コメンサルマイクロバイオームは、ケラチノサイトのHIF-1αシグナルとグルタミン代謝を誘導することにより、毛包の再生を促進する
GAOFENG WANG HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-5028-9717 , EVAN SWEREN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-6664-8174, [...], AND LUIS A. GARZA HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-6547-9695 +20著者情報・所属団体名

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サイエンスアドバンスズ
2023年1月4日
第9巻 第1号
DOI: 10.1126/sciadv.abo7555
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概要
はじめに
結果
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概要
組織傷害は幹細胞の代謝変化を誘発し、再生に影響を及ぼす可能性が高い。我々は、創傷誘発性毛包新生（WIHN）という臓器再生モデルを用いて、皮膚常在菌がケラチノサイトの代謝の主要な調節因子であることを明らかにし、細菌負荷、グルタミン代謝、および再生の間に正の相関を示すことを実証した。特に、マウス皮膚における包括的なマルチオーム解析と単一細胞のRNA配列決定により、細菌によって誘導された低酸素がケラチノサイトのグルタミン代謝を増加させ、それに伴って皮膚と毛包の再生が促進されることを明らかにした。また、ヒトの皮膚創傷では、広域抗生物質がグルタミン産生を阻害し、治癒を妨げる一因となっていることを明らかにした。これらの知見は、細菌によって誘導された代謝の変化が、幹細胞の損傷に対する耐性を向上させ、再生能力を高めるという、保存された一貫した生理的背景を明らかにするものである。マウスとヒトの皮膚マイクロバイオームによる代謝の予想外の再生調節は、損傷後の再生を強化するための重要な方法を示唆している。
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はじめに
マイクロバイオームは、恒常的な組織の維持、治癒、再生において重要な役割を担っている（1-3）。病的状態や外傷では、常在細菌が宿主の代謝を変化させることが研究で示されている（4, 5）。例えば、電離放射線に曝されると、腸内細菌のLachnospiraceaeとEnterococcaceaeはプロピオン酸とトリプトファンの代謝を促進し、宿主の造血を改善し、腸の損傷を修復することができる（6）。同様に、移植研究において、若いマウスの腸内マイクロバイオームは、FirmicutesやLachnospiraceaeの増加や酪酸代謝の促進を通じて、年老いたレシピエントマウスの腸の健康を増進させる（7）。皮膚においても、皮膚微生物は宿主の代謝調節に不可欠である（8, 9）。しかし、傷害修復時の代謝機能に対するマイクロバイオームの影響については、あまり研究が進んでいない。
私たちは以前、常在菌のマイクロバイオームが、特にインターロイキン-1β（IL-1β）シグナルを介して、皮膚再生にプラスの影響を与えることを明らかにしました（1）。皮膚の損傷が炎症を引き起こすと、免疫細胞（主にマクロファージ）がIL-1βを放出し、創傷誘発性毛包新生（WIHN）を刺激する。また、炎症性皮膚疾患や外傷では、ケラチノサイトがIL-1βを大量に発現する（10, 11）。しかし、これらの様々な条件下でケラチノサイトがIL-1βを生成するメカニズムは不明であり、代謝的な変化が原因であるかどうかも不明であった。
エネルギー代謝に関する先行研究が示すように、グルタミンはIL-1βの転写と産生に重要な代謝産物である（12, 13）。さらに、mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2)によって調節されるグルタミン代謝は、無毛期開始時に動員された後の毛包幹細胞（HFSCs）の再増殖に重要である(14)。同様に、これまでの研究で、グルタミンは毛包の重要なエネルギー源であることが示されています（15）。したがって、グルタミン代謝は、毛包新生シグナルの産生を促進し、HFSCsを直接活性化することによって、毛包再生の結節点に位置する可能性がある。しかしながら、グルタミンがより炎症促進的な作用を持つのか、それとも抗炎症的な作用を持つのかについては曖昧である(16-18)。同様に、マイクロバイオーム、グルタミン、傷害後の再生の間の正確なメカニズムもまだわかっていない。
我々は、皮膚常在菌が創傷の局所的な低酸素状態を作り出すことで、グルタミンを皮膚や毛包の再生に結びつけるのではないかと考えた。例えば、黄色ブドウ球菌は、低酸素誘導性因子-1α（HIF-1α）シグナルによりケラチノサイトのIL-1β産生を誘導する（19）。HIF-1αシグナルは、組織の低酸素状態において、微小環境の恒常性維持、特にエネルギー代謝の調節に重要な調節的役割を果たす（20, 21）。局所酸素濃度は、幹細胞の自己再生と分化に直接影響を与えることができる。造血幹細胞、神経幹細胞、ヒト胎盤細胞栄養細胞は、低酸素環境で生活することで利益を得ている (22, 23)。低酸素は、HFSCsを含む幹細胞の長期保存と維持を促進する(14, 24)。黄色ブドウ球菌は、増殖や代謝活動の過程で、微小環境中の栄養や酸素を消費して低酸素化に寄与しており（25）、皮膚細菌が代謝を調節して再生を促進する経路が示唆されている。
私たちの目的は、これらのばらばらでつながりのない要素を首尾一貫した生理学的モデルに統合し、マウスとヒトにおけるマイクロバイオームによる再生促進における代謝の役割を検証することであった。そのために、空間メタボロミクスとバイオインフォマティクスを用いて、異なる細菌負荷のもとで創傷微小環境を系統的にスクリーニングしました。その結果、グルタミン代謝が細菌負荷と正の相関を示すことを示しました。また、黄色ブドウ球菌が組織の低酸素を誘導することでHIF-1αシグナルを活性化し、それに伴ってケラチノサイトのグルタミン代謝とIL-1βの産生を増加させ、再生を促進することを明らかにした。さらに、常在菌の減少によりグルタミンレベルが低下し、ヒト被験者の創傷治癒を遅らせる。これらの未知の知見を総合すると、皮膚細菌叢によって誘導される再生促進代謝プログラムが保存されており、治療上重要な意味を持つことが示唆される。
結果
細菌はケラチノサイト依存性のIL-1β-MyD88を介してWIHNを刺激する
我々の以前の研究では、6つの皮膚微生物勾配モデルを用いて、皮膚微生物がWIHNを促進することを明らかにした。マウス皮膚常在菌の上位 5 種をスクリーニングした結果、S. aureus が最も強い WIHN 促進能を有していたことから、S. aureus を常在菌の代表として、さらにメカニズムの研究を進めた(1)。細菌負荷は、WIHNと用量反応的に相関する。標準的な実験室の特定病原体不使用（SPF）マウスと比較して、無菌（GF）マウスはWIHNが低く（fold change = -21.7, P = 5.8 × 10-8）、一方、SPFマウスにS. aureusを投与するとWIHNが高く（ fold change = 3.5, P = 2.1×10-7）（fig. S1A）なった。分類学的解析により、GF、SPF、およびS. aureus処理マウスの創傷床における細菌の相対量が、それぞれ、有意に増加することが確認された（図S1C）。SPF対照マウスとは異なり、黄色ブドウ球菌が最も多く、その他の細菌の割合はSPFマウスよりもほとんど低く、外因性黄色ブドウ球菌がその他の細菌を抑制していることが示された（図S1D）（1）。S. aureus処理創傷では、毛包再生のマーカーであるβ-cateninとHFSCsのマーカーであるKrt15が、毛包再生が始まるかさぶた剥離日0（SD0）で顕著に増加した（fig. S1B）。また、Il-1β-/-マウスの再生が悪く（fold change = -42.6, P = 2.1 × 10-7）、これはS. aureus処理では救出できないことも確認した（図S1、GおよびH）。最後に、K14-Myd88-/-マウスが野生型（WT）マウスよりも有意に低い再生能力を示し（fold change = -3.9, P = 1.0 × 10-4）、同様にS. aureusによる救済に反応しないという我々の以前の発見を検証した（図S1、IとJ）。分類学的解析の結果、K14-Myd88-/-とIl-1β-/-マウスの創傷床における細菌の相対量はWTマウスのそれよりも有意に低く、興味深い宿主-共役クロストークが示唆された（図S1E）。WTマウスの創傷床ではブドウ球菌が有意に多かったが、K14-Myd88-/-とIl-1β-/-マウスの創傷床ではPseudomonasが優勢であった（fig. S1F）。これらの結果は、皮膚マイクロバイオームがケラチノサイト依存性のIL-1β-Myd88シグナルを介してWIHNを誘導することを裏付けている。
細菌はグルタミン代謝を介してケラチノサイトのIL-1β産生を誘導する
私たちの次の目標は、細菌がIL-1βを誘導して再生を促進する仕組みを理解することであった。以前の研究では、異なる種類の細菌がToll様受容体2/3（TLR2/3）に依存しないメカニズムで毛包の再生を促進することが示され、細菌がパターン認識受容体を介してではなく、非特異的経路で再生を促進する可能性が示された。1つの可能性として、マイクロバイオームが微小環境における代謝を調節してIL-1βシグナルを促進することが考えられる（8, 9）。これを探るため、微生物負荷の異なるマウスの創傷において、脂肪酸、グルコース、糖鎖、ピルビン酸、グルタミン、グルタミン酸のエネルギー代謝をトランスクリプトームGene Ontology（GO）を用いて調べ、異なる代謝スコアを算出した（Fig. 1A）。最も有意に発現が増加した代謝経路はグルタミン代謝であり、細菌負荷とともに増加した。注目すべきは、SPF（高WIHN）マウス対GF（低WIHN）、黄色ブドウ球菌（高WIHN）対リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（低WIHN）マウスにおいて、グルタミン代謝の増加が再生能力と相関していることである（Fig. 1A）。最近の研究で、グルタミン代謝がHFSCsを活性化し、毛包のアナゲン期を促進することが示されたため、上記の2つの文脈に加え、発表文献からの第3の文脈：未処理のWTマウス（異なるマウス系統）における低（C57Bl/6J）対高（B6/FVB/SJL）WIHNでグルタミンとグルタミン酸代謝遺伝子発現を比較した (14, 26)。グルタミンおよびグルタミン酸遺伝子のほとんど、特にグルタミナーゼ（Gls）は高WIHNマウスでより高発現し、皮膚細菌負荷と正の相関があった（Fig. 1B）。GlsとGls2の発現量は高WIHN群で上昇していた（Fig.1C）。また、Gene set enrichment analysis（GSEA）により、細菌負荷が高く、再生能力の高いマウスの創傷皮膚では、グルタミンとグルタミン酸代謝が高発現することが確認された（図1, D, E）。

図1. 細菌は創傷床のグルタミン代謝を誘導する。
(A) 主成分分析（PCA）法によりマイクロアレイから算出した、GF（低WIHN）対SPF（高WIHN）およびPBS処理（WD3 50μl；低WIHN）対黄色ブドウ球菌処理（WD3上のコロニー形成単位1 × 107；高WIHN）マウスの、かさぶた剥離日（SD0）をWD14創床を用いてのエネルギー代謝のスコア。(B）低WIHN株（C57BL/6）対高WIHN株（B6/FVB/SJL）マウス；GF対SPFマウス；PBS処理対黄色ブドウ球菌処理マウスのSD0創床組織のマイクロアレイによるグルタミンおよびグルタミン酸遺伝子シグネチャーを示す。(C）定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）により検出したマウスSD0創傷床におけるGlsおよびGls2のmRNA発現（DおよびE）SD0マイクロアレイに基づくGF、SPF、PBS処理およびS. aureus処理マウスのグルタミンおよびグルタミン酸シグニチャーのGSEA。(F) WD5およびSD0において、GF、SPF、PBS投与およびS. aureus投与マウスの創床組織におけるグルタミンおよびグルタミン酸代謝物量を質量分析イメージング（MSI：左）および定量（右）により検出したもの。拡大画像は創傷床を、白色点線は表皮基底膜を示す。定量化において、各点は質量分析で測定されたグルタミンとグルタミン酸の発現量を示す。散布図およびヒストグラムグラフは平均値±SEMを示し、統計的な差を比較するために、対応のないスチューデントのt検定を用いた。SA, S. aureus.NES, 正規化濃縮スコア。
空間メタボロームの質量分析イメージング（MSI）を用いて、異なる代謝物の発現を可視化したところ、微量アミン、コレステロール、トリアシルグリセロールは、無傷の皮膚（ベースライン）、創傷時［創傷5日目（WD5）］または毛髪再生開始時（SD0；図S2、A〜C）のレベルと比較して有意に増加しないことがわかった。先行研究に基づき、没食子酸、α-ケトグルタル酸、イノシン、イノシン一リン酸、スペルミジン、スペルミンなど毛包の成長を促進する代謝物を測定した（27-30）。同様に、これらの代謝物は、試験したどの時点でも、皮膚の細菌負荷と有意に一致する傾向を示さないことが分かった（図S3、A〜F）。しかし、グルタミンおよびグルタミン酸の両レベルは、WD5およびSD0の間、高細菌負荷および高WIHNのマウスでより大きかった（図1Fおよび図S1KおよびS4A）。しかし、ベースラインにおける細菌負荷が高い場合と低い場合では、グルタミンおよびグルタミン酸レベルに有意な差は認められなかった（図S5、AおよびB）。これらのデータは、創傷時に細菌がケラチノサイトのグルタミン代謝を誘導することを示唆している。確認のため、毛包再生の開始時にマウスの創傷タンパク質を採取し、酵素結合免疫吸着法（ELISA）により、高WIHNマウスでグルタミン酸が高発現していることも検出した（Fig. 2A）。

図2. 細菌によるグルタミン代謝を介したケラチノサイトのIL-1β産生。
(A) SD0におけるGF、SPF、PBS処理マウスおよびS. aureus処理マウスのグルタミン酸発現をELISAで検出した。 (B) グルタミン、CB839（グルタミン酸生成阻害剤）またはS. aureusで処理したマウスケラチノサイト（MKC）のIL-1β mRNA発現をqRT-PCRにより検出した。DMSO、ジメチルスルホキシド。(C）ELISAによって検出されるように、FX11、UK5099、CB839、グルタミン、S. aureus、およびS. aureus上清で処理したMKCのIl-1β発現を示す。(D）qRT-PCRおよびELISAによって検出されるように、S. aureusおよびCB839で処理したマウスWD5創床組織におけるIl-1βの発現。(E）免疫蛍光法（IF）により検出される、S.aureusおよびCB839で処理したヒト包皮ケラチノサイト（HKC）におけるIL-1βタンパク質の発現。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole. (F) 傷のない皮膚とWD15ヒト皮膚のマイクロアレイにおける代謝遺伝子シグネチャー。(GおよびH）ワセリン処理およびネオスポリン処理したヒトWD15創傷床組織におけるグルタミンおよびグルタミン酸の発現を、図1と同様にMSI（H）および定量（G）により検出し、同じ統計およびグラフ化方法を用いた。n＝グループあたり3〜6の独立動物または独立ヒト試料。
グルタミン代謝がケラチノサイトのIL-1β発現に影響を与え、再生を促進するかどうかを調べるために、マウスのケラチノサイトを分離、培養し、グルタミンで処理した。その結果、グルタミンはケラチノサイトのIL-1β mRNAの発現を促進することがわかった（Fig. 2B）。グルタミナーゼ阻害剤CB839で処理したケラチノサイトは、Il-1βの発現を減少させたが（Fig. 2B）、この効果は外因性グルタミンの添加によって回復した（Fig. 2B）。我々は、in vitroでS. aureusの役割を検証しようとしたところ、S. aureusで処理したケラチノサイトがIl-1β mRNAの発現を誘導することがわかった（Fig. 2B）。注目すべきは、CB839がS. aureusによるIl-1βの発現を有意に抑制したことである（Fig. 2B）。これは、誘導がグルタミン代謝によって媒介されていることを示唆している。一方、他の代謝産物はケラチノサイトのIL-1β産生に影響を与えなかった。ラクターゼ脱水素酵素阻害剤（FX11）またはグルコース酸化阻害剤（UK5099）で処理したケラチノサイトは、ビヒクル処理した対照と比較して、IL-1βレベルが有意に減少しなかった（Fig. 2C）。しかしながら、CB839は、マウス角化細胞Il-1βタンパク質発現および放出を阻害した（図2C）。CB839はまた、黄色ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌上清によって誘導されたIl-1βタンパク質の産生を阻害し、mRNAの結果を確認した（Fig. 2C）。最後に、グルタミン代謝がIL-1βの産生に及ぼすin vivoでの影響について検討した。S. aureusはIL-1β蛋白とmRNAの産生を誘導し、CB839はその両方を抑制した（Fig.2D）。ヒトのケラチノサイトにおいても、CB839はIL-1βの産生を抑制した（Fig. 2E）。これらの結果は、皮膚細菌、特に黄色ブドウ球菌がケラチノサイトのグルタミン代謝を促進し、グルタミン代謝がケラチノサイトのIL-1βの産生に必須であることを示している。
最後に、健康な成人ボランティアを対象とした小規模試験で、膝窩部（膝の裏）の皮膚に両側のパンチ生検を行い、その後、車両（ワセリン石油ゼリー）または局所抗生物質（ネオスポリン）で処理することにより、ヒト創傷代謝に対する細菌の影響を検証した。治癒組織を採取するために、2回目の生検が行われた。トランスクリプトームの解析では、皮膚の創傷が代謝パターンの大きなシフトを誘発すること、そして創傷した皮膚ではグルタミン代謝が高度に誘導されることがわかった（Fig. 2F）。この知見は、損傷反応時にグルタミン代謝が増加することを示した先行研究（31, 32）と一致する。また、私たちの以前の研究では、抗生物質軟膏を使用すると、マウスとヒトの両方で創傷治癒速度が著しく低下し、マイクロバイオームが変化することが示されました（1, 33）。ヒトの傷のない皮膚では、グルタミン代謝、グルタミン酸代謝、細菌の相対量に左右の差はなかった（図S5、C、D）。しかし、創傷後、ネオスポリンで処理した側の細菌の総量は、ワセリンで処理した側より有意に少なかった（fig. S5D）。ワセリン処理側は、膝窩部で優占菌であるStaphylococcusが有意に増加することが特徴的であった（図S5E）。傷のない皮膚と傷のある皮膚の両方で、S. aureusとStaphylococcus epidermidisが優勢なStaphylococcus種であった（fig. S5F）。これらの結果と一致するように、抗生物質投与は、ヒト創傷床におけるグルタミン代謝遺伝子を有意に減少させた（図2F）。さらに、MSIは、抗生物質処理したヒト創傷床でグルタミンおよびグルタミン酸レベルが減少することを示した（図2、G、H、および図S4B）。これらのデータは、ヒト皮膚上の常在菌もグルタミン代謝を誘導し、再生を改善できることを示しており、我々のin vitroの結果とも一致する（1）。
グルタミン代謝はin vitroで幹細胞マーカーの発現と再生シグナルを誘導する
我々は、グルタミン代謝がケラチノサイトの再生シグナルに及ぼす影響をin vitroで検討した（1, 26, 34）。その結果、CB839はケラチノサイトの再生シグナルWnt7bとShh、幹細胞マーカーKrt15を阻害し、末端分化マーカーKrt1を誘導することがわかった（図3A）。しかし、CB839はMyd88-/-マウスとIl-1β-/-マウスのケラチノサイトではWnt7bとKrt15を抑制しなかった（Fig. 3B）。このように、グルタミンはIL-1β-MyD88シグナルを介して再生関連遺伝子を誘導する。CB839は、ヒト角化細胞における活性型β-カテニンおよびKRT15のタンパク質発現を阻害するが、KRT1のタンパク質発現を誘導する（図3C）。注目すべきは、マウス組換えIL-1β（rmIl-1β）の添加が、マウスケラチノサイトにおけるCB839によるWnt7bとShhの阻害とKrt1の促進を救うことができるということである（Fig. 3D）。これらのデータは、IL-1βがグルタミン誘導性再生遺伝子発現の下流シグナルであることを示唆している。

Fig. グルタミン代謝は、in vitroで幹細胞マーカーと再生シグナルの発現を誘導する。
(A) CB839処理マウス角化細胞（MKC）における再生マーカーWnt7b、Shh、幹細胞マーカーKrt15および分化マーカーKrt1のqRT-PCRによるmRNA発現量。(B）CB839処理したMyd88-/-およびIL-1β-/-MKCにおけるWnt7bおよびKrt15 mRNAの発現。(C）KRT15、活性型β-カテニン（ABC）、およびKRT1発現について染色したCB839処理ヒト角化細胞（HKC）の免疫蛍光（左）および定量化（右）。(D）CB839およびマウスrmIL-1β処理MKCのShh、Wnt7b、およびKrt1のmRNA発現を示す。統計学およびグラフはFig.1と同様。n＝1グループあたり3〜6匹の独立した動物または独立したヒト試料。
グルタミン酸はベースラインおよび細菌によって誘導されたWIHNに必要である
我々は、in vivoでの毛包再生に対するグルタミン代謝の影響を調査した。治癒中の傷口に外来性のグルタミンを添加すると、WIHNが誘発された（fold change = 2.2, P = 2.8 × 10-4）が、CB839はWIHNを抑制した（fold change = -3.2, P = 5.4 × 10-4）(Fig. 4A). この効果と一致するように、SD0においてグルタミンはグルタミン酸産生を誘導したが、CB839はそれを阻害した（図4B）。他の代謝経路がWIHNに影響を与えうるかどうかを判断するために、別々の細胞呼吸経路をブロックした（図S5G）。以前の研究で、乳酸代謝がHFSCsの活性化に必須であることが示されているので、FX11を用いてラクターゼデヒドロゲナーゼを阻害した(24)。FX11はベースラインのWIHNを阻害したが（fold change = -2.3, P = 1.2 × 10-4）、S. aureusによるWIHNは阻害しなかった（P = 0.30）(Fig. 4C)。したがって、乳酸代謝は毛包の再生を促進するが、細菌によって誘導される再生には重要な役割を果たさないことがわかった。WIHNに対するCB839の効果が単に代謝異常の結果ではないことを確認するために、阻害剤UK5099でピルビン酸の侵入を阻止することにより、クエン酸サイクル代謝も低下させた（図S5G）。しかし、UK5099は毛包の再生を阻害しなかった（P = 0.31）（図4D）。一方、CB839は、S. aureus誘発のWIHNを阻害した（fold change = -2.3, P = 4.9 × 10-4; Fig.4E）。また、SD0におけるベースラインおよびS. aureus誘発のグルタミン酸とIl-1βの発現を抑制した（Fig. 4F）。この知見は、マウス角化細胞をグルタミン欠損培地で培養するとグルタミン酸の発現が減少することを示した我々のin vitroのデータと一致している（図S5H）。同様に、グルタミンがない場合、細菌によって誘導されたケラチノサイトのグルタミン酸の発現も減少した（図S5H）。これらの結果を総合すると、細菌によって誘導される毛包の再生は、グルタミン代謝に依存していることが示された。最後に、グルタミン代謝によるWIHNの促進がケラチノサイト依存性であることを確認するために、骨髄系Myd88の役割を除くために、ケラチノサイトMyd88および骨髄系Myd88ノックアウトマウスを使用した。WT、Il-1β-/-、K14-Myd88-/-、LysM-Myd88-/-マウスにグルタミンを投与した。グルタミンはWTおよびLysM-Myd88-/-マウスでのみWIHNを誘導した（fold change = 2.5, P = 3.4 × 10-4）。これは、グルタミン代謝がIL-1βケラチノサイト依存性のMyd88シグナルを介して毛包の再生を促進することを示した（Fig. 4G）。

図4. グルタミン酸は、ベースラインおよびバクテリアによって誘導されたWIHNに必要である。
(A）共焦点走査レーザー顕微鏡（CLSM）（右上）、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色（右下）、および定量（左）によって検出した、PBS対照と比較したグルタミンおよびCB839処理（WD3）マウスのWIHN。赤の破線四角は再生毛包を示す。(B）ELISA法で測定したSD0マウス創傷床におけるグルタミン酸産生量。(C）黄色ブドウ球菌およびFX11処理（WD3）マウスのWIHNを、CSLM（右）および定量化（左）により検出した。(D）UK5099投与（WD3）マウスのWIHN、CSLMによる検出（右）および定量（左）。(E）黄色ブドウ球菌およびCB839投与マウスのWIHN、CSLMによる検出（右）および定量（左）。(F）ELISAにより測定した、S.aureus-およびCB839-処理マウスSD0創傷床におけるグルタミン酸およびIl-1β産生。(G）グルタミン処理または未処理のWT、Il-1β-/-、K14-Myd88-/-、およびLysM-Myd88-/-マウスのWIHN（右）と定量化（左）。統計学およびグラフはFig.1と同様。n = 3から7匹の独立した動物/グループ。
S. aureusは低酸素誘導HIF-1αシグナルを介してグルタミン代謝、IL-1β産生およびWIHNを刺激する
これまでの研究で、細菌負荷の増加、特に黄色ブドウ球菌が皮膚に低酸素を誘発することが示されている。これとは別に、低酸素誘導性HIF-1αシグナルがグルタミン代謝とIL-1β合成を促進することが研究により示されている（19, 35, 36）。我々は、細菌がグルタミン代謝を促進し、IL-1β産生を誘導するメカニズムを明らかにするため、GSEAを用いて、異なる細菌負荷下におけるヒトおよびマウスの創傷の低酸素状態を検出することを目指した。我々は、細菌負荷と再生を相関させたヒトとマウスの3つの研究、および異なるマウス系統間での高WIHNと低WIHNの4つの比較について再検討した。すべてのケースで、再生能力は低酸素性トランスクリプトームシグネチャーと相関していた（図5A）。ほとんどの低酸素関連遺伝子は、再生能の高い創傷で高発現している。Hif-1α mRNAは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により確認されたように、特に高発現していた（Fig. 5, B and C）。低酸素条件下でのケラチノサイトのグルタミン代謝とIl-1βの変化をin vitroで検討した。CB839は、通常の酸素条件下（図2B）と同様に、2％酸素下でIl-1βの発現を抑制した（図5D）。

Fig. 細菌が刺激するグルタミン代謝と低酸素誘導HIFシグナルを介したIL-1β産生。
(A and B) GF、SPF、PBS処理、S. aureus処理、低酸素のSD0創床においてマイクロアレイで検出された低酸素遺伝子のDEGs (A) と相対mRNA (B) のGSEA。aureus処理、低WIHN株（C57BL/6）、高WIHN株（B6/FVB/SJL）マウス、およびワセリンとネオスポリンで処理したヒト創傷床で検出した。 (C) GF、SPF、PBS処理およびSureus処理マウスSD0皮膚におけるqRT-PCRによるHif-1αのmRNA発現量．(D）MKCにおける低酸素条件下でのqRT-PCRによるIl-1β mRNAの発現。(E）グルタミンおよびHif-1α siRNAで処理した、または処理しないMKCにおける、ELISAによって検出されたIl-1βの発現。(F）低酸素または正常酸素条件下でHif-1α siRNAで処理した、またはHif-1α siRNAを使用しないMKCのグルタミン酸発現を、ELISAによって検出した。(G）低酸素または正常酸素条件下でHif-1α siRNAで処理したまたはHif-1α siRNAを用いないMKCのIl-1βおよびWnt7b発現を、qRT-PCRにより検出した。(H）ELISAおよびqRT-PCRによって検出された、Hif-1α siRNAで処理した、またはHif-1α siRNAを用いない黄色ブドウ球菌誘導MKCのグルタミン酸、Il-1β、Wnt7BおよびKrt7発現。Scr-siRはスクランブルsiRNAを示す。(I）CSLM（右）および定量（左）により検出された、S. aureusおよびLW6処理マウスのWIHN。赤の破線枠は再生毛包を示す。(J）黄色ブドウ球菌およびLW6投与（WD3）マウスSD0創傷床のグルタミン酸およびIl-1β発現をELISA法により検出した。グラフ化および統計はFig.1と同様。n＝1群あたり3〜6匹の独立した動物。
続いて、正常酸素（20％）および低酸素（2％酸素）条件下で、in vitroで培養したマウス角化細胞におけるグルタミン代謝およびIl-1β発現に対するHif-1αの効果を比較検討した。正常酸素下では、Hif-1α small interfering RNA（siRNA）を用いたHif-1αのノックダウン（図S5I）によりIl-1βの産生が減少したが、外因性グルタミンの添加によりこの効果は一部逆転し、グルタミン酸がHif-1αによるIL-1β産生の誘導を媒介していることが示唆された(図5E)。低酸素環境は、正常な細胞におけるレベルと比較して、ケラチノサイトのグルタミン代謝、Il-1βの発現、および再生促進Wnt7bの発現を誘導することがわかった（図5、FおよびG）。Hif-1αをノックダウンすることにより、低酸素条件下で培養したケラチノサイトのIl-1β発現を抑制した（図5G）。これらの結果は、低酸素がHIF-1αシグナルを介してグルタミン代謝を誘導し、それがIL-1βの産生と再生シグナルを誘導することを示している（図5、E〜G）。バイオインフォマティクス解析により、グルタミン酸トランスポーターであるSLC1A7は、細菌負荷が高く、WIHNが高いマウスやヒトの皮膚で高発現していることがわかった（図1Bおよび図2F）。以前の研究で、グルタミン酸トランスポーターの発現は、HIF-1αシグナルによって媒介されることが示された（37）。そこで、ケラチノサイトのSlc1a7の発現をノックダウンした。Slc1a7をノックダウンするとケラチノサイトのグルタミン酸発現は減少したが、S. aureusによって誘導されるグルタミン酸発現は有意に減少しなかった（図S5J）。したがって、他のグルタミントランスポーターは、グルタミン酸の発現がS. aureusによって刺激されたときに、代償的な役割を果たすのかもしれない。さらに、Hif-1αをサイレンシングすると、S. aureusによるグルタミン代謝と、Il-1β、再生シグナルWnt7b、幹細胞マーカーKrt7の発現も有意に減少した（図5H）。
In vivoでは、HIF-1α阻害剤LW6をマウスの創傷に注入し、WIHNを評価することにより、この知見を確認した。その結果、LW6は、ベースラインのWIHN（fold change = -5.1, P = 2.0 × 10-5）と黄色ブドウ球菌によるWIHN（fold change = -4.1, P = 2.8 × 10-6）の両方を阻害した（Fig. 5I）。同様に、LW6は、毛包再生初期の傷口におけるグルタミン酸およびIl-1βの発現を抑制した（Fig. 5J）。これらの結果は、低酸素によるHIF-1αシグナルがin vitroおよびin vivoでケラチノサイトのグルタミン代謝とIL-1β産生を刺激し、再生シグナルを誘導し、それによってWIHNを促進することを示す。
WIHN時のケラチノサイトの低酸素とグルタミン代謝
我々は、細菌がin vivoおよびin vitroでケラチノサイトの低酸素とグルタミン代謝を促進し、それがマウスやヒトの再生を誘導することを明らかにした。GSE108677（38）のもと、正常皮膚、小さな傷、大きな傷中心（WIHN）、大きな傷周辺（非WIHN）の4つの条件について、公開されているシングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）データベースでこの知見を検証した。既知のマーカーに従って、ケラチノサイト、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、末梢細胞の5種類の細胞タイプが定義されている（図S6A）(39)。これまでの研究で、創傷床のγδT細胞はFgf9を放出して真皮線維芽細胞のWntシグナルを活性化し、毛包の再生を開始するのに必要であることが示されている。その後、再上皮化（SD0）の際に、表皮ケラチノサイトが毛乳頭（HG）に合体し、Wntリガンドを放出して毛乳頭を活性化する（40, 41）。これらの細胞外シグナルは、胚に類似した毛包の形態形成を促進します。このような例から、WIHNでは免疫細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト間のコミュニケーションが重要であると考え、WIHN（創傷中心）と非WIHN（創傷周辺）の微小環境におけるケラチノサイトと他の細胞間の異なる相互作用を検討した。その結果、WIHNでは非WIHNに比べて細胞間情報伝達の強度が大きく、特に細胞間増殖因子について大きいことがわかった（図S6B）。
私たちは、ケラチノサイトに着目し、さらに詳しく調べました（図S6A、黒矢印）。マウスとヒトのバルクRNA-seqの結果と一致して、低酸素、酸化的リン酸化、グルタミン酸とグルタミン酸代謝のスコアは、正常皮膚から分離したケラチノサイトよりも創傷から分離したケラチノサイトで著しく高いことが示された。これらのスコアはまた、周辺部（非WIHN）よりも大きな創傷中心部（WIHN）で高かったことから、創傷床、特に再生毛包のケラチノサイトは、エネルギーとグルタミン代謝を高める必要があることがわかった（図S6C）。ケラチノサイトでは、低酸素症スコアがIL-1シグナル（R = 0.69, P < 2.2 × 10-16）スコアと正の相関があることが分かった（図S6D）。中心部（WIHN）と周辺部（非WIHN）のケラチノサイトを比較すると、WIHNケラチノサイトはタンパク質合成とミトコンドリア代謝経路を高度に発現し、HG発症を誘導していることがわかった。一方、非WIHNケラチノサイトは、瘢痕形成で上昇することが知られている細胞外マトリックス合成経路を高度に発現していた（図S6E）。WIHNは動的なプロセスであるため、擬似時間解析を使ってケラチノサイトの発達を再構築した（図S6F）。その結果、大きな傷、特に中心部（WIHN）では、幹細胞の潜在能力が強い発生初期にケラチノサイトが集中し、小さな傷（非WIHN）では、幹細胞の潜在能力が弱い発生後期にケラチノサイトが集中していた（図S6、FおよびG）。発生再構築遺伝子のクラスタリングを通じて、発生初期の細胞はp53、細胞周期、グルタチオン代謝、Hif-1のシグナルを高発現していることがわかった（図S6H）。また、幹細胞や発生マーカー（図S6I）、低酸素関連遺伝子（図S6J）は、仮死時間と共に減少した。これらのデータは、低酸素が幹細胞ニッチの代謝環境にとって重要であることを示した先行研究(42)と一致する。
WIHNにおける毛包の発達中の低酸素とグルタミン代謝
毛包再生中のケラチノサイトのエネルギー代謝の変化をさらに単細胞の分解能で調べ、ケラチノサイトの分化とHG発生に対する低酸素とグルタミン代謝の影響を確認するために、scRNA-seqを実施した。追加したマウス（1群5匹）で創傷中心部（WIHN）と創傷周辺部（非WIHN）を比較しました。これまでの研究で、ケラチノサイトが創傷中心に移動する前に遺伝子転写が変化することが示されており、ケラチノサイトの運命がHG発生前に決定されていることが示唆されている（41, 43）。我々は、毛包再生直前（SD0）の創床組織をシークエンス用に採取した。創傷中心部と周辺部の細胞を別々にクラスター化し、複数のマーカーを用いて異なる細胞クラスターを定義した（図6、AおよびB、および図S7、A〜D）。ケラチノサイト、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、末梢細胞の5種類の細胞が定義された（図6、A、B）。創傷中心部では、周辺部よりも異なる細胞タイプ間の相互作用が多く見られ、特に様々な細胞とケラチノサイト間のコミュニケーションが見られた（Fig. 6C and fig.）

図6. WIHNでは創傷中心部と周辺部では低酸素とグルタミン代謝が上昇している。
(AおよびB）WTマウスSD0創傷中心（高WIHN、A）およびSD0創傷周辺（非WIHN、B）のscRNA-seqによるt-SNEプロットの可視化。1サンプルにつき5匹のマウスをプールした。(C) CellChatアルゴリズムによって検出されたSD0創傷中心（上）または周辺部（下）における細胞間相互作用の全体数。太い線はより多くの相互作用があることを示す。(D) IL-6とIL-1の特異的な細胞間相互作用パターン(左)。SD0における創傷の中心部と周辺部での各細胞タイプの特異的な受信信号（右）。発信シグナルは図S7Fに示す。S7Fに示す。(E) SD0ケラチノサイトのすべての遺伝子発現プロファイル（上）または低酸素遺伝子発現プロファイル（下）のみでクラスタリングしたt-SNEプロット。(F) 創傷中心部と周辺部のケラチノサイトのGO濃縮解析。(G）創傷中心部と創傷周辺部を比較したケラチノサイトの低酸素、グルタミン、グルタミン酸代謝、IL-1シグナルのスコアをPCA法により算出した。(H）Spearman相関で解析したケラチノサイトのIL-1シグナルスコアと低酸素のスコアの相関。傷の中心部と周辺部のスコアをそれぞれ赤と青で示した。(I) 傷の中心部のケラチノサイトで、グルタミン酸スコアが高いもの（左）と低いもの（右）を比較したGO濃縮解析。グルタミン酸スコアの高低は、Materials and Methodsに詳述したようにPCA法を用いて算出した。Box plotグラフは、最小値、第1位、四分位値、中央値、第3位、最大値を示した。特に断りのない限り、Fig.1と同様に統計をとった。NADH、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型。
細胞間のコミュニケーションに関与する特定のシグナルを探索するために、様々な細胞に由来する、または影響を与えるシグナルをリストアップした（図6Dおよび図S7、FおよびG）。線維芽細胞や周皮細胞に作用する骨形成タンパク質（BMP）シグナルは、創傷の中心部で周辺部よりも大幅に弱く、一方、血管内皮細胞や線維芽細胞に作用するWntシグナルは創傷の中心部で大幅に強く、周辺部では弱くなることがわかった。これらの結果は、Wntが毛髪再生を誘導し、BMPがそれを阻害することを示す研究を支持するものである（41, 44）。ケラチノサイトに作用する全体的なIL-6シグナルは、創傷の中心部で周辺部よりもかなり強かった（図6D、赤矢印）。さらに、各細胞タイプからのIL-6シグナルは、私たちの以前の研究（図6D、左）と一致して、創傷中心部のケラチノサイトに多く作用していた（26）。また、IL-1シグナルは創傷周辺部には存在せず、創傷中心部でのみ発現していることに気づいた。この特異的な発現パターンは、ケラチノサイトがIL-1を放出し、それがオートクライン様式で作用していることを示し、前述の結果（図6D）を支持するものであった(1)。
異なるタイプの創傷細胞間の相互作用を確立した後、ケラチノサイト間の相互作用に注目した。すべての遺伝子を用いて教師なしクラスタリングを行ったところ、創傷中心部のケラチノサイトと周辺部のケラチノサイトが離れてクラスタリングし、それぞれ異なる遺伝子発現パターンを持っていることがわかった（図6E、上）。低酸素関連遺伝子セットのみを用いて教師なしクラスタリングを行った場合も、同じパターンが観察された。創傷中心部のケラチノサイトも周辺部のケラチノサイトと同様に、やはりクラスター化し、2つのグループ間の重複はほとんど見られなかった（図6E、下）。この現象は他の遺伝子セットでは起こらず（図S7H）、低酸素遺伝子発現シグネチャーが中心部と周辺部のケラチノサイトを区別する大きな要因であることが示唆された。我々は、中心部と周辺部のケラチノサイトの代謝状態を評価した。中心部と周辺部のケラチノサイトの差次発現遺伝子（DEGs）の濃縮解析の結果、中心部ではHIF-1シグナル、炭素代謝シグナル、グルタチオン代謝、アミノ酸生合成の発現が高いことがわかった（図6F）。また、中心部のケラチノサイトでは、低酸素、グルタミン代謝、IL-1シグナルのスコアが高いことがわかった（図6G）。このように、高WIHN創傷中心部のケラチノサイトは、低酸素状態やグルタミン代謝が高いようである。我々は、プロテオミクスを用いて、これらの知見を確認した。scRNA-seqデータおよび我々の以前の研究と一致して、レチノイン酸代謝、グルタミン酸代謝、およびグルタチオンは創傷中心で高く、脂肪酸代謝とグルコース代謝は低かった（図S7I）（34）。プロテオミクスデータから算出したグルタミン代謝、低酸素、IL-1シグナルスコアは創傷中心で高く、ケラチノサイトの分化スコアは低かった（図S7J）。また、低酸素スコアとIL-1シグナルスコアには正の相関があることがわかった（R = 0.67, P < 2.2 × 10-16）（図6H）。これらの結果から、高WIHN領域では、グルタミン代謝、低酸素、IL-1シグナルが高いことが、転写レベル、タンパク質レベルの両方で検証された。
創傷中心のケラチノサイトは、毛包を再生するための上皮成分の供給源であるため、解析のために単離した。グルタミン代謝の高低に関連するDEGについてGO濃縮解析を行ったところ、グルタミン代謝の高いケラチノサイトは、毛包の発達に必要なアデノシン5′-三リン酸合成、mRNA、タンパク質合成経路が強いことがわかった（図6I）。グルタミン代謝の低いケラチノサイトは、細胞外マトリックス形成、細胞間接着、細胞間結合が強く、これらは瘢痕組織の形成に必要であり、おそらくWIHNを阻害する（Fig.6I)。
異なるケラチノサイトサブタイプの運命を探るため、創傷中心部のケラチノサイトをクラスター化し、既知のマーカーに従ってラベルし、6つのサブタイプ：basal1、basal2、basal3、増殖性、有棘、およびHG（図7、AおよびB）を識別した（39, 45）。具体的には、Krt17, Lef1, Krt79, Sox9などのマーカーを用いてHGケラチノサイトを、Col17a1, Cox-2, Ube2cを用いて基底細胞および増殖ケラチノサイトをマークした（図7、A〜D）。創傷中心の他の細胞種と比較して、ケラチノサイトは、より強いIL-1とIL-6のシグナル入力と、より強いIL-1のシグナル出力を有していた（図S7K）。さらに、HGケラチノサイトは、他のケラチノサイトよりも低酸素、グルタミン、およびグルタミン酸代謝とIL-1シグナルが有意に高く、これは以前の研究（図7E）と一致した（1、14）。

図7. WIHNにおける低酸素とグルタミン代謝は、毛包の発達と相関している。
(A) SD0サンプルのscRNA-seqから創傷中心の各クラスタにおけるカノニカルケラチノサイトマーカー遺伝子のヒートマップ。(B) t-SNEプロットは、SD0創傷中心ケラチノサイト亜集団のクラスタリングを示している。(C) SD0創傷のH&E、Col17a1、Cox-2、Ube2c、Krt17染色により、basal1、basal2、増殖性、およびHGケラチノサイトの位置を確認する。スケールバー：50μm。(D) t-SNEプロットにおけるHGクラスターを同定するためのHGマーカー遺伝子の発現。(E）ケラチノサイト亜集団における低酸素、グルタミン、グルタミン酸代謝、IL-1シグナリングのスコア。(FおよびG）基底細胞、有棘細胞、増殖細胞およびHGケラチノサイトの発生パターンをプロットした疑似時間解析。(H）分化マーカーのヒートマップとシュードタイム。(I）HGマーカーであるKrt17、Krt79、Sox9の存在量をケラチノサイトのサブポピュレーションで分割して描いた疑似時間プロット。(J) 発生順序に従って、すべてのケラチノサイト（上）およびHG（下）を6つのステージに分割した疑似時間分析；異なるステージは、AからFの異なる色で示されている。箱ひげ図には、最小値、第1位、四分位値、中央値、第3位、最大値の値を示した。統計はFig.1と同様。
WIHNは動的なプロセスであるため、表皮分化の文脈における基底細胞の異なる状態を明らかにするために、擬似時間分析を用いてケラチノサイトの分化状態を算出した。発生パターンは、基底細胞、有棘細胞、増殖細胞、HGケラチノサイトの方向に沿っていた（図7、FおよびG）。シグネチャー遺伝子は、擬似時間が進むにつれて幹細胞マーカーから成熟マーカーへと変化した（図7H）。また、HGマーカーの発現は徐々に増加した（図7H、I）。HGの発生段階を6つの漸進的なステージに分けた。AからFまで（Fig. 7J）。HG細胞が発達するにつれ、低酸素とグルタミン酸の代謝は全体的に上昇傾向を示した（Fig. 7K）。また、IL-1シグナルもやや増加したが、グルコース代謝には大きな変化は見られなかった（Fig.7K）。これらの結果は、低酸素とグルタミン代謝の増加が、ケラチノサイトの幹細胞性を維持し、毛包の発達を促進することを示唆している（fig. S7L）。
考察
マイクロバイオームは、代謝に影響を与えるなど、多くの手段で宿主の健康に寄与している（6）。しかし、この分野では重要だがばらばらの研究にもかかわらず、代謝がマイクロバイオームの再生促進効果をどのように説明するのか、マウスとヒトにおける首尾一貫した統一的な生理学的メカニズムに結びつけられたことはない。私たちは前回の研究で、細菌負荷が高いほど毛包の再生が促進されることを、6群のマウスで細菌負荷の増加とともに検証しました。毛包再生誘導能は黄色ブドウ球菌が最も強いが、マウス皮膚常在菌の上位3種であるブドウ球菌、シュードモナス、ストレプトコッカスはいずれも毛包再生を誘導することが可能であった。また、TLR2やTLR3をノックアウトしても、細菌による毛包の再生促進には影響しません(1)。このように、特定のTLRセンサーとは無関係に再生を誘導できる多面的な細菌を用いた結果は、皮膚常在菌が特定の細菌の生物学的性質ではなく、非特異的かつ一般的な経路で毛包の再生を促進することを示唆しています。このモデルと一致するように、我々は、黄色ブドウ球菌が局所的な低酸素とそれに伴うグルタミン産生によって毛包の再生を非特異的に誘導するメカニズムを提案する。これらの知見は、再生におけるグルタミン代謝の重要性に未知の角度を加えるものである(35)。皮膚再生モデルでは、皮膚常在菌の微生物が創傷微小環境において低酸素を誘導し、HIF1αシグナルを活性化し、ケラチノサイトのグルタミン代謝を促進し、その結果、下流のIL-1βシグナルを活性化してWIHNを促進することが分かった。ヒトの皮膚にはWIHN現象は存在しないが、常在菌はマウスとヒトの創傷治癒速度を促進し、重複したメカニズムを示している(1)。これらの結果は、毛包の再生と創傷治癒における環境の重要性を浮き彫りにしています。
グルタミン代謝は、エネルギー代謝の効率を高めて幹細胞を活性化し、還元型グルタチオンの抗酸化作用を高めて幹細胞の生存率を高めることで再生を促進することができる（32, 35）。しかし、グルタミンが再生に影響を与えるメカニズムはまだ不明であり、例えば、グルタミンと免疫刺激との関係は曖昧である（16, 18, 46）。我々の研究は、グルタミンがケラチノサイトのIL-1βの産生を誘導することによって再生を促進することを示しており、セリンとコハク酸がIL-1βの産生を促進するという報告（いずれもグルタミン依存性）と一致している（12, 13）。他の文脈では、IL-1βの産生はまた、例えば神経系におけるグルタミン酸受容体の活性化を通じて増加する（47, 48）。一方、脳や気道でグルタミンを減らすと、IL-1βの産生と放出、および細胞の炎症が減少する（49, 50）。他の研究者は、グルタミンの外因性添加がIL-1βを増加させ、外因性IL-1βがグルタミン代謝を誘導することを示している（18, 46）。しかし、その代わりに、複数の報告が、グルタミンが免疫反応を抑制することを示している（16, 17）。我々の研究では、グルタミンをより炎症促進的な役割に位置づけ、ケラチノサイトのグルタミン代謝を阻害することでIL-1βの発現が低下することを示している。我々は、グルタミン輸送体SLC1A7を阻害すると、ケラチノサイトのベースラインのグルタミン酸を抑制できるが、S. aureusによるケラチノサイトのグルタミン酸発現は抑制できないことを見出し、他のグルタミン酸輸送体がケラチノサイトにおける細菌によるグルタミン酸輸送を補っていることを示唆するものであった。今後の研究では、グルタミン酸トランスポーターに対するバクテリアの影響をさらに調べる必要がある。しかしながら、我々の研究は、IL-1βに対するグルタミン酸の効果を、マイクロバイオームがどのように再生を促進するかという重要かつ過小評価されている生理的背景に位置づけるものである。結論として、マウスとヒトの両方において、グルタミン代謝は微小環境における炎症性因子に複雑な制御効果を及ぼし、代謝バランスの重要性を浮き彫りにしている。
fig. S5Dでは、ワセリンで処理した創傷床は、ブドウ球菌のばらつきが大きい。これは、異なるヒトボランティアの創傷における固有の免疫およびコロニー形成条件によるものと推測される。ブドウ球菌のばらつきを抑制するために、6人のボランティアにおけるブドウ球菌の存在量に対するGLS発現の相対定量をスピアマン相関分析で行ったところ、両者は高い正の相関を示した（R = 0.91, P = 0.011）。このことは、ボランティアによってばらつきはあるものの、やはりブドウ球菌がグルタミン代謝を促進するという考えを裏付ける相関関係であることを示唆している。将来的には、同一患者でこれらの絶対的な測定が行われる臨床サンプルサイズが大きくなれば、創傷床の微生物叢と代謝産物の関係をより詳細に研究できるようになるだろう。
今回の知見と我々の先行研究の両方から、IL-1βがWIHNを誘導することが示されている(1)。しかし、最近の研究では、肥満がIL-1Rシグナルを介して毛髪の減少を加速することが示され(51)、おそらく再生と恒常性維持の文脈におけるIL-1βに対する反応の違いを反映していると思われる。我々の発見と同様に、パラログIL-1αはHFSCsを活性化し、IL-36αとIL-6をアップレギュレートしてWIHNを促進することが示されている（26, 52, 53）。これらの証拠から、IL-1シグナルは皮膚損傷に対応する強力な再生促進因子であることが示唆される。
我々の研究は、この分野の将来の重要な課題を浮き彫りにしている。1つの重要な問題は、議論されているモデル間で異なる低酸素レベルの起源を決定し、検証することである（Fig.） SPFマウスはGFマウスに比べて、定着菌のために傷口の低酸素化が進んでいる可能性があるが、これは実験的に検証されなければならない。より興味深いのは、なぜマウスの系統によってWIHNに対応する創傷低酸素レベルが異なるのかを説明することである（fig. S1A）。同様に、ある種の細菌が他の細菌よりもより多くの低酸素を誘導あるいは抑制して再生を促進あるいは抑制する可能性があるかどうか、また、S. aureusを用いた我々の実験結果の一般化可能性についても、さらなる研究が必要である。もう一つの研究課題は、創傷時に軟膏を使用することが創傷床の低酸素化をどのように助長するかということである。また、低酸素が創床でのグルタミン代謝を誘導することで再生を促進することはわかったが、低酸素とIL-6などの他のWIHN促進シグナルや代謝経路との関係はまだ不明である。今後、低酸素が皮膚再生を促進する、より詳細なメカニズムが探求される必要がある。最後に、今後の重要な課題として、これらのメカニズムのいずれかが、ヒトに明確なWIHNが存在しないことの説明になるかどうかを検証することである。
皮膚マイクロバイオームがケラチノサイトのグルタミン代謝を活性化することによって皮膚や毛包の再生を促進するという我々の発見は、治療上重要な意味を持つ。局所用抗菌剤の無差別な使用は、常在菌叢による再生シグナル伝達を乱す可能性があるため、再考されるべきであろう。これらの薬剤は、細菌汚染がひどい場合、あるいは糖尿病、免疫抑制、慢性創傷など皮膚微生物叢に変化があることが分かっている患者に対して使用するのが最適である。第二に、グルタミンがIL-1β依存的に皮膚再生を誘導するという発見は、グルタミン酸またはIL-1βの単純な添加が、例えば慢性創傷において、創傷治癒を促進する可能性を示唆している。これらの経路を操作する薬剤を開発することは、今後の重要な研究課題である。さらに、我々の系では、常在菌である黄色ブドウ球菌が有益な役割を果たしているが、どの細菌が再生治癒を促進し、それらがどのように宿主因子と相互作用するかについては、今後、臨床に関連した文脈での研究が待たれるところである。このような研究は、急性および慢性の創傷に苦しむ何百万人もの患者のために、より優れた、より正確な治療法を提供することにつながると思われる。
材料と方法
動物
すべてのマウスのバックグラウンドはC57BL/6Jである。GFマウスはJohns Hopkins Bloomberg School of Public HealthのGerm-Free laboratoryから提供され、管理されたものである。SPFマウスは、Johns Hopkins School of Medicineの動物施設より提供され、飼育された。C57BL/6J, LysM-cre [B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J], Myd88fl/fl [B6.129P2(SJL)-Myd88tm1Defr/J] マウスはThe Jackson Laboratoryから入手した。LysM-creマウスとMyd88fl/flマウスを交配し、LysM-cre × MyD88fl/flマウス系統を取得した。K14-MyD88-/-マウスは、N. Archer (Johns Hopkins Medical Institutions)から提供された。Il-1β-/-マウスは、Y. Iwakura (University of Tokyo)から提供され、物質移転契約によりJohns Hopkins University School of Medicineから入手した。遺伝子型を確認するために、マウスの尾からDNAを抽出し、PCRで確認した。すべてのマウスの飼育と実験はJohns Hopkins Animal Care and Use Committeeの承認を受け、Institutional Animal Care and Use CommitteeのプロトコルMO17M298（非感染実験）とMO25M421（感染実験）に基づくものであった。
ヒト試料
ヒト皮膚サンプルは、ボランティアがインフォームドコンセントを提供した後、ヘルシンキ原則に従って取得された。すべての研究活動は、NA_00033375の下でジョンズ・ホプキンス施設審査委員会により監督された。ジョンズ・ホプキンス病院から廃棄された新生児包皮は、ケラチノサイトの分離と培養のために、以前に記述されたように収集された(34)。
簡単に言えば、7日以内に局所的な抗生物質を使用しておらず、6ヶ月以内に全身的な抗生物質を使用していない10人の成人ボランティアからの32の皮膚試料が含まれた。ボランティアは、試験開始前の24時間は洗わないように、また試験中は抗菌性石鹸の使用を控えるように依頼された。6人のボランティアから24個の皮膚サンプルを採取し、トランスクリプトーム配列と16SリボソームRNA（rRNA）配列（年齢層：18～53歳、男性3人）を決定した。18歳から53歳、男性3名、女性3名、白人2名、黒人1名、ヒスパニック2名、アジア系1名）。0日目（D0）に、両側の膝窩部から全厚パンチバイオプシー（4～5mm）を採取した。これらの試料を無傷の皮膚（ベースライン）とし、左側がワセリン群、右側がネオスポリン群とした。パンチング後、両側の膝窩部に毎日投薬を開始し、片側はワセリン、もう片側はネオスポリンで治癒するまで治療した。患者1から3は左側にネオスポリン、右側にワセリンを使用し、患者4から6は左側にワセリン、右側にネオスポリンを使用し左右の影響を除外した。ボランティアは治癒するまで毎日、包帯による傷の保護、ドレッシング材の交換、薬剤の塗布を行うよう指示された。その後、D15に部位を再診し、これらの試料を創傷皮膚（WD15）と定義した。D15に空間メタボローム質量分析のために4人のボランティアから8つの皮膚試料を採取した（年齢層：19～45歳、女性3人）。19歳から45歳、女性3名、男性1名、白人2名、アジア人2名）。これらのボランティアの傷のある皮膚と傷のない皮膚を採取し、上記のように処理した。
ヒトおよびマウス皮膚マイクロバイオームの収集
平均年齢28歳の健康な成人6名を皮膚マイクロバイオーム研究に参加させた(1)。皮膚疾患、感染症、妊娠、7日以内の局所抗生物質治療、または6ヶ月以内の全身性抗生物質治療を受けたボランティアは除外した。すべてのボランティアは、インフォームドコンセントに署名した。参加者はサンプル採取の24時間前から洗顔を控えるよう指示され、研究中は抗菌製品を使用しなかった。皮膚微生物は生検日（WD0）と再生検日（WD15）に膝窩部から採取された。前述したように，ボランティアはWD0からWD15まで毎日，片側にワセリン，もう片側にネオスポリンを使用した．20 mM tris（pH 8.0; Quality Biological, 723017）、2 mM EDTA（Sigma-Aldrich, E4884）、および 1.2% Triton X-100（Sigma-Aldrich, T9284）を含む溶解バッファであらかじめ湿らせた滅菌綿棒を微生物採取部位に40回擦り、6 cm2をカバーした。同じ準備ステップに続いて、別のスワブをブランクコントロールとして空中で振った。マウス皮膚マイクロバイオーム収集のため、まずバリカンで背中の毛を剃った。WD5では、上記のように溶解バッファーであらかじめ湿らせたスワブで創傷周辺の皮膚を40回こすり、創傷床マイクロバイオームを採取した。
WIHNモデル
すべての動物実験は、我々が以前に作成したWIHNモデルのプロトコールに従って実施した（1, 26）。すなわち、第1休止期の毛を有する体重8〜12gの21日齢の雄および雌マウスを選択した。マウスをイソフルランで麻酔し、剃毛し、無菌操作で背中の下部中央の1.44 cm2の全厚さの皮膚を剥離した。手術日をWD0とし、各実験デザインに従ってWD3に治療を行った。WD14頃、傷口のかさぶたが剥がれ落ちる。これをかさぶた剥離日（SD0）と定義し、毛髪再生が開始された時点とした。処置後24日目（WD24）に、再生された毛包の数を測定する。以前記載したように、共焦点走査レーザー顕微鏡（CLSM）を用いて、再生された毛包を可視化し、定量化した（26）。GFマウスでは、Johns Hopkins School of Public HealthのGF研究室のバブルで実施した。SPFマウスでは、Johns Hopkins School of Medicineの生物学的安全フード内で実施した。S. aureus（1×107/50μl）をWD3の痂皮下に注射した。また、WD3からSD0まで1日おきに、100 nM LW6（Selleck Chemicals）、1 mMグルタミン（Gibco）、200 nM CB839（Cayman Chemical）、500 nM FX11（Sigma-Aldrich），200 nM UK5099（Cayman Chemical）を20μl、痂皮の下に注入した。
ヒトおよびマウスケラチノサイトの分離、培養、および処理
ヒトのケラチノサイトは、先に述べたように、男性新生児の廃棄された包皮から得た(1)。包皮を切断して平らにした後、0.4％滅菌ディスパーゼII（シグマ-アルドリッチ、D4693）中に4℃で一晩置いた。翌日、滅菌鉗子を用いて表皮と真皮を分離した。続いて表皮を切開し、トリプシン-EDTA（Lonza、CC-5012）中で37℃、15分間消化した。トリプシン中和液（TNS）（Lonza、CC-5002）を使用して消化を終了させた。細胞を6μmフィルターでろ過し、2000rpmで5分間遠心分離した後、ケラチノサイト増殖培地（KGM）（Lonza、00192152）に再懸濁し、5％CO2を含む37℃の加湿インキュベーターに入れた。培地は1日おきに交換した。マウス角化細胞は、雄および雌の新生児マウスから得た。6匹の新生マウスを安楽死させ、75%エタノールで滅菌した後、皮膚を採取し、0.4%滅菌ディスパーゼII (Sigma-Aldrich, D4693) に4℃にて一晩置いた。翌日、滅菌鉗子を用いて表皮を真皮から切り離した。細胞は、ヒトのケラチノサイトについて上述したように収集した。すべての初代ケラチノサイトは、汚染細胞／不純物を除去するために少なくとも2世代にわたって継代された。マウスおよびヒトのケラチノサイトをKGM（Lonza、00192152）またはグルタミン欠損ダルベッコ改変イーグル培地（Lonza、BE12-614F）中で培養し、1×107／ml S．aureus、1 mMグルタミン（Gibco）、20 nM CB839（Cayman Chemical）、50 nM FX11（Sigma-Aldrich）、20 nM UK5099（Cayman Chemical）、またはrmIL-1β（100 ng/ml; R&D Systems）により異なる実験設計に従って処理した。siRNAトランスフェクションのために、Lipofectamine RNA iMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて、12ウェルプレートのケラチノサイトに10nM HIif-1α siRNAまたはSlc1a7 siRNA（Santa Cruz Biotechnology）-特異的またはスクランブル配列で48時間トランスフェクションさせた。低酸素実験のために、ケラチノサイトは2％O2インキュベーターで37℃、48時間培養した。
細菌株と調製
S. aureus (NRS384) を滅菌ループを用いてトリコスタチンA (TSA) 上にストリークした。37℃で一晩培養後、プレートから蛍光を発する単一コロニーを選択し、TSB（BD Bacto, 8330706）に接種し、37℃で18時間振盪した。この菌体をTSBで50倍に希釈し，さらに3時間培養して指数関数的な増殖期間に到達させた。細菌懸濁液を遠心分離し，洗浄した後，実験に必要な濃度に応じて滅菌PBSに再懸濁させた．最終濃度の細菌をTSAまたはLB上にプレーティングし、一晩培養した。コロニー形成単位数は吸光度（A600）により測定した。
組織学、免疫蛍光法、蛍光顕微鏡法
ヒトおよびマウスの皮膚サンプルを入手後、平らにして4%パラホルムアルデヒド（PFA; Thermo Fisher Scientific, J19943-K2) に素早く入れた。48時間固定した後、Johns Hopkins University Oncology Tissue Service Coreに生検を提出した。生検片はパラフィンに包埋し、4μm厚の切片にスライスした。生検切片をスライドグラスにマウントし、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。生検切片を脱パラフィンし、Target Retrieval Solutionを用いた抗原賦活に使用した。TBST［0.1％Tween20（Sigma-Aldrich、P2287）を含むトリス緩衝生理食塩水（Quality Biological、351-086-101）］で切片を洗浄し透過させた後、5％ヤギ血清および1％ウシ血清アルブミン（Fisher Bioreagents、BP9703-100）からなるブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートした。その後、抗体希釈液（Agilent Dako, S0809）に溶解した一次抗体とともに、切片を4℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は以下の通りである。Krt15（Sigma-Aldrich、HPA023910）、活性型β-カテニン（Sigma-Aldrich、05-665）、IL-1β（Abcam、Ab2105）、Krt1（Abcam、AB185628）、Krt17（Abcam、AB53707）、Cox-2（Thermo Fisher Scientific、PA5-17614）、Col17a1（Abcam、AB184996）及びUbe2c（Abcam、AB252940）であった。切片をTBSTで洗浄した後、蛍光結合した二次抗体とインキュベートした。一次抗体系統に対応するAlexa Fluor 488抗マウス免疫グロブリンG（IgG；Invitrogen、A-11001）、Alexa Fluor 488抗ラビットIgG（Invitrogen、A- 11008）、Alexa Fluor 594抗ラビットIgG（Invitrogen、A-11037）、で1時間、室内温度でインキュベートした。最後にTBST洗浄後、4′，6-diamidino-2-phenylindoleで細胞核を染色した。すべてのスライドはDFC365FX（Leica）を用いて画像化し、蛍光強度をImageJで定量化した。
ケラチノサイトの染色には、細胞を滅菌カバースライド上で培養し、インキュベーターで70％コンフルエントになるまで培養した。その後、細胞を4% PFAで20分間室温で固定し、PBSで洗浄後、0.1% Triton X-100で15分間室温でインキュベートした。ケラチノサイトのブロッキング、一次抗体と二次抗体のインキュベーション、蛍光強度の定量は、組織について上述したように実施した。
RNA単離と定量的リアルタイムPCR
ホモジナイズした新鮮なヒトとマウスの皮膚、およびヒトとマウスのケラチノサイトから、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてtotal RNAを単離した。RNA の濃度と純度は、マイクロスペクトロフォトメトリー（NanoDrop2000c, Thermo Fisher Scientific）により測定した。RNAをキット（Applied Biosystems）で相補的DNAに逆転写し、目的の遺伝子の相対発現をApplied BiosystemsのFAM色素付きTaqManプローブにより、murine Krt15 primers (Mm00492972_m1), murine Wnt7b primers (Mm01301717_m1) を含めて検出した。マウスKrt1プライマー（Mm00492992_g1）、マウスKrt7プライマー（Mm00468876_m1）、マウスHif-1αプライマー（Mm00468869_m1）、マウスShhプライマー（Mm00436528_m1）。マウスIl-1βプライマー（Mm00434228_m1）、ヒトKRT1プライマー（Hs00196158_m1）、およびヒトKRT15プライマー（Hs00856927_g1）である。発現量は構成遺伝子であるマウスRplp0 (Mm00725448_s1), ヒトRPLP0 (Hs00420895_gH), マウスβアクチン (Mm02619580_g1) と比較し、VIC色素付きTaqManプローブにより検出した。
16S rRNA 遺伝子の抽出、PCR 増幅、塩基配列の決定
16S rRNA 遺伝子の配列決定には、ヒト皮膚微生物サンプルはメリーランド州の CosmoID に、マウス皮膚微生物サンプルはミシガン大学医学部の微生物システム分子生物学研究所に送付した。16S rRNA 遺伝子の抽出、PCR 増幅、配列決定の詳細は既報の通りである(1)。
酵素結合免疫吸着測定法
各サンプルについて、72時間処理後の1×106ケラチノサイトから20μgのタンパク質を抽出した。また、WD5で各マウスの創傷床から20μgのタンパク質を抽出した。市販のアッセイキットを用いて、細胞および組織におけるグルタミン酸（Abcam、ab83389）およびIL-1β（Abcam、ab197742）の発現を定量化した。
質量分析
マウスおよびヒトの皮膚試料を液体窒素中で急速凍結し、無味ゼラチン（Oak Brook, NY）に包埋し、-80℃で一晩凍結させた。翌日、クライオスタットを用いて組織ブロックを15μmの切片にスライスした。皮膚切片は酸化インジウムスズ層でスライドグラスに接着させた。HTX Imaging M5 TM-Sprayerを用いて，α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA；10 mg/ml）マトリックスを皮膚切片に塗布した。80℃でスライスを上から下へ6回スプレーした。ノズルの噴霧能力は 100 ml/min であり，ノズルは 100 cm/min で移動させた．間隔は2mm，噴霧圧力は10psi，風速は3000ml/minで行った。ノズルと組織の距離は4 cm、乾燥時間は20秒であった。処理後の組織は、MSI分析に使用するまで真空デシケーターに入れた。
MALDI MSI
15T Solarix FT-ICR (Bruker Daltonics, Billerica, MA) をポジティブイオンモードに設定し、検出質量範囲を100から800質量/電荷比とした。レーザースポットを10μm、グレーティング距離を25μmに設定した。各ピクセルに800回の連続レーザーを照射し、マトリックスであるα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、2，5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、脂質標準混合物を用いて、ステンレス製のマトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）ターゲットで外部校正を行った。画像処理には、FtmsControl、FlexImaging、SCiLS Labを使用した。マトリックスのホットスポットの影響を低減するために、すべての化合物のスペクトルを正規化して全イオンをカウントしました。その後、MSIreaderを使用して、スライスの可視化と相対定量を行った。対照群と治療群を同じ日に処理した。
マイクロアレイおよびバイオインフォマティクス解析
GFマウス、SPFマウス、S. aureus処理マウス、PBS処理マウス、ヒト膝窩部の皮膚から得たRNAをJohns Hopkins Deep Sequence Centerへ提出した。このRNAは、メーカーの標準プロトコルに従って、ヒトおよびマウスの1.0STエキソンシークエンスによって配列決定された。オリジナルのAffymetrix CELデータは、比較のためにRobust Multichip Analysis (RMA)アルゴリズムを用いて標準化された。データは、アクセッション番号GSE158613、GSE158614、およびGSE158616でGene Expression Omnibus（GEO）にアップロードされた。
代謝スコアを算出するために、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), GSEA-Hallmark, またはGOデータベースから各代謝経路の注目遺伝子を特定し、RMA正規化法を用いて特定した各遺伝子の発現をzスコアに変換して、2群のサンプルの相対発現を既出の方法で得た(54)。主成分分析（PCA）アルゴリズムは、代謝経路における異なる遺伝子の貢献度に応じて異なる加重係数を割り当て、最終的に代謝経路の各単一遺伝子のzスコアとその対の係数を加算することで代謝スコアを得ることができる。解析コードとアルゴリズムの紹介は、GitHub IOBRパッケージ（バージョン0.99.9、アクセス日2021年6月17日）（https://github.com/IOBR/IOBR）を参照してください（55）。簡単に説明すると、PCAでは以下の方法で各サンプルの代謝スコアを算出した。
メタボリズムスコア＝∑PC1i∑PC1j
この式において、iはCox係数が正である遺伝子のzスコアであり、jはCox係数が負である遺伝子のzスコアである。GSEA 解析は GSEA のウェブサイト（http://gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）で行った。関連する生物学的プロセスおよび遺伝子は、KEGG、GSEA、GO、および公表文献から得た。
scRNA-seq とバイオインフォマティクス解析
scRNA-seq 解析には、R プログラムを使用した。自社で作成したデータセットGSE190175と外部のWIHNデータセットGSE108677を使用した。マウスのデータは、WTマウス5匹の組織をプールして2サンプル（創傷中心部と創傷周辺部）を取得し、合計12,760個の総細胞を得ました。SD0時のマウスの傷跡を採取し、傷の中心にある毛包の再生部位を傷中心、傷の周辺にある毛包の非再生部位を傷周辺と定義した。この組織をシングルセルに消化し、Johns Hopkins Medical Institute (JHMI) Deep Sequencing and Microarray Coreに送り、10×シングルセルのトランスクリプトームシーケンスを事前に実施した。創傷中心部と創傷周辺部のサンプルを別々に解析した。標準化解析のための遺伝子発現行列を得るために、Seuratパッケージ（バージョン4.0.5）を使用した。t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)関数を用いて、既知の特異的マーカーに従ったDEGsに基づいて、単一細胞をケラチノサイト、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、周皮細胞の5群にクラスタ化した。次に、ケラチノサイトは、既知のケラチノサイトマーカーに従って、basal1、basal2、basal3、増殖性、有棘、HG、不明の7つのサブタイプに分類された(39)。異なる細胞タイプまたはケラチノサイトサブタイプ間の相互作用は、RパッケージCellchat (version 1.1.3) を用いて解析した(56)。スコアの生成に使用したシグネチャー遺伝子は、KEGGまたは遺伝子セットバリエーション解析（GSVA）から得たものである。低酸素、代謝、IL-1シグナル伝達、およびケラチノサイト分化のスコアは、上記のようにPCA法を用いて算出した。GOエンリッチメント解析は、RパッケージClusterprofiler（バージョン3.11.1）を用いて実施した。擬似時間解析は、RパッケージMonocle（バージョン2.22.0）を用いて実施した。WIHNの過程で、ケラチノサイトはある状態から別の状態への移行を行い、異なる状態の遺伝子セットを発現している。この発現の動的な変化は転写制御されており、つまりある遺伝子は活性化され、他の遺伝子はサイレンシングされる。Monocleはこの遺伝子の動態を逆埋め込みグラフアルゴリズムで学習し、軌跡を構築しています。
GSE108677については、各群にプールされた雌マウス創床組織が2匹、SWD8、SWD14、large wound day 14 center (LWD14-center), LWD14-periphery の4群、計8匹のマウスと15710個の細胞が存在します。nFeature_RNA > 200、nCount_RNA > 1000、 percent.mt < 20で高品質な細胞をスクリーニングし、外来RNA、トランスファーRNA、ミトコンドリアRNAを除去しました。標準化解析のための遺伝子発現行列を得るために Seurat パッケージを使用した。次に、t-SNE 機能を用いて、DEGs に基づいて単一細胞を 14 のクラスターにグループ化した。この14のクラスターは、特定の細胞マーカーによって、ケラチノサイト、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、免疫細胞、および少数の未知の細胞の6つのグループに分けられた。低酸素、代謝、IL-1のスコアは、前述のようにPCA法を用いて算出した。スコアの生成に使用したシグネチャー遺伝子は、KEGGまたはGSVAから得た。GOエンリッチメント解析は、RパッケージClusterprofilerを使用して行った。擬似時間解析には、RパッケージMonocleを使用した。異なる細胞種の相互作用は、RパッケージCellchatを使用して解析した。
DEGsを同定するために、ケラチノサイトを創傷中心と創傷周辺に分けた。この2つのグループ間でDEGを定義するために、Rパッケージlimmaを使用した。遺伝子発現の変化を推定するために、moderated t 検定を用いた経験的ベイズアプローチを実施した。Rパッケージのlimmaによって決定されたHigh GluスコアとLow Gluスコアの間のDEGを決定するために、有意性基準（修正P値<0.05）を使用した。多重検定のためのBenjamini-Hochberg補正は、調整P値を計算するために使用された。創傷中心部および周辺部のケラチノサイト間のDEGは、同様の方法で定義した。
プロテオーム解析
簡単に説明すると、マウスSD0の傷跡を、創傷中心と創傷周辺に分け、各群3匹ずつ採取した。市販のプロトコルを用いて皮膚タンパク質を抽出し、Waters nanoACQUITY UPLCシステムとOrbitrap Fusion Tribrid質量分析計を用いてプロテオーム計測を行った。具体的な処理手順は、我々の先行研究(34)を参照することができる。プロテオーム解析には、上述のPCAアルゴリズムを用い、代謝シグネチャー遺伝子の発現に基づき代謝スコアを作成した。代謝シグネチャー遺伝子は、KEGG、Hallmark、および公表文献から取得した。
16S rRNA 遺伝子配列のバイオインフォマティクス解析
簡単に説明すると、収集した皮膚マイクロバイオームをメリーランド州のCosmoIDとミシガン大学医学部の微生物システム分子生物学研究所に送り、16S rRNAの塩基配列を決定してもらった。16S rRNA遺伝子配列の生データ解析には、先に示したようにFastx_toolkit_v0.0.14を用いた(1)。分類にはBased Taxonomic Classification Method (BLCA) とGreenGenesを用いた。QIIME2は、操作的分類単位解析とシャノン多様性に使用した。α-、β-多様性はq2-diversity pluginで算出した。β-多様性のPCAはRパッケージstats cmdscaleで作成した。マイクロバイオームデータはRパッケージggplot2により可視化した。
統計解析
in vivoおよびin vitroの代表的なデータはすべて、少なくとも3つの個別物質と2～3つの独立した実験から得られたものである。散布図と棒グラフは、平均値±SEで表示される。ボックスプロットは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示す。2群間の比較は、対応のないスチューデントのt検定で解析した。多群間比較には、パラメトリック手法として一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。統計的有意性はP値（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001）により定義し，P値は両側とした．0.05未満のP値は統計的に有意であるとみなした。NSは有意差なしを示す。相関係数は距離相関とスピアマン解析によって計算した。有意なDEGを同定するために、Benjamini-Hochberg法を適用し、P値を偽発見率に換算した。すべての統計解析はR (https://r-project.org/) を用いて行った。
謝辞
南方病院形成美容外科のChinese Skin Microbiome (CSM) Study Groupの技術サポートと、ジョンズ・ホプキンス病院皮膚科のCutaneous Translational Research Program (CTReP) の被験者整理と組織サンプル調製に感謝する。また、G. SemenzaとC. Levineには、それぞれプロジェクトと原稿についてフィードバックをいただき、広東省組織工学建設検出重点実験室には実験器具を提供していただいた。
資金提供 この研究は、National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, part of the National Institutes of Health, under R01AR074846 01 and UG3 AR079376 to L.A.G., the Thomas Provost, MD, Young Faculty Development Fund of Johns Hopkins Dermatology to L.A.G. and the National Natural Science Foundation of China (grant no. 82202468) to G.W. によって支援されてい る。
著者の貢献 コンセプト立案。著者：G.W.、L.A.G. 方法論。方法論：G.W., E.S., W.A., M.A.K., and J.C. 調査。G.W.、Y.L.、Y.X.、E.W.、M.P.A.、L.L、Y.M.、R.C、D.Z、S.L、A.L、E.D、D.K、N.K.A、L.R. Visualization: G.W.、W.A.、J.C. 監修。執筆-原案：G.W., W.A., J.C., M.A.K., E.A.G., S.K.R., and L.A.G: G.W. 執筆・査読・編集 E.A.S.，S.K.R.，L.A.G.．
競合する利益 著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。
データおよび資料の入手 データ・資料の入手：本論文の結論を得るために必要なデータはすべて論文および/または補足資料に記載されている。マイクロアレイデータは NCBI GEO: https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/ にアクセッション番号 GSE158613、GSE158614、GSE158616 で寄託されている。16S rRNA-seq データは NCBI Sequenced Read Archive (SRA): https://ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term= にアクセッション番号 PRJNA665993 および PRJNA665992 で寄託された。scRNA-seqデータは、NCBI GEOにアクセッション番号GSE190175で寄託された。公開されているscRNA-seqデータはGEOからGSE108677で取得した。
補足資料
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参考文献・注釈
1
G. Wang, E. Sweren, H. Liu, E. Wier, M. P. Alphonse, R. Chen, N. Islam, A. Li, Y. Xue, J. Chen, Y. Chen, S. Lee, Y. Wang, S. Wang, N. K. Archer, W. このような状況下において、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。Cell Host Microbe 29, 777-791.e6 (2021).

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