マウスの両方で、肺ILC2コンパートメントの拡大と一致したが、ILC2数は時間経過を通して野生児の方が少ないままであった（図3D、図S7）。

図S6.
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図S6.
ST2+エフェクターTヘルパー細胞の数は、SPFマウスに比べて野生児で多い。
(A）肺のゲーティングされたCD4 T細胞におけるCD44対Foxp3発現の代表プロット（左側のプロット）。ゲーティングされたエフェクターCD44+Foxp3-CD4 T細胞におけるCD44対ST2の代表プロット（中央のプロット）、およびゲーティングされたTregにおけるFoxp3対ST2の代表プロット（右側のプロット）。ST2+エフェクターCD4 TおよびST2+ Tregのグラフを以下に示す（各群n=5マウス）（B）経鼻rIL-33（毎日200 ng、3日間連続）注入の模式図および時間経過に伴うST2+ Th：ST2+ Tregの比率（上）。ゲーティングされたST2+CD4+T細胞内のFoxp3対CD44発現の代表プロット。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。p < 0.05、* p < 0.01、***p < 0.001。

図S7.
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図S7.
野生化マウスはAlternaria alternata（AA）抽出物に対してアレルギー反応を起こす。
(A)アルテルナリア（AA）経鼻投与（1日20μg、3日間連続）とBALおよび肺中の好酸球および好中球の絶対数の模式図。(B）AA投与後のSPFマウスおよび野生化マウスの肺におけるILC2、ST2+エフェクター（CD44+）CD4 TおよびST2+ Tregの絶対数。(C) ゲートされたST2+CD4+T細胞内のFoxp3対CD44発現の代表プロットと、AA投与後のST2+ Th:ST2+ Tregの比率。PBS、AAおよびrIL-33の注入は、同じ実験の一部として実施した。PBSの記号は、rIL-33のグラフに示したのと同じコントロール値であることを示すために灰色で示した。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001。

図3.
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図3.
野生児ではILC2が減少しているが、rIL-33投与に対するアレルギー反応は強い。
(A）ILC2を同定するためのゲーティング戦略。CD4対系統（CD3、CD19、CD11c、NK1.1）、CD90.2対CD45.2、CD127対ST2の代表プロット。(B) 肺および骨髄のILC2の集計。 (C) マウスの気道へのrIL-33（毎日200 ng、連続3日間）またはPBSの投与とその後の解析。気道および肺実質への好酸球浸潤のグラフ。(D）rIL-33/PBS投与後の肺におけるILC2、ST2+ TヘルパーおよびST2+ Treg細胞数のグラフ。(E）Ki-67+であったゲーティングされたILC2、ST2+ TヘルパーまたはST2+ Treg細胞の頻度のグラフ。AおよびBでは、各群n=5マウス。CからEでは、各時点で各群n=3マウス。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

Tヘルパー細胞活性化の主な様式は、MHC-IIに提示された同族ペプチドをTCRが認識することである。しかしながら、最近の研究では、エフェクターTh2細胞はTCRを介したシグナルとは無関係に、自然サイトカインに反応することが示された(30)。SPFマウスでは抑制性ST2+ TregがST2+ Th細胞を上回ったが、野生型では逆であった（図S6B）。野生化マウスにrIL-33またはAAを短期間投与すると、肺のST2+ Th細胞は拡大し、ST2+ Treg細胞よりも多数派を維持した（図3D、図6B、図S7A-B）。野生児のST2+ Th細胞は、rIL-33（図3E）またはAA（図S8）に応答して急速に分裂に入ったが、これはSPFマウスでは観察されなかった。このことは、野生児の豊富なマイクロバイオームが、侵入してくるアレルゲンによって誘発されるアラミンに反応するよう、内因性Th2細胞をプライミングしていることを示している。

図S8.
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図S8.
野生児マウスのST2+ Th細胞は、rIL-33またはAAを投与すると急速に分裂に入る。
(AおよびB）rIL-33（A）またはAAエキス（B）投与後の、ゲーティングされたILC2、ST2+エフェクターThおよびST2+TregにおけるKi-67の発現を示すヒストグラム。rIL-33のKi-67定量化を図3Eに示す。表示されたサブセットにおけるKi-67の定量化をAA注入（B）について示す。すべての比較にスチューデントのt検定を用いた。**P < 0.01.

我々の研究は、微生物の多様性が増加し、真菌やヘリコバクター、乳酸桿菌、ビフィズス菌、バクテロイデス（10, 31-34）など、以前からアレルギー感作を弱めることが提唱されている微生物でコロニー形成されているにもかかわらず、野生児は強固なアレルギー免疫反応を起こしたことを明らかにした。どちらかといえば、微生物暴露はHDMに対する同族抗原特異的Th2細胞応答と、アルマチンに対する非同族抗原特異的Th2細胞応答を促進した。

微生物曝露とは別に、座りがちな生活や屋内生活、身体活動の低下、不健康な食生活など、多くの生活習慣要因がアレルギー発症率の急激な上昇に関与していることが提唱されている(35)。さらに、大気汚染の増加や、ほとんどすべての一般消費財に含まれる新しい化学物質への環境暴露が着実に増加していることなどの微生物環境要因が、アレルギー疾患の急増に寄与している可能性が高い(36)。

この概念実証研究は、十分に制御された実験的アプローチを用いており、多様な微生物への曝露不足がアレルギー発症率上昇の主要因であるという考え方に真っ向から異議を唱えている。その結果、アレルギー疾患の多因子性という性質が強調され、生活習慣、環境汚染、新規化学物質などの他の要因が果たすかもしれない役割をより徹底的に考慮することで、アレルギー疾患に対する我々の見方を再調整することが求められている。

研究助成
JMCはSwedish Research Council（2018-02536）およびSwedish Cancer foundation（CAN2017/715, 20 0261 F）の支援を受けた。SNとCCはKI学内資金の支援を受けた。S.P.R.はDeutsche Forschungsgemeinschaft DFG（ドイツ研究財団；Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1およびSFB 1160 IMPATH）の支援を受けた。JMは中国奨学委員会のフェローシップを受けた。

著者の貢献
構想： JMC。

方法論： JM、Spr、Sn、SV、HJH。

調査： JM、SC、JMS、ML、JMC、SN。

データのキュレーションと可視化： JM、JMS、JMC、Spr。

資金獲得： JMC、SN、SPR。

監修： JMC、SN。

原案執筆： JM、JMC。

執筆-校閲・編集： JMC、SPR、SN。

競合利益
S.P.R.は競合利益なしを宣言し、Taconic Biosciences社がNIDDKから天然の腸内細菌叢を持つWildRマウスのライセンスを受けたことを明らかにした。

補足資料
材料と方法
マウス
すべての実験にC57BL/6NTacマウス病原体フリー（MPF）マウスを使用し、SPFの特徴付けを行った。C57BL/6NTac野生化マウスは、Rosshartら(18)が記載したように、逆無菌再分化によって作製した。ワイルドリングマウスコロニーは、ドイツのフライブルグ大学メディカルセンターで飼育され、繁殖された。実験開始時、ワイルドリングマウスおよびC57BL/6NTac MPFマウスは約8週齢であった。ワイルドリングマウスとC57BL/6NTac MPFマウスは同時にカロリンスカ研究所の比較医学動物施設に運ばれ、実験開始の少なくとも1週間前から休息させた。本明細書に記載されたすべての実験には雌マウスを使用した。実験はストックホルム地域倫理委員会の承認を得た（8971/2017+B6905/2020）。

衛生基準の評価
C57BL/6NTac野生化マウス： Opti-Spot Cards（IDEXX BioAnalytics社製）で乾燥させた血液滴、乾燥毛皮スワブ（Puritan社製DRYSWAB™ FLOCK）、乾燥口腔スワブ（COPAN社製FLOQSwabs®）および糞便ペレットを製造業者のサンプリングガイドラインに従って採取し、IDEXX BioAnalytics社製「Mouse 3R Comprehensive Serology Panel」ならびに「Mouse 3R Quarantine Annual SOPF PCR Panel」を利用した2つの独立した方法（PCRおよび血清学）で微生物をスクリーニングした。アッセイはプールされたサンプルに対して実施され、2つの独立した方法論のうち少なくとも1つによって微生物が同定された場合、その微生物は存在するとみなされた。従来の特定病原体を含まないC57BL/6NTacマウス： 衛生基準はマウス業者（Taconic Biosciences社）により評価・報告された。

モデル
イエダニ
8週齢のマウスをイソフルランで麻酔し、40μlのPBS中に1μgのHDM（Stallergenes Greer）を経鼻的に感作した。感作から7日後、マウスに10μgのHDMを5日間連続投与した。最後のチャレンジの4日後にマウスを犠牲にして臓器を摘出した。BALは、1mlのPBSで気道を3回連続洗浄することにより行った。

リコンビナントIL-33（RIL-33）またはオルタナリア（AA）抽出物
rIL-33（200ng）またはAA抽出物（20μg）を3日間連続で経鼻投与した。マウスBAL、肺組織およびmedLNを、2日目（rIL-33またはAAの2回目の投与の1日後）および4日目（rIL-33またはAAの最後の投与の2日後）に採取した。

臓器処理
肺、medLN、mesLN、胸腺、および脾臓を、PBS（FACSバッファー）中の2％熱不活性化FCS（Sigma）約10ml容量で100μMのふるいにかけて、単一細胞懸濁液にした。大腿骨は、23～25Gの針を用いて冷FACSバッファーで洗浄した。肺、脾臓および骨髄の全単一細胞を、低張緩衝液を用いて赤血球を溶解した。細胞は再刺激の必要性に応じて、FACS緩衝液か組織培養液に再懸濁した。

T細胞の再刺激
サイトカイン産生を検出するため、細胞はペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、2-メルカプトエタノール（すべてInvitrogen製）、10％熱不活性化FCS（Sigma製）を添加したIMDM中で培養した。PMA（50ng/ml）とイオノマイシン（5μM）による再刺激のために、Brefeldin A（Sigma）を培養初期から添加し、3時間後に細胞を回収した。HDM特異的再刺激のために、細胞懸濁液を20μg/mlのHDM抽出液とともに48ウェルプレートにプレーティングした。6時間後、ブレフェルジンAを培養に添加し、さらに9時間培養した後、細胞を回収し、FACS解析のために抗体で染色した。Foxp3の核内染色を行う場合は、eBioscience Fixation Kitを使用した。

Derp1 217-227 CQIYPPNVNKI I-A(b) 四量体染色
I-A(b) イエダニ Der p 1 217-227 CQIYPPNVNKI は NIH Tetramer Core Facility から取り寄せた。肺細胞の半分を250μlのFACS緩衝液に懸濁し、Fcブロック、ラットおよびマウス血清（すべて1/100希釈）を加え、よく混合し、室温（RT）で10分間インキュベートした。その後、FACSバッファーで全量を500μlに調整し、5μlのPE標識テトラマーを加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、EasySep™ Mouse PE Positive Selection Kit II (STEMCELL, Catalog #17666 )を用いてPE標識テトラマー細胞を選択した。簡単に説明すると、細胞を10mlの冷FACSバッファーで一度洗浄し、25μlのPE Selection Cocktailを加えた250μlのMACSバッファー（PBS中0.5% FBS、2mM EDTA）に再懸濁し、RTで15分間インキュベートした。その後、15μlのDextran RapidSpheres™を加え、さらに10分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、メーカーのプロトコールに従ってマグネットで選択した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーはBD LSRIIを用い、以下の抗体を組み合わせて行った： BD: CD19 (1D3), CD11c (HL3), B220 (RA3-6B2), CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5 and GK1.5), CD8 (53-6.7), CD44 169(IM7), GR-1 (RB6-8C5), IFN-γ (XMG1.2), IL-4 (11B11), IL-17 (TC11-18H10), Ki-67 (B56), CXCR3 (CXCR3-173), CD90. 2（53-2.1）、CD45.2（104）、CD25（PC 61）、CD69（H1.2F3）、CD49d（R1-2）、Siglec-F（E50-1702440）および精製ラット抗マウスCD16/CD32（2.4G2）；Invitrogenより： CD127（A7R34）、CD11c（N418）、FOXP3（FJK-16s）、IL-13（ebio13A）；Biolegendより： IL-5（TRFK5）、NK1.1（PK136）、ST2（DIH9）。固定可能な生存率色素eFluor 780（Invitrogen社製）。すべてのサンプルはフローサイトメーターで測定する前に固定した。

病理組織学的解析
肺を10％ホルマリンで膨張させ、パラフィンに包埋する前に最低24時間固定した。回転式ミクロトーム（Mikrom HM355s）で4μM切片を切り出し、過ヨウ素酸-シッフ-ジアスターゼ（PAS-D）染色とヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行った。粘液スコアの解析では、PAS-D染色切片を0～4点満点で採点し、陽性染色細胞で覆われた気道の割合に基づいて点数を割り振った；気道の0％が影響を受けた場合は0点、1～25％は1点、26～50％は2点、51～75％は3点、75％以上は4点。マウスの肺1個につき最低38個の完全な気道がカウントされた。上皮の厚さの分析では、上皮が単層でなく、細胞が1個以上ある気道に1点。気道上皮細胞のクラスターが存在する場合は1点とした。気道周囲の炎症の評価；炎症がない場合は0点、気道周囲に炎症細胞がある場合は1点、気道周囲に炎症細胞のリングがある場合は2点、リングの深さが2～4細胞の場合は3点、リングの深さが4細胞以上の場合は4点とした。

ELISA法
HDM実験では、アレルゲン抽出物（5μg/ml）または組換えDer p 2（3μg/ml）をPBSで希釈し、ELISAプレート（nunc）にコートした。プレートを4℃で一晩インキュベートし、翌朝PBS中の2％牛乳でブロックした。IgG1の検出には血清を1:10に希釈した。アレルゲン特異的IgEの検出には、まず血清からIgGを除去し、製造業者のプロトコールに従ってProtein G HP SpinTrap™カラムを用いた。プレートをPBS/Tweenで洗浄した。ウェルに血清を加え、室温で2時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、HRP結合抗IgG1（Southern Biotech, 1070-05）またはビオチン結合抗IgE（BD, R35-72）の二次抗体と1時間インキュベートした後、ストレプトアビジン-HRP（Mabtech）を添加した。TMB基質（KPL）とH2SO4は、反応の展開と停止に使用した。Asys Expert 96 ELISAリーダー（Biochrom社製）を用いて450nm/405nmのODを読み取った。

統計分析
使用した統計解析は各図に記載されている。2群の比較にはStudentのt検定を用いた。2つ以上の比較を行う場合は、一元配置分散分析およびBonferroniの多重比較検定を用いた。すべてのグラフに平均値とSEMを示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

補足
野生のマウスは多様な常在菌と病原体にコロニー形成されている
野生のマウスの衛生基準はマウス3R総合血清学パネルとマウス3R検疫年間SOPF PCRパネルの2つの方法を用いて決定した。これらは表S1に報告されている。

微生物の多様性とアレルギー発症リスクには逆相関があることがいくつかの研究で示されている（34, 37, 38）。ワイルドリングマウスは、飼育環境および腸、皮膚、膣のマイクロバイオームにおける微生物のレパートリーにおいて、かなり多様性が高い（(18)で報告）。カンピロバクター科、ナイセリア科、ヘリコバクター科、パスツレラ科などのグラム陰性菌のコロニー形成は、野生化マウスの皮膚の特徴である。乳酸菌やバクテロイデスなど、アレルギーの発症を制御すると考えられている特定の常在菌に関しては、野生児はこれらの属のレベルが高く、ビフィズス菌を含むアクチノバクテリア門のレベルが高い(33, 37, 39-45)。真菌（特に子嚢菌門）および蟯虫もまた、野犬では顕著であり、これらはアレルギー感作に関与している可能性がある（31, 34, 46, 47）。全体として、野生個体はSPFマウスよりも微生物の多様性がかなり高く、アレルギー感作および疾患を制御すると提唱されているいくつかの微生物も含まれている。

野生個体では胸腺の細胞性が低下している。
我々は胸腺、脾臓、肺、縦隔リンパ節を含む臓器の免疫細胞構成を特徴付けた。野生児マウスの胸腺は、SPFマウスに比べて総リンパ球数が少ないことがわかった。CD4+CD8+（DP）胸腺細胞、成熟CD4 T細胞（CD4+CD8-）および成熟CD8 T細胞（CD8+CD4-）はすべて量が減少していた（図S1A-B）。CD4-CD8-(DN)胸腺細胞は割合としては増加していたが、DN1-DN4サブセットの標準的な頻度で構成されているようであった（図S1C-D）。

抗原経験CD4およびCD8 T細胞は野生化マウスの末梢リンパ系および非リンパ系臓器に存在する。
SPFマウスと野生化マウスでは、脾臓と肺におけるCD4およびCD8 T細胞の総数は同程度であった。しかし、野生化マウスの脾臓と肺では、CD44+エフェクターCD4およびCD8 T細胞が非常に濃縮されていた（図S2）。Foxp3+抑制性Treg細胞は、以前に発表されたように頻度が減少しているように見えたが（18）、SPFと野生化マウスの脾臓では数的には同程度であった（図S2）。野生化マウス脾臓と肺のエフェクターCD8 T細胞集団は「真のメモリー」CD8 T細胞（CD8T™）に富んでいたが、「バーチャルメモリー」CD8 T細胞（CD8TVM）(48)の数は脾臓では同程度で、肺では増加していた（図S2）。縦隔リンパ節（medLN）はSPFマウスに比べ野生児の方が大きく、ナイーブ細胞集団を含め、特徴づけられた全ての細胞集団が増加していた（図S2）。T細胞によるサイトカイン産生を特徴づけるために、SPFマウスと野生児マウスの白血球調製物を、phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）とionomycinで3時間刺激した。サイトカインIFN-γ（Th1）、IL-5および/またはIL-13（Th2）、またはIL-17（Th17）を発現するエフェクターTヘルパー細胞（CD3+CD4+CD44+Foxp3-）は、SPFマウスと比較して、野生の脾臓、肺および縦隔リンパ節において、同程度の頻度で観察されたが、有意に高い数で存在した（図S3）。CD8 T細胞コンパートメントでは、野生化マウスはIFN-γ産生細胞の頻度と全体数が高かった（図S3）。このように、野生化マウスは胸腺の細胞性が低下し、末梢リンパ系および非リンパ系器官においてエフェクターCD4およびCD8 T細胞がより多く存在することが特徴的である。

HDM抽出物投与マウスの炎症性特徴
野生化マウスにHDMを投与すると、肺実質、気道、循環系に強い炎症徴候が誘発された（図1）。HDMを投与したマウス（図S4A）の細胞炎症の質を解読するために、肺をホルマリンで膨張させ、固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色および過ヨウ素酸シッフ・ジアスターゼ染色のために切片化した。SPFまたは野生個体にHDMを投与すると、気道周囲に顕著な炎症が誘発され、HDM投与マウスでは上皮肥厚の徴候が見られた（図S4B）。全体として、野生児とSPFマウスの肺切片は同程度の炎症を示した。気道および肺実質細胞を、好酸球、好中球、肺胞マクロファージ、T細胞およびB細胞を識別できるマーカーで染色したところ（図1に報告、ゲーティング戦略は図S4Cに示す）、HDMを投与された野生のマウスの肺では強い炎症が認められた。

HDMに対するTh2細胞応答は、SPFマウスに比べて野生児で亢進している。
図2（本文）に示した肺と気道におけるTヘルパー細胞サイトカイン産生の解析を補足するために、medLNのリンパ球もまた、HDMで短時間または一晩、PMA/イオノマイシンで再刺激した。PMA/イオノマイシン刺激後、HDMを投与した野性化マウスは、SPF対照と比較してTh1、Th2およびTh17細胞の数が有意に多かった（図S5A）。HDM存在下で一晩培養すると、野生児ではTh2細胞のみがより多く存在したことから、HDMはSPFマウスよりも野生児でより強力なTh2細胞応答を誘導したことが示唆された（図S5A）。また、HDM存在下で再刺激したIL-13+エフェクターTh細胞においても、いくらかのIL-4産生が検出されたが、その反応の大きさはSPFマウスと野生児マウスの間で有意差はなかった（図S5B）。

HDMに対する抗原特異的応答をより高感度に解析するために、肺細胞をDer p 1 217-227 CQIYPPNVNKIを負荷したI-AbのPE標識4量体（Der p 1:I-Ab4量体）とインキュベートした。これは以前、B6マウスのHDMに対する支配的な反応として同定された(28, 49)。本文の図2Dで報告した結果は、Der p 1:I-Ab四量体反応細胞内のFoxp3、CXCR3、ST2による染色に基づいている（図S5C）。PBSを投与した野生児マウスでは、テトラマーに結合するエフェクターCD4 T細胞はほとんど見られなかったことから、HDM（D. pteronyssinus）に事前に暴露されていないことが示唆された（図2D）。HDMに暴露されたマウスでは、Der p 1:I-Ab四量体反応細胞の中にTreg細胞、Th1細胞、Th2細胞を明確に区別することができた（図S5C）。Treg細胞の頻度は減少し、Th2細胞の頻度はSPF Der p 1:I-Abテトラマー反応性細胞と比較して増加した。

ST2+ Tヘルパー細胞は野生化マウスで有意に多く、炎症性危険シグナルに迅速に反応する。
SPFマウスでは、抑制性Treg（Foxp3+）細胞の約10％がIL-33RサブユニットであるST2を発現している。従来型Tヘルパー（Foxp3-）細胞のST2発現は比較的少なく、これは清浄なSPFマウスではTh2細胞が相対的に少ないことと一致している。野生児の肺には、ST2+ Tヘルパー細胞がかなり多く含まれていたが（図S6A）、ST2+ Treg細胞の割合に有意差はなかった。内臓脂肪組織、筋肉、肺のST2+ TregはrIL-33の投与に非常に反応し、これらの組織の炎症を抑制するのに役立っている可能性があることが、最近のいくつかの報告で確認されている(50-53)。野生個体では、ST2+ Tヘルパー細胞とST2+ Tregの比率は2：1以上であったが、SPFマウスでは、ST2+ TregがST2+ Tヘルパー細胞をはるかに上回っていた（図S6B）。野生個体におけるrIL-33の投与期間中、ST2+ Tヘルパー細胞とST2+ Tregの比率は維持され、わずかに増加さえしたことから、ST2+ Tヘルパー細胞は、TCRを刺激するためにペプチド抗原の外因性注入を必要とすることなく、rIL-33に反応したことが示唆される。

ワイルドリングマウスとSPFマウスにAA抽出物を投与すると、肺と気道に急速な炎症反応が起こった。一般にrIL-33より強力ではないが、AAは野生化マウスにおいてSPFマウスと同程度に気道および肺の好酸球増加と好中球増加を誘導した（図S7A）。AAを投与された野生個体では、ILC2が時間経過を通じて減少した一方、ST2+ Tヘルパー細胞はAAを投与された野生個体では2日目に増加したが、4日目には増加しなかった（図S7B）。ST2+ Tヘルパー細胞とST2+ Tregの比率は、野生個体では2:1に維持され、SPFマウスでは4日間にわたって増加したことから、SPFマウスではde novo Tヘルパー細胞応答が生じたことが示唆された（図S7C）。

rIL-33およびAAの短期注入モデルにおける投与後のST2+ Tヘルパー細胞およびST2+ Treg細胞の拡大から、分裂中の細胞をマークするKi-67発現を解析することになった。どちらのモデルでも、ILC2は野生化マウスとSPFマウスの両方で急速に分裂に入った（図3E、図S8B）。Ki-67+細胞の割合の有意な増加は、野生児のST2+Tヘルパーにおいても特異的に観察され、野生児の内因性Th2細胞は、外因性同族抗原の投与がなくても、自然免疫性サイトカインに応答して分裂・増殖することができることを示している（図3E、図S8Aにゲート戦略を示す）。

SPFマウスのST2+Tヘルパー細胞では、このような分裂のスパイクは観察されなかった。同様の反応がAAチャレンジ後にも観察され、最初のアレルゲン投与から2日後にKi-67+ ST2+Tヘルパー細胞の有意な増加が観察された（図S8B）。このように、ST2+ Tヘルパー細胞は、野生個体では自然炎症シグナルに迅速に反応するが、SPFマウスでは反応しないようである。

謝辞
野性マウスの輸送と飼育を円滑に進めてくれたKM-F動物施設のスタッフに感謝する。肺組織の病理学的解析はKarolinska InstitutetのMorphological Phenotype Analysis施設で行った。

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2021年3月29日掲載
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