ヒトにおける菜食とケトジェニック食で誘発される末梢免疫シグニチャーの違い
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出版：2024年1月30日
ヒトにおける菜食とケトジェニック食で誘発される末梢免疫シグニチャーの違い
https://www.nature.com/articles/s41591-023-02761-2
ヴェレーナ・M・リンク、ポアラニ・スブラマニアン、...ヤスミン・ベルカイド 著者一覧を見る
Nature Medicine (2024)この記事を引用する
指標詳細
要旨
栄養はあらゆる生理学的プロセスに広範な影響を及ぼす。しかし、栄養がヒトの免疫にどのような影響を与えるかは、まだほとんど分かっていない。ここでは、20人の参加者がそれぞれ2週間、菜食またはケトジェニック食を順次摂取した臨床試験（NCT03878108）の事後解析を行うことで、食事介入が免疫と微生物叢の両方に及ぼす影響を探索した。多次元フローサイトメトリー、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム、メタゲノミックデータセットを含むマルチオミクスアプローチを用いて、各食事、および食事の切り替えが宿主免疫と微生物叢に及ぼす影響を評価した。その結果、ケトン食は全体的に、経路の有意なアップレギュレーションと、適応免疫系に関連する細胞の濃縮に関連していることが明らかになった。一方、ビーガン食は、抗ウイルス免疫に関連する経路のアップレギュレーションを含め、自然免疫系に大きな影響を与えた。いずれの食事もマイクロバイオームと宿主関連アミノ酸代謝に有意かつ異なる影響を与え、ベースラインおよびビーガン食と比較して、ケトジェニック食ではほとんどの微生物経路の強いダウンレギュレーションが認められた。参加者の多様性にもかかわらず、アミノ酸、脂質、免疫系に関連する化合物によって駆動されるデータセット間の緊密な結合ネットワークも観察された。総合すると、本研究は、多様な参加者において、2週間の制御された食事介入は、宿主免疫に有意かつ多様な影響を与えるのに十分であることを示しており、これは精密な栄養介入に示唆を与える可能性がある。ClinicalTrials.gov登録： NCT03878108。
主な内容
栄養は、免疫系を制御するものを含むすべての生理学的プロセスに影響を及ぼす1。栄養と宿主免疫との関連は、がんや慢性炎症性疾患などの様々な疾患状態における治療的栄養介入を開発する重要な機会となる。食事と疾病状態との関連を裏付けるものとして、低脂肪の菜食主義者やベジタリアンの食事は、炎症の減少、心血管疾患のリスク低下、総死亡率の低下と以前から関連している2,3,4。一方、高脂肪・超低炭水化物食（一般にケトジェニック食と呼ばれる）は、定義されたタイプのてんかんにおける症状の軽減や神経炎症の軽減と関連している5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。しかしながら、栄養介入による予防および治療の可能性があるにもかかわらず、栄養がヒトの免疫にどのような影響を及ぼすかはほとんど不明である。
栄養は、燃料の量や質だけでなく、微生物叢15,16を介して宿主の生理機能に影響を与える可能性がある。微生物叢は、宿主の回復力を促進すると考えられる方法で、その機能を再構成および変化させる能力を有している。そのため、マイクロバイオームの構成と機能の形成には、栄養が重要な役割を果たしている17,18,19,20,21,22,23。微生物叢と栄養との関連は実験モデルにおいて明らかに確立されているが、このような共生的な二者関係がヒトの免疫にどのような影響を及ぼすかは、ほとんど未解明のままである。
栄養介入によるヒトの免疫系への影響に関するデータが少ないことに加え、これまでの研究では、一度に1つの食事に対する反応しか検討されていない。栄養介入に対する個人の反応は非常に多様であり24 、消費される食事の数も多いことから、異なる食事に対して個人がどのように反応するかを研究することは、依然として重要な研究課題である。今後、厳密に設計された臨床介入がない限り、ヒトの健康を形成するために栄養を利用することは継続的な課題である。
本研究では、高度に管理された臨床環境において、免疫と微生物叢の両方に対する食事介入の影響について検討した。我々の知る限り、本研究は、ケトジェニックおよびビーガン食がヒトに与える影響を調べた初めてのマルチオミクス研究である。これらの結果を総合すると、宿主免疫とマイクロバイオームの顕著なリモデリングが示され、ケトジェニック食とビーガン食の影響が異なることが明らかになった。この研究から得られた知見は、疾病の予防と治療のための食事に基づく治療法の選択肢についての理解を深める可能性がある。
食事介入はリンパ球の構成を変える
米国国立衛生研究所（NIH）の臨床センターに入院した20名の参加者を対象に、高度にコントロールされた栄養学的研究を行った（図1a）。このクロスオーバー研究では、多様な参加者コホート（Extended Data図1a-d）が、ケトジェニック低炭水化物食（脂肪75.8％、炭水化物10.0％）とビーガン低脂肪食（脂肪10.3％、炭水化物75.2％）を、無作為に、異なる順序で2週間、自由摂取した（図1a）。どちらの食事も、非スターチ性野菜（1日あたり約1kg）を基本に、消化可能な炭水化物の量は少なく、高度に加工された食品は必要最低限しか摂っていない。ケトジェニック食では、肉、鶏肉、魚、卵、乳製品、ナッツ類などの動物性食品を加えた。ビーガン食では、豆類、米、根菜類、大豆製品、トウモロコシ、レンズ豆、エンドウ豆、全粒穀物、パン、果物を加えた。ビーガン食はケトジェニック食に比べて食物繊維が多く、糖質が少なかった（Extended Data Fig.） 参加者の栄養摂取量は、2つの食事間でその組成が有意に異なっていた（Extended Data Fig.） さらに、ケトジェニック食の参加者は脂肪酸とアミノ酸の摂取量が多かった（Extended Data Fig.） ケトジェニックおよびビーガン食の詳細については、提示された食事の写真を含めて、以前に発表されている25。
図1：NK細胞とT細胞は食事の変化によって有意な影響を受ける。
図1
a, 実験設定の概略図。20人の参加者を2つのグループに分けた（第1グループ： 女性4人（ピンク）、男性6人（青）： 一方のグループは2週間ヴィーガン食で開始し、その後すぐにケトジェニック食に変更した（グループA）。データ（下部に表示）は、ベースラインとして最初の食事の前に直接収集し、1回目と2回目の食事終了時に収集した。マイクロバイオームサンプルについては、異なる日にデータを収集した（詳細はExtended Data Fig. フローサイトメトリーのゲーティング戦略については、Extended Data Table 1およびExtended Data Fig.2を参照のこと。このパネルに記載されている食事の順序は、最初の食事とは無関係に、すべての参加者で同じである。c、ケトジェニック／ビーガン食とベースライン食の間で頻度が有意に変化した細胞集団の倍数変化（P値＜0.01）（紫：ビーガン／ケトジェニック食で発現が増加、緑：ベースライン食で発現が増加）。ドットは-log10(P値)でスケーリング。d,ケトジェニック食とビーガン食の間で頻度が有意に変化した細胞集団の倍数変化（P値＜0.01）（紫色はケトジェニック食で発現が増加、緑色はビーガン食で発現が増加）。ドットは-log10(P値)でスケーリング。有意性は両側対t検定で計算した。ゲーティング戦略については、Extended Data Fig. 37. 制御性T（Treg）細胞、CD127lowCD25highCCR4+HLA-DR+；CD16+NK細胞、CD3-CD19-CD14-HLA-DR-CD123-CD56+CD16+；活性化Tヘルパー（TH）細胞、CD3+CD19-CD4+CD8-HLA-DR+CD38+；活性化NK細胞、CD3-CD19-CD14-HLA-DR-CD123-CD56+CD16lowCD57high。BA、ベースライン；DC、樹状細胞；DN、二重陰性；Gr、顆粒球；pp、一人当たり；S、サンプル。
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ベースラインの食物摂取量は、食物質問票を用いて推定した（Extended Data Fig.1j）。このコホートに基づく以前の報告では、ケトン食を摂取している参加者においてケトン体が増加していることが確認され、菜食主義の参加者はケトン食を摂取している参加者に比べて摂取カロリーが有意に少ないことが示された25。血液サンプルをいくつかの時点で採取し、フローサイトメトリーによる細胞集団の構成（n = 7）、バルクRNAシーケンス（RNA-seq）による遺伝子発現（n = 6）、SomaLogicによるタンパク質組成（n = 20）を評価した。マイクロバイオームメタゲノム配列決定のために糞便サンプルを採取し（n = 10）（拡張データ図1k）、血液と尿の両方でメタボローム解析を行った（n = 20）。なお、サンプルの都合上、すべての参加者についてすべてのアッセイを実施できたわけではない。
まず、末梢血単核球（PBMC）の細胞組成をフローサイトメトリーで評価した（Extended Data図1lおよび2、Extended Data表1および2、文献26）。PBMC分析は、サンプル処理に耐えられない好中球を除く、すべての主要な免疫細胞タイプに焦点を当てた。予想されたように、ベースラインでは参加者間で高いばらつきが観察された（例えば、ナイーブCD4 T細胞の頻度は、CD45+細胞全体の5％からほぼ25％まで幅があった）（図1b）。
注目すべきは、食事の順序とは無関係に、食事そのものを変化させると、ケトジェニック／ビーガン食とベースライン食の両方で、ナイーブCD8 T細胞のレベルが有意に減少し、活性化CD4 T細胞、エフェクターCD4 T細胞、エフェクターCD8 T細胞のレベルが有意に増加するなど、有意な変化が誘発されたことである（図1cおよびExtended Data図1m）。このような変化が食事の変化によるものなのか、それとも標準的な西洋食によく見られる加工度の高い食品の摂取が急激に減ったことによるものなのかは不明であるが、今後の研究課題であろう。
各食事の摂取後には、食事の順序とは無関係に、いくつかの明確な変化も観察された。例えば、ケトジェニック食を摂取すると、ビーガン食と比較して、活性化制御性T細胞とCD16+ナチュラルキラー（NK）細胞の頻度が有意に増加することが観察された（図1dおよびExtended Data図1n）。さらに、ケトジェニック食と比較してビーガン食では、活性化Tヘルパー細胞および活性化NK細胞の頻度が有意に増加することが観察された（図1dおよびExtended Data図1n）。このように、食事の変化そのものが宿主免疫系に大きな影響を及ぼしていた。さらに、ケトジェニック食とビーガン食の両方が、リンパ球の構成と活性化の状態に明確な変化をもたらした。
ビーガン食とケトジェニック食では免疫シグネチャーが異なる
次に、ベースライン時とダイエット後の全血のバルクRNA-seqを行った。高発現遺伝子のクラスタリングは、3つの条件すべてと個人間で転写産物の発現に顕著な違いがあることを示した（Extended Data Fig.） 主成分分析（PCA）では、主成分1（PC1）は参加者間のトランスクリプトームの差異をとらえ、変動の37.38％を説明したのに対し、PC2は食事間の差異をとらえ、変動の34.45％を説明した（Extended Data図3b）。予想通り、ほとんどの変動は個人差に起因していた。しかし、食事も全血トランスクリプトームに大きな影響を与えた。
次に、それぞれの食事に関連する機能的軌跡を評価した。この目的のために、血液転写モジュール27（BTM）解析と、各食事比較間で発現が異なる全遺伝子のホールマーク解析を行った（図2a,bおよび拡張データ図3c,d）。このアプローチにより、ケトジェニック食とビーガン食の間で、全体的なパスウェイの濃縮において顕著な二極化が明らかになった（図2a,b）。例えば、ケトジェニック食は、T細胞の活性化、B細胞や形質細胞の濃縮、NK細胞など、適応免疫に関連する経路のアップレギュレーションと関連していた（図2aおよび拡張データ図3d）。このように、T細胞の活性化と記憶形成に関連する基本的な経路である酸化的リン酸化（文献28,29,30に総説あり）は、菜食主義者やベースライン食と比較して、ケトジェニック食で有意に強化された（図2b）。
図2：ケトジェニック食は適応免疫の亢進と関連し、ビーガン食は自然免疫の亢進と関連する。
図2
a,下部に記したすべての比較で濃縮されたパスウェイを示すBTM解析。ドットは-log10(P値)でスケールされ、ネットワーク濃縮スコア(NES)で色付けされている。カテゴリー名は短縮した。完全な名称は拡張データ図3iを参照。有意性はfgsea pathwayパッケージで計算され、多重検定が補正された。b, 下段に示したすべての比較で濃縮されたパスウェイを示すホールマーク解析。ドットは-log10(P値)でスケーリングし、NESで色付けした。カテゴリー名は短縮した。完全な名称は拡張データ図3jを参照。有意性はfgsea pathwayパッケージで計算し、多重検定を補正した。 c, IPA疾患項解析の結果を示す棒グラフ。x軸は活性化Zスコア（ケトジェニック食とビーガン食の比較）。バーは-log10(P値)で色分けされている。正のZスコア値はケトジェニック食に富む疾患用語を示し、負のZスコア値はビーガン食に富む疾患用語を示す。d, Human Protein Atlas35からダウンロードした血液からソートされた集団の遺伝子発現のヒートマップ（行Zスコアとして）。描かれている遺伝子は、BTM解析においてケトジェニック食とビーガン食の間で有意に濃縮されたパスウェイのメンバーである。Bはベースライン、Kはケトジェニック、Vはビーガン、Pは以前の食事。
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対照的に、ビーガン食は、自然免疫および抗ウイルス応答に関連する経路の発現上昇と関連していた（図2a,bおよび拡張データ図3c）。機能解析ではさらに、I型インターフェロンのシグネチャーと応答のアップレギュレーションが予測された（図2a,b）。食事の順番は転写変化には影響しなかった（Extended Data Fig.） 私たちや他の研究者は、内在性レトロウイルス（ERV）の感知が宿主免疫に寄与すること、そして食餌脂質の変化がERVの発現に影響することを明らかにしてきた31,32,33。実際、ERVの発現は、個人間でも、食事変化後でも、明確に変化することが観察され、ERVの個別のセットは、定義された食事後に各参加者で一意に発現が上昇した（Extended Data Fig.）
研究デザインに基づき、赤血球造血の重要な構成要素である鉄の1日摂取量は、ケトジェニック食と比較してビーガン食の方が多かった（Extended Data図3f）。従って、ビーガン食のみで、赤血球分化、ヘム生合成および代謝のアップレギュレーションが観察された。食事に関連するシグネチャーと疾患状態との相関を調べるため、次にIngenuity Pathway Analysis（IPA）の疾患用語解析を行った（図2c）。この解析により、ビーガン食では赤血球関連パスウェイが増加し、ケトジェニック食ではリンパ球増加が確認された。また、ケトジェニック食と比較して、ビーガン食ではがんに関連するパスウェイの活性化がより高いことも確認された。合計308のがん関連パスウェイが有意であり、そのうち66はケトジェニック食後に高い活性化を示すと予測され、242はビーガン食後に強い活性化を示すと予測された（Extended Data Fig.） 活性化スコアの差が2以上に達したパスウェイは4つあり、そのすべてがビーガン食後に強い活性化を示した（図2c）。注目すべきは、これらの観察結果だけでは、患者のがんに対する感受性やがんの転帰に違いがあることを予測できないことである。我々のデータは、ケトジェニック食とビーガン食の両方ががんの転帰に影響を及ぼす可能性があることを示唆しており、ケトジェニック食が他のがん治療と併用することで有益であるという考えを支持する予備的証拠である34。しかし、これらの潜在的な関連性や転帰の有益性や悪化との関連性を検証するためには、ヒトにおける詳細な疫学研究や動物モデルにおけるメカニズム研究が必要であろう。
転写変化の促進因子を予測するために、我々は血液から選別した細胞集団の発現プロファイルを評価し35、濃縮されたパスウェイから遺伝子発現を解析した。このアプローチを用いると、菜食後の自然免疫のアップレギュレーションは主に好中球によって駆動されると予測されるのに対し、ケトジェニック食での適応免疫のアップレギュレーションはB細胞とT細胞によって駆動されると予測されることがわかった（図2dおよびExtended Data図3h）。
全体として、我々のデータは、ケトジェニック食は適応免疫シグネチャーを豊かにし、ビーガン食は自然免疫シグネチャーを豊かにするという、免疫系に対する食事の多様な影響を強調した。
ケトジェニック食はプロテオソームに広範な影響を及ぼす
次に、ベースライン時とケトジェニック食またはビーガン食後の全参加者の血漿から、SomaLogicを用いて約1,300個のタンパク質の存在量を測定した。線形混合効果モデル（LME）を適用すると、ビーガン食とケトジェニック食のタンパク質存在量に、異なるグループの参加者間で有意差は認められなかった（P = 0.5624）。分散分析（ANOVA）により、一部のタンパク質が食餌間で有意な影響を受けていることが明らかになった。特に、ケトジェニック食がタンパク質量に最も大きな影響を与えた（ベースライン食対ケトジェニック食、107；ビーガン食対ケトジェニック食、137）が、ベースライン食とビーガン食の間で有意に変化したタンパク質はわずかであった（21）（図3a）。食事の順番は、差次的に豊富なタンパク質の倍数変化の方向や大きさには影響しなかった（Extended Data Fig.4a-c）。さらに、開始食餌が異なる参加者のデータにANOVAを適用しても、食餌によって有意に影響される追加タンパク質は見つからなかったことから、食餌の順序はタンパク質存在量に対する食餌の影響に影響しないことが確認された（Extended Data Fig.）
図3：プロテオミクスデータは、ケトジェニック食後の適応免疫のアップレギュレーションを示している。
図3
a, 上部に示した比較のタンパク質量のボルケーノプロット。有意差のあるタンパク質（2倍以上の変化、偽発見率（FDR）＜0.01）は紫色で示した。有意性は、多重検定補正を用いたペアのWilcoxon符号順位検定で計算した。c, STRINGを用いた機能的濃縮解析を示す棒グラフ。ケトジェニック食とビーガン食（左）およびケトジェニック食とベースライン食（右）の間の全タンパク質の倍数変化について解析を行った。d, プロテオームデータのPCAを性別に色分けしたもの。 e, PCAからのユークリッド距離を性別に分けた箱ヒゲプロット。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×IQR以内の最小値まで伸びている（n = 20、男性11/女性9）。有意性は一対の両側t検定により算出。**P < 0.01. GO、遺伝子オントロジー、FDR、偽発見率。
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次に、Human Protein Atlas35から組織アノテーションをダウンロードし、影響を受けたタンパク質の起源を解析した。ケトン食は、血液、脳、骨髄を含むいくつかの組織に由来すると予測されるタンパク質に影響を与えたが、どちらの食事も肝臓と二次リンパ臓器に由来すると予測されるタンパク質に影響を与えた（図3b）。従って、ケトン食は菜食よりも宿主タンパク質の分泌やクリアランスに幅広い影響を与える可能性がある。
STRING36を用いて、全タンパク質のフォールド変化に基づく機能的濃縮解析を行った（図3c）。トランスクリプトミクス解析で得られた結果と一致して、菜食後のヘム代謝において有意な濃縮が観察された（図3c）。注目すべきは、ケトジェニック食と比較して、ベースライン食ではインスリンシグナル伝達経路の濃縮も観察されたことである（図3c）。
PCAでは、食事による分離は見られなかったが、いくつかの外れ値が示された（図3d）。さらに分析を進めると、外れ値はすべて女性参加者であり、ケトジェニック食後にかなり大きな変化を示したことから、食事に対する反応性における性差の可能性が浮き彫りになった（図3e）。食事療法間のタンパク質存在量の性差には、グルコース代謝や免疫に関連するタンパク質も含まれていた（Extended Data Fig.4e）。
このように、プロテオーム解析の結果、ケトン食が研究参加者のプロテオームに最も強い影響を及ぼす可能性が明らかになった。さらに、プロテオミクスデータは、ビーガン食がヘム代謝を促進し、食事に対する反応の大きさに性差があるという考えを支持した。
ケトジェニック食は微生物のアミノ酸代謝をダウンレギュレートする
宿主の食事は、微生物叢の構成と機能の主な要因の一つである17,18,19,20,21,22,23。そのため、微生物叢の組成と予測される機能の変化を解析できるマイクロバイオームメタゲノムシークエンシングを行った。主座標分析（PCoA）では、食餌間の明確な分離は見られなかったが（図4a）、データは2つの異なるクラスターに分類された。さらに調査を進めると、先行研究37と同様に、食事介入前のプレボテラ（Prevotella）濃度が高いクラスターと低いクラスターに大別された（Extended Data図5a）。このような差は、ベースラインの食事中の食物繊維摂取量の変動によってもたらされた可能性があるが、ベースラインの食事を調べることを目的とした食品アンケートの分析では、参加者の食物繊維摂取量に有意差は認められなかった（Extended Data図5d）。
図4：ケトン食はマイクロバイオームの組成と機能を有意に変化させる。
図4
a,マイクロバイオームデータのPCoAと95％信頼区間。b,ベータ分散プロットのセントロイド分析。c,PCoA分析から得られた各個人のベータ多様性プロットと各参加者のケトジェニック食とビーガン食の接続。接続線は開始食によって色分けされている。有意性は、限界モデル~食事+SubjectIDを用いたPERMANOVA検定で計算された。 d, ベースライン、ケトジェニック、ビーガンの食事（左）に従った全個体について、豊富な系統（>1%）の分布を示す積み重ね棒グラフ。有意性はMaaslin2を用いて計算し、P値はqvalue Rパッケージで調整した。ドットプロットは、食餌比較間の門の変化の有意性を示す（右）。紫色の点は有意な変化を示し、緑色の点は有意でないことを示す。 e, 有意なすべての分類群（Q値＜0.2）について、ケトジェニック食とビーガン食の間で有意に存在量の異なる種の倍数変化の箱ひげプロット。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×IQR以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×IQR以内の最小値まで伸びている（n = 10）。 f, ケトジェニック食対ベースライン食（左）およびケトジェニック食対ビーガン食（右）のEC数の存在量の倍数変化を示すボルケーノプロット。紫色の点は、各比較において有意に存在量の異なる経路からの酵素を示す。有意性はMaaslin2を用いて計算し、P値はBonferroni-Hochbergで補正した。 g, MetaCyc濃縮解析から有意に変化したパスウェイの数（左）と、ケトジェニック食対ベースライン食およびケトジェニック食対ビーガン食におけるアミノ酸およびビタミン生合成の変化したサブパス ウェイ（右）を示すロリポッププロット。h,全酵素のプールに寄与する属（左）、およびケトジェニック食とビーガン食の間で有意に濃縮度の異なるパスウェイからの全酵素（右）を示す積み上げ棒グラフ。PAMP、病原体関連分子パターン。
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参加者1人当たりのマイクロバイオームの多様性（α多様性）には、食事間で有意差は認められなかったが、ケトジェニックダイエットとビーガンダイエット（β多様性）ではマイクロバイオーム組成に有意差が認められ、ケトジェニックダイエットの摂取後にマイクロバイオーム組成が変化することが示された（図4b,cおよびExtended Data図5b）。α多様性（P = 0.1028）、β多様性（P = 0.75952、P = 0.65461、シャノン多様性）については、各食事群間で有意差は認められなかった（Extended Data図5c）。Phyla分析では、ベースラインと比較してケトジェニック／ビーガン食の間で有意な変化が見られたが、ケトジェニック食とビーガン食を比較した場合はわずかな違いしかなかった（図4d）。ケトジェニック食とビーガン食／ベースライン食の間のベータ分散の変化の原動力となった違いのほとんどは、同じ系統内の種の存在量のシフトに起因していた。ケトジェニック食とビーガン食の間の種の存在量の変化は、主に放線菌、バクテロイデーテス、ファーミキューテスおよびプロテオバクテリアで観察され、ファーミキューテスが最も影響を受けた門であった（26種が変化し、そのうち18種がビーガン食でより豊富になった）（図4e）。また、先行研究15,37,38,39と同様に、ケトン食や動物性食品を多く含む食事で豊富になることが知られている菌種（例えば、Bacteroides sartorii、Bacteroides vulgatus23）のケトン食後の変化や、食物繊維や植物性食品を多く含む食事で豊富になることが報告されている菌種（例えば、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium pseudocatenulatum40）のビーガン食後の変化も観察された（図4e）。
次に、機能的な洞察を得るために、すべてのリードを酵素委員会（Enzyme Commission: EC）番号にマッピングした。摂取した各食事と一致して、ビーガン食でアップレギュレートされた微生物酵素の大部分は、植物特有の多糖類の消化に関連していた。一方、ケトジェニック食でアップレギュレートされた微生物酵素は、植物と動物の両方に由来する多糖類の消化に関連していた（Extended Data Fig.） 興味深いことに、ケトジェニック食は、ベースライン食やビーガン食と比較して、微生物遺伝子量の大幅なダウンレギュレーションをもたらし、これはケトジェニック食後の多数の経路のダウンレギュレーションによって反映された（図4f,g、左）。例えば、アミノ酸の生合成（12）とビタミンの生合成（9）は、ケトジェニック食後にダウンレギュレートされた。これには必須アミノ酸と分岐鎖アミノ酸（BCAA）の生合成や、ビタミンB1、B5、B12の生合成経路も含まれていた（図4g、右）。ケトジェニック食後のマイクロバイオーム内のアミノ酸代謝の減少は、ケトジェニック食中のアミノ酸の存在量が高くなり、宿主が微生物由来のアミノ酸に依存しにくくなったことに起因している可能性がある。それぞれの食餌に関連する機能的トレードオフのさらなる解明は、重要な研究課題であろう。
次に、機能的変化の潜在的な促進因子を同定するために、データセットで評価したすべての酵素を生産する上位の属と、食事介入後に有意な影響を受けた経路の一部であるすべての酵素を同定した（図4h）。その結果、6属（Bacteroides、Blautia、Eubacterium、Faecalibacterium、Lachnospira、Ruminococcus）だけが、有意に変化した経路から酵素を発現すると予測された（図4h）。マイクロバイオームにおける機能的変化のドライバーをさらに探求することで、食事介入を用いた精密マイクロバイオームモデリングへの扉が開かれるかもしれない。
このように、ケトジェニック食はビーガン食よりもマイクロバイオームの構成と予測される機能に大きな影響を与え、そのうちのいくつかはアミノ酸とビタミンの代謝に関連するパスウェイがダウンレギュレートされた。
食事は宿主のアミノ酸代謝と脂質に影響を与える
メタボローム解析は、食事が宿主の代謝をどのように形成するかについての貴重な洞察を提供することができる。次に、全参加者の血漿と尿を対象にメタボローム解析を行った（補足表1）。プロテオームとマイクロバイオームのデータセット（図3dと4a）とは対照的に、血漿メタボロームデータから作成したPCAでは、参加者全員を食事別に分離し、ベースラインのメタボロームプロファイルはケトジェニックとビーガンの食事プロファイルの間に直接クラスター化され（Extended Data図6a）、性差による影響はわずかであった（Extended Data図6b,c）。食事群間の代謝物プロファイルに有意差は認められなかった（P = 0.4892）。合計で185代謝物（859代謝物中）が血漿中でビーガン食とケトジェニック食の間で有意に変化し（54代謝物がビーガン食で上昇、131代謝物がケトジェニック食で上昇）（図5a）、脂質が最も影響を受けた（拡張データ図6e）。ビーガン食とベースライン食の間で有意に変化した代謝物は3つだけで、ケトジェニック食とベースライン食の間で有意に変化した代謝物は16個（合計676個中）であった（Extended Data図6d）。ANOVAにより、食事の順番は代謝物プロファイルに対する食事の影響に影響しないことが確認された（Extended Data Fig.6f）。したがって、メタボロミクスはトランスクリプトームやプロテオミクスのデータよりも、宿主に対する食事の影響をより直接的に読み取ることができる。
図5：食事は宿主のアミノ酸代謝に大きく影響する。
図5
a, ケトジェニック食とビーガン食の全代謝物のボルケーノプロット。有意差のある代謝物（FDR < 0.01）は紫色で表示。b, ケトジェニック食（左）とビーガン食（右）でアップレギュレートされた、有意に異なる濃縮MetaboAnalystパスウェイの結果を示す棒グラフ。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱内の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×IQR以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×IQR以内の最小値までである（n = 20）。d, 血漿（x軸）と24時間尿（y軸）サンプル間のパスウェイ濃縮度の比較。e,参加者（列）ごとに有意差のあるすべての脂質の量を示すヒートマップで、脂質が飽和脂肪酸を含むか不飽和脂肪酸を含むかを色の凡例で示す。P値： *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。
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栄養-メタボライト-宿主生理のクロストークに関する機能的洞察を得るために、血漿サンプルから機能濃縮解析を行った（図5b）。ケトジェニック食とビーガン食の両方が、アミノ酸生合成経路の有意なアップレギュレーションと関連していた（図5b）。特に、ケトジェニック食は、バリン、ロイシン、イソロイシン（BCAA）の生合成および分解に関連する経路を有意にアップレギュレートした（図5b）。これは、ケトジェニック食を摂取している参加者の血漿中のBCAA存在量が高いことと一致している（図5cおよび文献25）。このように、食事中のアミノ酸の豊富さは、宿主のアミノ酸代謝をアップレギュレートし、微生物叢によるアミノ酸代謝をダウンレギュレートするという逆説的な結果をもたらすかもしれない（図4g）。一方、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸の代謝とアルギニンの生合成は、菜食によって特異的にアップレギュレートされた（図5b）。
血漿サンプルを用いて観察されたのとは対照的に、尿サンプルからの代謝物を評価すると、食餌間の差はあまり明らかではなく、菜食と比較してケトジェニック食ではパントテン酸とCoAの生合成経路のみが有意にアップレギュレートされた（Extended Data Fig.6g）。すべての濃縮経路を重ね合わせると（有意性とは無関係に）、血漿と尿サンプルで同時に濃縮された4つの経路が明らかになり、そのすべてがケトジェニック食後のアミノ酸とビタミンの生合成のアップレギュレーションと関連していた（図5d）。
ケトジェニック食中の脂肪酸摂取量の増加に伴い、ケトジェニック食とビーガン食を比較すると、多くの脂質も濃縮された（ケトジェニック食では81種類、ビーガン食では22種類）（Extended Data Fig.） 飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の含有量はケトジェニック食で有意に高かったが（Extended Data Fig. 対照的に、菜食では不飽和脂肪酸を含む脂質が有意に増加した（図5e）。これらの相違が宿主免疫に及ぼす影響の違いに関与しているかどうかは、今後の研究で明らかにする必要がある。
全体として、マイクロバイオームのデータと一致して、血漿中の宿主代謝産物プロファイルに対するケトジェニック食の影響は、ビーガン食よりも強いことが観察された。濃縮されたパスウェイのほとんどはアミノ酸代謝に関連しており、マイクロバイオームデータセットとメタボロミクスデータセットの両方で合計16のパスウェイが濃縮されていた（図6a）。驚くべきことに、参加者の数が少なく多様であるにもかかわらず、そのうちの10パスウェイは、ビーガン食を摂取することによって、収束的に濃縮された（図6a）。
図6：データ間の高度に相互接続されたネットワークは、免疫、アミノ酸、脂質によって駆動されている。
図6
a,メタボロミクス（緑）およびマイクロバイオームデータ（紫）において、ケトジェニック食とビーガン食で有意に濃縮度の異なる経路の比較。 b,c,免疫カテゴリー（b）および食事（c）別に色分けした、10以上の結合を持つすべての微生物酵素、代謝産物、タンパク質からなる相互結合ネットワーク。
フルサイズ画像
次に、特に酵素、代謝産物、タンパク質間の相関に注目した（拡張データ図7a-c）。すべての対相関行列に相関の高い領域が見られた。代謝物と微生物酵素にはかなりの量の負の相関が見られ（拡張データ図7a）、代謝物とタンパク質、微生物酵素とタンパク質には主に正の相関が見られた（拡張データ図7b,c）。
相互接続の高いデータポイントを特定し（拡張データ図7d-f）、10個以上の有意な相関を持つデータポイントのみを考慮したネットワークを作成した（図6b）。その結果、すべてのデータセット間に連結を持つ高密度なネットワークが観察され、上部領域は類似した存在量のデータポイントのみから構成され、下部領域はケトジェニック食とビーガン食で有意に存在量が異なる多くのデータポイントから構成されていた（拡張データ図7g）。ネットワーク内の微生物酵素、代謝産物、タンパク質は、免疫系、アミノ酸、脂質、アポトーシス、細胞接着など、多種多様な生物学的機能と関連していた（Extended Data Fig.） 次に、最も代表的な機能用語（脂質、免疫系、アミノ酸）に注目した（図6b）。ネットワークの下部領域は、主に脂質やアミノ酸に関連する化合物によって駆動されていた。ネットワークの上部では、主に免疫関連のデータポイントが密につながり、それらは主に適応免疫と宿主-ウイルス相互作用に関連していた。トランスクリプトームとプロテオミクスのデータセットから得られた結論と一致するように、適応免疫に関連するデータポイントのほとんどは、ビーガン食と比較してケトジェニック食の方がより豊富であった（図6c）。
このように、異質で参加者の数が少ないにもかかわらず、我々の複雑なデータセットによって、タンパク質、代謝産物、微生物酵素の間の高度に相互接続されたネットワークを明らかにすることができた。
考察
栄養がヒトの免疫を制御する原理を明らかにすることで、疾病を予防・治療するための個別化された栄養介入をデザインする能力が大幅に向上する可能性がある。ここでは、高度にコントロールされたクロスオーバーの食事介入がヒトの免疫、代謝、マイクロバイオームに及ぼす影響を調べた、我々の知る限り初めての研究を紹介する。特に重要なのは、参加者の多様性にもかかわらず、タンパク質、微生物酵素、代謝産物を定量化した複雑なデータセットから、非常に収束的で相互に関連した経路が明らかになったことである。しかし、この研究は少数の参加者のみを対象としている。現段階では、これらの結果がボーダー集団にどのように一般化されるかは不明である。この疑問に十分に答えるためには、より大規模な研究が必要である。私たちの研究を総合すると、プロテオーム、メタボローム、マイクロバイオームのデータに対してケトジェニック食がより広範な影響を及ぼすことが明らかになったが、宿主免疫に対してはどちらの食事も有意な影響を及ぼした（図6d）。なぜケトジェニック食がビーガン食よりも宿主免疫、代謝、マイクロバイオームにより広範な変化をもたらしたのかは、現段階では不明である。1つの可能性として、ケトジェニック食では、主なエネルギー源として脂肪とケトン体の利用が増加し、ベースライン食とビーガン食の両方で主な燃料であった炭水化物の利用が減少したことが考えられる25。
我々の研究により、2週間の食事介入は、遺伝、年齢、性別、民族性、人種、そして肥満度さえも凌駕して、宿主免疫に顕著な変化をもたらすことが明らかになった。注目すべきは、この研究では食事と食事の間に休止期間を設けていないことである。興味深いことに、食事を摂る順番は結果に影響せず、宿主の免疫、マイクロバイオーム、プロテオミクスおよびメタボロミクス・プロファイルを再構築するには、2週間の食事で十分であることが示された。とはいえ、宿主に影響を与えるのに必要な期間や影響の持続期間については、さらに調査する必要がある。今回の研究結果は、宿主免疫の迅速な再配線における食事の重要な役割を浮き彫りにしているが、本研究の大きな限界の一つは、免疫シグネチャーの探索が血液に限定されていることである。末梢血で観察されたケトン食やビーガン食の影響が、組織免疫の変化を反映しているかどうか、また、すべての組織がそれぞれの食事に収束的に反応するかどうかは、まだ解明されていない。とはいえ、少なくとも血液中のコンパートメントでは、ケトジェニック食が適応免疫に関連するシグネチャーを高めていることが明らかになった。これらの知見は、以前に報告されたマウスにおけるγδT細胞応答を増加させるケトジェニック食の役割と一致している41,42。一方、菜食によって自然免疫能が上昇することは、これまで報告されていない。我々の知見はまた、菜食後の赤血球造血とヘム代謝の有意なアップレギュレーションを強調している。ヘムは赤血球造血中の転写とタンパク質合成の制御に重要であり43、酸素運搬に加えて、赤血球は自然免疫の重要な調節因子である44。この観察と一致して、赤血球造血のもう一つの重要な構成要素である食事性鉄の全体的摂取量は、ケトジェニック食よりもビーガン食の方が有意に多かった。食事性鉄分には、ヘム鉄（主に肉や動物性食品に含まれる）と非ヘム鉄（植物や動物性食品に含まれる）の2種類がある45。両者は生物学的利用能と吸収率が異なる。ヘム結合鉄の約30％が吸収されるのに対し、非ヘム結合鉄は1～10％しか吸収されない。鉄源の違いによって免疫系や宿主の代謝に与える影響が異なるかどうか、またどのように異なるかは、現在のところ不明であるが、今後の研究で調査すべき重要な変数であろう。
食事が宿主免疫に及ぼす影響を評価する際に考慮すべき重要な変数は、相対的なカロリー摂取量である。同じコホートを用いた以前の研究では、ケトジェニック食と比較した場合、ビーガン食の自由摂取はカロリー摂取量の有意な減少と関連していることが示された25。我々の研究室や他の研究室による以前の研究では、カロリー摂取量の減少は宿主免疫の有意な変化46,47,48と関連しており、特にヒトでは単球機能の増加が見られた47。従って、菜食による自然免疫の増加が、栄養の質的な違いによるものか、量的な違いによるものか（あるいはその両方か）は、現時点では不明であり、さらなる調査が必要であろう。
食事は宿主マイクロバイオームの最も重要な調節因子であり、これと一致するように、ケトジェニック食はマイクロバイオームの組成と機能に顕著な影響を及ぼすことがわかった。ヒトを対象とした先行研究37では、ケトン食摂取中に胆汁耐性菌が増加し、ファーミキューテス菌が減少するなど、マイクロバイオーム組成の変化が示され、本研究でも再現された。菜食では食物繊維の摂取量が大幅に増加したにもかかわらず、ベースライン食と菜食の間に大きな違いは観察されなかった。しかし、参加者のサンプリングは糞便に限られており、微生物群集や酵素機能の変化は、上皮や小腸固有層など、今回のサンプルにはあまり含まれていない部位で濃縮されている可能性があることを強調しておく必要がある。食事がマイクロバイオームに与える影響をより深く理解するためには、マイクロバイオームのより包括的なサンプリングが必要であろう。それにもかかわらず、我々の知見は、ケトジェニック食後にほとんどの微生物酵素がダウンレギュレートされ、アミノ酸代謝および生合成に関連する経路の大幅なダウンレギュレーションにつながったことを明らかにした。対照的に、メタボロミクスのデータから、ケトジェニック食は全参加者の血漿中のメタボローム・プロファイルに強い影響を与え、BCAAおよび他のアミノ酸経路のアップレギュレーションが認められた。ケトジェニック食はアミノ酸を豊富に含むため、この観察結果は微生物叢と宿主との間の機能のトレードオフを浮き彫りにしている。注目すべきは、アラニン、アスパラギン酸、グルタミンの代謝経路が、マイクロバイオームでもメタボロミクスデータセットでも、ビーガン食後にアップレギュレートされたことである（図6a）。宿主とマイクロバイオームの両方におけるアミノ酸代謝の正確な制御とトレードオフを理解するためには、さらなる研究が必要であろう。
栄養は私たちの生理学のあらゆる側面に多大な影響を与える。したがって、食事がヒトの免疫と炎症に及ぼす影響について、厳密な理解を深めることが急務である。現段階では非常に予備的ではあるが、我々の知見は、ビーガン食とケトジェニック食の摂取により、がんに関連する経路の活性化に違いがあることを示している。現在までのところ、ヴィーガン食が癌や他の疾患に与える影響を調査した研究はない。しかし、以前の事例研究では、ケトジェニック食の抗がん作用の可能性が提案されている（総説34）。このように、作用機序を理解し、定義された食事を摂取することが特定の疾病状態と関連する可能性を理解するためには、まだ多くのことが残されている。今回の知見は、統合生理学をよりよく理解し、ヒトの健康を改善し、疾病を緩和するために、高度に制御された食事介入を行う大きな可能性をさらに浮き彫りにするものであると確信している。
方法
参加者の募集と選択
研究プロトコルは、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の施設審査委員会（Institutional Review Board）により承認され（NCT03878108）、Open Science Frameworkウェブサイト（https://osf.io/fjykq/）で入手可能である。参加者は研究のリスクについて十分に説明を受け、研究手順の前に同意書に署名した。本研究は2019年4月から2020年3月まで、NIH臨床センターの代謝臨床研究ユニットで実施された。本研究の第1の主要アウトカムは、各2週間の食事期間間の平均エネルギー摂取量を比較した。2つ目の主要アウトカムは、各ダイエット期間の2週目の平均エネルギー摂取量を比較した。両主要アウトカムの結果は以前に報告されている25。本研究の主要な探索的目的（この原稿で報告されている）は、免疫、マイクロバイオームの組成と機能、および代謝物プロファイルの変化を、各2週間の食事期間間で比較することであった。研究参加者、組み入れ・除外基準、実験セットアップの詳細については、以前に発表されている25。つまり、18～50歳の男女で、体重が安定しており、代謝性疾患、心血管疾患、代謝に影響を及ぼす可能性のあるその他の疾患（例えば、がん、糖尿病、甲状腺疾患）のない人が本研究の対象となった。研究参加者はNIH臨床センターの代謝臨床研究ユニットに入院し、個室で生活した。性別は自己申告により決定された。プロテオミクスとメタボロミクスのデータについては、20人の参加者からサンプルを採取し（男性11人/女性9人）、性差による反応の違いを分析した。マイクロバイオームデータについては、10名の参加者のサンプルを解析した（男性5名/女性5名）。RNA-seqデータについては、参加者6名（男性3名/女性3名）のサンプルを解析し、フローサイトメトリーデータについては、参加者7名（男性3名/女性4名）のサンプルを解析した。これらのデータセットではサンプル数が少ないため、性差は解析されなかった。すべての参加者からインフォームドコンセントを得たが、すべての参加者が広範なデータ共有に同意したわけではない。そのため、フローサイトメトリー、プロテオミクス、メタボロミクスデータ、栄養学的情報、およびメタデータは希望者のみ共有されるが、RNA-seqおよびマイクロバイオームデータは、これらのデータセットの参加者全員が広範なデータ共有に同意したため、一般公開される。
統計と再現性
本研究は、主要アウトカムおよび副次的アウトカムの効果を評価するのに十分な検出力を有していた。詳細な検出力の計算は文献25に掲載されている。本原稿で示した解析は探索的なものであり、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いていないが、観察された効果は大きく、統計的に非常に有意であった。2つのマイクロバイオームサンプルは、採取日の関係で解析から除外された（ベースライン用のサンプルは、食餌摂取8日以上後に採取された）。本試験の性質および参加者に提示された食物の明らかな違いにより、研究者は実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていなかった。
食事介入
食事療法のためのすべての食事および間食は、ProNutraソフトウェア（v.3.4、Viocare）を用いて、USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 26（https://www.ars.usda.gov/ARSUSERFILES/80400535/DATA/SR26/SR26_DOC.PDF）およびUSDA Food and Nutrient Database for Dietary Studies, 4.0（https://www.ars.usda.gov/northeast-area/beltsville-md-bhnrc/beltsville-human-nutrition-research-center/food-surveys-research-group/docs/fndds-download-databases/）から得られた栄養値を用いて、設計および分析された。食品と飲料はNOVAシステムに従って分類され、グリセミック指数は経口ブドウ糖50gに対する相対値として計算された。どちらの食事も、消化可能な炭水化物の量が少ない非スターチ性野菜を基本としている点は共通していた。ケトジェニック食では、肉、鶏肉、魚、卵、乳製品、ナッツ類などの動物性食品が加えられたが、ビーガン食では豆類、米、根菜類、大豆製品、トウモロコシ、レンズ豆、エンドウ豆、全粒穀物、パン、果物が加えられた。
ペットボトルの水と一般的な食事を代表するスナックが、入院室のスナックボックスで一日中自由に提供された。食事は参加者に提示され、好きなだけ食べるように指示された。
各食事の残りの食品および飲料が確認され、栄養スタッフが各食品の消費量を計算するために重量を量り、前述の栄養ソフトウェアを使用して栄養素およびエネルギー摂取量が計算された。これは、1,680食すべての食事と、毎日の間食およびボトル入り飲料水について完了した。2人の参加者は、ビーガン食を摂っている間の食事重量に誤差があったため、これらの誤差があった日（合計3日間）の摂取データは最終データセットから削除された。
血液サンプルの収集
個人ごとに異なる時点で血液サンプルを採取した（補足表1）。
フローサイトメトリーおよびトランスクリプトーム解析のための血液サンプルの処理
フローサイトメトリー用のPBMCを分離するために、7人の被験者から3つの時点で得られた血液（21サンプル）を使用した。さらに、トランスクリプトーム解析のために、3時点で6人の被験者から血液を採取した（18サンプル）。PBMCは、標準プロトコール（https://chi.niaid.nih.gov/web/new/our-research/SOP-Isolation.pdf）に従って、10％ジメチルスルホキシド（Sigma-Aldrich）を加えた90％熱不活性化FBS（Gibco）中で凍結保存する前に、密度勾配遠心にLeucoSepチューブ（Greiner Bio-one）およびFicoll-Paque Plus（GEヘルスケア）を用いて、5mlの全血から単離した。RNA解析のため、100μlの全血をTrizol-LS（Qiagen）で製造者の指示に従って溶解し、直ちに-80℃に保存した。
PBMCのフローサイトメトリー
21サンプルのPBMCを解凍し、50 U ml-1 benzonase nucleaseを含むRPMIで洗浄後、PBSで洗浄した。細胞をLIVE/DEAD Fixable Blue Dye（Life Technologies社製）でインキュベートし、洗浄後、100μlのFACSバッファー（0.5%子牛胎児血清、0.5%正常マウス血清、0. 02%NaN3）中で、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD56、CD123、CD127、CCR4、CCR6、CCR7、CCR10、CXCR3、CXCR5、HLA-DRおよびIgDに対するフルオロクロム標識抗体と30分間インキュベートした（Extended Data Table 2）。細胞をFACSバッファーでさらに2回洗浄し、1％パラホルムアルデヒドで固定し、Aurora spectral cytometer（Cytek Biosciences）を用いて取得した。
フローサイトメトリーデータの解析
データ取得後、FlowJoソフトウェアv.10（BD Biosciences）を用いて、以前に記載されたマニュアルゲーティング戦略26に基づき、主要集団の頻度を解析した（Extended Data Table 1およびExtended Data Fig.2）。統計解析のために、個体ごとの集団ごとの頻度間の倍数変化を計算し、Bonferroni-Hochberg多重検定補正を用いた両側対のt検定を用いて評価した。
LMEモデルによる食順のデータへの影響の推定
食事の順序によって生じるバイアスがあるかどうかを推定するために、プロテオミクス、メタボロミクス、マイクロバイオームのデータに対して、lmerTest Rパッケージ49を用いてLMEモデル（~diet_group + (~diet_group | diet)）を適用した。
全血のRNA-seqライブラリー調製
miRNeasy Micro Kit（Qiagen）を用いて、Trizol-LSに保存した18サンプルからRNAを抽出した。簡単に言うと、イソプロパノールでバッファーRWTを調製し、RNeasyカラムに結合させた後、RNAをDNaseI（Qiagen）で処理してから洗浄し、20μlのヌクレアーゼフリー水で溶出した。RNA濃度はQubit RNA High Sensitivity assay（Thermo Fisher）を用いて測定し、品質はAgilent 4200 TapeStation（Agilent Technologies）を用いて評価した。RNA-seqライブラリーは、Universal Plus mRNA-seq KitとNuQuant Human Globin AnyDeplete kit（Tecan Genomics）を用いて、100 ngのトータルRNAから調製した。まず、メッセンジャーRNA転写物を捕捉し、断片化し、相補的DNAに変換した。第二鎖合成と末端修復の後、DNA断片をイルミナプラットフォームと互換性のあるデュアルインデックスアダプターでライゲーションした。ライブラリーは鎖選択とリボソームRNAおよびグロビン転写産物の除去を行い、その後16サイクルの増幅を行った。精製したライブラリーをQubitとAgilent TapeStationで解析し、それぞれ濃度とサイズ分布を評価した後、正規化してシーケンス用にプールした。プールの最終モル数は、KAPA library quantification kit（Roche）を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。ペアエンドシーケンスは、NextSeq 500（Illumina）でHigh Output 150-cyclesキットを用いて2×75塩基対（bp）フォーマットで行った。
RNA-seqの解析
シーケンス結果は、Illumina bcl2fastq software（Illumina）を用いてデマルチプレックスし、FASTQ形式に変換した。シーケンスリードをアダプターおよびクオリティトリミングし、splice-aware STAR aligner50を用いてヒトゲノム（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000001405.26/; version hg38）にアライメントし、既報のプロトコル51を用いて一塩基多型（SNP）コールを生成した。SNPコールはサンプルの品質管理と被験者マッピングに使用された。差次的発現遺伝子は、各遺伝子のcounts per million (c.p.m.)の対数をモデル化するlimma linear model52を用いて同定した。濃縮遺伝子セットは、fgsea Rパッケージ53に実装されているpreranked gene-set enrichment analysis (GSEA) アルゴリズムを用いて同定した。遺伝子は、limmaモデルから得られた関連係数のモデレートT統計量を用いてランク付けした。MSIGDBのHallmarkコレクション（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/collections.jsp）とBTMs27（https://github.com/shuzhao-li/BTM）を含む遺伝子セットリストで濃縮度を評価した。解析は、ケトジェニックダイエット対ベースラインダイエット、ケトジェニックダイエット対ビーガンダイエット、ケトジェニックダイエット対以前のダイエット、ビーガンダイエット対ケトジェニックダイエット、ビーガンダイエット対ベースラインダイエット、ビーガンダイエット対以前のダイエットの6つの異なる比較について行った。以前の食事とは、事前に直接摂取した食事を指す（例えば、ケトジェニック食対以前の食事を分析する場合、以前の食事とは、A群ではビーガン食、B群ではベースライン食を指す）。PCAはRでprcomp関数を用いて行った。ヒートマップのデータ可視化には、Transcripts per million（TPM）を使用し、TPM値または行Zスコアのいずれかを表示した。IPA54（Qiagen）は、疾患用語の濃縮を解析するために使用した。パスウェイシグネチャー全体に対する選別細胞集団の寄与を解析するために、血液から選別した免疫細胞集団の遺伝子数をHuman Protein Atlas35からダウンロードし、行Zスコアを示すヒートマップとして可視化した。
血漿のプロテオーム解析
20名の被験者から3つの時点で得られた末梢血漿（60サンプル）を、アプタマーベースの定量的プロテオミクスバイオマーカー探索プラットフォームであるSomaScan HTS Assay（SomaLogic社製）を用いて解析した55。このアッセイは、受容体、キナーゼ、サイトカイン、プロテアーゼ、成長因子、プロテアーゼ阻害剤、 ホルモン、構造タンパク質など、広範な生物学的サブグループに属する1,306種類のタンパク質を定量化する。測定された分析物の完全なリストはSupplementary Table 2にある。アッセイはメーカーの仕様書に従って実行され、データはハイブリダイゼーション、プレート間および中央値のシグナル変動について正規化され、ウェブツールを用いて検査された。
プロテオミクスデータの解析
Bonferroni-Hochberg補正を用いた両側paired t-testを用いて、差次量タンパク質を算出した。組織シグネチャーについては、Human Protein Atlas58から組織特異性をダウンロードした。ケトジェニックおよびビーガン食で有意に発現が増加したすべてのタンパク質について、組織特異性が増強または濃縮されたタンパク質を組織由来の解析のために考慮した。PCAはprcompパッケージを用いてRで行った。PCAにおける男女間の差異を評価するため、各個体について、ベースライン食とケトジェニック食、ベースライン食とビーガン食、ケトジェニック食とビーガン食の間のデータポイント間のユークリッド距離を算出し、女性と男性のデータ間でStudentのt検定を適用した。機能解析はSTRING (https://string-db.org/)を用い、食餌間の全タンパク質のfold変化のデータを用い、STRING解析アルゴリズム'proteins with value/ranks'を用いて行った。
マイクロバイオームサンプルの収集
個体ごとに異なる時点で便サンプルを採取した（補足表3）。Lysis Matrix E チューブ（MP Biomedicals）でPrecellys 24 Tissue Homogenizer（Bertin Instruments）を用いて最初のホモジナイズを行い、得られた上清をEppendorf自動リキッドハンドリングシステムでMagAttract PowerMicrobiome DNA/RNA EP キット（Qiagen）を用いて製造元の指示に従って処理した。
単離した DNA は BioTek Synergy HTX プレートリーダーで濃度と品質を確認した。
Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）を用いて、メーカーの説明書に従い、100 ngのDNAをサンプルインプットとしてメタゲノミックライブラリーを調製した。ライブラリーの濃度は、Qubit 2.0蛍光光度計（Life Technologies社製）でQubit dsDNA HSアッセイを用いて定量した。ライブラリーのサイズと品質は、Agilent 4200 Tapestation上のAgilent High Sensitivity D5000 ScreenTapeで評価した。
メタゲノミックライブラリーを等モル濃度に正規化し、プールした。プールを1.8 pMに希釈し、1% PhiXコントロールライブラリーと混合し、NextSeq 500シーケンサー（Illumina）のNextSeq 500/550 High Output v2 150サイクル試薬カートリッジを使用してペアエンドシーケンス（2 × 75 bp）を行いました。
マイクロバイオーム解析
シーケンス解析のため、リードペアをQ15で品質トリミングし、BBDuk（https://github.com/BioInfoTools/BBMap/tree/master）を用いてイルミナNexteraアダプター配列を除去した。その後、SPAdes59のmetaSPAdesパイプラインでペアをアセンブルした。分類学的な割り当ては、存在量推定にBracken61を使用し、maxikraken2 (v_1903_140GB)データベース(https://lomanlab.github.io/mockcommunity/mc_databases.html)を用いてKraken2 (ref.60)で行った。ヒトゲノムと一致する配列はすべての解析から除外した。β多様性と分類学的存在量のPCoAには、相対的存在量のJaccard距離尺度を用いた。β多様性の変化を評価するために、vegan Rパッケージ2.6-2のadonis2関数を用い、限界モデル~Diet + SubjectIDを用いて、並べ替え分散分析(PERMANOVA)を行った。
推定遺伝子量は、アセンブルされたコンティグの計算遺伝子探索にProdigal62を使用し、seqkit63を使用してコンティグを別々のFASTAファイルに分割することで並列化し、bowtie2 (ref.64)でリードをアセンブルにマッピングし、samtools65でbamファイルをソートし、picard (http://broadinstitute.github.io/picard/)でマッピング統計量を生成し、マシン重複を除去し、VERSE66でhtseqアルゴリズム67を使用してマッピングから遺伝子量を推定した。KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、EC (https://enzyme.expasy.org/)、MetaCyc69 (https://metacyc.org/)のパスウェイ、データベース、およびデフォルトパラメーターを用いた推定遺伝子配列の機能アノテーションには、HUMAnN 3.0 (ref. 68)を使用した。各食餌間で推定酵素（EC）量を比較し、各食餌で有意に高いことが判明したものは、各食餌で一意に濃縮された推定化合物に基づいて、KEGGパスウェイ推論用の「unique only」オプションを使用してAMON70で分析した（図6にデータを示す）。
食餌間の分類学的および遺伝子存在量の統計的比較は、まず中心対数比によって存在量を変換し、変換と正規化を'NONE'に設定し、LMEモデル~Diet + (1 | SubjectID)を用いてメソッド'LM'を設定したMaAsLin2 (ref. 73)を用いて行った。アルファ多様性と順序付けは、vegan Rパッケージ2.6-274でdiversity関数とbetadisper関数を用いて計算した。多様性の統計分析は、veganのadonis2関数とlmerTest Rパッケージ49を用いて行った。すべてのP値は、qvalue Rパッケージのqvalue関数を用いて多重比較の補正を行った。
メタボロミクスサンプルの収集
ディスカバリーメタボロミクス解析は、Metabolon社により、参加者20名（60サンプル）の保存（採取後-70℃）血漿および尿（24時間かけて採取）サンプルに対して実施された。サンプルは2つの異なるバッチで取得され、ケトジェニック食とビーガン食のサンプルは一緒に取得され、ベースライン食のサンプルは別の実験で取得された。サンプルは、タンデム質量分析（MS/MS）付き超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）を用いて、内因性由来のアミノ酸、炭水化物、脂質、補酵素およびビタミン、エネルギー代謝の中間体、ならびに食物や薬物などの外因性供給源に由来する異種生体物質など、複数の代謝経路を代表する広範な代謝物（<1 kDa）について分析された。簡単に説明すると、血清サンプルはハミルトン社製の自動MicroLab STARシステムを用いて調製された。回収標準物質を添加し、タンパク質画分をメタノールで抽出した後、激しく振盪し、遠心分離した。サンプル抽出物を乾燥させ、一定濃度の標準物質を含む回収溶媒を用いて再構成した。これらの抽出物を逆相UPLC-MS/MSを用いて、ポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ESI）およびネガティブイオンモードのESIで分析した。生データの抽出、ピーク同定、および処理は、Metabolonが独自に開発したソフトウェアと、真正の標準物質に基づいて4,500以上の既知の代謝物を含む生化学的参照ライブラリを使用して行いました。
メタボロミクス解析
ケトジェニック対ビーガン食のダウンストリーム解析（合計40サンプル）では、4つ以上のインポート値（データの10%）を持つすべての化合物がフィルタリングされました。ベースライン食対ケトジェニック/ビーガン食（合計60サンプル）の解析では、6つ以上のインピュテーション値（データの10%）を持つすべての化合物がフィルタリングされました。食事間の有意差を算出するために、化合物ごとに対Studentのt検定を行い、P値をBonferroni-Hochberg補正した。
ケトジェニック食とビーガン食を分析した血漿データセットでは、合計188化合物が欠測/不正確な値のためにフィルタリングされ、合計859化合物が分析対象として残った（補足表4）。ベースライン食とケトジェニック/ビーガン食を比較した血漿データセットでは、合計413化合物がフィルタリングされ、合計678化合物が解析対象となった（補足表5）。ケトジェニック食とビーガン食を比較するパスウェイ解析では、ビーガン食またはケトジェニック食で有意に発現が上昇した化合物をHuman Metabolome Database（HMDB）IDに変換し、KEGGパスウェイを対象としたパスウェイベースの濃縮解析を使用してMetaboAnalyst75にアップロードした。カスタムバックグラウンドがアップロードされた（補足表4）。カスタムバック グラウンドを作成するために、HMDB ID を持つすべての化合物を MetaboAnalyst にアップロードし、化学名に変換した。このファイルをバックグラウンドとして使用し、683化合物のうち102化合物はHMDB化合物名と一致せず、581化合物がバックグラウンドセットに残った。
ケトン食とビーガン食を比較した尿データセットでは、合計412化合物が欠落/不正確な値のためにフィルタリングされ、合計970化合物が分析対象として残されました。621化合物のカスタムバックグラウンドがアップロードされ、そのうち52化合物はMetaboAnalystで認識されなかった（補足表4）。
血漿と尿のパスウェイの比較のために、MetaboAnalystによって濃縮されると予測された全てのパスウェイをフィルターなしで使用した。血漿と尿の濃縮スコアをプロットした。
脂質ヒートマップには、脂質として分類された有意差のあるすべての化合物を使用した。脂質は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、または混合脂肪酸として手動で割り当てられた。
相関分析
10人以上の参加者のデータがあるすべてのデータセットを相互に相関させた（プロテオミクス、メタボロミクス、マイクロバイオームデータ）。すべての比較について、ケトジェニック食とビーガン食のlog2倍変化を計算した。
微生物酵素量をタンパク質量と相関させるため、各被験者の時間2に対して時間3に採取したサンプルから、各EC数のc.p.m.量のlog2倍変化とタンパク質量のlog2倍変化を計算した。
微生物酵素量と代謝物量を相関させるため、各被験者の時間2に対して時間3に採取したサンプルから、各ECのc.p.m.存在量のlog2倍変化と代謝物量のlog2倍変化を計算した。代謝物とタンパク質の存在量を相関させるために、各被験者の時間2に対して時間3に収集したサンプルから、タンパク質の存在量と代謝物の存在量のlog2倍変化を計算した。すべてのサンプル比較について、pspearman76 Rパッケージで計算したスピアマンのρを用いて各被験者の相関を計算し、P値はp.adjustでFDR補正した。
メタボロミクスおよびマイクロバイオームパスウェイ
メタボロミクスおよびマイクロバイオーム（AMONを使用）データのKEGGパスウェイ解析を比較した。メタボロミクスデータセットとマイクロバイオームデータセットで濃縮が予測されたすべてのパスウェイを統合した。
ネットワーク解析
すべての有意な相関を選択し、下流のネットワーク解析を行った。結合数が 10 以上のすべての酵素、代謝物、タンパク質がネットワークに統合された。R パッケージ igraph77 および tidygraph (https://tidygraph.data-imaginist.com/) を用いてネットワークグラフを作成し、可視化した。
報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
全てのRNA-seq生データはdbGAP: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gapprev/gap/cgi-bin/study.cgi?study_id=phs003187.v1.p1。マイクロバイオームのシーケンスデータはBioProject accession PRJNA981159から入手可能。その他のデータセット（非特定メタデータ、栄養情報、フローサイトメトリーデータセット、プロテオミクスデータセット、メタボロミクスデータセット）は、広範なデータ共有に同意しない参加者がいるため、リクエストに応じて入手可能である。リクエストは、対応する著者であるYasmine Belkaid (ybelkaid@niaid.nih.gov)、Kevin Hall (kevinh@niddk.nih.gov)、またはVerena Link (verena.link@nih.gov)までお送りください。2週間以内に対応いたします。栄養データの解析には、USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 26 (https://www.ars.usda.gov/ARSUSERFILES/80400535/DATA/SR26/SR26_DOC.PDF)およびUSDA Food and Nutrient Database for Dietary Studies, 4.0 (https://www.ars.usda.gov/northeast-area/beltsville-md-bhnrc/beltsville-human-nutrition-research-center/food-surveys-research-group/docs/fndds-download-databases/)を使用した。RNA-seq解析では、リードをヒトゲノム（バージョンhg38）にマッピングした（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000001405.26/）。血液からソートした細胞集団からの遺伝子発現解析、およびタンパク質からの組織由来解析には、Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/)を利用した。機能アノテーション解析には、MSIGDBのHallmarkコレクション（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/collections.jsp）と血液転写モジュールデータベース（https://github.com/shuzhao-li/BTM）を利用した。マイクロバイオーム解析には、maxikraken2 DB (https://lomanlab.github.io/mockcommunity/mc_databases.html) (v_1903_140GB)、KEGG DB (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、enzyme nomenclature (EC) DB (https://enzyme.expasy.org/)、MetaCyc DB (https://metacyc.org/)、dbCAN DB (https://bcb.unl.edu/dbCAN/)、CAZy DB (http://www.cazy.org/)を利用した。
コードの利用可能性
すべてのデータセットが公開されているわけではないので、これらのデータの解析に使用したすべてのカスタムコードは、リクエストに応じて入手可能である。リクエストは対応する著者、Yasmine Belkaid (ybelkaid@niaid.nih.gov)、Kevin Hall (kevinh@niddk.nih.gov)、またはVerena Link (verena.link@nih.gov)までお送りください。2週間以内に対応いたします。
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参考文献のダウンロード
謝辞
この厳しい研究プロトコールにボランティアとして参加してくれた研究参加者全員、およびNIH MCRUの看護・栄養スタッフの協力に感謝する。サンプル処理についてはA. Mukherjeeに感謝する。P. Loke、N. Collins、M. Enamorado、A. Wellsのコメントと議論に感謝する。図1a、3b、6dの一部はBioRender.comで作成した。本研究の一部は、NIAIDのIntramural Research ProgramおよびNIAIDからGuidehouse, Inc.へのBCBB Support Services Contract HHSN316201300006W/75N93022F00001に基づく連邦政府資金により支援された。
著者情報
著者および所属
米国国立衛生研究所アレルギー・感染症研究所宿主免疫・マイクロバイオーム研究室メタオーガニズム免疫セクション（米国メリーランド州ベセスダ
ヴェレーナ・M・リンク、アポロ・ステイシー、リャン・チー、ヤスミン・ベルカイド
米国国立衛生研究所ヒト免疫学NIHセンター（メリーランド州ベセスダ
Verena M. Link, Foo Cheung, Kyu Lee Han, Brian A. Sellers, Galina Koroleva, Richard Apps & Yasmine Belkaid
バイオインフォマティクス・計算生物学部門、サイバーインフラストラクチャー・計算生物学研究室、国立アレルギー・感染症研究所、米国メリーランド州ベセスダ
ポアラニ・スブラマニアン
米国国立衛生研究所臨床センター輸血医学部門細胞工学センター（米国メリーランド州ベセスダ
キュ・リーハン
クリーブランド・クリニック、ラーナー研究所、心臓血管・代謝科学部門、クリーブランド、OH、USA
アポロ・ステイシー
米国メリーランド州ベセスダ、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所
アンバー・B・クールヴィル、ケビン・D・ホール
NIAIDマイクロバイオーム・プログラム、国立アレルギー・感染症研究所、米国メリーランド州ベセスダ
シュレーニ・ミストリー & アンドリュー・バーンズ
貢献
V.M.L.、K.D.H.、Y.B.が研究を計画した。K.L.H.、B.A.S.、G.K.、S.M.、A.B.、R.A.が試料処理、データ取得、データ沈着を行った。V.M.L.、P.S.、F.C.、A.S.、L.C.、A.B.C.およびY.B.がデータ解析を行った。V.M.L.とY.B.は論文を執筆した。
連絡先
Verena M. Link、Kevin D. Hall、Yasmine Belkaidのいずれかにご連絡ください。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Medicine誌は、本論文の査読に貢献してくださった匿名の査読者に感謝する。主担当編集者 Nature Medicineチームと共同でSaheli Sadanand。
追加情報
出版社からの注記 スプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 研究コホートと食事に関する背景情報。
(a-d)研究集団における様々な特徴の分布。人種（a）、性別（b）、体格指数（BMI）（c）、年齢（d）。(e)ケトジェニックおよびビーガン食における食物繊維および食物糖の量（1000kcal当たりグラム）。(f,g)食事の構成成分の摂取量を百分率（f）および総グラム（g）で示した箱ひげ図。(h) 食餌中の脂肪酸の消費量（グラム）。(i)飼料中のアミノ酸消費量（グラム）。有意性は多重検定補正をかけた両側一対のt検定によって計算した。(j)食事アンケート分析に基づくベースライン時の異なる栄養素からのエネルギー摂取の割合。(k）マイクロバイオームデータの収集時期を示す概略図。(l) フローサイトメトリーデータにおけるCD45+生細胞の頻度。(m) ベースラインと食事（図1cより）の間で有意差のあるすべての細胞タイプの頻度の棒グラフ。各ドットは1個体を表す。ドットは開始時の食事で色分けされている（青：ビーガン、オレンジ：ケトジェニック）。(n）ケトジェニック食とビーガン食で有意に異なる全細胞型の頻度の棒グラフ（図1dより）。各ドットは1個体を表す。ドットは開始食（青：ビーガン、オレンジ：ケトジェニック）で色分けされている。f-jは箱ひげ図。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジからヒンジ平均の最大1.5×IQR以内の最小値まで伸びている（n = 20）。データはm,nの棒グラフで表される。エラーバーは標準偏差を示す（n = 7）。P値： * < 0.05; ** < 0.01; *** < 0.001; **** < 0.0001.
拡張データ Fig.
高次元のフローサイトメトリーデータに対するゲーティング戦略。
Extended Data 図3 RNA-seq解析のサポートデータ。
(a)全参加者と食餌における全発現遺伝子（TPM > 32）のヒートマップ。(b) RNA-seqデータの主成分分析（PCA）。(c)有意な自然免疫パスウェイ（BTM解析）からの全遺伝子のlog 2 foldchangeを示すヒートマップ。参加者番号はヒートマップの上部に表示され、最初の食事（青：ビーガン、オレンジ：ケトジェニック）で色分けされている。(d)有意な適応免疫経路の全遺伝子の対数2倍変化を示すヒートマップ（BTM解析）。参加者番号をヒートマップの上に示し、最初の食事で色分けした（青：ビーガン、オレンジ：ケトジェニック）。(e）発現したすべての内在性レトロウイルス（ERV）のヒートマップ（TPM > 4）。(f）ケトジェニックおよびビーガン食における1日の総鉄摂取量の平均値（グラム）。データは箱ヒゲプロットで表される。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×IQR以内の最小値まで伸びている（n = 20）。有意性は両側対のt検定により算出した。(g)ケトジェニック食とビーガン食を比較したIPA病期解析で有意に濃縮されたパスウェイの数を示す棒グラフ。円グラフは、ケトジェニック食（オレンジ）およびビーガン食（青）後に活性化が強まったがんパスウェイの割合を示す。(h) Human Protein Atlas35からダウンロードした血液からソートした集団の遺伝子発現のヒートマップ（行Zスコアとして）。描かれている遺伝子は、HALLMARK解析でケトジェニック食とビーガン食の間で有意に濃縮されたパスウェイのメンバーである。(i) BTM長名の表-図2a参照 (j) HALLMARK長名の表-図2b参照。P値： *** < 0.001.
Extended Data 図4 プロテオミクスデータのサポートデータ。
(a-c)ヴィーガン食対ベースライン食(a)、ケトジェニック食対ベースライン食(b)、ケトジェニック食対ヴィーガン食(c)において、有意差のあるすべてのタンパク質について、開始食（青：ヴィーガン食、オレンジ：ケトジェニック食）別に参加者を色分けしたlog2倍変化のヒートマップ。(d)ケトジェニック食対ベースライン食(左)、ケトジェニック食対ビーガン食(右)の全データセット、A群(開始食:ビーガン食)、B群(開始食:ケトジェニック食)のデータから、有意に差のあるタンパク質の重複を示すベン図。(e)女性参加者と男性参加者の間で有意に存在量の異なるタンパク質。有意性は、Studentのt検定に多重検定補正を加えて算出した。
Extended Data 図5 マイクロバイオームデータのサポートデータ。
(a)図4aのクラスター間の差異を示す積み上げ棒グラフで、プレボテラ属の存在量の差異に起因する。上部の色は、図4aのどのクラスターのデータかを示す。S：サンプル （b）チャオリッチネス（左）とシャノン多様性（右）で測定したアルファ多様性。(c)チャオリッチネス（左）とシャノン多様性（右）で測定したアルファ多様性を食餌ごとのグループで割ったもの。(d)総合健康指数（HEI）スコアと食物アンケートに基づくベースライン食での食物繊維摂取量を示す箱ひげ図。(e)多糖類の分解源別に色分けした微生物酵素のボルケーノプロット。箱の下縁と上縁は第1四分位点と第3四分位点（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×IQR以内の最小値まで伸びている（b, cではn = 10、dではPrevotellaceae lowではn = 8、Prevotellaceae highではn = 2）。
Extended Data 図6 メタボロミクスデータのサポートデータ。
(a, b) 血漿メタボロミクスデータの主成分分析（PCA）。PC1（変動の10.1%を説明）とPC2（変動の7.7%を説明）を食事（a）と性別（b）で色分けした。(c)PCAからのユークリッド距離を性別に分けた箱ヒゲプロット。箱の下縁と上縁は第1四分位数と第3四分位数（25パーセンタイルと75パーセンタイル）に対応し、箱の中の線は中央値を示す。上ヒゲはヒンジから1.5×四分位範囲（IQR）以内の最大値まで、下ヒゲはヒンジから最大1.5×四分位範囲（IQR）以内の最小値まで伸びている（n = 20 - 11オス/9メス）。(d) ビーガン食とベースライン食を比較した代謝物のボルケーノプロット（左）とケトジェニック食とベースライン食を比較した代謝物のボルケーノプロット（右）。有意性は、多重検定補正をかけた一対の両側t検定で計算した。(e）カテゴリーごとの総代謝物数（左）とカテゴリーごとに有意に変化した代謝物の割合（右）を示す棒グラフ。(f)A群（開始食：ビーガン）、B群（開始食：ケトジェニック）および完全データセットについて、参加者の代謝物量の重複を示すベン図。(g) 24時間尿サンプルのMetaboAnalyst分析。
Extended Data 図7 ネットワーク分析のサポートデータ。
(a-c）全代謝物と微生物酵素（a）、代謝物とタンパク質（b）、微生物酵素とタンパク質（c）の相関を示す相関ヒートマップ。(d-f)全代謝物と微生物酵素(d)、代謝物とタンパク質(e)、微生物酵素とタンパク質(f)の有意な相関数のヒストグラム。(g, h) 有意性（g）とカテゴリー（h）で色分けされた高度に接続されたデータ点のネットワーク。
拡張データ 表1 高次元フローサイトメトリーのゲーティング戦略
フルサイズの表
拡張データ 表2 高次元フローサイトメトリーに使用した抗体と希釈液
フルサイズの表
補足情報
補足情報
補足表1および3。
報告概要
補足表2
SomaLogicで測定された全タンパク質のリスト。
補足表4
血漿および尿のメタボロミクスデータ、ケトジェニックおよびビーガン食の食餌ごとの平均値、fold変化およびadj.P値。
補足表5
血漿のメタボロミクスデータ、ケトジェニック/ビーガン食とベースライン食との食餌ごとの平均値、変化倍率およびadj.P値。
権利と許可
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Link, V.M., Subramanian, P., Cheung, F. et al. ヒトにおけるビーガン食とケトジェニック食で誘発される末梢免疫シグニチャーの違い。Nat Med (2024). https://doi.org/10.1038/s41591-023-02761-2
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受理
2023年06月07日
受理
2023年12月11日
発行
2024年1月30日
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https://doi.org/10.1038/s41591-023-02761-2
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