バンドが出ない、バンドの形がおかしい、バックグラウンドが汚い、などに対応する方法を列挙する。ここでは特に培養細胞や組織から精製したライセート、精製したリコンビナントタンパク質を対象とする。

サンプル調製

タンパク質濃度の決定

　ウエスタンのためのSDS-PAGE において、1レーンにロードする総タンパク質量は10-50 μg が適正とされる。もちろん少なければ検出不能になる。多すぎるとレーンの歪みや、バンドの歪み、近接したバンドの歪み・マスキングに繋がる(アルブミンやチューブリンなど、大量に含まれるタンパク質により近接したタンパク質が押され、バンドの位置が変化してしまう等)。

　タンパク質にSDS sample buffer (多くはLaemmle buffer)を加える前に、ブラッドフォードなどで総タンパク質量を測定し調整することができる。ブラッドフォードは界面活性剤(Triton -x100など)の影響を受けやすい点、芳香族の多いタンパク質では過小評価しやすい点に注意が必要である。ブラッドフォードとは異なる原理でタンパク質量を定量するキットが各社より販売されている。

タンパク質濃度の調整

　サンプル中のタンパク質濃度が低かった場合、濃縮が必要になる。

　リコンビナントタンパク質の精製において多用されるのは、アミコンシリーズ(https://www.merckmillipore.com/JP/ja/20140428_103131) に代表される、限外濾過と遠心を用いた方法である。50 ml 遠心チューブスケールから1.5 ml チューブスケールのものが販売されている。一部の塩や小分子が除かれてしまうこと、製品のカットオフ値より分子量の小さいタンパク質（カットオフ値より大きくとも、見た目の大きさが小さいタンパク質も含む）は除かれてしまう点に注意が必要である。1.5 ml チューブスケールのものがあるとはいえ、培養細胞より採取した数十 μl　のサンプルでは回収が困難という弱点もある。

　少量のサンプルでも濃縮が可能な方法に、クロロホルムーメタノール沈殿法がある。方法はここでは詳述しないが、リカバリは悪くない。タンパク質によっては変性の可能性はあるが、native-PAGE などでなく後からLaemmle buffer の添加と加熱などで完全に変性させるのであれば問題にならないだろう。

バッファー大丈夫ですか

Laemmle buffer は4x-5x 程度で使い、βメルカプトエタノールが添加されているレシピが頻用されている。ラボによってはβメルカプトエタノールを使用時に後入れしている場合もある。

SDS-PAGE

ゲルの選択

　SDS-PAGE のゲルの特性を知って選択する必要がある。

　まず大きな違いとして、アクリルアミド濃度が全体で均一なものと、グラディエントのかかっている（上部が薄く、下部が濃い）ものが存在する。市販されているゲルの多くは5 % から20 %である。一般的に大きなタンパク質は低濃度で、小さなタンパク質は高濃度で分離されやすい。市販のゲルであればカタログにラダーを流した写真があるため、対象とするタンパク質の大きさ部分の解像度が一番良い、つまり対象とするタンパク質の分子量付近が一番引き延ばされて見えるゲルを選択することで、小さな分子量の違いを検出可能にしたり、ノンスペシフィックなバンドとの分離を可能にする。手製ゲルの場合も、市販品のカタログスペックを参照にアクリルアミド濃度を検討することは有効である（ただし、低濃度のゲルは柔らかく脆いため、作製の難易度は高くなる）。

　また、ゲルによってはSDSを含有していないもの（泳動中にバッファーからSDSが染み込む）と、最初からSDSを含有しているものとがあり、SDS以外のものを界面活性剤として利用する場合などは注意を要する。

泳動時間・電流

　一般的にはゲル1枚あたり20-40 mA で泳動することが多いだろう。高電流で泳動すれば短時間で済み、低電流で泳動すれば長時間かかることは言わずもがなであろうが、ここにも注意が必要である。

　高電流で泳動した場合、バッファーの温度は上昇する。温度が上昇すればゲルが脆くなることは明らかであり、この後の取り扱いを悪くする。

　「泳動し終わったけどトランスファーの装置が空いてないからしばらく待とう」「泳動終わってるけど他の実験してるからちょっと放置」という行為も、バンドの乱れの原因となる。電流がかかっていない場合、ゲル中のタンパク質は拡散してしまうからである。では、どうしても泳動の終わった状態でしばらく待たなければならない時はどうするか。「超低い電流を流しておく」である。1-5 mA 程度で電流を流しておくと、バンドの拡散をある程度予防できる。

電極の向きあってますか

　見出しの通りである。プレステインドのラダーを必ず流そう。泳動槽によって、電極の向きを問わない製品（ATTOなど）と、電極の向きが指定されている製品（WAKOなど）がある。なぜか電流に刺さっているコードのプラスマイナスが逆になっているという意味不明な状況も稀にある。

バッファー大丈夫ですか

　確認しよう。10x で保存しているラボもあれば、5xで保存しているラボもある。また、泳動槽に入れるバッファーの量はケチらないほうが賢明である。ゲルの温度上昇を防ぐという役割もある。

トランスファー

タンク式かセミドライか

現在使われているトランスファーの原理としては、タンク式とセミドライ式があるが、どちらが使われているかはラボによって異なる場合が多い。タンク式は大きなゲルに対応することが難しいが、セミドライのトランスファー装置は大きなゲルに対応するものが販売されている。なぜかセミドライの方が綺麗にバンドが出る、またはその逆、といった例もある他、ゲルの挟みやすさは人によって感じ方が違うため、人によって宗派が異なる場合が多い。稀ではあるが、タンク式の方がうまくいく、もしくはセミドライの方がうまくいく、といった例がないわけではない。ゲルの挟み方が大きく違うため、単純にどっちの方が上手にできるかという向き不向きも結果を左右してしまう。ちなみに、使うバッファーの量はセミドライの方が断然少ない。高電流を流す場合には、タンク式のほうが冷却は容易である（タンクに保冷剤をいいれる、タンクごと氷水に漬けるなど）。セミドライを使う時は、メンブレンやろ紙が焦げないように注意しよう（メンブレンが焦げると非常に独特の臭さがある）。

ニトロセルロースかPVDFか

　現在はPVDFをデフォルトにしているラボが比較的多いように思われる。主に使われるのはニトロセルロースかPVDF であるが、どちらも長所短所がある。タンパク質とメンブレンの組み合わせは時にバンドの見え方を大きく左右するので、条件検討としてメンブレンの種類を変えることが有効である場合も多い。タンパク質によってニトロセルロースとPVDF で全くバンドの出方が変わることもあるので、極めて注意の必要な点である。

　ニトロセルロースは前処理が不要で、すぐに使用可能である。PVDF よりもバンドが鮮明で、バックグラウンドも低い傾向にある。比較的大きなタンパク質（100 kDa ~）では、PVDF よりも優れている場合が多い。しかしPVDF より脆いため、続く抗体との反応の際にピンセットで掴んだ部分を引きちぎってしまうという事態が発生しうるが、慣れれば十分に防ぐことのできる事故である。また、ニトロセルロースは油性ボールペンで書き込みが可能である。複数のメンブレンを同時に扱う際や、上下を確実に区別したい際などには、ブロッキングの前か後に、余白に直接書き込みをしても後の段階に支障はない。PVDFではこの書き込みはできない。

　PVDF は最低でも1時間以上かけた前処理が必要である。メタノールに浸して数十秒、トランスファーバッファーに浸して1時間以上というプロトコルが一般的であろうか。この前処理を怠ると、トランスファーの効率を大きく低下させる。PVDF の長所として、小さいタンパク質を逃しにくい、疎水性のタンパク質を逃しにくい、という点が挙げられる。小さいタンパク質や疎水性の高いタンパク質では、ニトロセルロースを用いた場合トランスファーの段階でメンブレンを抜けてしまうという事態が生じうるが、PVDF はその傾向が少ない。

　ちなみに、ニトロセルロースをメタノールに漬けると溶ける。

バッファー大丈夫ですか

　見出しの通りである。ストックの倍率、あとから入れるメタノールの量が異なる場合がある。確認しよう。また、トランスファーバッファーはPAGEのバッファーと異なり複数回の使用が可能であるが、もちろん使用のたびに劣化するため、過度の再利用（数回以上）は避けるべきである。

ゲルとメンブレンの間に入り込む泡

　ゲルとメンブレンを均一に密着させることは重要であるが、その際に空気の泡が入らないことも重要である。空気が入った部分は転写されないため、その部分だけ抜けてしまう。ゲルをメンブレン上に移動させる際にコロコロ（正式名称は何なのか）を使って空気の泡を抜く手法が一般的である。それ以前に、バッファー内で発生している空気にも注意しよう。水とメタノールを混合すると、空気の溶解度の違いにより、非常にたくさんの泡がバッファー内に生じる。バッファーを調製する際は早めにつくって密閉せずに静置しておく、もしくは機械的に脱気をするなどして空気を抜いておくと、泡の混入を減らすことができる。

ろ紙の枚数

　メンブレンとゲルの外側にはメッシュのクッションのようなものとろ紙を配置し、メンブレンとゲルを密着させる。メッシュのクッション（正式名称は何なのか）は繰り返ししようすることによって弾力や厚さを失っていくため、徐々に密着が弱くなってしまう。また、カセットの接続部も経年劣化の可能性がある。密着が弱い場合、ろ紙の枚数を増やすことで対処できる（本当はクッションやカセットを買い替えるのが一番であるが、意外と高価）。ゲルの厚みやトランスファー装置が変わればもちろん最適なろ紙の枚数や厚みが異なるため、カタログや経験者の意見を確認して決定すべきである。

タンクの温度

　タンク式の場合、トランスファーの途中でバッファーの温度は上昇する。これがゲルの変形や脆さを引き起こす場合がある。タンクごと氷水に漬ける、タンクに凍った保冷剤を突っ込むなどして、過度の温度上昇は防ぐ方がよい。

漏電

　これはトラブルシューティングとは関係ないかもしれないが、漏電には気を付けよう。トランスファーは大きな電流を使用する。特にタンク式の場合、タンクの外側やこぼれたバッファーを伝って電流が流れる。槽にふれなくとも、机の上を流れたバッファーにふれることで感電の危険がある。タンクはプラスチックなど電気の流れない容器に入れることで事故を防ぐことができる。

　また、実験に不慣れな学部生などには、「使用中のトランスファーのタンクに触るな」という指導をしておこう。死ぬかも。

トランスファーの時間

　極端に大きなタンパク質（動きにくい）を対象とする場合、トランスファーの通電時間を長くすることで、確実にメンブレンに移すことができる。高分子量の部分が全量転写されているかは、マーカーの高分子量部分がゲルに残っていないかで確認できる。転写が不十分だと、プレステインドマーカーの高分子量部分がゲルに残っているのが見える。

ブロッキング

　ブロッキングには様々な方法があり、スキムミルク、BSA、市販のブロッキング剤などが使用される。ブロッキングの不足はバックグラウンドの上昇を招く。逆にover night や数日をかけたブロッキングは「オーバーブロッキング」を引き起こし、感度を低下させる可能性があることには留意せねばならない。理論上、ブロッキング溶液は使いまわせるが、たとえ4℃で保存してもすぐカビが生えるのでやめよう。安価かつ様々なタンパク質を含むという点では、スキムミルクが最良である。「牛乳/乳製品が高騰」というニュースがあった場合、スキムミルクは品薄になりえる。

　また、スキムミルクには微量のフォスファターゼが含まれており、あるタンパク質のリン酸化型を特異的に検出する際にはブロッキングをスキムミルクで行うべきではないという意見もあるが、スキムミルクで行っても問題はないという意見の方が大半である。

一次抗体

濃度

　まずはデータシートや取扱説明書の通りに希釈するのが原則である。PBST とTBST のどちらが推奨されるかが書いてある場合もあるので、まずはそれに従う。自作の抗体や古すぎてスペック不明の抗体の場合、まず1000 x から試すのが無難である。抗体はタンパク質であるため、ブラッドフォードなどで濃度を決定することができるが、値段を考えると思いきった方法である。

　あまりに抗体が濃すぎる（1万 xで使いたいがそんな量はかりとれないよ等）の場合、一部を希釈して保存してもよい。希釈にはPBS+50%グリセロール+0.05%アザイドが使用できる。

希釈溶媒

　前述した通り、抗体の希釈にはPBST（PBS+0.1% Tween）もしくはTBST を用いるのが原則であるが、工夫によりウエスタンの綺麗さを改善できる。

　バックグラウンドが高い場合、ブロッキング液で抗体を希釈するという方法がある。通常ブロッキングで使う濃度もしくはそれよりやや低い濃度のブロッキング液を用いる。

　バックグラウンドが高い、ノンスペシフィックなバンドが多い場合、0.1 % SDS 存在下（PBS 0.1 % SDS など）で反応させることで改善することができる場合がある。抗体の感度は下がりうるが、弱い抗原抗体反応を防ぐ効果がある。この場合、ブロッキングがやや薄れるので、一次抗体での反応後、ウォッシュの前にもう一度ブロッキングをすることで、二次抗体の過剰な付着を防ぐ。

バッファー大丈夫ですか

　PBS を5xや10x で保存している場合がある。間違えてはならない。また、0.1% Tween 存在下ではカビが生えることがある。特に室温の高い夏場などに長期で放置している場合は気を付けよう。

反応時間

　ほとんどの抗体では、ウエスタンブロッティングでの使用では4℃ over night を推奨している。確実に抗原全量と反応させるためには、時間をかける方が賢明である。室温で1-2 時間反応させるという方法もあるが、抗原抗体反応がサチュレートしていない可能性は念頭に置こう。

洗浄（ウォッシュ）

　ラボによって流儀が異なる場合が多い。何分かけるのか、何回交換するのか、シーソーかシェイカーか、等々。原則は30分以上、3回以上としているラボが多いのではないだろうか。シーソーとシェイカーとでは、シェイカーの方が激しく攪拌するため、ウォッシュの効率は高い。over night 以上のウォッシュはシグナルの低下を招きうる。複数のメンブレンをひとつの容器でウォッシュすることは多くの場合問題とならないが、抗体の種類や用いるバッファーの量によっては抗体が他のメンブレンに付着し反応する（クロスリアクト）可能性があるため、注意しなければならない。感度の非常に高い抗体では起こる可能性が高い。

再利用

　希釈した抗体を複数回使いまわすことがある。一般的には推奨されない。希釈したタンパク質（抗体を含む）は劣化・変性する傾向にある。劣化のスピードは抗体にもよるが、都度新しいものを使う方が賢明である。

二次抗体

動物種

　マウス、ラビット抗体を二次抗体として用いる場合がほとんどであるが、時にヤギやヒツジ抗体を用いる場合がある。以前はモノクロ―ナル抗体はマウス抗体であることが殆どであったが、現在ではラビットのモノクロ―ナル抗体も多い。ヤギやヒツジに関しては二次抗体を持っていないラボもあるので、事前に確認しておくべきである。学生が「キャットの二次抗体は……」と言ってきた場合、それはカタログナンバーの「cat. 」である。ネコ抗体は存在しない（はず）。

反応時間

　市販の二次抗体であれば、一次抗体より短時間で済む。室温で1時間程度で十分な場合が殆どである。逆に二次抗体での長時間の反応はバックグラウンドの上昇を引き起こしうる。

バッファー大丈夫ですか

　前項の通りである。

洗浄（ウォッシュ）

　前項の通りである。

　備考：二次抗体の標識に使われる酵素として、HRP(西洋ワサビペルオキシソーム)とAP(アルカリフォスファターゼ)が挙げられる。最も頻用されるのはHRPであり、二次抗体といえばHRP抗体を指す場合が多い。AP標識の二次抗体を用いる場合は現像前の洗浄をPBSTではなくTBS もしくはTBSTで行う方がよいという意見もあり、二次抗体を使用する前にどちらの酵素で標識されているか確認すると参考になる場合がある。

現像

発光試薬（ECL）の選択

　発光に用いる試薬は様々なものが市販されているが、感度・強度や発光の持続時間がそれぞれ異なるため、適したものを選択する。一般的に感度の高いものはバックグラウンドも上昇する。

　発光の強度が不明な場合、感度の弱いものから順に試していく。感度の弱い試薬で強度が不十分であれば、ウォッシュバッファーで軽く洗い流した後に、より感度の高い試薬を用いる。

撮影方法の選択

　現在ではほとんどの場合、CCDカメラを用いて検出する。強度やデータの持ち出しが容易である。CCDカメラには冷却型のものと非冷却型のものが存在するが、一般的には冷却型の方が性能は優れると言われる。

　CCDカメラではなく、昔ながらのフィルムを使った現像も可能である。CCDカメラより感度が数倍高いことが大きな利点である。CCDカメラでは検出できない弱いバンドを検出できることも多い。

ストリッピング

　他の抗体でウエスタンをしたいがサンプルが足りないので、一度使ったメンブレンを違う抗体でウエスタンしたい。その時に用いるのがストリッピングという技法である。「一度くっついた抗体を引きはがす」作業である。

　ストリッピングに用いるバッファーの組成と条件は様々であるが、代表的なものとして2% SDS, 62.5 mM Tris HCl pH6.5, 100 mM βメルカプトエタノールにメンブレンを浸し、50℃（器具の乾燥機の中）で30分間インキュベート、というものがある。この組成はSDSで抗体を引きはがすものであるが、他にもグリシンと強酸性を用いる方法もある。また、市販のストリッピングバッファーも販売されており、50℃での保温が不要、より短時間、βメルカプトエタノール不含などの特性を持つ。

　ストリッピング処理によってブロッキングの効果も弱まるため、再びブロッキングを行ってから一次抗体との反応より同様の手順で行う。当然ながら抗原となるタンパク質も一部メンブレンから離れるため、シグナルは全体的に弱くなる。抗体の感度や標的とするタンパク質の特性によってはストリッピングによって検出できなくなる可能性があるため、できるだけストリッピングは避けるべきと言わざるを得ない。

ドットブロット

　ウエスタンブロッティングの変法として、dot blot という方法が存在する。これはSDS-PAGE を経ずに、メンブレンと抗体のみをもちいてタンパク質を検出する方法である。メンブレンに点状に数μl のタンパク質溶液を染み込ませ、ブロッキング以降を通常のウエスタンと同様に行う。メンブレン上に小さくスポットしていくため一度に非常に多くのサンプルを観察することが可能である。量以外の情報（分子量など）は得られない。また、一次抗体が非常に特異性の高いものでなければ、正確な情報は得られない。細胞ライセートなど、含まれるタンパク質の種類が非常に多い場合にも不適である。しかしリコンビナントタンパク質精製時のフラクションの解析（どのフラクションに目的タンパク質が存在するか）など、比較的pure なサンプルを多数並べて解析したい場合には有用な方法である。

まとめ

ウエスタンブロッティングは結果を見るまでに非常に多段階の作業を必要とする実験である。各段階でのトラブルシューティングと工夫により、よりよい精度での観察が可能である。

追記

SDS-PAGE, トランスファー共に、電流もしくは電圧を一定にして行うが、どちらを一定にするかはラボや個人により異なる。それぞれの長所短所は下記を参考にされたい。

タンパク質電気泳動における電力の設定（Thermo Fischer Scientific）

謝辞

一回目の公開後すぐに、Twitterを経由して様々な方に素晴らしいサジェスチョンを頂きました。ありがとうございました。