南アフリカ、フリーステート州における潜在性乳房炎および一見健康な乳牛の乳汁微生物叢の特性解析

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2023 Oct; 10(10)： 616. オンライン公開 2023年10月11日. doi: 10.3390/vetsci10100616
PMCID: PMC10610705 PMID: 37888568
南アフリカ、フリーステート州における潜在性乳房炎および一見健康な乳牛の乳汁微生物叢の特性解析
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10610705/


N. G. Khasapane,1,* Z. T. H. Khumalo,2,3 S. Kwenda,4 S. J. Nkhebenyane,1 and O. Thekisoe5
マルコス・ヴェイガ・ドス・サントス学術編集者
著者情報 論文ノート 著作権およびライセンス情報 PMC免責事項
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要旨
簡単な要約
乳腺炎は、機械的、物理的、化学的、生物学的原因によって引き起こされる乳腺の炎症である。乳腺炎の原因物質の同定は、獣医学で一般的な方法である微生物学的培養およびDNA技術を用いて達成された。さらに、ハイスループット次世代シーケンシング（NGS）とバイオインフォマティクス技術の著しい進歩により、ヒトと動物の両方における乳房炎感染に関連するマイクロバイオームの、培養ベースの手法からゲノム配列ベースの特性解析への移行が容易になった。そこで本研究では、16Sメタゲノミクスを活用して、小規模酪農家の不顕性乳房炎（SCM）と一見健康な（非SCM）乳牛乳の分類学的プロファイルを把握した。解析の結果、95門、33綱、884目、124科、202属、119菌種が確認された。データ解析の結果、SCMと非SCMの乳牛のマイクロバイオーム構成はかなり異なることが明らかになった。

要旨
牛の乳腺炎は、微生物感染または物理的損傷によって引き起こされる乳腺の乳房組織の炎症である。乳房炎は、乳房と乳汁の物理的、化学的、生物学的変化によって特徴付けられます。いくつかの異なる細菌種が乳腺炎の原因菌として同定されているが、多くの潜在性乳腺炎（SCM）症例は培養陰性である。本研究の目的は、16S rRNA配列決定により、SCMと一見健康な乳牛（非SCM）の乳汁微生物叢の特徴を明らかにすることであった。α多様性指標はSCM牛と非SCM牛の間で有意差を示した。主座標分析におけるβ多様性指標は、サンプルをタイプ別に有意にクラスタリングしたが（PERMANOVA検定、p < 0.05）、非計量的次元尺度法ではクラスタリングしなかった（PERMANOVA検定、p = 0.07）。全体的な解析の結果、合計95門、33綱、82目、124科、202属、119菌種であった。アクチノバクテリオータ（Actinobacteriota）、バクテロイディオータ（Bacteroidota）、ファーミキューテス（Firmicutes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）の4つの門が、SCMおよび非SCM牛サンプルからの全シーケンシングリードの97％以上を占めた。最も豊富な細菌クラスは、非SCM牛サンプルではActinobacteria、Bacilli、Bacteroidia、Clostridia、Gammaproteobacteriaであったが、SCM牛サンプルでは主にActinobacteria、Alphaproteobacteria、Bacilli、Clostridia、Gammaproteobacteriaであった。非SCM牛サンプルでは、Anthropi spp.、Pseudomonas azotoformans、P. fragi、Acinetobacter guillouiae、Enterococcus italicus、Lactococcus lactisが優勢であったのに対し、SCM牛サンプルでは、P. azotoformans、Mycobacterium bovis、P. fragi、Acinetobacter guillouiae、P. koreensisが優勢であった。本研究では、SCM牛乳と非SCM牛乳の間で細菌種に違いがあることが判明した。したがって、詳細な疫学研究が必要である。

キーワード：潜在性乳房炎、微生物叢、メタバーコーディング、牛乳
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  1. はじめに
    乳房炎は酪農事業に世界的な影響を与える重要な病気であると考えられており、その中には医療費や疾病管理費、罹患動物の死亡、再発コストなどが含まれる[1]。最も一般的な乳房炎である潜在性乳房炎は、無症状の乳房内炎症で、特定の牛群の 20 ～ 50% の牛が罹患します。SCC が 150 × 103 個/mL を超える牛が 3 頭中 2 頭以上いる場合、感染しているとみなされます。不顕性乳房炎は、病気の原因となる細菌が含まれている可能性はありますが、乳の性状にはほとんど変化がありません。不顕性乳房炎は臨床的乳房炎よりも多くの損失を引き起こし、乳房炎を引き起こす病原体によっては、ある牛群内の個々の牛に広がる可能性が高い[2,3]。この感染症が突然発症する主な原因は、感染性の細菌が乳房内に侵入し、乳腺の物理的バリアが破壊されることである。病気が進行すると、乳汁中のマイクロバイオーム異常が起こり、乳汁中の病原性細菌が増加し、常在細菌が減少する。最近まで、乳房炎に関連する微生物叢の記述は、単一の細菌の発見と単離に依存していた [3] 。

乳房炎は疫学的に異なる微生物によって引き起こされるため、原因菌によって伝染性乳房炎と環境性乳房炎に分類される [4]。伝染性乳房炎の原因菌としては、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌属（Streptococcus agalactiae）、レンサ球菌属（Streptococcus dysgalactiae）、マイコプラズマ属（Mycoplasma spp.）、コリネバクテリウム・ボビス（Corynebacterium bovis）などが挙げられるが [5]、環境性乳房炎の原因菌としては大腸菌が最も一般的である [6]。牛の乳房炎を引き起こす細菌については広く理解されているにもかかわらず、Linら [7]は、古細菌、ウイルス、真菌などの他の微生物も疾患プロセスに関与している可能性があり、同様に調査されるべきであると強調している [8]。

乳房炎との闘いにおいて最も重要なことのひとつは、乳房炎を迅速、正確かつ的確に検出できることである [9]。従来のアプローチは、一般的に乳房炎の原因という要素を無視し、対症療法的な診断に集中していました。重点的な治療の欠如、不適切な抗生物質の選択、抗生物質の過剰使用はすべて、細菌における薬剤耐性の発達の原因となり、生乳の抗生物質汚染のリスクを高める [10,11]。これらの原因菌の同定は、獣医学で一般的な方法論である微生物学的培養を用いて行われてきた[10]。原因菌の微生物学的培養では必ずしも細菌が増殖するとは限らないが、分子学的アプローチにより、高い感度と特異性で乳房炎の検出を強化することができる [12]。ハイスループット次世代シーケンサー（NGS）とバイオインフォマティクス技術の著しい進歩により、ヒトと動物の両方における乳房炎感染に関連するマイクロバイオームについて、培養ベースの方法からゲノム配列ベースの特性解析への移行が促進されている[13,14]。これらのNGSアプローチの中でも、16S rRNA遺伝子シーケンスは、近年、乳房炎微生物叢の特性解析に最も広く利用されている手法であり続けている[15]。これらの研究はまた、微生物代謝、病原性、抗生物質耐性に関する情報など、これらの微生物群集の機能的特徴に関する洞察も提供している[16,17]。牛乳微生物叢に関する研究をレビューすると、多くの地域の牛乳に共通する分類群が存在することがよくわかる。ウシ乳の微生物叢に関する研究で最もよく言及されるのは、ブドウ球菌、連鎖球菌、シュードモナス、ビフィドバクテリウム、プロピオニバクテリウム、バクテロイデス、コリネバクテリウム、腸球菌である[18,19,20]。さらに、メタ分類学的調査により、乳房炎を引き起こす病原性細菌 [21]、乳酸菌（LAB） [22]、腐敗乳菌 [23] の集団の変化が明らかになっている。そこで本研究では、16S rRNAメタバーコーディングを用いて、南アフリカのフリーステート州にある小規模農場の不顕性乳房炎（SCM）と見かけ上健康な（非SCM）乳牛の乳微生物叢を特徴付け、比較した。

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2. 材料と方法
2.1. 乳房炎のスクリーニングと検体採取
サンプルは全国乳房炎協議会のガイドライン [24] に従って採取した。乳検体は、酪農家または酪農作業員による慣例的な搾乳前乳房準備後、搾乳機装着前の同じ時間帯（早朝）に採取した。その後、サンプル採取前に、各牛の乳頭を蒸留水で洗浄し、二次汚染を防ぐために使い捨てのペーパータオルで乾燥させた。その後、サンプルが無菌的に採取されることを確実にするため、50 mL滅菌ファルコンチューブを用いて乳サンプルを採取する前に、乳頭端に70%エタノールを塗布した。最初の乳梗は廃棄した。

Maluti-a-Phofung、Mantsopa、Setsoto（図 1）の 3 市町村に所在する小規模農場 7 戸の牛 166 頭から、合計 166 個の複合乳サンプルを無作為にスクリーニングし、製造元の指示に従っ たカリフォルニア乳房炎検査（DeLaval、南アフリカ）による乳房内感染検査のために採取した。簡単に説明すると、前乳を廃棄した後、1 頭につき 1～2 回の複合乳を各パドルコンパートメントに採取した。パドルは乳の大部分が排出されるように傾斜させ、各区画にティースプーン 1～2 杯（5～10mL）を残した。保留乳と同量のCMT試薬を各セルに導入した。牛乳試薬の組み合わせを円を描くように回転させ、ゲルまたはスライムの有無を目視で観察し、各四半期ごとに記録した。0は反応なし、1は微量、2は弱い陽性、3は確実な陽性、4は強い陽性である。その後、陽性検体をフローサイトメトリー（Mérieux NutriSciences社、南アフリカ・ミッドランド）を用いた体細胞数（SCC）測定にかけた。その後、SCC の結果に基づいて、不顕性乳房炎と診断された 55 頭から 10 検体のみと、健常と判断された 166 頭から 10 検体を滅菌した 50 mL ファルコンチューブで採取し、氷で管理されたクーラーボックスを使用して DNA 抽出のために研究室に輸送した。体細胞数の結果は、Karzis ら[24]が推奨するように、SCC > 100,000 ～ 500,000 個/mL の弱い陽性、SCC > 500,000 ～ 1,000,000 個/mL の明瞭な陽性、SCC > 1,000,000 個/mL の強い陽性としてスコア化され、解釈された。従って、SCCが100,000個/mL以上＜500,000個/mL未満でCMT 1+の検体は不顕性感染とみなされ、SCCが100,000個/mL未満でCMT 0の検体は健常とみなされた。

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図1
南アフリカのフリーステート州（黄色の線）とフリーステート州内のサンプリングされた自治体（ピンク色）を示す地図。

2.2. DNA抽出とPCR
本研究の目的のため、Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kitを使用し、製造者の説明書（Zymo Research, Irvine, CA, USA）に従ってそれぞれの牛乳サンプルからゲノムDNAを抽出した。DNA 濃度の測定には NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer を使用した（Oxoid, Thermo Fisher, Johannesburg, South Africa）。

2.3. 16S rRNA遺伝子の増幅とサンプルのバーコード化
1分子リアルタイムPacBioシーケンス技術（Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA）を利用し、様々な農場の牛乳サンプル中の細菌集団の多様性を調べた。細菌特異的プライマー27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）および1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）は、Pootakhamら[25]によって報告されたように、ゲノムDNAから全長16SリボソームRNA遺伝子を増幅するために、Inqaba Biotechnical Industries（Pty）Ltd、 Ltd.（南アフリカ、プレトリア）で行った。実験サンプルの処理に加えて、1つの参照株、すなわちUHTミルクも処理した。これには実験サンプルと同じPCRと配列決定の実験装置が含まれていたが、実験用DNAテンプレートは二重蒸留水に置き換えられた。結果に影響を与える可能性のある化学物質による汚染がないことは、Catozziら[16]の研究に見られるように、塩基配列決定中の各PCR反応において陰性コントロールが増幅しないことで示された。

2.4. バイオインフォマティクスと統計解析
PacBio Sequel System（Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA）を用いて得られたアンプリコンシークエンスデータを解析するために、Rソフトウェア（v 4.3.1）パッケージ[27]に実装されているDADA2解析ワークフロー[26]を使用した。まず、PacBio SMRT Linkソフトウェア(v 7.0)を用いて生アンプリコンデータを処理し、FASTQ形式のコンセンサスサーキュラーシーケンス(CCS)リードを作成した。DADA2ワークフローの一環として、プライマー配列をフィルターし、PacBio CCSリードは、PacBio CCSリードの標準的なDADA2前処理ステップ（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/392332v2.full、2022年1月17日アクセス）に従って品質管理を行った。アンプリコン配列バリアント（ASV）の推論はDADA2法を用いて行った。SILVA reference database (v138; https://zenodo.org/record/4587955#.Y2F0p3ZBw2w accessed on 17 January 2022)に基づき、DADA2でフォーマットしたトレーニング配列セットを用いて、分類とASVのアバンダンスを決定し、割り当てた。

R（v3.6.1）のPhyloseq（v1.28.0）[28]、ggplot2（v3.2.1）、AmpVis2（v2.6.4）[29]、DESeq2（v1.24.0）[22]パッケージを使用し、存在量バープロット、アルファおよびベータ多様性順序付け、豊かさと存在量の差の推定、統計解析、視覚化を含むすべてのダウンストリーム解析を行った。NMDS順序プロットにおけるグループレベルの有意差は、veganパッケージ（https://github.com/vegandevs/vegan 2022年1月17日アクセス）のadonis関数に実装されているPERMANOVA（擬似F比を用いた並べ替え検定）を用いて評価した。グループ間のアルファ多様性を比較するために、Kruskal-Wallis順位和検定を利用した。UpsetR (v1.4.0)とVenn Diagram (v1.6.20)を用いてベン図を作成した[30]。

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3. 結果
3.1. 体細胞数
我々の調査結果から、潜在性乳腺炎を評価した 166 頭のうち、SCC > 200,000 < 500,000 cells/mL の乳牛は 55 頭（33.13%）のみであり、National Mastitis Council の勧告および Karzis ら [24]によって確立された基準に基づいて、牛レベルで乳腺の炎症に苦しんでいると考えられた。

3.2. 配列の特徴
不顕性乳房炎でない牛の生乳サンプル10個と不顕性乳房炎であった牛のサンプル10個の合計499,544（最小値=9152、平均値=24,977.2、最大値=48,172）CCSを使用し、合計209,357（最小値=3869、平均値=10,467.85、最大値=25,205）の非キメライルミナリードを作成した。DADA2を通して、分析したサンプル群からのリードを、王国（細菌）レベルで883のユニークなASVに結合した。少なくとも98.8%の塩基配列に、認識された門を割り当てることができた（表S1）。

3.3. 分類学的プロフィール
不顕性乳房炎に関連した生乳の正確な細菌プロファイルを、不顕性乳房炎でない生乳の細菌プロファイルと比較して得るために、全長16S rRNA遺伝子のSMRT配列決定を行った。ASVは17の細菌門から平均相対存在量5.8%で観察され、これらのうち4つの細菌門（放線菌門、バクテロイーダ門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア）は、感染サンプルと健常サンプルの全シーケンスリードの97%以上を占めた（図2）。

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図2
SCMおよび非SCMミルクサンプルにおける最も豊富な4つのフィラの分布。

コアマイクロバイオームをさらに解析した結果、非SCMサンプルでは放線菌、バチルス属、バクテロイディア属、クロストリジア属、ガンマプロテオバクテリア属、SCMサンプルでは放線菌、アルファプロテオバクテリア属、バチルス属、クロストリジア属、ガンマプロテオバクテリア属が最も多く検出された（図3）。注目すべきは、我々の標準試料が、非SCM試料やSCM試料と比較して、かなり異なる分類学的プロファイリングを示したことである。その結果、Kingdom分類は確かにBacteria、Bacteroidota門、Bacteroidia綱、Flavobacteriales目、Weksellaceae科、Chryseobacterium属に相当し、Chryseobacterium hominisという1種が同定された（表S2）。

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図3
SCMおよび非SCM牛乳サンプル中の最も豊富な5つのクラスの分布。

本研究ではさらに、非SCMサンプルにはEnterobacterales、Flavobacteriales、Lactobacillales、Pseudomonadales、Xanthomonadalesの菌が含まれる一方、SCMサンプルにはそれぞれCorynebacteriales、Erysipelotrichales、Lactobacillales、Peptostreptococcales-Tissierellales、Pseudomonadalesが含まれ、菌の目も多様であることが観察された（図4）。その結果、両サンプル群にはそれぞれ15属の細菌が含まれていることが確認された： Acinetobacter、Pseudomonas、Clostridium sensu stricto 1 Corynebacterium、Dietzia、Enterococcus、Kocuria、Lactococcus、Leuconostoc、Methylobacterium-Methylorubrum、Paeniclostridium、Romboutsia、Sphingomonas、Streptococcus、Turicibacterであった（図5）。

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図4
SCMおよび非SCM牛乳サンプル中の最も多い5つの細菌目の分布。

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図5
SCMおよび非SCM牛乳サンプル中の最も豊富な15属の分布。

最後に、配列を菌種レベルで分析したところ、両グループとも15種の優勢な細菌種が多様に含まれていることがわかった。非SCMサンプルでは、Anthropi属、P. azotoformans属、P. fragi属、A. guillouiae属、E. italicus属、L. lactis属、P. lundensis属、L. mesenteroides属、C. otitidis属、S. parauberis属、psychrophile属、P. putida属、rhizophila属、C. shigense属、P. synxantha属が検出された。azotoformans、M. bovis、P. fragi、A. guillouiae、P. koreensis、L. lactis、P. lundensis、M. marinum、L. mesenteroides、S. parauberis、P. putida、L. raffinolactis、P. synxanthaがSCMサンプルで検出された（図6）。

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図6
SCMおよび非SCM牛乳サンプル中の最も豊富な15種の分布。

3.4. 16S配列決定によるα多様性
全サンプル群のα多様性を比較したところ、種の豊富さ指数（Chao1およびACE）および種の均等性指数（ShannonおよびSimpson）により、SCMと非SCMの牛乳サンプルはグループ間で有意差がないことが示された。Chao1とACEの両指数とも、SCMと非臨床性乳房炎サンプルの間に有意差は示されなかった（補足図S1およびS2）。一方、シャノン多様性指標はSCM群と非閉塞性乳房炎群で差がなく（クラスカル・ワリス一元配置分散分析：p = 0.58）（補足図S3）、シンプソン多様性も有意差はなかった（クラスカル・ワリス一元配置分散分析：p = 0.8）（補足図S4）。レアファクションの結果はデータの多様性を確認するものであり、健常なサンプルの中には全サンプルの中で最も多様性が高いものもあった。

3.5. 16S配列決定によるベータ多様性解析
本研究の目的のため、2つのβ多様性解析を行ったが、どちらも同じパターンであった。NMDS解析の結果、SCMおよび非SCM牛乳サンプルの細菌群集はクラスター化しておらず、したがって互いに有意差はなかった（PERMANOVA p = 0.07; F = 1.53）（補足図S5）。主座標分析では、NMDS分析が(PERMANOVA) p = 0.05; F = 1.53であることが確認された（補足図S6）。

3.6. SCMと非SCMにおける細菌分類の重複と存在量の差の比較
検出された細菌分類学の重複を決定すると、牛乳サンプルの両グループ（SCMと非SCM）は22ファミリーを共有した。しかし、SCMおよび非SCMの牛乳サンプルでは、111ファミリーおよび3ファミリーが独自に検出された（図7）。重複する属を調べると、両グループとも28属を共有していた。これとは別に、SCMサンプル群では165属が単独で検出され、非SCMサンプル群では9属が非共有であった（図8）。種の構成を調べると、SCM標本群には82の固有種があったのに対し、非SCM標本群には22の固有種があり、両者は31の固有種を共有していた（図9）。SCM試料と非SCM試料の間の存在量の違いを調べたところ、すべての試料で、ファーミキューテス属、放線菌属、プロテオバクテリア属が優勢であった。しかし、Romboutsia属、Corynebacterium属、Pseudomonas属、Clostridium属が最も多く、Acinetobacter属が最も少なかった。

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図7
非SCMグループとSCMグループのファミリーレベルでのユニーク分類群と共有分類群の数を示すUpSetR交点プロット。1つの点はユニークな分類群の数を示し、2つの点はファミリーレベルでの共有分類群の数を示す。

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図8
非 SCM と SCM を「感染」グループとした場合の属レベルでのユニーク分類群と共有分類群の数を示す UpSetR 交差プロット。1つの点はユニークな分類群の数を示し、2つの点は属レベルで共有される分類群の数を示す。

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図9
非 SCM と SCM を「感染」グループとした場合の種レベルでのユニーク分類群数と共有分類群数を示す UpSetR 交点プロット。1つの点はユニークな分類群の数を示し、2つの点は種レベルで共有された分類群の数を示す。

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4. 考察
一般的な乳房炎研究とその発症原因の探求は現在も重要であり、これらの問題に対する答えを見つけるためのオミックス技術の応用は非常に限られている [31]。潜在性乳房炎は、泌乳中の乳牛を頻繁に襲い、乳生産量の減少により酪農家に経済的損失をもたらす疾患である [32]。泌乳牛における SCM の発生は、臨床的乳房炎の発症と進行にも関連しています。さらに、乳房炎の原因とその原因となる微生物を知ることは、その発生率を下げるための予防戦略の開発に役立つであろう。本研究では、SMRTシーケンス法を用いて、牛の潜在性乳房炎に関連する乳微生物叢を健康な牛と比較した。細菌群集を理解するために、様々なシークエンシング技術を利用した様々な研究が実施されているが、それらは属レベルでの微生物の同定だけに限られている[33,34,35]。PacBio SMRTシーケンスのようなシーケンシング技術は、他のシーケンシングプラットフォームと比較して、より長いリードや全長配列の生成能力、菌種レベルでの同定を可能にする分解能などの利点があるため、この調査で利用された。

1960年以来、複合生乳サンプルからの体細胞数（SCC）は広く受け入れられ、ウシの泌乳腺の炎症の実用的な尺度として[36]、また経済的損失の指標として使用されている[37]。SCCの閾値は乳房の健康状態の指標として使用され、現在も論争の的となっている [17]。その結果、南アフリカの観点から、本研究では Karzis ら [24]の基準を考慮し、SCC が 100,000 個を超え 500,000 個/mL 未満の乳牛は潜在的炎症牛と見なした。不顕性乳房炎が疑われる乳牛のマイクロバイオームを、健康な乳牛（非SCM）と比較してより深く理解するために、ウシの乳汁 DNA を利用した。両グループにおいて、ウシの生乳マイクロバイオームでは、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）が優勢であり、それらの相対量はSCMと非SCMの乳牛の生乳サンプル間で変化した。これらの知見は、ウシ[38,39]およびヒト[40]の乳房炎マイクロバイオームに関する先行研究と一致している。Proteobacteria と FirmicutesがウシのSCMで優勢な門として同定されたことがあり[41]、これは最近の知見を支持するものである。

本研究では、SCMサンプルはシュードモナス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスの複数の菌株で占められており、ポーランドで行われた生乳サンプルからの先行研究の結果を裏付けている[42]。これらの微生物群の多くは潜在的な日和見菌として活動し、代謝、宿主防御、免疫学的発達を阻害し [43]、様々な重症度の乳房感染症を引き起こす可能性がある [44]。私たちの研究では、土壌、淡水、湖沼の堆積物に見られる好気性グラム陰性菌の一種であるメチロバクテリウム属の存在も明らかになった［45］。これらの細菌は、免疫不全者の日和見感染症に関連している [46]。メチロバクテリウムは牛乳サンプルからも検出された [47]。Streptococcus属とCorynebacterium属は、両グループで優勢な属の中で相対的な存在量が高いことが判明した。S. agalactiae、S. uberis、S. dysgalactiaeなどのStreptococcus属は、乳房炎を引き起こす細菌としてよく知られている[48,49]。

S. parauberisは、以前はStreptococcus uberis type II [50]として知られていたが、サンプルの一部から検出された。牛の乳腺を侵す炎症性疾患である乳房炎を引き起こすことで最も知られており、症例の最大20%で分離される。コリネバクテリウム属も乳牛の乳房炎の原因菌として同定され、伝染性であるとよく言われている [51]。以前の研究では、中国の乳牛群894頭から得られたバルクタンクミルクサンプルにコリネバクテリウムが17.0％の頻度で検出され [52]、ブラジルの乳牛1242頭からは22.9％の頻度で検出された [53]。マイクロバイオームの多様性（αおよびβ多様性）測定により、微生物異常症は健常サンプルと疾患サンプルで異なることが明らかになった。今回の研究では、SCM牛と非SCM牛の乳サンプルから、微生物の多様性と種の豊富さに違いがあることが明らかになった。β多様性[54]もまた、SCMと非SCMの牛乳サンプル間で有意な微生物の違いを示した。

SCM 牛乳サンプルで検出された優勢な細菌種は Pseudomonas であった。この属には自然界に広く存在するグラム陰性菌が含まれ、乳製品の腐敗菌として最も頻度が高いと考えられている[55]。シュードモナス属はヒトや動物の重要な病原体とはみなされていないが、この属の多数の種がヒトや動物の疾病に関連している。これらの生物に対する適切な同定方法がないため、非病原性のシュードモナス属（P. psychrophila、P. putida、P. koreensisなど）が病原性であると誤同定されている [56]。

ラクトコッカス属菌（ラクトコッカス・ラフィノラクティスおよびラクトコッカス・ラクティス）も本研究でいくつか検出された。ラクトコッカス菌は消化器系を介してヒトに感染すると考えられている [57]。L. lactis subsp. cremorisの病原性や感染方法については、依然として不明である［58］。培養に依存しない方法を用いた他の研究では、生乳、低温殺菌乳、牛の乳房炎の生乳からラクトコッカスが検出された [59,60]。その結果、本研究ではSCMおよび非SCMサンプルにおけるラクトコッカス属の有病率を調べた。ラクトコッカス属は乳房炎乳により多く含まれることが示され、これらの細菌が疾患の原因因子である可能性が示された。

本研究ではまた、Leuconostoc mesenteroidesを発見した。このバクテリオシンは、ロイコノストック株だけでなく、様々なエンテロコッカス株やリステリア株も阻害した。乳酸菌（LAB）の大部分は、適格安全性推定リスト（QPS）や一般に安全と認められたリスト（GRAS）に掲載されており、食品の安全性を保証している [61]。しかしながら、エンテロコッカス属菌のような一部のLABは、特定のヒト感染症を引き起こし、抗生物質耐性の蔓延に関与しているため、これらの利点から除外されている[62]。また、ヒトや動物の腸内細菌叢に偏在しているため、牛乳中のこれらのLABの存在は、不衛生な生産およびヒトまたは動物の経路のいずれか、または両方の糞便汚染を示す可能性がある[63]。

この研究ではアシネトバクター属菌（A. guillouiae）も検出されたが、アシネトバクター属菌の伝播における食品の役割についてはほとんど知られていないため、これは重要である。しかし、多くの論文で、生乳や低温殺菌牛乳、乳製品、粉ミルク中にアシネトバクター属菌が存在することが報告されている [66,67] 。アシネトバクター属は自然界でよく見られる微生物である。そのため、生乳中のアシネトバクター属菌の存在は、単に汚染に起因する可能性がある。アシネトバクター属は、乳頭、乳房表面、罹患乳腺、搾乳機、輸送システム、搾乳機器の洗浄に使用される汚染水、および酪農場の環境からバルクタンクミルクを汚染する可能性がある [68]。最後に、健常乳のマイクロバイオームでは、周囲、消化管、および動物の皮膚に由来する多様な菌株が優勢であった。これらの常在細菌の病原過程はほとんど不明であるが、特に免疫不全の宿主において、多様な病原因子を作り出すことにより、乳腺および／または宿舎において、程度の差こそあれ、日和見感染を引き起こす可能性がある [69]。

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5. 結論
本研究では、16Sメタバーコード解析を用いて、SCM乳牛の乳中マイクロバイオームを非SCM乳牛の乳と比較して特徴付けた。データ解析の結果、SCM乳牛と非SCM乳牛のマイクロバイオーム組成はかなり異なることが明らかになった。本研究では、これまでの研究では報告されていなかった、生乳サンプルの特異的な支配的円形コンセンサス配列（CCS）の有意な違いを発見した。アルファ多様性解析により、SCMサンプルの微生物叢の豊富さと多様性は、非SCMサンプルよりも大きいことが示された。本研究でSCM牛の乳から観察された乳微生物叢に基づき、牛乳腺の健康管理には、生乳微生物叢の生態や潔癖性細菌および多細菌性疾患の同定などの補足情報を得ることができる詳細な疫学調査が推奨される。

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謝辞
酪農家の協力に感謝する。

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補足資料
以下の補足資料は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/vetsci10100616/s1 からダウンロードできる。表S1：DADA2パイプラインで追跡したリード数（サンプルごとのASV数、リッチネス、属レベルで分離されたASVを含む）。表S2：参照サンプルの分類学的プロファイリング。図S1：Chao1リッチネス推定値を示すアルファ多様性ボックスプロット（p = 0.47）。図S2：グループ（SCMと健常牛）ごとのACE指標を示すα多様性ボックス＝プロット（p = 0.28）。図 S3： シャノン多様性を示すアルファ多様性箱ひげ図（p = 0.58）。図 S4： シンプソンの多様性推定値を示すアルファ多様性ボックスプロット（p = 0.8）。図S5：健常群とSCM群のNMDS分析のベータ多様性（p = 0.07; F = 1.53）。図S6： SCM群と健常群に対する原理的協調分析を示す*（p = 0.05; F = 1.53）。

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資金提供声明
本研究は、南アフリカ国立研究財団（NRF）の一部助成によるものである（助成金固有の参照番号（UID）： 134137).

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著者貢献
N.G.K.およびO.T.：構想、N.G.K.：資金獲得、調査、データ管理および原案執筆、N.G.K.およびS.K.：データ解析、S.K.：ソフトウェアおよび可視化、N.G.K.、Z.T.H.K.、S.J.N.およびO.T.：執筆-校閲および編集。すべての著者が本原稿を読み、その内容に同意した。

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施設審査委員会声明
本研究は、中央工科大学応用食品安全バイオテクノロジーセンターの科学委員会により承認された。National Department of Agriculture, Land Reform and Rural Development（南アフリカ共和国）は、1984年動物疾病法35の第20条許可を発行した（許可番号12/11/1/12A（1650KL）（JD））。フリーステート大学動物研究倫理委員会は倫理的許可を発行した（UFS-AED2020/0060/21）。

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インフォームド・コンセント
本研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。

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データ利用声明
本研究の結果を裏付けるために使用されたデータは、本原稿で入手可能である。

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利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。

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脚注
免責事項／発行者注：すべての出版物に含まれる声明、意見およびデータは、著者および投稿者個人のものであり、MDPIおよび／または編集者のものではありません。MDPIおよび/または編集者は、コンテンツで言及されているアイデア、方法、指示、製品に起因する人体または財産の損害について、一切の責任を負いません。

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