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発行：2023年3月13日
繁栄か生存か：低塩分土壌の原核生物生活

https://environmentalmicrobiome.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40793-023-00475-z?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

ブランカ・ヴェラ＝ガルガロ
マルセラ・エルナンデスさん
...
アントニオ・ヴェントーサ
作家を表示する
環境マイクロバイオーム第18巻、記事番号：17（2023） この記事を引用する
メトリックス詳細
アブストラクト
背景
土壌サービスは、地球上の生命にとって中心的なものであり、その主役は微生物である。そのため、土壌の品質を評価するためには、土壌内の微生物動態を支配する原理と要因を理解する必要があります。塩分を多く含む土壌は、9億ヘクタール以上の土地に影響を及ぼす生命にとっての制約であり、その数は気候変動により驚くほどの速度で増加すると予測されています。しかしながら、このような生息地で微生物の生活がどのように展開されているかについては、ほとんど知られていない。本研究では、18O-水を用いたDNA安定同位体探査（DNA-SIP）により、低塩分土壌サンプル（ECe = 97.02 dS/m）で増殖可能な分類群を初めて決定した。さらに、この生息環境における原核生物の生育に光が果たす役割を評価した。
結果
その結果、古細菌とバクテリアの両方が増殖し、分類群特有の増殖パターンから、塩類土壌での成功の要因に関する知見を得ることができた。塩分適応のためのエネルギー的に効率的なメカニズム（ソルトイン戦略）を共有するハロアーキアやサリニバクターなどの極端な好塩性菌に関連する系統が、活発なコミュニティを支配していました。また，Staphylococcus属，Aliifodinibius属，Bradymonadales属，Chitinophagales属など，中程度の好塩性・耐塩性分類群に属する細菌も培養中に増殖したが，重同位体をあまり取り込まなかった。光は原核生物の光合成を刺激せず、代わりにほとんどの細菌の成長を制限し、成長した古細菌の多様性を減少させた。
結論
本研究の結果は、塩類土壌での生活はエネルギー的に高価であり、土壌の不均一性や外多糖類生産あるいは捕食などの形質が、低塩類土壌での成長を支えている可能性を示唆するものである。塩類土壌の従属栄養生物群集を支えるための光栄養の貢献は、依然として不明である。本研究は、このような環境の管理にとって重要な機能をより包括的に理解するための道を開くものである。さらに、塩分濃度が微生物群集に与える影響について理解を深めるために、塩類土壌でのさらなる研究の可能性を示すものである。
はじめに
塩害土壌は、世界全体で9億ヘクタール以上と推定され[52]、乾燥・半乾燥地域で最も多く見られると言われています。気候条件の変化により、塩害は継続的に増加すると予想され、2050年までに耕地の50％までが干ばつや塩害の影響を受ける可能性があると推定されている[61]。これらの土壌では、塩分の物理的、化学的、生物学的影響と、比較的高い温度、低い水分、高い日射量といった他の共通する同時発生要因が、植物や微生物群の発達を制限しています。土壌は一般に、飽和土壌抽出液の電気伝導度（ECe）が4 dS/mを超えると塩害とみなされる。しかし、ECeが2 dS/mを超える土壌では、敏感な作物の成長にすでに影響がある場合があり、16 dS/mを超えて満足に収穫できる耐性のある作物はごくわずかである[56]。この範囲を超える導電率の値を持つ土壌は、過塩水とみなすことができる。可溶性塩の含有量が高いと、植物の発育に支障をきたし、その結果、植物が枯渇し、最終的には不毛の地となる。植生がなければ、土壌への炭素の投入が大幅に減少し [51]、耐塩性微生物や好塩性微生物のみが生息できる環境となる。塩類土壌の面積が拡大し、この転換が経済的および環境的に重要であるにもかかわらず、これらの生息地で微生物の生活がどのように展開されるかについては、驚くほどほとんど知られていない。
低塩分土壌の微生物成分に関するこれまでの研究は、世界中のいくつかのサイトにおける群集の多様性と組成、および物理化学的要因との関係の評価で構成されており [10, 11, 17, 29, 30, 35, 36, 58, 59, 64, 67] 、高塩分土壌における生命の群集全体のメカニズム的側面を扱う研究はほとんどない [12, 44, 45] 。このため、これらのシステムの機能についての理解は不十分であり、水生と陸上の生息地が微生物に与える制約が異なることから [4, 7] 、広く研究されている低塩性水から得られた好塩性および好塩性コミュニティの原則が、土壌においてもどの程度当てはまるかは不明であるという事実が深刻な問題であった。このような背景から、塩性土壌の微生物生態に関する研究を進めることで、新たな知見が得られ、水生生息地からの外挿の妥当性が評価される可能性があります。塩性土壌や過塩性土壌の生物多様性プロファイリングによると、塩性土壌の生命限界条件にかかわらず、いくつかのフィラの古細菌やバクテリアのメンバーが存在することが示されている。多くの研究が、ユーリーカルチャオタ、シュードモナドタ、バクテロイダオタ（最近バルネオロタとロドサーモタに再分類されたバクテロイダオタを含む）に属する好塩菌が塩性土壌を支配していることを示しています。が、多様な代謝能力と塩に対する感受性を持つ他の分類群（Bacillota、Actinomycetota、Cyanobacteriota、Chloroflexota、Deinococcota、Gemmatimonadota、Planctomycetotaなど）の代表も世界中のサイトで偏在している [10, 11, 17, 29, 30, 35, 36, 58, 59, 64]. これらの土壌における原核生物の多様性と群集構造には、水分量、pH、土壌有機炭素などの環境因子が重要な役割を果たすことが確認されている [58, 67]。現在、塩類土壌における原核生物群集の多様性と構造が明らかになりつつあるが、その機能についての理解は不十分である。ECeが52 dS/mまでの自然塩土壌では、微生物の呼吸と増殖が検出されているが[44]、これらの活動に関与する微生物の正体は明らかにされていない。微生物のシードバンクの規模や性質が不明確であることから [22, 37, 54] 、塩類土壌で検出された微生物の代表が、特定の瞬間にどの程度活動し成長しているか、どの形質がこうした極限環境での活動に不可欠か、あるいはどのようなエネルギー源が彼らの活動を支えているかは不明である。
太陽光は、塩類土壌の生態系に広く存在し、微生物の動態に多様な影響を与える可能性がある要因です。光合成により、光独立栄養生物は光を利用して新しい炭素化合物を生成し、従属栄養生物の成長をサポートすることができます。光従属栄養生物も光から代謝プロセスのエネルギーを得ることができますが、太陽光は、光によって生成された活性酸素種（ROS）によって生体分子に有害な影響を与え、微生物に悪影響を及ぼすことがあります。実際、塩類土壌の調査では、光合成代謝を行う細菌（Cyanobacteriota、Pseudomonadota、Chloroflexota、Gemmatimonadota、Bacillota）やロドプシン系の光従属栄養能を有する微生物（Euryarchaeota, Pseudomonadota、Bacteroidota、Balneolota、Rhodothermota、Cyanobacteriota、Bacillota、Actinomycetota、Deinococcota、ChloroflexotaおよびPlanctomycetota）。これらの土壌では、光照射に対する抵抗性を付与する一連の適応を持つハローキーパーが、群集の大きな割合を占めている [18, 25, 53]。このような多様な光応答機構を持つ群集では、光が微生物活動の重要な駆動因子となり、エネルギーと炭素の流れに影響を与える可能性があります。
18O濃縮水を用いたDNA安定同位体探査（H218O-DNA-SIP）は、環境試料中の成長する微生物を同定することができます[1, 47]。水はすべての生物にとって普遍的な基質であるため、H218Oでインキュベートしたサンプル中の活発に増殖する微生物は、新たに合成されたDNAに18Oを取り込み、密度勾配で増殖していない生物のDNAと分離することができる。この方法は、環境因子が微生物の増殖に与える影響を調べることもできます。この方法は、南極のマクマードドライ谷[50]のような極限環境も含め、多様な生態系における土壌微生物群集の調査に成功裏に適用されています[49]。
本研究では、H218O-DNA-SIPとハイスループットシークエンシングを組み合わせて、オディール塩沼の過塩水土壌における原核生物の成長を評価し、活性の高い分類群およびその活動を支える可能性のある生理的形質を特定しました。また、光の影響を評価することで、微生物増殖の促進因子または抑制因子としての光の役割について、さらなる知見を得ることができました。
研究成果
採取した土壌のEC1:5は17.96 ± 5.75 dS/m（平均±SD）（n = 3）、pHは5.5 ± 0.12（n = 3）、重量比水分（WC）は 0.14 ± 0.01 g water/g乾燥土壌（n = 6）でした。この電気伝導度の値は、飽和ペースト状抽出物における約97.02 dS/mに相当する[19]。水分は、培養前に0.08±0.03g水/g乾燥土壌（n = 3）にまで減少させた。以前の研究では、これらの土壌の溶存有機炭素（DOC）含有量は680.3～2703.2 mg/kgの範囲であった[58]。
サンプルはH218Oで3週間インキュベートされたが，これは，自然条件下で倍加時間が最大23日である成長中のハロアカを標識するのに十分な時間であったはずである [34, 38]。土壌サンプルは、微生物の成長に対する太陽光の潜在的な役割を評価するために、明所または暗所でインキュベートした。光化学系 II の阻害剤である DCMU (3-[3,4-dichlorophenyl]-1,1-dimethylurea) は、光独立栄養活動と光従属栄養活動を区別するための処理として含まれていた (Fig. 1) 。
図1
使用した手法の全体図。まず、土壌を約50％の保水力まで乾燥させた。次に、土壌のサブサンプルを4つの処理（明、暗、明+3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea、DCMU、暗+DCMU）にそれぞれ3連で従事させた。コントロールには滅菌脱イオン水を使用した。チューブを37℃のインキュベーターに入れ、LightまたはDarkのいずれかの条件下で21日間培養した。DNA抽出後、Neufeldら[54]が記載したように、わずかな修正を加えてDNA-SIP手順を行った（方法の項を参照）。得られた14のフラクションのそれぞれにおける古細菌および細菌の16S rRNA遺伝子を、リアルタイムPCRによって定量した。DNAフラクションは、浮遊密度に応じて3つのグループにプールした：ライトDNA（L、浮遊密度が1.690-1.729g/mlの範囲で、コントロールと一致するため、非標識DNAに相当する個々のフラクションからなる）、中重量DNA（MH、1.730-1.749g/ml）および重質DNA（H、1.750-1.780 g/ml）。ビン詰めした密度画分を16S rRNA遺伝子について分析した
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18O処理サンプル（H218OまたはH218O + DCMU）のDNAプールの浮力密度が、H216Oコントロールのインキュベーションのものと比べて高いことが示すように、DNAの同位体濃縮は成功した（図2）。細菌と古細菌のコミュニティは、異なるラベル化パターンを示しました。古細菌の場合、18Oインキュベーションサンプルから得られた16S rRNA遺伝子コピーのほとんど（93-99%）が、採用した処理にかかわらず、重いフラクション（浮遊密度、BD > 1.73 g/ml）に検出されました。また、G + C含有量がDNAの密度に及ぼす影響を表す非標識DNAの分布は、狭い一峰性の対称分布を示した。一方、18Oインキュベーションで得られたDNAの分布は、G + C含有量だけでは説明できない、幅が広く、歪んだ異質な分布を示しました。このことから、古細菌の標識化の程度には、各処理内でばらつきが生じたと考えられる。細菌については、1.73 g/mlを超える浮遊密度で出現する16S rRNA遺伝子の割合は暗所でのみ明らかになり、これは暗所＋DCMUインキュベーションにおける対照試料との有意差のみだった（p = 0.03, Fig. 2）. より高密度なグラジエントフラクションへのDNAのシフトは、古細菌よりも細菌の方が低かった（Fig.2）。光でインキュベートしたH218O処理サンプルでは、バクテリアの16S rRNA遺伝子配列のごく一部がコントロールよりも高い浮遊密度に現れ、大部分は標識の兆候を示さなかった（Fig.2）。
図2
異なる処理の土壌DNAをアイソピクニック遠心分離して得られたグラジエントの各密度画分における細菌および古細菌の16S rRNA遺伝子コピー数。相対値は、各グラジエントにおけるコピー数の合計を考慮して算出した。各パネルは、コントロールと処理（H218O、H218O DCMUを明所または暗所でインキュベートしたもの）を示している。コントロールと処理間の有意差（p < 0.05, Student's t-test）は(*)で示されている。棒グラフは3連の標準偏差を示す。
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13の異なる門（古細菌の場合はEuryarchaeotaとNanohaloarchaeota、細菌の場合はActinomycetota、Bacteroidota、BRC1、Cyanobacteriota、Deinococcota、 Candidatus Dependentiae、Bacillota、Gemmatimonadota、 Planctomycetota、Pseudomonadota、Verrucomicrobiota）が、いずれの処理またはコントロールにおいても1%を超えるアンプリコンで表された（追加ファイル1：図 S1）。
Amplicon Sequence Variants (ASV)のShannon indexに基づくα多様性から、H画分の古細菌の多様性は、暗黒＋DCMU、光または光＋DCMU処理よりも暗黒インキュベーションで高いことがわかった（図3）。MHフラクションの古細菌群集のα多様性は、低密度フラクション（L）よりもわずかに低いだけであった。細菌群集の多様性は、LからHのビン詰めフラクションまで密度が高くなるにつれて減少した（Fig. 3）。
Fig. 3
コントロールとトリートメントの各ビンク分画におけるA古細菌群集とB細菌群集のシャノン多様性指数。箱ひげ図は、各グループ（n = 3）の多様性指数の分布の中央値（横線）、75パーセンタイル（箱）、最大値と最小値（箱外の点）を示す。
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MHとHの両方のフラクションのフィロタイプは、H218O標識処理のグラジエントフラクションの密集したプール画分において、非標識（自然存在量のH216O、コントロール）のグラジエントの対応するプール画分と比較して、相対存在量の割合に著しい増加があった場合に標識されていると見なされた。H218O処理とH216Oコントロールの間の違いを検出するDESeq2アルゴリズムに依存するHR-SIPアプローチ（HTSSIP）によると、合計239のフィロタイプが、H（78フィロタイプ）またはMH（146フィロタイプ）プール画分のいずれか、あるいは両方（15フィロタイプ）でラベル化されていることが判明しました。
本研究では、どちらかのドメインに属するASVの総数がほぼ均等でしたが（ASVは53.7%が古細菌、46.3%が細菌に分類）、ラベル付きリードの93.2%が古細菌に属していました（224 ASV、これらのアンプリコンで確認されたすべての古細菌ASVの21.62%)。これらは、ハロバクテリア（Euryarchaeota）クラスの既知のファミリーすべてにまたがり、ファミリーレベルで分類されていないハロバクテリアや、ナノハロアーキア（Nanohaloarchaeota）にも及んでいました。本研究で検出された全細菌系統の1.7%にあたる15種類の細菌系統のみが、我々の手法で有意に標識化されたと確認された。これらは、Rhodothermaceae（Bacteroidota）のSalinibacter、Balneolaceae（Bacteroidota）のAliifodinibius、未分類のChitinophagales（Bacteroidota）、未分類のBradymonadaceae（Pseudomonadota）、Thermoanaerobacterales - Family III（Bacillota）、Staphylococcusaceae（Bacillota）、BacillotaおよびPseudomonadotaの未分類のメンバーとして分類した。すべての処理およびプール画分において、ドメインArchaeaからの代表が標識として同定されたが、ライト処理のヘビー画分（H）にはBacteria属の16S rRNA遺伝子配列は見られなかった（図4および5）。
図4
いずれの処理および重質プール画分（ミディアムヘビー、MH、ヘビー、H）においても、リードの1%以上を占める古細菌分類群の相対存在量中央値（n = 3、点）と50%信頼区間エラーバー（線）を、属レベル（または最も近い分類）で示した点-範囲図。塗りつぶされた点は、特定の分類群の少なくとも1つの代表が有意に標識されていると同定されたことを示す。色は異なる系統を表す -上から順に。ユリカモメ目、ナノハロカモメ目
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図5
処理およびヘビープール画分（ミディアムヘビー、MH、ヘビー、H）のいずれかのリードの1%以上を占める細菌分類群の相対存在量中央値（n = 3、点）および50%信頼区間エラーバー（線）を属レベル（または最も近い分類）で示す点-範囲プロット。塗りつぶされた点は、特定の分類群の少なくとも1つの代表が有意に標識されていると同定されたことを示す。色は異なる系統を表し、上から下へ。シュードモナドータ、バクテロイダータ、バシロタ、ゲマティモナドータ、プラクトミセトータ、デイノコックス、カンディダスデペンディア、アクチノミセトータ
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各サンプルの標識群集の順序解析から、標識生物の16S rRNA遺伝子が見つかった画分の浮力密度（H対MH）に反映される同位体濃縮度が、照射体制よりも群集組成の違いを決定する強い要因であることがわかった（追加ファイル2：図S2）。それにもかかわらず、明暗で異なるコミュニティが標識された。例えば、Hフラクションでは合計46個のASVが同定されたが、このうち3個だけが明暗両処理で存在した。MHフラクションで同定された83個のASVのうち、明暗両方のインキュベーションで確認されたのは12個だけでした。
明所で培養したサンプルの合計22のラベル付き系統型のうち、Hフラクションでは2つのハロアルケアルASVが優勢でした。ASV-1267（Halosiccatus属に属する）はこれらのフラクションの標識リードの59～63％を占め、ASV-117（Halorientalis属に属する）はリードの26～28％を占めた。暗黒処理での標識コミュニティは、より多様であった。Euryarchaeota（71.6-83.3%を占める）、Pseudomonadota（14.3-22.7%）、Nanohaloarchaeota（0.2-14%）およびBacillota（0-1.8%）のフィラのメンバーがラベル化されていた。DCMUを投与したサンプルは、明所処理（Hフラクションで76-91%）と暗所処理（Hフラクションで51-69%）の両方で、Natronomonasに関連する系統が優勢であった。この系統は、明所でも暗所でもDCMUを用いない場合は標識されなかった。一方、明所および／または暗所処理で増殖した系統型は、対応するDCMU処理でも標識されていた。さらに、ハロプラヌス属に属する2つのASVが、適用した処理とは無関係に、すべてのHフラクションで同定された。既知の光独立栄養生物は、どの処理でも標識されなかった。重要なことは、処理に対する反応に属人的なばらつきが見られたことである。
考察
本研究は、オディール塩沼の塩類土壌において、活発に増殖している原核生物の同定と、その増殖に及ぼす光の役割の可能性を解明することを目的とした。塩性土壌の微生物群集はこれまでにも調査されてきたが、土壌マトリックス内でのこれらの集団の活性と成長はこれまで研究されていなかった。私たちは、活発に複製する生物を同定できるH218O-SIP[48]を用いて、その場での成長をモニターしました。H218O-SIP（光合成阻害剤DCMUの有無にかかわらず）を用いて土壌サンプルを3週間インキュベートすると、細菌と古細菌の両方のDNAが重いフラクションから検出されました（図2）。これは、両方のドメインの代表が、成長の代理である同位体を取り込んだことを示しています。注目すべきは、分類群によって異なる成長レベルが確認されたことです。古細菌は、i) 勾配が重いフラクションに存在する全DNAの割合、ii) 標識度、iii) 測定された光環境に対する耐性 (Fig. 2) および iv) 標識されたASVの割合において、細菌より優れていた。一般に、標識された細菌系統の割合が低いこと、細菌の標識が弱いこと、光に対する感受性が高いことから、標識された細菌は生理的成長限界に近いところで成長していることが示唆されました。これらのグローバルな標識パターンの基礎となるメカニズムについて、より細かい分類レベルでの成長反応の評価を通じてさらなる洞察を求めた。
どのプール画分でもリードの1%以上を占める13の系統（Additional file 1: Figure S1）のうち、Euryarchaeota、Nanohaloarchaeota、Bacteroidota、Pseudomonadota、Bacillotaのみが成長コミュニティで表された（図4と図5）。標識分類群のうち、極めて好塩性のハロアルカエア（Euryarchaeota）とサリニバクター（採用したデータベースではBacteroidotaに分類されていたが、現在はRhodothermota門に属すると認識されている）に関連するものが、これらの土壌を支配していました。これらの系統的に無関係な2つの生物は、ユニークで効率的な浸透圧適応戦略を共有しており、高塩濃度での生育という点で、明確な潜在的優位性を持っている。高塩分環境での生活は、エネルギー的にコストがかかる[32]。細胞質の浸透圧調整にKClを用いること（いわゆるソルトイン戦略）で、ソルトイン戦略の維持に必要なコストは、しばしば浸透溶媒の合成に依存する他の好塩菌が用いるソルトアウト戦略のコストのほんの一部に過ぎない［32、33］。このように，極端な好塩性生物は，バイオマス生産など，浸透圧適応以外の生理機能にエネルギー予算のより高い割合を割り当てることができる。このことは、低塩分水系で観察されるように、これらの生物が塩類排出戦略に依存する生物よりも高い塩分上限値に耐え、高いin situ成長率を有する理由であると主張される [34]。
驚くべきことに，これらの土壌における極限好塩菌の優勢は，低塩性水域よりも比較的低い導電率で生じるようである [5, 43, 55]。現在の土壌塩分評価（土壌抽出液の電気伝導度）が、ある瞬間に土壌系の微生物が直面する実際の浸透圧ストレスを正確に表現する能力に関する不確実性とともに [26] 、土壌に特有の追加のストレス要因が、測定した伝導度レベルが低いほどエネルギー効率の高い生物を選択する可能性があると我々は仮定している。土壌では、溶質の量に起因する浸透圧効果とは別に、マトリック効果（固体粒子の存在とその性質に由来）が水の利用をさらに制限するため、細胞の緊張を維持し、酸化損傷を修復し、細胞機能のために水を得るためのエネルギー的な負担が余分にかかることになる。さらに、このような土壌に生息する微生物は、エネルギー源の不足（希少性または拡散制限による）を経験する可能性がある。このような背景から、これまで研究されてきた多くの低塩分水系では、塩分濃度が生命を制限する主要な要因であり、したがって、塩分濃度と微生物群集組成は高い相関があるが、塩害土壌の微生物群集組成を塩分濃度のみから予測することは不可能であると考えられる。全体として、我々の発見は、主要な生命制限要因としての塩分の相対的重要性が、土壌よりも低塩分水系で高いということと一致する。また、これらの結果は、ソルトインメカニズムが、エネルギーを必要とする状況において、幅広い利益をもたらすことを示唆している。しかし、これらの仮説を検証するためには、土壌微生物が効果的に経験する塩分濃度とECの相関をさらに評価する必要がある。
また、ハロアーキアやサリニバクターと同様に、中程度の好塩性菌や耐塩性菌に関連する系統も標識されていた（図4および図5）。本研究におけるこれらの生物の増殖には、いくつかのメカニズムが関与している可能性がある。土壌の時空間的不均質性は、もっともな説明となる。塩類土壌では、不均質性により、多様な物理化学的組成を持つ時間的・空間的に孤立したマイクロハビタットが形成され、様々な耐塩性や要求性を持つ生物が保護される可能性がある [54, 57] 。同時に、標識された分類群は、これらの生息地での生活に特に適した特徴を持っている可能性がある。例えば、エキソポリサッカライド（EPS）を生産する能力が認められているStaphylococcus属に関連する系統が標識されたことは、このメカニズムが塩性土壌で有利であることを示唆している。EPSは、乾燥や塩害から身を守り、炭素貯蔵ポリマーとして機能するなどの特徴があります[13]。さらに、最近報告された細菌食によって繁栄するグループであるBradymonadaceaeに関連する生育生物が同定されたことから[28]、捕食生活がこれらの土壌の特定の状況において微生物に利益をもたらす可能性があることが示唆されている。土壌水分が減少すると捕食が減少することから[46]、不飽和土壌で捕食が有利であるとするのは矛盾しているように思えるかもしれない。この点で、標識された分類群は、3週間の全期間を通じて活発に生育していた可能性もあるし、ある特定の瞬間だけ生育していた可能性もある。後者は、Bradymonadaceaeに関連する系統の場合であり、土壌の水分補給時に捕食する機会が多かった可能性がある。また、Chitinophagalesの仲間の多くは、リグニンやキチンなどの複雑なポリマーを代謝することができ、植物や昆虫由来の物質が散発的に系に到達することで選択的優位性を獲得していると考えられる。最後に、限られた文献からは、Aliifodinibiusに関連する代表的な生物が、この生息環境における他の中等度好塩菌に対して、どのような特性によってさらなる優位性を得ることができるかは不明である。これらの分類群や他の未同定分類群は、塩性土壌での生活に適した未認識の戦略を持っている可能性があり、その記述が待たれるところである。
成長した系統は、同位体を取り込む程度が異なっており、記載された特性またはそれらの組み合わせが、異なる程度に有利である可能性を示している。さらに、資源獲得に関連する形質（炭素源やエネルギー源の多様性、運動性など）やエネルギー産生代謝のタイプも成長速度に影響を与える。栄養獲得は系統的に不安定な形質として同定されているため[16]，栄養の違いは，同じ属に属する異なるASVや同じ浸透圧適応機構を採用していると推定される系統型の成長反応に見られるばらつきを説明するのに寄与するかもしれません。
DNAに取り込まれる酸素の主な供給源の違いも、標識のばらつきの一因である可能性があります。生物は、外部の水、代謝水、または他の酸素含有有機化合物から酸素を取り込むことができる [1, 21, 23] 。分類群による酸素の主な取り込み経路に関する情報は限られているため、これらの要因の寄与を評価することは困難である。
再水和後の生育の開始時期が異なれば、同様に標識の程度も異なる可能性がある。微生物が、再湿潤イベントまたは炭素源の添加のいずれかに応じて、すなわち、水および／または栄養の制限が緩和されたときに、特定の応答開始を示すという証拠がある[46]。この現象は、短期的には代謝回復のメカニズム、長期的には基質の協調的な連続利用や摂食関係によるものとされている [1, 20, 39]．ハローキーパーは特に乾燥に強いので[53]，乾燥期間後に急速に成長を再開しても不思議ではなく，観察された優位性のもう一つの基礎となる。また、MHとHの系統型は、異なるライフスタイルを送るか、栄養関係にある可能性もある[49]。
本研究では、光によってほとんどの細菌の増殖が制限され（図2）、多様な古細菌群集の発達が阻害された（図3）。これは、塩田での先行研究で検出された、光強度の増加に対する原核生物の多様性の低下と一致する[60]。いずれの場合も、明所（暗所と比較）または高照度（低照度と比較）において、塩類戦略家が塩類排出細菌より有利であった。これらの土壌では、ハロアーキアとサリニバクターに対する光の未確定な成長促進効果とは別に、光照射の負の影響も光レジームの機能として異なる群集の構成に寄与している可能性がある。光による生体分子への悪影響は、主に活性酸素種（ROS）の発生によってもたらされ、すべての生物が同じように対応できるわけではなく、広範囲かつ特異的な修復が必要となる。この点、ハロアーキアには、活性酸素による細胞構造の損傷を保護・修復するための多様なシステムがあり、紫外線や赤外線の照射に対する高い耐性という観点から評価されている[62]。好塩菌についてはそのような詳細な研究はないが，好塩菌の多くはハロアーキアよりも酸化ストレスに対する耐性が低いという証拠がある [55]．さらに，塩類土壌での原核生物の成功にエネルギーが重要な役割を果たすという提案された枠組みでは，ソルトイン戦略に依存する生物は，光誘導損傷の修復に費やせるエネルギー予算の割合が高くなる可能性があるため，ソルトアウトよりも優れていると考えられる．
このことは、原核生物の光合成が、今回の実験条件下では重要な役割を果たしていない可能性を示唆している。また、真核生物の光独立栄養体が活性化している可能性についても検討した。原核生物の光合成がない場合、DCMUを添加した光と添加しない光でインキュベートしたサンプル間の差は、真核生物の光合成活動か光従属栄養の効果を示唆する可能性があります。DCMU処理は、高い再現性間変動と、重要なことに、阻害剤のオフターゲット効果の兆候を示し（図4と5）、確信に満ちた解釈を導き出すことができなかった。文献によると、Dunaliella 属（Chlorophyta）の藻類は、塩水池のような低塩水系で従属栄養生物群集を支えているが [38] 、他の低塩水系では明らかに存在しない [2] 。この属は塩性土壌で検出されているが[3, 8]、今回調査した特定の場所のメタゲノムデータセットでは、葉緑素科に関連する配列は見られなかった[59]。塩類土壌における光合成グループの正確な生態学的役割とエネルギーおよび炭素の流れは、土壌地殻だけでなく、これらの環境におけるさらなる研究と自然光の設定で決定されるべきである。本研究の条件下では、新鮮な光合成物質が生産されないことが明らかであるが、採取時に土壌試料に既に存在していた有機炭素や、乾燥-湿潤過程で生じた細胞破片が、重要なエネルギーおよび炭素源となる可能性がある。
なお、このデータセットで有意に標識された系統を同定するために採用した手法の分解能は、配列決定された画分の数と各系統の標識の組み込みの程度に依存することに留意する必要がある。さらに、H218O SIP研究のように標識生物の数が多い場合、濃縮の有意性を検出する統計手法の検出力は低下する。本研究では、3つのプール画分（L、MH、H）の配列決定により、システム内で最も成功した分類群のみを検出することができ、この調査の目的には十分であった。
結論
本研究は、塩類土壌における原核生物の増殖の要因と光の影響について検討し、これらのシステムの微生物生態と機能のメカニズム的理解への道を開くものである。極端な好塩性生物（主にハロアーキア属）が最も成功した生物として同定され、これらのシステムにおいて極端に好塩性のユーリーアーキア属が重要であることが示された。しかしながら、比較的多くの中等度好塩性細菌種や耐塩性細菌種が生理的成長限界に近い状態で生育しているように見えた。このことは、これらのシステムにおける土壌機能に対する極度の好塩性と適応度の低い集団の相対的貢献、および劣化土壌の群集の回復の可能性に関する重要な生態学的疑問を提起する。また、本研究は、生命を制限する主要な要因としての塩分濃度の相対的重要性が、陸上の過塩水環境と比較して塩水環境では高い可能性があることを明らかにし、一方のシステムから他方のシステムに直接外挿することの難しさを示している。
材料と方法
サンプリング、物理化学的特性評価、サンプル前処理
2017年8月に、ウエルバ（スペイン南西部）に位置するオディエル塩沼（GPS座標37.207218、-6.965999）の塩性未植生パッチからコア土壌サンプル3点（深さ4cm、互いに10cm離れ、周囲の植物から少なくとも60cm離れている）を採取し、この同じ地域で原核生物の多様性や空間動態、代謝可能性について記述した先行研究の有無に基づいて選択しました [58, 59]. サンプルは、実験室への輸送のために低温に保たれた。主に乾燥した塩の結晶からなる薄い1～2 mmの表層を捨て、3つの土壌サンプルを混合しながら、4℃で2 mmのメッシュを通した湿式ふるい分けにかけた。含水率は、一定温度のオーブンで一定重量になるまで重量法で測定した。pHと電気伝導度は、1：5（w/v）抽出液で測定した。飽和ペースト抽出物の電気伝導度は、公表されている関係を用いてEC1:5から推定した[19]。
H2 18O-SIP実験の設計とインキュベーション
培養に先立ち、土壌はCaCl2を含む滅菌ボックスに1cmの層を置き、37℃で乾燥させ、重量測定で定期的に水分をモニターすることにより、約50％の保水力まで乾燥した。
土壌のサブサンプル（2 g）を15 mlのファルコンチューブに秤量し、3連で4つの各処理に供した。30μlのH218O（CK Isotopes, Ibstock, UK）＋（i）光；（ii）暗黒；（iii）光＋5μM 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea（DCMU, Sigma-Aldrich）；（iv）暗黒＋5μM DCMU. コントロールには滅菌脱イオン水(H216O)を使用した。湿らせた土壌を十分に混合し、チューブ壁面に沿って広げ、厚さ数ミリの薄層をつくった。チューブは37℃のインキュベーターに21日間入れた。光源は40WのLED電球2個で、5500Kの光を147.5±10μmolクアンタ/m2 sで照射した。暗黒条件は、対応するチューブをアルミホイルで覆うことで実現した。ファルコンチューブは、無酸素状態の発生を避けるため、毎週開封した。
DNA抽出、アイソピクニック遠心分離、グラジエントフラクショネーション
FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, California, USA) を用いて、培養期間終了時に各サブサンプルの 0.5 g から DNA を抽出した。Neufeldら[31]が記載したDNA-SIPの手順に従ったが、若干の修正を加えた。アイソピクニック遠心分離では、1μgのDNAを5.1 ml Quick-Seal (Beckman Coulter) チューブに入れ、グラジエントバッファとCsCl溶液で最終密度1.725 g/mlを達成した。サンプルを、Beckman VTi90ローターを備えたOptima XPN 80超遠心機（Beckman）上で47,200rpmおよび20℃で60〜65時間回転させた（Dumont and Hernández、2019）。シリンジポンプで水を一定速度（700μl/分）で送液することにより、チューブ内容物を350μlずつの14フラクションに分画し、Reichart AR200 digital refractometerで各フラクションの密度を測定した。各画分のDNAは、2μlの線状アクリルアミド（Ambion、5mg/ml）と2容量のPEG溶液（30％PEG 6000、1.6M NaCl）を用いて一晩沈殿させた。
グラジエントフラクション中の16S rRNA遺伝子の定量化
各フラクションの古細菌と細菌の16S rRNA遺伝子は、AB StepOnePlus装置とStepOneソフトウェアv2.3（Applied Biosystems）でTaqManアッセイを用いてリアルタイムPCRにより定量した。古細菌と細菌は、古細菌はArc787F-Arc1059R-Arc915P、細菌はBAC338F-BAC805R-BAC516Pのプライマーとプローブの組み合わせで別々に標的化した[66]。プローブは5'末端に6-carboxyfluorescein (6-FAM)、3'末端にBlack Hole Quencher 1 (BHQ1) (Sigma-Aldrich) で合成された。標準品はクローニングした遺伝子のPCRによって調製し、各アッセイで検量線用に連続希釈（101-106）した。各反応の最終容量は10μlで、5μlのTaqMan Fast Advanced Master Mix（1X（サーモフィッシャー）、0.5μlのプライマー/プローブミックス［18μlのフォワードプライマー（0.9μM、18μlのリバースプライマー（0.9μM、5μlのプローブ（0.25μM、59μlのTEバッファ）、1.0μlのDNAテンプレート、3.5μlの水からなる。両アッセイとも同じプログラムを使用し、95 ℃で5分間、その後95 ℃で30秒、62 ℃で60秒のサイクルを35回繰り返す構成とした[66]。アッセイの決定係数（R2）は0.996から0.99の範囲であり、増幅効率は86から103％の間であった。
DNAフラクションを浮遊密度に応じて3つのグループにプールした：ライトDNA（L、浮遊密度が1.690-1.729g/mlの範囲で、コントロールと一致するため、非標識DNAに相当する個々のフラクションからなる）、ミディアムヘビーDNA（MH, 1.730-1.749g/ml） およびヘビーDNA（H、 1.750-1.780 g/ml）. ビン詰めされた密度画分は、後述するようにコミュニティ特性の計算を容易にするために、特定の遺伝子ターゲットについて分析された。プールされたサンプルは、ユニバーサルプライマー515FBと806RBを用いたV4領域の16S rRNAアンプリコンシーケンスのために、サウザンプトン大学（英国）の環境シーケンス施設に送られた［15］。これらのユニバーサルプライマーは、シーケンス施設で標準的に使用されており、16S rRNAイルミナアンプリコンシーケンスのためのEarth Microbiome Projectプロトコルによって提案されました。これらは、細菌だけでなく、Euryarchaeota（これらの過塩水環境における主な古細菌の代表）およびThaumarchaeotaをカバーすることが知られている。しかし、他の古細菌を検出するためのユニバーサルプライマーの効率は、王国に特化したプライマーの効率とは異なることが分かっており[6]、qPCR結果とアンプリコンシーケンスデータを比較する際に、格差が生じる可能性があります。
16S rRNAアンプリコン解析／バイオインフォマティクス解析
アダプターおよびプライマー配列は、cutadapt 1.16 [24]を用いてデータセットから削除した。Amplicon Sequence Variants (ASV) identification, removal of chimeras and taxonomic assignations with SILVA NR database version 132 [41] was carried out with DADA2 package version 1.10 [9] in R 3. 6.2 for macOS [42]で、sort、filterAndTrim (maxEE = c(2,2), truncQ = 2, rm.phix = TRUE), learnErrors, derepFastq, dada, mergePairs, removeBimeraDenovo, assignTaxonomy および addSpecies という関数を用いて行った。このバージョンのSILVAデータベースでは、ナノハロアルカイアはNanoarchaeota phylumに含まれている。混乱を避けるため、class、order、familyでNanohaloarchaeotaに属すると判断された場合は、門の名前を修正しました。また、門の名前も現在の門の命名法に従って更新された。解析にはRパッケージphyloseq v.1.24.0 [27]を使用しました。少なくとも3つのサンプルに存在しないASVは削除された。このステップでは、40の異なる系統から2019のASVがフィルタリングされました。これらのASVを合計すると、各サンプルのリードの2%未満になります。個別には、どのサンプルでもリードの0.003%以上を占めるものはありませんでした。アルファ多様性の傾向は、このステップによって変更されることはありませんでした（データは示されていません）。この有病率フィルターは、サンプル処理に関連するアーティファクトを確実に除去するために採用されました。サンプル間でまれにしか見られないASVを除外することで、有意にラベル付けされた分類群に関するその後の統計的検定の検出力を高めることができました。その後、DECIPHER v2.14パッケージ[63]のAlignSeqs機能で配列を整列し、FastTree 2.1.11 [40] for macOS（塩基のデフォルトモード）で系統樹を作成した。標識ASVの同定は、HTSIPパッケージv1.4.1 [65]のHR-SIP法に実装されているように、コントロール（非標識）勾配における同じプール画分との比較によって実施されました。非計量的多次元尺度法（NMDS）の順序付けは、ASVレベルで計算された標識フィラの存在量データの二乗根変換のBray Curtis dissimilarityに基づいて計算され、プロットにはphyloseqの関数 ordinate (transform = FALSE) が用いられた。配列データはSequence Read Archive (SRA)にbioproject accession number PRJNA634977として寄託された。
データおよび材料の利用可能性
本研究で生成・解析されたデータセットは、Sequence Read Archive (SRA)のアクセッション番号SRX8395748からSRX8395801で公開されています。また、バイオプロジェクトのアクセッション番号はPRJNA634977 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA634977)です。
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リファレンスのダウンロード
ファンディング
この研究は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033の助成金PID2020-118136 GB-I00の支援を受けています。AVは、FEDER資金を含むスペインのJunta de Andalucía (grants P20_01066 and BIO-213)からの支援を謝辞とする。MGDは、Natural Environment Research Council (NERC、英国)の支援を受けたことを認める。資金提供団体は、研究のデザイン、データの収集、分析、解釈、原稿の執筆に関与していない。
著者情報
著者と所属
セビリア大学薬学部微生物学・寄生虫学教室、41012、セビリア、スペイン
ブランカ・ヴェラ＝ガルガロ＆アントニオ・ヴェントーサ
サウサンプトン大学生物科学部、サウサンプトン、SO17 1BJ, UK
ブランカ・ヴェラ＝ガルガロ＆マーク・G・デュモン
イースト・アングリア大学ノリッチ・リサーチ・パーク・生物科学部・ノリッチ・NR4 7TJ, UK
マルセラ・エルナンデス（Marcela Hernández
貢献度
BV-Gは、研究の構想、実験の実施、データの分析、論文の起草、図・表の作成、論文の草稿のレビューを行った。MHは、実験を行い、論文のドラフトをレビューした。MGDは、研究の構想、実験の実施、データの分析、論文の草稿を検討した。AVは研究を考案し、論文の草稿を検討した。最終原稿はすべての著者が読み、承認した。
対応する著者
マーク・G・デュモンまたはアントニオ・ヴェントーサに対応する。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
該当事項はありません。
掲載の同意について
該当事項はありません。
競合する利益
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関の管轄権主張に関して、中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1: 図S1.
以下の条件からなる各コントロールおよび処理の複合画分L（浮遊密度1.690-1.729g/mlの画分）、MH（浮遊密度1.730-1.749g/mlの画分）、H（1.750-1.780g/ml）における1%以上のリードで表されるA古細菌およびB細菌相のバープロットを作成しました。サンプル2 g + H218O 30 µl + (i) Light / (ii) Dark / (iii) Light + 5 µM 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU) / (iv) Dark + 5µM DCMU.
追加ファイル2: 図S2.
各処理（Light / Dark / Light + 5 μM 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (DCMU) / Dark + 5 μM DCMU）およびビングフラクション（L、浮力密度が範囲1.690-1.729g/gの個々のフラクションからなる）における成長A）古細菌、B）細菌、C）全体群集間の関連を示すNMDS解析。 690～1.729g/ml；MH、1.730～1.749g/mlの範囲の浮力密度を有するフラクションからなり、H、1.750～1.780g/mlの範囲の浮力密度を有するフラクションを包含する）。違いは、ASVレベルで計算されたBray Curtisの非類似度に基づいています。色と形は、異なる処理とビニングされたフラクションを示す。
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Vera-Gargallo, B., Hernández, M., Dumont, M.G. et al. Thrive or survive: Prokaryotic life in hypersaline soils. Environmental Microbiome 18, 17 (2023). https://doi.org/10.1186/s40793-023-00475-z
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2022年9月06日受領
2023年2月24日受理
2023年3月13日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40793-023-00475-z
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環境マイクロバイオーム
ISSN: 2524-6372
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