ピノキオはおもちゃ職人のゼペットが作ったあやつり人形である。子供のいないゼペットは、ピノキオが「自分の子供になりますように」と星に願う。皆が寝静まった頃、ブルー・フェアリーが現れてピノキオに生命を授けた。そして一部始終を見ていたコオロギのジミニー・クリケットを良心役に任命し、「勇気を持って正直で優しい性格になれば人間になれる」と言い残し、消えて行った。

騒音で目覚めたゼペットは、生命を授かったピノキオを見て大喜びし、翌日ピノキオを学校へ送り出す。しかし、世間知らずのピノキオは詐欺師の狐のJ・ワシントン・ファウルフェローと、その子分で猫のギデオンの「スターの暮らし」の甘言に乗せられ、きちんと断るようにというジミニーの忠告も聞かず、ストロンボリ一座に売り飛ばされてしまう。

糸の無い人形ということで一座のスターになったピノキオだったが、何も知らず家に帰ろうとした途端、怒ったストロンボリによって鳥籠に閉じ込められてしまう。そこへ最後の別れを告げに来たジミニーと再会し、自分が騙されていたことに気づいて脱出を試みても、錠前が錆び付いていてまったく開かず困り果てる。そこへブルー・フェアリーが現れてピノキオを問いただすが、ジミニーに本当のことを言うように忠告されるも、嘘をついたピノキオの鼻は伸びはじめてしまう。嘘をついたことを反省したピノキオと、彼にチャンスを与えて欲しいとジミニーの説得もあり、ブルー・フェアリーの手助けでピノキオはストロンボリ一座を逃げ出して家に帰ろうとする。

しかし、家に帰る途中で再びファウルフェローとギデオンに呼び止められ、今度は、遊びの島「プレジャー・アイランド」へ行こうと誘われ[注釈 1]、拉致同然に連れて行かれたピノキオは馬車に乗り、島へ向かう。そこではどんな悪いことでも許される島で、ピノキオはそこで過ごすうちに悪いことは楽しいと認識してしまい、二度にわたって言いつけを忘れてしまう。さらには散々心配したにもかかわらず、自分を侮辱した悪童ランプウィックを庇った挙げ句に彼を「親友」と呼ぶピノキオにとうとう愛想が尽きたジミニーは怒って帰ろうとした矢先、プレジャー・アイランドにいる子供達がロバになっていき、最後には町に売り飛ばされることを知ると、大慌てでピノキオの救出に向かった。その頃ランプウィックが目の前でロバになってしまい、自身にもロバの耳としっぽが生えて来たため混乱しパニックになったピノキオは、戻ってきたジミニーと一緒に危機一髪でプレジャー・アイランドを脱出し、家へと帰っていった。

ところが、家に帰ると明かりがついておらず、ゼペットはおろか猫のフィガロと金魚のクレオもいなくなっていた。二人が途方にくれていると、空から一枚の手紙が落ちてくる[注釈 2]。ジミニーが読み上げると、そこには驚くべき事が書かれていた。いつまで経っても帰って来ないピノキオを心配して探しに行ったゼペットが、船で海へ出かけた矢先クジラの王様・モンストロに飲み込まれてしまっていたのだ。
ピノキオとジミニーは海に行き、ゼペットを救出しようと尻尾に石を縛り付けて飛び込むも自身もモンストロに飲み込まれ、腹の中でゼペットとの再会を果たす。ピノキオにロバの耳や尻尾が生えていたことに驚くゼペットだが、何も言わずに優しく抱いた。船にあったイカダを見たピノキオは知恵と勇気で腹の中で焚き火を起こし、ゼペットといっしょにモンストロの腹の中から脱出することに成功するが、怒ったモンストロに追いかけられることになる。イカダが壊れてもピノキオは力尽きかけたゼペットを庇い必死に岩場まで泳ぐも、モンストロは執拗に追いかけて来る。そこでたまたま目に止まった岩場の隙間に逃げ込み、続けてモンストロもまた勢いよく突っ込んだが、それを最後に生死不明となる。
水飛沫によって運良く浜辺に打ち上げられたゼペット達と、傘をクッションにしたジミニーはかろうじて生還するが、ピノキオは砕けた岩に巻き込まれ、波打ち際にうつ伏せで倒れているところをジミニーに発見されるも、既に息絶えてしまっていた。

死んでしまったピノキオを前に、ゼペットとジミニー達は悲しみに暮れていた。そこへブルー・フェアリーが現れ、ピノキオは勇気ある行動を讃えられる。そして彼女の力で生き返らせるとともに本当の人間の子供に姿を変えた。目を覚ましたピノキオは、ゼペットと喜びを分かち合った。ジミニーが外へ出て空の星に向かい礼を言うと、胸元に良心の証である金色のバッジが現れ、ジミニーは感激に浸った。

私のピノキオが本当の子供になりますように

セペット　あなたは人々に幸せを与えました

願いを叶えましょう

善悪の区別を教え

誘惑を退けさせ

まっすぐな道へ導きなさい