エボラウイルス糖タンパク質の機能解析システム

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.94.26.14764

高田綾人, Clinton Robison, 後藤英夫, +3, 川岡善弘著者情報・所属機関
1997年12月23日
94 (26) 14764-14769
https://doi.org/10.1073/pnas.94.26.14764
16,111453
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第94巻｜第26号
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要旨
エボラウイルスは、ヒトや霊長類以外の動物に出血熱を引き起こし、最大90％の死亡率をもたらす。このウイルスの研究は、バイオセーフティレベル4の封じ込めを必要とするその並外れた病原性によって妨げられてきた。この問題を回避するために、我々はエボラウイルス糖タンパク質の機能解析のための新しい相補システムを開発した。このシステムは、受容体結合Gタンパク質遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む組換え水疱性口内炎ウイルス（VSV）に依存している（VSVΔG*）。ここでは、エボラレストン・ウイルス糖タンパク質（ResGP）がVSV粒子に効率よく組み込まれることを示す。このResGPを組み込んだ組換えVSV（VSVΔG*-ResGP）は、エボラウイルスの宿主範囲トロピズムと一致する方法で、検討した他の哺乳類や鳥類のどの細胞よりも霊長類の細胞に効率よく感染したのに対し、VSV Gタンパク質で相補したVSVΔG*（VSVΔG*-G）は、試験した細胞の大部分に効率よく感染した。我々はまた、エボラウイルスの細胞レセプターを調べるために、このシステムの有用性を検証した。細胞を化学修飾して表面タンパク質を変化させると、VSVΔG*-ResGPに対する感受性は著しく低下したが、VSVΔG*-Gに対する感受性は低下しなかった。これらの知見は、N-結合オリゴ糖鎖を持つ細胞表面糖タンパク質がエボラウイルスの侵入に寄与していることを示唆しており、おそらくウイルス侵入のための特異的レセプターおよび／または補因子として作用していると考えられる。このように、我々のVSVシステムは、高病原性ウイルスや試験管内で培養できないウイルスの糖タンパク質の機能を調べるのに有用である。
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フィロウイルス科には、マールブルグウイルスとエボラウイルスが含まれ、これらは糸状のエンベロープを持つ、非分節型の陰性鎖RNAウイルスである(1, 2)。両ウイルスとも、ヒトおよび非ヒト霊長類に重篤な出血性疾患を引き起こし、死亡率が高い(1, 2)。エボラウイルスグループは、1976年に初めて同定されたザイール亜型とスーダン亜型、1989年にフィリピンから米国に輸入されたイヌホザルから最初に分離されたレストン亜型、1994年にコートジボワールのタイ森林で発見された株で構成されている。フィロウイルスの自然発生源は依然として不明である。
フィロウイルスは少なくとも7つの構造タンパク質を含んでおり、そのすべてが単クローン性ポリアデニル化mRNA転写産物から翻訳される(2-7)。表面糖タンパク質（GP）は、7つの構造タンパク質遺伝子のうち4番目の遺伝子から発現される(3, 6)。フィロウイルスは、ビリオン表面にスパイクを形成する単一の膜貫通型GPを含んでいるので、GPがレセプターとの結合と膜融合に関与し、ウイルスの侵入につながる可能性が高い。フィロウイルスのGPはI型糖タンパク質で、N-結合型とO-結合型の両方の糖鎖を持ち（2, 8, 9）、アミノ酸配列から予測される分子量よりもかなり大きい。しかしながら、GPと他のフィロウイルスタンパク質の生物学的機能についてはほとんど知られていない。フィロウイルスの構造と生物学的挙動を解析しようとする試みは、バイオセーフティーレベル4の封じ込めの必要性によって妨げられてきた。
ラブドウイルスの原型である水疱性口内炎ウイルス（VSV）は、エンベロープRNAウイルスの複製と集合を研究するモデル系として用いられてきた。VSVは多くの動物や昆虫の細胞で増殖し、大量に増殖することができる。Lawsonら(10)とWhelanら(11)は、プラスミドから組換えVSVを作製し、外来タンパク質を発現させるベクターとして使用する可能性を提起した(12)。より最近では、Schnellら(13)が外来糖タンパク質（すなわち、細胞CD4または麻疹ウイルス糖タンパク質）のVSV粒子への組み込みを報告している。本研究では、Gタンパク質遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む組換えVSVを作製し、受容体結合と膜融合を担うエンベロープタンパク質がトランスで供給されない限り感染しないようにした。次に、この新しい組換え型VSVをエボラウイルスGPの機能解析に用いる可能性を検討した。ここでは、組換えVSVとエボラ・レストンGPの相補化に成功したことを報告する。
材料と方法
プラスミド
エボラ・レストンウイルス糖タンパク質（ResGP）（14）、VSV Gタンパク質（15）、インフルエンザA/トルコ/アイルランド/1378/83（H5N8）ウイルスヘマグルチニン（16）をコードする完全長cDNAを哺乳類発現ベクターpCAGGS（17）にクローニングし、それぞれpCResGP、pCVSVG、pCTHと命名した。
細胞。
Vero、BHK、MDCK、およびMDBK細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）、l-グルタミン（GIBCO/BRL）、ビタミンおよびアミノ酸溶液（GIBCO/BRL）、およびペニシリン-ストレプトマイシン溶液（Sigma）を添加したEagle's MEMで増殖させた。L細胞には、FCSの代わりにウマ血清を用いた。293T、COS-1、NIH 3T3、Tb1Lu細胞は、10％FCS、l-グルタミン、抗生物質を含む高グルコースDMEMで培養した。チャイニーズハムスター卵巣クローン22細胞は、E. Ruley（Vanderbilt University）から提供され、5% FCS、l-グルタミン、抗生物質を含むHam's F-12培地で培養した。DBT細胞は、テキサス大学のS. Makinoから提供されたマウス星細胞腫細胞株で、10％新生子牛血清、トリプトースリン酸ブロス（GIBCO/BRL）、抗生物質を添加したMEMで培養した。蚊の幼虫細胞株からのクローンC6/36細胞は、アールの平衡塩類溶液と10％FCSを添加したMEMで培養した。
組換えVSVの作製
VSVゲノムの全長cDNAクローン（インディアナ血清型）(10)のGタンパク質遺伝子のコード領域を、Ser-65をThrに置換した改変版GFP遺伝子(18)のコード領域に置換した。このプラスミドをpVSV-ΔGと命名した。60mmディッシュのBHK細胞を、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスvTF7-3(19)に37℃で1時間、10の倍数で感染させた。その後、感染細胞を、VSVヌクレオカプシドタンパク質、リンタンパク 質、ポリメラーゼタンパク質、糖タンパク質を発現するプラスミドpVSV-ΔGを、それぞれ10、3、5、1、3μgの重量比で、示したようにコトランスフェクションした(20)。トランスフェクションから48時間後に上清液を採取し、上清液の2分の1を、vTF7-3に感染させ、Gタンパク質のみをコードするプラスミド5μgをトランスフェクトした細胞の2番目のプレートに感染させるのに用いた。感染から24時間後、細胞を蛍光顕微鏡でGFP発現を調べた。蛍光細胞の存在は、VSVゲノムの回収に成功したことを示した。mlあたり25μgのシトシンβ-d-アラビノフラノシド存在下、プラスミドDNAからGタンパク質を発現する細胞に、Gタンパク質で相補されたVSVΔG*（VSVΔG*-G）を含む上清を追加継代し、VSVΔG*-Gの高力価ストックを得た。後述する実験では、約109感染単位のVSVΔG*-Gを含む上清を孔径0.2μmの膜で濾過し、ワクシニアウイルスを除去した。その後、BHK細胞に感染させ、蛍光顕微鏡でGFPを発現する細胞数を定量することにより、上清液中のウイルス力価を再度測定した。
VSV GまたはResGPで相補化したVSVΔG*、または相補化なしのVSVΔGの調製。
293T細胞を、Lipofectamine（GIBCO/BRL）を用いてpCVSVG、pCResGP、またはpCAGGSでトランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後、細胞をVSVΔG-Gに感染多重度1で37℃で1時間感染させた。その後、PBSで3回洗浄し、培地を加えた。CO2インキュベーター内で37℃で24時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離して細胞を除去した。各ウイルスストックは使用するまで-80℃で保存した。
異なる細胞株における受容体結合タンパク質で相補された組換えVSVの滴定。
細胞単層をカバースリップ上で増殖させ、PBSで洗浄した後、連続希釈したウイルスストックに感染させた。37℃で1時間吸着させた後、接種液を吸引し、増殖培地を加えた。細胞をCO2インキュベーター内で37℃、12-14時間培養し、PBSで洗浄後、PBS中10％ホルマリンで固定した。異なる細胞株におけるウイルスの感染単位は、GFPを発現する細胞の数を数えることにより決定した。
細胞の化学修飾。
Vero細胞をツニカマイシン（シグマ社製）存在下、CO2インキュベーター内で37℃、8時間プレインキュベートした後、ウイルスを1時間感染させた。接種液を吸引し、増殖培地を加えた後、細胞を12時間培養し、感染細胞を数えた。プロテアーゼ、ノイラミニダーゼ、または過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）による処理では、細胞をPBSで3回洗浄し、無血清培地中、Pronase（Calbiochem）、トリプシン（GIBCO/BRL）、ビブリオコレラ菌ノイラミニダーゼ（GIBCO/BRL）、またはNaIO4（Fisher）の存在下、CO2インキュベーター内で37℃、20分間（プロテアーゼ）または1時間（ノイラミニダーゼおよびNaIO4）インキュベートした。反応を停止させるため、各ウェルに等量の完全培地を加え、細胞をPBSで洗浄した。その後、細胞にウイルスを感染させ、感染細胞を数えた。Vero細胞もまた、塩化アンモニウム（Sigma）存在下、CO2インキュベーター内で37℃、2時間プレインキュベートした。その後、ウイルスを感染させ、塩化アンモニウム存在下で培養した。
結果
エボラ・レストン・ウイルスGPの機能を調べるため、まずニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプラスミドベクターpCAGGSでトランスフェクションして発現させた。ResGPに対するmAb（14）と反応性のある2種類の分子量（130kDaと160kDa）が、放射免疫沈降法で検出された（図1）。フローサイトメトリー解析で示されたように、GPは効率よく細胞表面に輸送された（データは示さず）。次に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンについて述べたように、発現したGPが中性pHで、あるいは低pHにさらされた時にポリカリオン形成を誘導するかどうかを調べた（16）。ResGPは、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンやVSV Gタンパク質を発現する細胞のポリカリオン形成につながる条件下でも、中性pHや低pHへの暴露でポリカリオン形成を誘導しなかった（データは示さず）。そこで我々は、エボラウイルスGPの機能を調べるための別のアプローチを模索した。
図1
ResGPのVSV粒子への組み込み。ウイルスタンパク質は、還元条件下で10%ゲルのSDS/PAGEで分析した。VSVのG遺伝子を含む発現ベクタープラスミド（レーン1）、ResGP遺伝子（レーン2）、またはベクタープラスミドのみ（レーン3）でトランスフェクトした293T細胞を、トランスフェクションの30時間後に[35S]メチオニンで5時間標識した。細胞溶解液中のタンパク質を、VSV Gタンパク質（レーン1）またはResGP（レーン2および3）に対するmAbで沈殿させた。VSVのGタンパク質（レーン4、VSVΔG*-G）またはResGP（レーン5、VSVΔG*-ResGP）で相補化したVSVΔG*、または相補化を欠いた（レーン6、VSVΔG*）VSVを含む組換えVSVを[35S]メチオニンで標識し、示差遠心分離と25-45%スクロース勾配を通した沈降により精製した。
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ResGPのVSV粒子への組み込み。
リバースジェネティクスを用いて、Gタンパク質遺伝子の代わりにGFP遺伝子を含むVSV（VSVΔG*）を作製した。VSVΔGの感染性は、Gタンパク質をトランスで供給することで回復する（VSVΔG-G）。ResGPがこの組換えVSVの感染性を補完するかどうかを調べるために、まずVSV粒子に組み込まれるかどうかを試験した。pCVSVG、pCResGP、またはpCAGGSをトランスフェクトした293T細胞にVSVΔG*-Gを感染させ、[35S]メチオニンで標識した。pCVSVGをトランスフェクトした細胞の培養液から精製したビリオンには、VSVの構造タンパク質がすべて含まれていた（図1、レーン4）。pCResGPをトランスフェクトした細胞のライセート（レーン2）から、抗ResGP mAbでおおよそ分子量130kDaと160kDaの2つのタンパク質が免疫沈降したが、これらの細胞の培養液（VSVΔG*-ResGP）から得られたビリオンには160kDaのタンパク質しか含まれていなかった（レーン5）。細胞溶解液中に検出されたより小さなタンパク質は、GPの未成熟型であった可能性が高い。ベクター導入細胞からのビリオン（VSVΔG*）は内部タンパク質（N、P、M、レーン6）のみを含んでいた。
部分精製ビリオンの電子顕微鏡観察では、VSVΔG*-ResGPとVSVΔG*-Gビリオンのエンベロープにスパイクが密に配列していたが、VSVΔGビリオンはスパイクがなかった（図2A）。ResGPに対するモノクローナル抗体は、部分的に破壊されたVSVΔG-ResGPビリオン（図2B中、右上）には結合したが、無傷の粒子（図2B中、左上）には結合しなかった。実際、同じmAbはエボラ・レストン・ウイルスを中和しない（A.S.、未発表データ）。ビリオンと共培養された膜小胞（図2B中、下中央に矢印）には、mAbで装飾されたスパイクも含まれていた。対照的に、VSV Gタンパク質に対する中和mAb I1(21)は、Gタンパク質を含む形態学的に無傷のVSV粒子と破壊された粒子を認識したが、VSVΔG*-ResGPとVSVΔG*-Gは認識しなかった（図2C）。
図2
組換えVSV粒子の電子顕微鏡観察。VSVのGタンパク質（VSVΔG*-G）またはResGP（VSVΔG*-ResGP）で相補化したVSVΔG*、または相補化なしのVSVΔGを調製し、20%スクロースで遠心分離して部分精製した。ウイルスをネガティブ染色（A）、またはResGP（B）またはVSV Gタンパク質（C）に対するマウスmAbとコロイド状金で結合させた抗マウスIgGで標識した後、ネガティブ染色した。
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ResGPによる組換えVSV感染性の補完。
受容体結合/融合タンパク質を欠くVSVの感染性をResGPがレスキューできるかどうかを調べるため、VSVΔG-G、VSVΔG*-ResGP、またはVSVΔGをVero細胞に感染させた。VSVΔG-ResGPまたはVSVΔG*-Gに感染させると、多くの細胞がGFPを発現したが、VSVΔGに感染させるとGFPを発現する細胞はほとんどなかった（図3）。VSVΔGのバックグラウンド感染性（表1に示す）は、VSVに対する抗血清によって中和されたことから、VSVΔG*-Gの接種に起因すると考えられた（データは示さず）。これらの結果は、エボラウイルスGP自体がVero細胞へのウイルスの付着と侵入に十分であることを示している。
図3
組換えVSV感染によるGFPの発現。Vero細胞にVSVΔG*-G、VSVΔG*-ResGP、またはVSVΔGを感染させ、感染12時間後に蛍光顕微鏡でGFPの発現を調べた。
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表1
異なる細胞株に対する組換えVSVの感染率
VSVΔG-GVSVΔG*-ResGPVSVΔGVero（サル）6.75.22.1COS-1（サル）6.35.12.1293T（ヒト）6.55.12.0BHK（ハムスター）6.73.42.4CHO（ハムスター）5. 73.72.1L（マウス）6.13.61.8NH3T3（マウス）5.03.31.0DBT（マウス）6.63.72.5MDCK（イヌ）6.23.91.8MDBK（ウシ）5.22.60.8CEF（ニワトリ）6.43.52.2Tb1Lu（コウモリ）5.12.90.3C6/36（蚊）3.30.60.3
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ある系統の細胞は、同じバッチのウイルスで感染させた。データは3バッチのウイルスで繰り返した実験の代表的な結果である。感染から12～14時間後、GFPを発現する細胞の数を数えることにより、異なる細胞におけるウイルスの感染単位を決定した。
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組換えVSVに対する細胞株の感受性。
エボラウイルス糖タンパク質の機能解析のためのVSVシステムの有用性をテストするために、エボラリストンウイルスレセプターの有病率を推定するために、組換えVSVに対する感受性について様々な細胞株をスクリーニングした（表1）。VSVΔG-Gウイルス株は、その起源種に関係なく、感染力価（GFPを発現する細胞の数を数えて測定）が105.0から106.5の範囲で、試験したすべての哺乳類および鳥類の細胞に均一に感染した。昆虫細胞株(C6/36)は他の細胞株よりもVSVΔG*-Gに対する感受性が低かった。対照的に、VSVΔG*-ResGPウイルスストックの感染性は、調べた細胞株の種類に大きく依存した。霊長類由来の細胞（Vero、293T、COS-1）では、VSVΔG*-ResGPの感染力価は、ハムスター、イヌ、ウシ、マウス、ニワトリ、コウモリ由来の細胞よりも100倍高かった。VSVΔG*-ResGPはC6/36昆虫細胞株には感染しなかった。これらの結果は、エボラウイルスの細胞内への侵入を決定する重要な要素（例えば、レセプターの特異的特徴）が動物種によって異なることを示唆している。
組換えVSVの感染性に対するベロ細胞の化学修飾の影響。
エボラリストンウイルスの細胞レセプターの生物学的特性に関する情報を得るために、化学修飾した細胞に対するVSVΔG*-ResGPとVSVΔG*-Gの感染性を比較した。バックグラウンド感染力（上述の通り）は無視できると考えられたため（Vero細胞に対するVSVΔG*-ResGP感染力の0.08%）、以下の実験ではウイルスをVSV抗体で処理しなかった。Vero細胞をプロテアーゼ、ノイラミニダーゼ、過ヨウ素酸ナトリウムでプレインキュベートし、ウイルス感染における細胞表面タンパク質、シアル酸、糖質の役割をそれぞれ調べた。処理した細胞をVSVΔG*-ResGPまたはVSVΔG*-Gに感染させ、顕微鏡視野あたり100-200個の感染細胞が得られるように希釈した。細胞をプロナーゼまたは過ヨウ素酸ナトリウムでプレインキュベートすると、VSVΔG*-ResGPの感染力は著しく低下したが、VSVΔG*-Gではあまり効果がなかった（図4）。細胞を20μg/mlのプロナーゼまたは0.8mMのNaIO4で処理した場合、VSVΔG*-ResGPの感染力は、それぞれ非処理細胞の感染力の9.1%または4.4%に減少した。これらの条件下ではVSVΔG*-Gの感染性もある程度低下したが、その影響は間接的なものであり、細胞の過剰な損傷を反映していると考えられた。トリプシンまたはノイラミニダーゼ処理では、いずれのウイルスの感染性も低下しなかった（図4）。高濃度の酵素（16μg/ml）で細胞をトリプシン処理すると、細胞の著しい剥離と構造変化を伴う過剰なタンパク質分解が起こった。シアル酸をレセプターの重要な構成要素として認識するインフルエンザウイルスに対する細胞の感受性を消失させるには、20 milliunits/mlのノイラミニダーゼ処理で十分であった（データは示さず）。これらの結果は、VSVΔG*-ResGPは細胞表面の糖タンパク質と相互作用するが、シアル酸をレセプターとして利用しないことを示唆している。VSVΔG*-ResGP感染における細胞表面GPの役割を、N-グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンを用いてさらに評価した。図4に示すように、この薬剤はVSVΔG*-ResGPの感染性を著しく低下させたが、VSVΔG*-Gの感染性は低下させなかったことから、VSVΔG*-ResGPの感染性にはN-結合オリゴ糖鎖を持つ表面糖タンパク質が大きく寄与していることが示された。
図4
化学修飾したVero細胞における組換えVSVの感染性。Vero細胞を指示濃度の試薬でプレインキュベートした。その後、VSVΔG*-GおよびVSVΔG*-ResGPの感染性を調べた。各バーは、10顕微鏡視野から算出した感染単位の割合（平均±SD）を示す。
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リソソームトロピック剤は、細胞内の酸性コンパートメントのpHを上昇させる。塩化アンモニウム（NH4Cl）はエンドソームのpHを中和するため、pH依存性の低い融合活性を持つウイルスは、NH4Cl処理によってエンドソーム膜とエンベロープを融合することができなくなり、その結果、感染性が失われる(22)。そこで我々は、ResGPが感染を開始するために低いpHにさらされる必要があるかどうかを調べた。VSVΔG*-ResGPとVSVΔG*-Gの感染性は用量依存的に低下し、16 mMのNH4Clで完全に阻害された（図4）。これらの結果は、他のVSVタンパク質がウイルス感染の開始に低pH暴露を必要としないように、両GPが細胞膜との融合に低pHを必要とすることを示唆している。
考察
我々は、感染の初期段階におけるエボラウイルスGPの機能を研究するために使用できるVSVシステムを開発した。ResGPは効率的にVSV粒子に組み込まれ、受容体結合／融合Gタンパク質を欠くVSVの感染性を補完した。これらの知見は、ResGPが細胞レセプターに結合し、膜融合を仲介する能力があることを示している。GPはエボラウイルスの唯一の表面糖タンパク質であるため、ウイルスの結合と膜融合に関与すると考えられてきたが、証明はされていない。ここに示す結果は、この役割を立証し、エボラウイルスの細胞膜への結合と融合を安全に調べるためにGPをどのように操作できるかを示すものである。
フィロウイルスのレセプターと推定されるものの一つに、アシアロ糖タンパク質レセプターがある。肝細胞にのみ存在し(23)、末端にガラクトース残基を持つN-結合型糖鎖を持つGPを認識する(24)。しかし、フィロウイルスは汎発性であり、このレセプターを欠く細胞株（例えば、ヒト内皮細胞）はウイルスに感受性があるので(25)、他の細胞レセプターが存在するはずである。この研究で調べた細胞株はすべてVSVΔG*-ResGPに感受性であったが、その程度は異なっており、ResGPのレセプターとして機能する共通の分子を保有している可能性がある。しかし、種に依存した構造の違いが、ResGPとこの分子との相互作用に影響を与え、その結果、霊長類以外の細胞のVSVΔG*-ResGPに対する感受性が低下しているようである。
化学修飾した細胞に対するウイルス感染性のアッセイから、N-結合オリゴ糖側鎖を持つ特定の表面GPがVSVΔG*-ResGPの細胞侵入に重要な役割を果たしていることが示唆され、おそらくHIVや単純ヘルペスウイルスで示されているように、ウイルスに対する特異的な細胞レセプター、あるいはおそらく補因子としての役割を果たしているものと思われる。このように、エボラウイルスの細胞内侵入に影響を与える細胞レセプターと可能性のある補因子に関する今後の研究の方向性が示された。
ResGPが効率的にVSV粒子にパッケージされたことは注目に値する。以前、VSVのGタンパク質の細胞質尾部がビリオンへの効率的な組み込みに必要であると報告されたが(28)、我々は最近、逆遺伝学的アプローチを用いて、細胞質尾部は実際にはGタンパク質の組み込みには必要ないことを発見した（C.R. and M.A.W.、未発表データ）。VSVのGタンパク質の細胞質尾部を持つ非VSVタンパク質が、VSVに効率よく組み込まれた例は1つしかない(29)。本研究では、ResGPがVSV粒子にしっかりとパッケージされていることを電子顕微鏡で示した。推定される細胞質ドメインのアミノ酸配列は、Ebola Reston GPとVSV Gタンパク質の間に大きな相同性はないが、GPはこのドメインに、ResGPと他のVSVタンパク質との相互作用を可能にする構造的特徴を含んでいる可能性がある。
我々が記述した相補性システムは、ウイルス侵入に関与するGPの機能的ドメインの研究を可能にし、膜タンパク質の機能研究において大いに役立つ可能性がある。さらに重要なことは、高病原性ウイルスや試験管内で培養できないウイルスの膜タンパク質を解析する研究において、試験管内培養やバイオセーフティーレベル4の封じ込めの必要性をなくすことができることである。
略語
VSV
水疱性口内炎ウイルス
GP
糖タンパク質
GFP
緑色蛍光タンパク質
ResGP
レストンGP
FCS
子牛胎児血清
謝辞
Beth Rodgers、Krisna Wells、Peggy Brownには優れた技術的助力を、John Gilbertには原稿の編集を感謝する。また、I1ハイブリドーマを提供してくださったD. S. Lyles博士、GFP cDNAを提供してくださったM. Chalfie博士に感謝する。本研究は、米国国立衛生研究所からY.K.へのPublic Health Service Research Grants AI33989およびM.A.W.へのGM53726、Cancer Center Support grant、American Lebanese Syrian Associated Charitiesの助成を受けた。
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23
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27
R I Montgomery, M S Warner, B J Lum, P G Spear Cell 87, 427-436 (1996).
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28
M A Whitt, L Chong, J K Rose J Virol 63, 3569-3578 (1989).
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29
R J Owens, J K Rose J Virol 67, 360-365 (1993).
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