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セル・レポート
43巻 4号 2024年4月23日 114079号
論文
ストレス腸内におけるトリプトファン代謝の日内リズムを駆動する微生物叢

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124724004078


著者リンク オーバーレイパネルを開くCassandra E. Gheorghe 1 2 3 8, Sarah-Jane Leigh 1 2 3 8, Gabriel S.S. Tofani 1 3, Thomaz F.S. Bastiaanssen 1 3, Joshua M. ライテ 1 2 3 6、エリサ・ガルデリン 1 2、アショクマール・ゴビンダン 1 4、コナル・ストレイン 1 4、ソニア・マルティネス・ヘレロ 1 2 3 7、マイケル・S・グッドソン 5、ナンシー・ケリー＝ローネイン 5、ジョン・F・クライアン 1 3、ジェラルド・クラーク 1 2 9
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https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114079
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ハイライト

急性ストレスは微生物のトリプトファン代謝を変化させ、腸管バリアの完全性を損なう

トリプトファン代謝細菌は日内リズムを示す

宿主のトリプトファン酵素は腸内で日周リズムを示す

微生物の減少が腸管バリアと宿主のトリプトファン代謝のリズムを変化させる

まとめ
慢性ストレスは微生物叢-腸-脳軸機能を破壊し、トリプトファン代謝の変化、腸管バリア機能の障害、日内リズムの乱れと関連している。しかし、急性ストレスが腸に及ぼす影響や、それが日内生理にどのように影響されるかについては、ほとんど知られていない。ここでは、無菌マウスと抗生物質欠乏マウスを用いて、トリプトファン代謝における微生物叢依存的な振動が、ベースライン時および急性ストレスに応答して、腸管バリア機能をどのように変化させるかを理解した。セカルメタボロミクスにより、トリプトファン代謝が15分間の急性ストレスに最も反応することが同定され、ショットガンメタゲノミクスにより、リズム性を示す細菌種のほとんどがトリプトファンを代謝することが明らかになった。この結果から、急性ストレスに対する消化管反応は時間帯とマイクロバイオームに依存し、回腸ではストレス誘発性の機能的変化が、大腸ではトリプトファン代謝の変化が特徴的であることが明らかになった。

グラフィカル抄録

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キーワード
トリプトファン代謝微生物叢腸脳軸急性ストレス腸機能腸透過性概日リズム腸バリア微生物代謝産物インドール代謝産物
研究テーマ
CP: 微生物CP: 代謝
はじめに
ストレスの生理的影響はしばしば腸に現れ、微生物叢-腸-脳のコミュニケーションを変化させ、慢性的なストレス曝露が腸のバリア機能2、トリプトファン代謝3、微生物叢組成を変化させることが多くの研究で示されている4,5。トリプトファン代謝の変化は、トリプトファンとその代謝産物の循環濃度の変化、ひいては脳への利用可能性の変化につながる可能性があるため、神経精神医学的健康において特に注目されている6,7,8。しかし、慢性ストレスの「構成要素」である急性ストレスが、腸内恒常性とトリプトファン代謝の接点に及ぼす影響については、ほとんど知られていない9。

概日リズムは多くのストレス関連疾患10,11,12で障害されるため、急性ストレスの研究において重要な検討事項である13。交代勤務者、第一応答者、派遣要員は、しばしばストレスと概日リズムの障害の両方を経験し、健康やパフォーマンスに影響を及ぼす可能性がある14,15,16。腸内におけるトリプトファンの利用可能性と代謝は微生物によって制御されており、日周期の摂食パターンに依存している7。トリプトファンは、腸と脳の両方において、宿主によってキヌレニン経路またはセロトニン経路へと異化される。一方、細菌はトリプトファンをトリプタミンやインドール化合物に分解し、アリール炭化水素受容体（AhR）20,21、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーAメンバー1（TRPA1）22、プレグナンX受容体（PXR）23,24などの宿主受容体と相互作用することで、腸の生理機能、バリア機能、ホメオスタシスを変化させる。われわれは最近、急性ストレスがマウス腸内のセロトニン作動性システムを破壊するのに十分であること、そしてこうしたストレス誘発性の変化が微生物叢に依存していることを明らかにした30。

私たちは、宿主と微生物のトリプトファン代謝には日内リズムがあり、相互依存性があると仮定した。さらに、このような微生物叢に依存したトリプトファン代謝の振動が、消化管がストレスにどのように反応するかを変化させるという仮説を立てた。ここでは、ストレス暴露後の宿主と微生物のインターフェイスの指標として、急性ストレス因子に対する腸内容物および組織中のトリプトファン代謝物を定量した。さらに、微生物叢が腸管バリア機能とトリプトファン代謝の日内リズムにどのような影響を与えるかを調べた。最後に、時間帯と微生物の枯渇がどのように相互作用し、地域依存的に急性ストレスに対する腸応答を形成するかを明らかにした。

結果
急性ストレスはin vivoで腸透過性を亢進させ、腸内の宿主および微生物のトリプトファン代謝物濃度を変化させる
前臨床モデルにおいて、慢性ストレスは消化管細胞間透過性を増加させ、腸-脳軸2,5にわたるトリプトファン代謝を変化させるが、これらのプロセスが急性ストレスにどのように反応するかについてはほとんど知られていない。そこでわれわれは、4 kDaのフルオレセイン-5-イソチオシアネート（FITC）-デキストランを経口投与し、ストレス反応前後の循環FITC濃度を評価することで、従来の動物または抗生物質投与動物において、15分間の急性拘束ストレスが腸透過性に影響を与えるのに十分かどうかを調べた（図1A）。その結果、拘束によってストレス直後の生体内における細胞間透過性が一過性に上昇し、その程度は従来の動物と抗生物質投与動物で同程度であったが、拘束から75分後にはコントロールレベルに戻った（図1B；すべての統計結果は表S1に報告）。このことから、抗生物質による微生物の枯渇は、ストレスが消化管細胞間透過性に及ぼす影響を修正しないことが示唆される。

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図1. 急性ストレスはin vivoで腸透過性を増加させ、腸内の宿主および微生物のトリプトファン代謝物濃度を変化させる。

(A）マウスは、ツァイトゲーバー時間（ZT）1/ZT2の間で15分間の拘束ストレスを受ける30分前に、4 kDa FITCを経口投与された。拘束の前後に尾血を採取した。

(B) ベースラインおよびストレス後（T0, T45min, T90min, T240min）の血漿中FITC濃度（μg/mL）（n = 8 mice/群）。データは平均値±SEM；三元混合一般線形モデルで解析；灰色部分はストレス暴露を表す。

(C) (D)-(N)の実験デザイン：従来型マウス、無菌マウス、無菌コロンブスマウスは15分間の拘束を受けた。マウスはZT1-ZT7、ナイーブ（コントロール）、ストレス直後、またはストレス後45分間回復した時点で安楽死させた（n = 7マウス/群/時点）。

(D)主成分分析により、従来型マウス、無菌マウス、およびコロニー形成された無菌マウスの糞便メタボロームに対するストレス効果をβ-多様性（Aitchison距離；楕円は群95％信頼区間）で示した。データは個々のポイント。

(E）従来型マウスのストレスによって変化した糞便代謝物の濃縮解析。データはp値を変換したもので、円の大きさは濃縮率を表す。

(F-N）選択した糞便トリプトファン関連代謝物の相対発現。データは平均値±SEM、個体値を重ね合わせたもの。二元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

このダイナミックなストレス反応に関与する微生物-宿主相互作用をさらに理解するために、ストレス負荷直後および45分後に、このストレス負荷が従来型マウス、無菌マウスおよびコロニー形成無菌マウスの糞便内容物および大腸粘膜のメタボロームに変化を及ぼすかどうかを検討した（図1C）。メタボローム組成はストレスと微生物の状態によって変化することが観察されたが（図1D）、大腸粘膜のメタボローム組成は微生物の状態によってのみ影響された（図S1A）。糞便代謝物のパスウェイ濃縮解析では、トリプトファン代謝が従来型マウスの急性ストレス曝露によって最も影響を受けるパスウェイであることが同定された（図1E）。これは大腸粘膜では反映されず、システイン代謝とメチオニン代謝だけが有意に濃縮された経路であった（図S1B）。これらの結果から、ストレスによるトリプトファン代謝産物の変化は、無傷のマイクロバイオームに依存し、大腸内腔に局在することが示唆された。

個々の代謝物のレベルで解析した結果、ストレスが影響を及ぼすのは、微生物にコロニー形成されたマウスの糞便トリプトファン代謝物のみであることが確認された。主に微生物由来の代謝物であるトリプタミン（図1F）は、従来型マウスではストレスによって変化したが、インドール酢酸塩（図1G）はすべてのコロニー形成マウスでストレスによって変化した。3-ホルミリンドール（図1H）、N-アセチルトリプトファン（図1I）、インドール乳酸塩（図1J）、インドールプロピオン酸塩（図1K）は、コロニーを形成した無菌マウスにおいてストレスにより変化した。糞便内容物中の主に宿主由来のトリプトファン代謝物も、微生物コロニー形成マウスでのみストレスにより変化した（図1L-1N；その他のトリプトファン代謝物は図S2に示す）。一方、大腸ではストレスによるトリプトファン代謝物の変化はほとんど認められなかった（図S1C）。具体的には、微生物が定着したマウスの大腸粘膜では、ストレスによってインドールアセチルグリシン、インドールプロピオン酸、トリプタミンが増加したが、キサントレン酸は、無菌マウスと定着した無菌マウスの両方でストレスによって増加した。ストレス誘発性トリプトファン代謝に関しては、コロニー形成マウスと無菌マウスの間で明らかな違いが観察されたが、従来の無菌マウスとコロニー形成マウスの間では、ストレスによって異なる代謝物群が変化することはあまり明らかではなかった。これらの結果から、ストレスによるトリプトファン代謝産物の変化は、成体期のマイクロバイオームと、発育期の腸内ホメオスタシスに及ぼす影響の双方に依存することが示唆される。まとめると、腸管バリア透過性とトリプトファン代謝の両方が、急性拘束ストレスによって動的かつ一過性に変化し、後者の効果はマイクロバイオームに依存するようである。具体的には、急性ストレスは、主に微生物に依存したトリプトファン代謝物レベルを増加させる一方で、微生物にコロニー形成されたマウスの糞便内容物中の宿主由来のトリプトファン代謝物を減少させるようである。これらの影響が、吸収の変化によるものなのか、代謝の変化によるものなのかは不明である。

宿主と微生物の接点における急性ストレス反応の細胞的・分子的特徴に関する理解は限られている9。無菌状態や抗生物質による微生物叢の減少がストレス反応やそれに関連する行動に及ぼす影響は、広く特徴づけられ31,32,33、トリプトファン代謝の変化と関連している。抗生物質の効果において観察される実験間の差の一部は、時間帯による影響や、特異的な残留微生物につながる薬物-微生物叢相互作用によるものと考えられる。心理的ストレスに対する反応が時間帯によって変化すること34や、微生物量が1日の中で変動すること35は知られているが、1日の中での微生物のトリプトファン代謝についてはほとんど知られていない。そこで我々は、微生物のトリプトファン代謝と関連する腸機能の日内リズムを調べることを目的とした。

トリプトファン代謝細菌と微生物のトリプトファン代謝は、従来型マウスにおいて日内リズムを示す。
我々は、ショットガンメタゲノム解析を用いて従来型マウスの糞便マイクロバイオームの塩基配列を決定することで、このような微生物の振動を菌株レベルで調べた。私たちの実験は、このような組成振動の機能的な意味をより深く理解することを目的とした（図2A）。

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図2. トリプトファン代謝細菌および予測代謝産物は、従来型マウスの糞便内容物において日内リズムを示す。

(A）従来型マウスをZT5、ZT11、ZT17、ZT23で安楽死させ（n = 8匹/時点）、糞便内容物を採取した。

(B）細菌種の豊富さのリズム（Chao1 index）。データは平均値±SEMで、各ポイントを重ね合わせた；概日リズム性についてフーリエ分解したサインとコサイン要素に線形モデリングで解析した（Kronosパッケージ）。∗p < 0.05.

(C）主成分分析により、従来型マウスで調べたZTにおける微生物組成の違いをβ多様性（Aitchison距離；楕円は群95％信頼区間を表す）の観点から表示した。

(D)有意なリズムを持つトリプトファン代謝菌の相対量をヒートマップで示す（Kronosパッケージを用いて決定）。データはZスコアの平均値。

(E)有意にリズミカルな腸脳モジュールの相対的存在量を表すヒートマップ（Kronosパッケージを用いて決定）。データはZスコアの平均値。

(F-G）トリプトファン関連腸脳モジュール。(F)は不整脈として一元配置一般線形モデルで解析し、(G)はKronosパッケージで解析した。∗p < 0.05.

微生物種の豊富さは日内リズムを示し（図2B）、微生物叢の組成は順列多変量ANOVA評価で時間帯によって変化した（図2C）。従来のマウスでは、検出された菌株の約3％（104/3,637）が相対的存在量にリズム性を示した。注目すべきは、日内リズムを示す細菌の61％がトリプトファンを代謝する遺伝子を含んでいたことである（菌株の日内リズムを図2Dに示す）。

腸代謝モジュール（GMM）38および腸脳モジュール（GBM）39を用いて、1日のマイクロバイオームの機能的能力を調べた。GMMは、微生物のKEGGオルソログを、それぞれ宿主の代謝および中枢神経系の機能に潜在的な意味を持つ機能ギルドにグループ化したものである。103個のGMMのうち26個（図S3）、56個のGBMのうち13個（図2E）も日内リズムを示した。これらの機能は、短鎖脂肪酸合成、ヒスタミン合成と分解、一酸化窒素合成と分解に及んだ。微生物のトリプトファン分解には有意なリズムは見られなかったが、ZT17に比べてZT11で上昇していた（図2F）。さらに、キヌレニンを3-ヒドロキシ-キヌレニンに変換する微生物キヌレニン分解39は、有意に律動的であった（図2G）。宿主のキヌレニン代謝はミトコンドリア機能40、免疫および脳の恒常性41に重要である一方、3-ヒドロキシ-キヌレニンは酸化的損傷と細胞死に関連し、いくつかの精神神経疾患において上昇する42。したがって、適応的ストレス反応にはエネルギー代謝、免疫機能、神経シグナル伝達の変化が関与するため、微生物キヌレニン代謝の時差は心理的ストレスに対する感受性が高まる時期を作り出す可能性がある。トリプトファン代謝を行う生物種の変動が、微生物由来のトリプトファン代謝産物の差異につながるかどうかを評価するため、ショットガンシーケンスデータとTrpNetデータベース43を相互参照し、それらの潜在的な存在量を予測した。この解析から、予測されたトリプトファン代謝物も日内リズムを示すことがわかった（表S2）。

いくつかのトリプトファン代謝菌の相対的な存在量、微生物のトリプトファン代謝能力、および予測されたトリプトファン代謝産物のすべてが日内差を示し、これは宿主のトリプトファン代謝と消化管機能に重要な意味を持つ可能性がある。そこで我々は、宿主の消化管機能、特にトリプトファン代謝とバリア機能の日内リズムに、無傷の微生物叢が必要かどうかを明らかにすることを目的とした。

微生物叢は概日リズムとトリプトファン代謝に関与する遺伝子のリズムを調節する
微生物叢が宿主組織におけるトリプトファン代謝の日内リズムをどのように調節しているかを理解するために、従来型マウス、無菌マウス、抗生物質投与マウスから採取した肝臓、回腸、大腸組織における遺伝子発現を解析した。まず、これらの組織において、微生物の破壊が分子時計機能に関わる遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べた。その結果、抗生物質欠乏と無菌状態では、従来のマウスと比較して、3つの組織すべてで概日時計遺伝子の日内遺伝子発現が変化することがわかった（図S4A）。肝臓では（図S4B）、抗生物質欠乏はPer1の振幅を増大させ、Per2のピークをシフトさせた。一方、無菌状態は時計のリズム性の変化とPer1のリズム性の消失と関連していた。肝臓における我々の結果は、Bmal1、Clock、Per1については、従来型マウスと無菌C57BL/6マウスを用いた先行研究と一致しているが、Per2については特に異なっており、無菌状態による異なる影響が報告されている44,45。回腸では（図S4C）、抗生物質欠乏はBmal1の振幅を減少させ、Cry1のリズムをシフトさせたが、無菌状態はコアフィードバックループと転写調節因子の両方を変化させた：無菌マウスはPer1とCry2のリズムの喪失、Cry1とRoraの振幅の増加、Per2とNr1d1の位相の変化を示した。これらの結果は、回腸概日時計遺伝子に対する無菌状態の影響に関する以前の知見とも一致している46。微生物枯渇と無菌状態は、コアフィードバックループとその転写制御因子の両方において、大腸遺伝子発現に影響を与えた（図S4D）。無菌状態と抗生物質投与はともに、大腸時計のリズムの消失と、Per2、Cry1、Cry2の振幅の増大と関連していた。抗生物質による微生物の枯渇は、Nr1d1とPer1の振幅の増大と特異的に関連し、一方、無菌状態はRoraの位相シフトを引き起こした。この知見は、抗生物質カクテル投与による微生物叢の枯渇が、マウスの回腸と結腸におけるBmal1、Cry1、Per1、Per2の発現を変化させることを示した先行研究47と一致している。

次に、トリプトファン代謝と代謝物シグナル伝達を制御する宿主遺伝子が、微生物叢の破壊によってどのように変化するかを調べた。腸内では、トリプトファンは宿主によってキヌレニン経路（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ[Ido1]による）またはセロトニン経路（トリプトファン水酸化酵素[Tph1]による）のいずれかで異化される。従来のマウスでは、Ido1とTph1遺伝子の発現とリズムは部位に依存しているようである。従来型マウスの回腸では、Tph1（図3A）は日周リズムを示すが、Ido1（図3B）は日周リズムを示さないことから、回腸でトリプトファンがセロトニンに変換される際に、時間依存的な影響があることが示唆される。一方、Ido1の発現は抗生物質処理によって減少し、無菌状態によっても減少した。AhR、PXR、およびTRPA1は、微生物および宿主由来のトリプトファン代謝産物に結合することでバリア機能を調節することが示されている、腸に発現する受容体である22,23,24。AhRが微生物のトリプトファンシグナル伝達に関与していることを示唆する文献が多数あることから、AhR活性化によって制御される転写産物（チトクロームP450ファミリー1サブファミリーAメンバー1（Cyp1a1；AhR活性化に伴って転写が増加する）、AhRリプレッサー（Ahrr）、およびAhr）の発現も調べた。回腸では、すべての実験群がAhR発現にリズムを示したが（図3C）、抗生物質処理と無菌状態の両方により、休止期が活性期にシフトした。Pxr発現もまた、すべての実験群で日周リズムを示した（図3D）。無菌状態では遺伝子発現のピークが不活性期の中間にシフトし、抗生物質処理ではリズムの振幅が減少した。トリプトファン代謝物シグナル伝達に関与する他の遺伝子についても調べた： 回腸におけるTrpa1とAhrrの発現は微生物叢の破壊によって変化したが、Cyp1a1の発現は影響を受けなかった（図S5B）。一方、Cyp1a1の発現は影響を受けなかった（図S5B）。無菌状態は前者の振幅を増大させ、先端位相をシフトさせたが、無菌状態と抗生物質投与は後者の日内リズムを誘導した。まとめると、トリプトファンシグナル伝達における回腸日周リズムは、無菌状態によってのみ破壊された（図3E）。

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図3. 微生物の状態は、宿主のトリプトファン代謝および代謝物シグナル遺伝子の日内リズムを領域依存的に調節する。

通常マウス、無菌マウス、抗生物質投与マウスをZT5、ZT11、ZT17、ZT23で安楽死させた（n = 8-12マウス/時点）。

(A-J）（A-E）回腸および（F-J）結腸の相対的遺伝子発現（n = 7-10マウス/群/時点）。データは平均値±SEM；概日リズム性をフーリエ分解したサインとコサイン要素に対する線形モデリングで解析し、Tukey調整後ホック比較を行った。∗p < 0.05. 円形グラフは各群の相対的な尖頭位相と振幅を表し、実線は統計的に有意な日周リズムを表す。左側の色のついた星印は、関連する実験グループの個々のリズムを表し、右端の灰色の括弧は、日内リズムのグループ間差（グループ＊時間相互作用）を示す。回腸（E）および結腸（J）において、どのトリプトファン関連遺伝子の日内リズムが、従来のマウスに比べて無菌状態（青）または抗生物質カクテル（赤）によって有意に変化するかをまとめた図。

(K)実行された多系統関連解析の概略図。

(L-M）宿主トリプトファン関連遺伝子とKEGGパスウェイを共有する微生物機能との関連。データポイントは、従来型マウスにおける宿主遺伝子発現と微生物関連KEGG機能との間のピアソン相関係数を示す。Benjamini-Hochberg(BH)調整q<0.1および差分関連（宿主組織との傾き相互作用p<0.05）のみを含む。黄色の円：回腸、ピンクの円：結腸。

両領域において、Tph1（図3F）とIdo1（図3G）の発現は、従来型マウスでは相互のリズムを示しており（結腸でのみ有意）、トリプトファン代謝がセロトニンまたはキヌレニン経路のいずれかに向けられる時間窓が存在することを示唆している。さらに、微生物叢は大腸のトリプトファン酵素のリズムに重要な役割を果たしている。抗生物質投与と無菌状態の両方がTph1とIdo1のリズムを破壊し、全体的な遺伝子発現を減少させた。AhR発現は抗生物質処理と無菌状態によって上昇し、後者は日内リズムを誘導した（図3H）。Pxrの発現は従来のマウスではリズミカルであったが、抗生物質処理によって部分的に、また無菌状態によって完全に抑制された（図3I）。さらに、トリプトファンシグナル伝達の他の遺伝子マーカーも大腸で変化した（図S4C）：抗生物質投与はTrpa1のリズムを消失させ、無菌状態はアクロフェーズをシフトさせた。無菌状態はAhrr発現を変化させ、アクロフェーズを活性相にシフトさせた。一方、抗生物質処理はCyp1a1発現のリズミシティを誘導し、他の実験群では不整脈であった。要約すると、微生物叢の破壊は結腸におけるトリプトファン代謝とシグナル伝達の変化を誘導した（図3J）。無菌状態では、律速酵素と調べたすべての受容体経路の日内リズムが変化し、抗生物質処理ではTph1、Trpa1、Cyp1a1の発現が変化した。重要なことは、肝臓は腸で吸収された代謝物を肝門脈を介して受け取ることである。図S5Aは、肝トリプトファン代謝の日内リズムが、無菌マウスと抗生物質欠乏マウスでも、程度は低いものの、変化していることを示している。

まとめると、無菌状態と微生物枯渇は、分子時計における日周期の遺伝子発現の乱れと、消化管におけるトリプトファン代謝とシグナル伝達に関連している。無菌状態は回腸と結腸の両方で広範囲にこれらの経路を混乱させるが、微生物枯渇の影響は主に結腸で観察される。

宿主トリプトファン遺伝子発現は、微生物機能と領域依存的に相関する
宿主トリプトファン関連遺伝子発現と微生物機能との関係をさらに調べるために、知識ベースの統合アプローチ（図3Kの概略図）を用いた48。まず、腸管宿主遺伝子（Ido1、Tph1、Ahr、Ahrr、Cyp1a1）と微生物遺伝子を、対応するKEGGオルソログに変換した。宿主遺伝子とKEGGパスウェイグループを共有する微生物KEGGオルソログは、宿主とマイクロバイオームの特徴ペア間の差次的関連を評価するために相関分析を受けた。特にIdo1、Tph1、Cyp1a1はすべて回腸と結腸の微生物機能と相関していた（図3Lと3M）。いくつかの微生物-宿主遺伝子ペアは、宿主組織に基づいてばらばらの関連を示した。具体的には、回腸のIdo1は、細菌のエネルギー代謝と宿主のミトコンドリア機能の両方に重要なユビキノン生合成に関与する複数の微生物酵素と正の相関を示した。一方、大腸のTph1は微生物の葉酸生合成とだけ負の相関があった。トリプトファンは細菌によってビタミンB群に変換されるため、宿主のトリプトファン代謝は微生物の異化に伴うトリプトファンの利用可能性に影響される可能性があることから、これらの関連は予想される50。両腸領域におけるCyp1a1の発現は、微生物のメラトニン／カテコールアミン生合成およびレチノール代謝の増加、微生物のトリプトファン代謝の減少と相関していた。この所見は、Cyp1a1がトリプトファン代謝産物をリガンドとするAhRの活性化に応答して転写されるという事実と一致している。回腸Cyp1a1の発現は、微生物による解糖の変化と脂肪酸代謝の低下と関連していた。トリプトファン代謝産物はバリア機能を制御することができるため28、上皮および粘液のバリア完全性のマーカーに同様の日内変化が観察されるかどうかを調べた。

微生物状態と時間帯は、腸管バリアマーカーの遺伝子発現を部位依存的に調節する
腸管バリア機能に対する概日性の寄与を調べたこれまでの研究で、タイトジャンクションのmRNAレベルと透過性が分子時計に依存した曜日差を示すこと51,52、概日性の乱れが腸管バリア透過性を増加させること52,53が示されている。微生物叢が腸管ホメオスタシスと概日時計機能に重要な寄与をしていることは確立されているが47、微生物叢がバリア完全性の曜日差に関与しているかどうかは不明である。ここでは、腸管バリアの完全性の2つの重要な特徴である腸管上皮および粘液バリアに関連する遺伝子に対する微生物の状態の影響を調べた。回腸では、従来のマウスでは測定した遺伝子のどれにも日内リズムは見られなかった（図4A-4G）。具体的には、タイトジャンクションタンパク質1（Tjp1）遺伝子の発現（図4A）はすべての実験群間で平均的に異なっていたが、無菌状態ではオクルディン（Ocln；図4B）とクローディン-1（Cldn1；図4C）に日内変動が、抗生物質投与ではOclnとCldn5に日内リズムが誘導された（図4D）。我々の知る限り、腸におけるタイトジャンクション遺伝子発現の日内リズムを調べた研究は1つしかない。同様に、著者らは大腸のOclnとCldn1遺伝子の発現に日内変動があることを観察したが、評価した他のタイトジャンクションには日内変動はみられず、これらの日内変動における微生物叢の役割については調べていない51。回腸では、無菌状態ではMuc2にリズミカルな発現が誘導され（図4E）、抗生物質投与では、従来型マウスと比較して、Muc2とMuc3の両方でリズミカルな発現とピーク発現のシフトが誘導された（図4F）。抗生物質と無菌状態は、従来型マウスに比べて回腸のCldn5とMuc3の日内リズムを変化させたが（図4G）、回腸の遺伝子発現は従来型マウスでは日内変動を示さなかった。

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図4. 微生物の状態は腸管バリアマーカーの遺伝子発現の日内振動を部位依存的に調節する

(A-N）従来型マウス、無菌マウス、抗生物質投与マウスの（A-G）回腸および（H-N）結腸における腸管バリア機能に関与する宿主遺伝子の相対的遺伝子発現（n＝7-10マウス／群／時点）。データは平均値±SEM。概日リズムのフーリエ分解サイン・コサイン要素への線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p < 0.05. 円形グラフは各実験群の相対的なアクロフェーズと振幅を表し、実線は統計的に有意な日周リズムを表す。左側の色のついた星印は、関連する実験グループの個々のリズムを表し、右端の灰色の括弧は、日内リズムのグループ間差（グループ＊時間相互作用）を示す。要約図は、回腸（G）と結腸（N）において、どのバリア関連遺伝子の日内リズムが、従来のマウスと比較して、無菌状態（青）または抗生物質カクテル（赤）によって有意に変化するかを示している。

大腸の遺伝子発現パターンは、時間帯や微生物叢の乱れに対してより敏感であった。測定されたすべての遺伝子は、従来型マウスでは不活性期の後半にピークを持つ日内リズムを示し、微生物叢の介入によってほぼすべてが乱された。特にTjp1（図4H）とOcln（図4I）では、抗生物質投与によって全体的な発現が増加し、無菌状態によってリズムが消失した。無菌状態は大腸Cldn1の振幅を増加させピークをシフトさせたが（図4J）、微生物介入はいずれも発現全体を増加させ、Cldn5のピークを活性相にシフトさせた（図4K）。無菌状態ではMuc2（図4L）とMuc3（図4M）のリズムが逆転し、抗生物質投与では発現全体が増加し、両遺伝子ともピークが暗期の始まりにシフトした。まとめると（図4N）、無菌状態は従来型マウスと比較して、測定されたほぼすべての遺伝子においてリズムの変化を誘導したが、抗生物質投与は回腸で観察されたようにMuc3とCldn5のリズムを変化させた。全体として、抗生物質による微生物枯渇と無菌状態の両方が、腸管バリアの完全性に関与する遺伝子の日内リズムに影響を及ぼし、無菌状態の方が大腸でより多くの変化を誘発した。これらの結果は、腸管バリア関連遺伝子発現の適切な日内リズムの形成と、いったん形成されたリズムの維持における微生物叢の役割を示している。

微生物の枯渇が日中の腸管バリア機能に及ぼす影響は、投与された抗生物質によって異なる
トリプトファンをインドールに変換する重要な酵素であるトリプトファナーゼはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方で発現しているが、トリプトファン代謝に重要な他の微生物酵素（トリプトファンモノオキシゲナーゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、フェニル乳酸脱水酵素、トリプトファン合成酵素など）はあまり発現しておらず55、したがって選択的抗生物質曝露によって異なる影響を受ける可能性がある。我々の介入は時間帯と相互作用して、遺伝子発現レベルで腸管バリアの完全性に影響を与えるので、腸管バリア機能の日内変化に対する微生物枯渇の差の影響を調べた。そのために、バンコマイシン（グラム陽性菌の減少）、ゲンタマイシン（グラム陰性菌の減少）、または以前の実験で使用した広域抗生物質カクテルでマウスを処理し、電気生理学的特性と副細胞透過性を測定するウッシングチャンバー装置を用いて生体外腸管機能を評価した。これによって、これまで研究されてきたようなグローバルな透過性ではなく、回腸と結腸の違いを調べることができた。

回腸では、イオン輸送（図5A）-経上皮電気抵抗（TEER；図5B）や4 kDa FITC-デキストラン透過性（図5C）-は、従来のマウスでは日内リズムを示さなかった。短絡電流（図5A）は、抗生物質投与によってもリズミカルさを維持したが、ピークは明暗相間にシフトした。ゲンタマイシンおよびバンコマイシン単独投与は、いずれも短絡リズム性を消失させた。バンコマイシンは回腸のTEERにリズミシティを誘導し（図5B）、これは従来型マウスやゲンタマイシン投与マウスとは異なっていた。抗生物質投与は、全体として従来型マウスと比較して回腸傍細胞透過性を変化させなかった（図5C；ただし、バンコマイシンはZT17において全群と比較して透過性を有意に増加させた）。興味深いことに、このコホートのマウスでは、回腸OclnおよびCldn5（図S6A）が従来型マウスで日周リズムを示し、このリズムはすべての処置群で維持された。特に、抗生物質カクテルは全体的なOcln発現およびリズム振幅を増加させたが、ゲンタマイシンおよびバンコマイシン処置は遺伝子発現およびリズム振幅を増加させ、ピークを明暗相間にシフトさせた（一方、従来型マウスおよび抗生物質処置マウスは明相中間にピークを示した）。対照的に、Cldn5の発現は抗生物質カクテルとバンコマイシン処理によって上昇し、ゲンタマイシン処理マウスとは異なるリズムを示した。まとめると（図5D）、異なる抗生物質曝露は回腸の腸管バリア機能に独自の影響を及ぼし、抗生物質カクテルとバンコマイシンは従来のマウスと比較して機能的測定における日内リズムを変化させた。

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図5. 微生物枯渇は腸管バリア機能とトリプトファン代謝の日内リズムを乱す

(A-S）ビヒクル（従来型）、ゲンタマイシン（グラム陰性菌枯渇）、バンコマイシン（グラム陽性菌枯渇）、抗生物質カクテルを投与したマウスをZT5、ZT11、ZT17、ZT23で安楽死させた（n = 7-10マウス/時点）。回腸および結腸組織をUssingチャンバーに装着し、イオン輸送（短絡電流[Isc]）、経上皮電気抵抗（TEER）、および細胞間透過性を評価した。(A）回腸におけるIsc、（B）TEER、（C）FITC透過性。(E)結腸におけるIsc、(F)TEER、(G)FITC透過性。データは平均値±SEM；概日リズム性をフーリエ分解したサインとコサイン要素に対する線形モデリングで解析し、Tukey調整後ホック比較を行った。∗p < 0.05. 回腸（D）および結腸（H）において、ゲンタマイシン（黄色）、バンコマイシン（紫色）、または抗生物質カクテル（赤色）によって、従来のマウスと比較して有意に変化したバリア関連遺伝子の日内リズムをまとめた図。(I-M)回腸および(N-R)結腸におけるトリプトファン代謝およびシグナル伝達に関与する宿主遺伝子の相対的発現（n = 7-10マウス/群/時点）。データは平均値±SEM；概日リズム性をフーリエ分解サイン・コサイン要素に線形モデリングし、Tukey調整後ホック比較で解析。∗p < 0.05.

(S）回腸（上）および結腸（下）において、どのトリプトファン関連遺伝子の日内リズムがゲンタマイシン（黄色）、バンコマイシン（紫色）、抗生物質カクテル（赤色）によって従来のマウスと比較して有意に変化するかをまとめた図。

(TおよびU) (T)インドールおよび(U)インドール酢酸の嚢内濃度。

(V) (A)のマウスの頭蓋内容物を処理し、大きな食物の粒子と細菌を除去した後、AhRルシア細胞とインキュベートし、AhR活性を誘導する可能性を調べた。

(W）セカル上清により誘導されたAhR活性。データは平均値±SEM；概日リズム性をフーリエ分解サイン・コサイン要素に線形モデリングし、Tukey調整後ホック比較で解析。∗p < 0.05. 円形グラフは各実験群の相対的なアクロフェーズと振幅を表し、実線は統計的に有意な日周リズムを表す。左側の色のついた星印は、関連する実験グループの個々のリズムを表し、右端の灰色の括弧は、日内リズムのグループ間差（グループ＊時間相互作用）を示す。

同様に大腸においても、従来型マウスでは短絡電流のみが日周リズムを示した（図5E）。すべての抗生物質投与群では、イオン輸送のピークが活性相にシフトし、明暗期にピークが観察された従来型マウスとは対照的であった：これはゲンタマイシンおよび抗生物質カクテルで統計的に有意であった。大腸TEER（図5F）は全体的にバンコマイシン処理で上昇し、一方、傍細胞透過性（図5G）は抗生物質カクテル処理で低下した。大腸のOclnおよびCldn5発現（図S6B）は、すべての実験群でリズミカルであった：従来群と抗生物質投与群ではOcln発現のパターンが類似していたが、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンはこの遺伝子を全体的に減少させた。対照的に、すべての抗生物質処理により、Cldn5の発現は従来のレベルに比べて全体的に増加した。要約すると（図5H）、ゲンタマイシンおよび抗生物質カクテルはともに、結腸におけるイオン輸送のリズミカルな変化を誘導する一方で、バンコマイシンはタイトジャンクション遺伝子の発現に特異的な効果を誘導する。

全体として、バンコマイシンと抗生物質カクテルが腸管バリア機能と関連遺伝子発現の日内リズムに最も広範な影響を及ぼすことがわかり、グラム陽性菌の減少が観察された影響の根底にある可能性が示された。しかし、バンコマイシンと抗生物質カクテルによって誘発された観察された変化は、その治療に特有のものであることに注意すべきである。バンコマイシン治療は回腸機能と大腸遺伝子発現を変化させ、抗生物質カクテルは両領域のイオン輸送を変化させた。

微生物枯渇が日周期の腸内トリプトファン代謝に及ぼす影響は、投与した抗生物質とは無関係である。
我々の結果と文献から、トリプトファン代謝と腸管バリア機能の間に相互作用があることが示唆されたので、次にトリプトファン関連遺伝子の発現を評価し、これが観察された機能的変化と関連しているかどうかを調べた。測定した遺伝子のうち回腸では、従来型マウスで日内リズムを示したのはIdo1のみであった（図5I-5M）。具体的には、Tph1（図5I）はすべての抗生物質曝露によって従来型マウスに比べて全体的に増加したが、Ido1遺伝子発現（図5J）は抗生物質カクテルとゲンタマイシン投与の両方で減少した。Ido1のリズムは、抗生物質カクテルで処理したマウスでは維持されたが、バンコマイシンとゲンタマイシンでは消失した。Ahr（図5K）、Pxr（図5L）、およびTrpa1（図5M）はすべて、回腸のバンコマイシンおよび抗生物質カクテル処理によって全体的に増加した。さらに、バンコマイシンはAhrとTrpa1に、ゲンタマイシンはAhrに、抗生物質カクテルはPxrとTrpa1にリズミシティを誘導した。さらにAhRシグナル伝達経路に関与する遺伝子を調べたところ（図S7A）、ゲンタマイシンおよび抗生物質カクテルはAhrr遺伝子発現にリズミシティを誘導し、バンコマイシンはCyp1a1にリズミシティを誘導した。Ahrrの発現は、平均してすべての実験グループ間で異なっていた。まとめると（図5S）、すべての抗生物質投与は、回腸におけるトリプトファン関連受容体の日内リズムを従来のマウスと比較して変化させたが、各抗生物質投与は独自の効果を誘導した。

大腸では、評価した遺伝子のうち、Ido1、Pxr、Trpa1が従来型マウスで日内リズムを示した（図5N-5R）。大腸Tph1はすべての抗生物質処理によって全体的に減少した（図5N）が、Ido1の発現はバンコマイシンおよび抗生物質カクテルによって特異的に減少した（図5O）。同様に、Ahr発現はバンコマイシンおよび抗生物質カクテルの両方によって低下した（図5P）。バンコマイシンとゲンタマイシンはPxrの日内リズムを消失させたが、これは抗生物質カクテルの影響を受けなかった（図5Q）。Trpa1はすべての実験群でリズミカルであり、すべての抗生物質処理で遺伝子発現全体が減少した（図5R）。AhrrおよびCyp1a1もまた、結腸における抗生物質投与によって変化した（図S7B）：すべての抗生物質投与によってAhrr発現全体が減少し、ゲンタマイシンおよび抗生物質カクテルは、従来型マウスおよびバンコマイシン投与マウスで観察された日内リズムを消失させた。対照的に、Cyp1a1の発現はバンコマイシンとゲンタマイシンの両方によって全体的に減少した。一方、抗生物質カクテルは不活性期には同様の減少を誘導したが、活動期には従来のマウスと変わらなかった。結論として（図5S）、バンコマイシンおよび抗生物質カクテルは結腸におけるIdo1発現の日内リズムを変化させ、一方、ゲンタマイシンは従来型マウスのみと比較してAhrrのリズムを変化させた。

次に、グラム陽性またはグラム陰性微生物を標的とした異なる抗生物質曝露が、急性ストレスによって変化することを以前に示した微生物由来のトリプトファン代謝物レベルに及ぼす影響を調べた。具体的には、糞便中のインドールとインドール酢酸濃度を調べた。従来のマウスでは、糞便中のインドール濃度は日内リズムを示したが、これはすべての抗生物質処理によって破壊された（図5T）；さらに、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンは糞便中のインドール濃度を全体的に減少させた。さらに、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンは、糞便インドール含量を全体的に減少させた（図5U）。糞便インドール酢酸は、いずれの実験群でも日内リズムを示さなかったが、従来型マウスと比較して、バンコマイシンおよび抗生物質カクテルによって上昇し、ゲンタマイシンによって減少した（図5U）。また、回腸で評価したすべてのトリプトファン代謝産物関連受容体遺伝子発現は、広域スペクトルおよびグラム陽性菌の除去によって増加したことから、これらのマウスの回腸内容物がAhRを活性化する能力を調べた（図5V）。すべての抗生物質投与群は、このアッセイで誘発される発光を用量依存的に減少させ（図5W）、抗生物質カクテルで最大の効果が観察された。しかし、これらの変化は概日リズムを示さず、バンコマイシンで観察された独特の機能的および遺伝子発現の障害を説明することはできなかった。

要約すると、標的微生物および広域微生物枯渇の両方が、腸管バリア機能と関連遺伝子発現に1日中影響を及ぼすことが明らかになった。TEERはバンコマイシン処理によって両方の腸領域で変化したが、バンコマイシンは回腸のみにおいて傍細胞透過性に影響を及ぼした。すべての抗生物質曝露は、セロトニン合成をより近位にシフトさせるようであり、回腸と結腸でそれぞれTph1が増加および減少したことが示す一方、キヌレニン産生に関連する遺伝子は両方の腸領域で減少した。これらの機能的および遺伝子発現的変化は、腸管上皮におけるAhR活性を介するものではなさそうである。

急性拘束ストレスは回腸の腸管バリア機能を変化させる
次に、腸管バリア機能と宿主トリプトファン代謝の日内リズムに対する微生物枯渇の影響が、急性拘束ストレスに対する腸管反応において重要な因子であるかどうかを調べた。心理的ストレッサーに対する急性ストレス応答は、これらのフェーズで異なることが知られており13、また、これらの時間帯は、われわれが注目する指標のピーク発現が最も頻繁に観察される場所であったことから、われわれは活動期と不活発期の間の移行期（ZT11とZT23；図6A）に注目した。

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図6. 急性拘束ストレスは回腸の腸管バリア機能を変化させる

(A）抗生物質カクテルを投与したマウスをZT11またはZT23で急性拘束し、45分後に安楽死させた（n = 8-12マウス/時点）。回腸および結腸組織をUssingチャンバーに装着し、イオン輸送（Isc）、TEER、および細胞外透過性を評価した。

(B-D）回腸におけるIsc（B）、TEER（C）、FITC（D）の透過性。データは平均値±SEMで、各ポイントを重ね合わせた；三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p＜0.05、p＜0.01、p＜0.001。

(E-G）結腸におけるIsc（E）、TEER（F）、FITC（G）の透過性。データは平均値±SEMで、個々の点を重ね合わせ、三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析した。∗p＜0.05、p＜0.01、p＜0.001。

(H-K)回腸と大腸の宿主遺伝子の相対的発現（n = 7-10マウス/群/時点）。データは平均値±SEMで、各ポイントを重ね合わせ、三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

(L)回腸（薄いピンク）と結腸（マゼンタ）において、どのバリア関連指標の日内リズムがストレスによってナイーブマウスに比べて有意に変化するかをまとめた図。

回腸では、イオン輸送（図6B）は抗生物質投与や急性ストレスの影響を受けなかったが、TEER（図6C）はストレスによって全体的に減少した。細胞外透過性（図6D）はストレスにより増加し、投与と時間帯の間で有意な相互作用を示した。従来のマウスでは、ストレスはZT23で透過性を特異的に増加させたが、抗生物質投与マウスではZT11でのみ透過性を増加させた。このことは、微生物叢が時間帯と相互作用して、急性ストレスが細胞外透過性に及ぼす影響を調節している可能性を示唆している。対照的に、大腸イオン輸送（図6E）は概日効果のみを示したが、TEER（図6F）はZT23で増加し、抗生物質曝露により増加したが、ストレスの影響は認められなかった。大腸傍細胞透過性（図6G）は時間帯によって影響を受け、ZT11で透過性が増加した。

この実験で評価した遺伝子のうち、ストレスによって変化したのは限られた数だけであった。回腸Ocln発現（図6H）は、処理と時間帯の間で有意な相互作用を示した：抗生物質処理はZT23でのみOcln発現を増加させた。対照的に、Cldn5はいかなる介入によっても影響を受けなかった（図6I）。結腸では、Ocln遺伝子発現（図6J）はストレスにより減少し、全体としてZT23で増加したが、Cldn5遺伝子発現（図6K）は抗生物質処理により減少し、ZT23で増加した。まとめると（図6L）、ストレスに応答した機能的な腸管バリアーの変化は回腸で特異的に観察され、時間帯に依存しないようであったのに対し、結腸での変化はOcln遺伝子発現の減少に限られていた。このような大腸での遺伝子発現の変化が、別の時点における機能的な違いにつながるかどうかは、まだ不明である。

急性拘束ストレスは時間帯や腸内細菌叢と相互作用して、微生物と宿主のトリプトファン代謝マーカーを変化させる
急性ストレスが糞便内容物のトリプトファン代謝物レベルを変化させることが示されたので（図1）、トリプトファン代謝に関連する宿主遺伝子が拘束、時間帯、微生物枯渇によって変化するかどうかも調べた。回腸では、Tph1（図7A）およびIdo1（図7B）遺伝子の発現が、処理と時間帯の間に相互作用を示した：抗生物質曝露は、ZT23よりもZT11で、これらの遺伝子の発現をより大きく減少させた。Ahr発現は影響を受けなかったが（図S8A）、Cyp1a1は急性ストレスにより増加し（図7C）、ストレスマウスの回腸におけるAhR活性の増加を示した。回腸のAhrr発現は、抗生物質がZT23よりもZT11でより強い効果を誘導する、時間帯と処置の間の相互作用を示した（図S8A）。

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図7. 急性拘束ストレスは微生物と宿主のトリプトファン代謝とシグナル伝達を変化させる

抗生物質カクテルを投与したマウスにZT11またはZT23で急性拘束ストレスを与え、45分後に安楽死させた（n = 8-12マウス/時点）。

(A-F）（A-C）回腸および（D-F）結腸におけるトリプトファン代謝およびシグナル伝達に関与する宿主遺伝子の相対的遺伝子発現（n = 7-10マウス/群/時点）。データは平均値±SEM。三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

(GおよびH) (G)インドールおよび(H)インドール酢酸のセカール濃度。データは平均値±SEM；三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

(IとJ）ZT11とZT23におけるセカルスーパーナタント誘導AhR活性。データは平均値±SEM；三元配置一般線形モデリングとTukey調整後ホック比較で解析。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

(K)回腸（薄いピンク）と大腸（マゼンタ）において、どのトリプトファン関連遺伝子の日内リズムがストレスによってナイーブマウスに比べて有意に変化するかをまとめた図。

大腸Tph1遺伝子発現（図7D）は、処置とストレスの間で有意な相互作用を示した： Tph1発現は通常マウスではストレスにより減少したが、抗生物質投与マウスではストレスにより増加した。Ido1遺伝子発現（図7E）は抗生物質処理により低下し、ZT23では全体的に低下した。Ahr遺伝子発現（図S8B）は抗生物質処理により減少したが、大腸Cyp1a1は処理、ストレス、および時間帯の相互作用による有意な効果を示した（図7F）：ストレスはZT11で従来型マウスのCyp1a1を増加させ、ZT23で抗生物質処理マウスのCyp1a1を増加させるようであった。

次に、急性の拘束ストレスが糞便内容物のトリプトファン代謝産生を変化させるという我々の知見（図1）が、1日中一貫して当てはまるかどうかを確認した。ここでは、糞便内容物中のインドールとインドール酢酸濃度に注目した。その結果、糞便中のインドールはストレスによって全体的に増加し、ZT23では平均濃度が低くなった（図7G）。一方、糞便中のインドール酢酸はストレスや時間帯による差はなかったが、抗生物質カクテル投与により増加した（図7H）。糞便インドール含量にストレスによる違いが認められたので、ストレスマウスから採取した糞便上清がin vitroでAhR活性を上昇させるかどうかを評価した（図7Iおよび7J）。従来のマウスの糞便内容物は、抗生物質処理マウスや無菌マウスのものより多くのAhR活性を誘導したが、ZT11（図7I）やZT23（図7J）ではストレスの影響は観察されなかった。

まとめると、急性ストレスはTEERの機能的変化を引き起こし、時間帯と相互作用して、回腸において特に副細胞透過性の障害を誘導する。これらはCyp1a1発現の変化、および糞便インドール濃度の変化と関連しており、ストレスに応答して特異的なトリプトファン代謝産物の産生が増加することを示唆していた（図7K；図1の所見と一致）。しかし、ストレスを受けたマウスの糞便上清はin vitroではAhR活性を変化させなかった。これらの実験では結腸機能はストレスによる影響を受けなかったが、Tph1およびOcln遺伝子発現の変化は、ストレスによって腸のホメオスタシスとバリア調節に変化が生じたことを示している。

考察
急性ストレスは慢性ストレスの構成要素であるが、宿主と微生物のインターフェースにおける急性ストレス応答の細胞および分子的特徴についてはほとんど知られていない9。宿主のストレス応答における微生物叢の役割について、より詳しく説明することが、理解を深めるために必要である。それ以来、腸管上皮の腸内分泌細胞と微生物のトリプトファン代謝産物との間のクロストークが証明され、宿主のトリプトファン代謝、マイクロバイオーム、腸管バリア機能の間の共生関係が示唆されている。さらに、腸管上皮細胞の時計は、微生物のリズム、組成、宿主の腸管ホメオスタシスを駆動する上で重要である36。本研究では、微生物の視点を取り入れることで、ストレス暴露と概日リズムの乱れの相互作用を支えるメカニズムの理解を深めることができることを実証した。

我々は、急性ストレス暴露が腸内の宿主トリプトファン分解に部位依存的に影響することを明らかにしている30。本研究では、15分間のストレス負荷が、細菌コロニー形成マウスにおいてセカルトリプトファン代謝を変化させ、微生物の状態とは無関係にin vivo透過性を増加させるのに十分であることを示し、急性心理学的ストレス負荷が腸管内腔における微生物由来の代謝産物の産生に影響しうることを示している。我々のストレスプロトコールが腸管透過性に及ぼす影響は、より長時間のストレッサー（1～4時間）を用いた先行研究58,59,60,61,62とほぼ一致している。

我々の研究は、腸管バリア機能と宿主のトリプトファン代謝における正常な日内リズムのために、微生物叢が重要な役割を果たしていることを補強している。微生物叢集団は概日リズムを発現しており、19,35。本研究は、このような日内リズムが菌株レベルでも存在することを証明するもので、同定された菌株の約3％が従来型動物で日内リズムを示し、そのうち半数以上がトリプトファンを代謝することができた。我々は、推定される微生物のトリプトファンおよびキヌレニン分解が、時間帯によって違いを示すことを見出した。微生物のトリプトファンリガンドは宿主のトリプトファン代謝に関与しており、腸管バリア機能を調節する受容体（AhR、63,64 TRPA1、22、PXR65）に結合することが知られているので、微生物叢の破壊が関連遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを調べた。興味深いことに、これら3つの受容体の回腸でのmRNA発現は、抗生物質フルカクテルおよびバンコマイシン処理（グラム陽性菌の減少）による微生物叢の減少後に、ビヒクルまたはゲンタマイシン（グラム陰性菌の減少）と比較して上昇した。このことから、これらのレセプターのアップレギュレーションは、グラム陰性菌の存在、あるいは抗生物質耐性微生物の過剰増殖に反応していると考えられる。インドールおよびインドール酢酸の糞便中濃度を定量したところ、前者は抗生物質曝露によって阻害されたが、後者はフル抗生物質カクテルおよびバンコマイシン処理の両方で上昇した。これらの結果から、特定の抗生物質処理によって微生物のトリプトファン代謝がどのように変化するのか、ショットガンメタゲノム解析やメタボローム解析によってさらに明らかにする必要がある。

微生物のトリプトファン代謝産物は、AhRを介して腸管バリア機能66や免疫シグナル伝達63に作用することが以前から示されているため、われわれは実験グループの糞便代謝産物が、時間帯に依存した形でAhRを介したCyp1a1転写を増加させるかどうかを評価した。興味深いことに、抗生物質の一部または全部を投与したマウスの糞便上清で処理した細胞では、AhR活性が用量依存的に低下した。しかし、AhRを介したCyp1a1の転写は、ストレス動物から採取した糞便上清では増加しなかった。回腸のCyp1a1発現の違いは、糞便内容物に直接さらされない特定の細胞タイプにおけるAhR活性の変化によるものかもしれないし、ストレスによって特定のAhRリガンドの吸収が変化したのかもしれない。今後の実験では、シングルセルアプローチを用いてAhR活性化が起こっている場所を特定するか、サーカディアン遺伝子またはAhRノックアウトマウスを利用すべきである。これらのアプローチにより、in vivo実験とex vivo実験の違いがさらに解決されるかもしれない。さらに、特定の微生物の役割、あるいは欠落した微生物の代替を調べることは、ストレスによって誘発される消化管機能障害を改善する治療戦略を開発する上で極めて重要であろう。

TPH1とIDO1は、それぞれセロトニン経路またはキヌレニン経路へのトリプトファン変換を担う宿主酵素である。IDO1は免疫調節性68であり、粘膜部位における宿主-微生物共生関係において重要な役割を果たすことが知られている63。ここでは、大腸のIdo1とTph1のリズムが、転写レベルで微生物の存在に依存していることを示している。同様に、これまでの研究では、細菌の代謝産物がIdo1の発現を調節すること、69 大腸のTph1レベルが従来のマウスと比較して無菌マウスでは異なること、70 特定の細菌が宿主のセロトニン生合成を増加させることが示されている。25 対照的に、我々は、微生物集団の変化が大腸のセロトニン産生を阻害し、回腸のセロトニン合成を増加させる可能性があることを示した。

研究の限界
日内変動は、研究されたパラメータに対する強い概日性の影響を示唆している。今後の研究では、サーカディアンディスラプションまたはノックアウトモデルを用いて、今回の知見を検証する必要がある。ストレスに関連する消化管障害は雌に多く71、また性差は微生物の概日リズムに影響を及ぼすため、雌マウスにおけるストレス誘発透過性変化の特徴を明らかにすることに重点を置くことは極めて重要である19。無菌マウスと抗生物質処理マウスを用いた実験における差異は、遺伝子発現の生物地理学的パターンに影響を及ぼす異なる供給者およびコロニー形成状態による初期微生物叢の違いに起因する可能性がある。さらに、分岐鎖脂肪酸や二次胆汁酸など、他の微生物代謝産物の概日変動についても、急性ストレス暴露との関連で調べる必要がある。

結論
宿主トリプトファンの代謝と利用可能性は、神経精神、胃腸、免疫、代謝の健康に不可欠である7,72。本研究では、腸と肝臓における宿主トリプトファン酵素の日内リズムが、微生物叢に依存して変化することを示した。宿主のトリプトファン代謝、特にIDO1におけるこのようなリズム73は、免疫機能、宿主の代謝、胃腸の健康、行動を形成していると考えられる。現在までのところ、この分野における研究のほとんどは、単一の時点に焦点を当てたものであり、疾患過程におけるトリプトファン代謝を理解するための重要な窓を見逃している可能性がある。さらに本研究は、短時間のストレス曝露でも腸管バリア機能と糞便メタボロームが変化することを示し、ストレスに関連した消化管機能障害や腸脳軸相互作用の障害に潜在的な意味を持つ。重要なことは、腸管バリアと宿主のトリプトファン代謝の正常な日内リズムを維持するためには、微生物叢が不可欠であるということである。これらの観察は、健康および疾患におけるストレス体験と概日リズムの乱れの接点において重要な意味を持つ。

STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
化学物質、ペプチド、組み換えタンパク質
MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Thermo Fisher Scientific M6494
Dulbecco's modified eagle medium F12 Nutrient Mixture + L-glutamine Thermo Fisher Scientific 11320-074
アンピシリンナトリウム塩 ディスカバリーファインケミカルズ 69-52-3
ゲンタマイシン硫酸塩 ディスカバリーファインケミカルズ 1405-41-0
バンコマイシン塩酸塩 ディスカバリーファインケミカルズ 1404-93-9
イミペネム一水和物 ディスカバリーファインケミカルズ 74431-23-5
フルオレセイン-5-イソチオシアネート Sigma-Aldrich FD4
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4305719
L-Kynurenine Sigma-Aldrich K8625
ウシ胎児血清 Sigma-Aldrich F9665
ペニシリン/ストレプトマイシン Sigma-Aldrich P4333
QUANTI-Luc 分泌ルシフェラーゼ検出培地 Invivogen Rep-qlc1
ノルモシン Invivogen Ant-nr-1
ゼオシンInvivogen Ant-zn-05
重要な市販アッセイ
高容量cDNA逆転写キット Thermo Fisher Scientific 4368814
mirVana miRNA単離キット Thermo Fisher Scientific AM1561
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit Qiagen 51604
Nextera XT DNA ライブラリー調製キット Illumina FC-131-1096
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit サーモフィッシャーサイエンティフィック Q33230
インドールアッセイキット Sigma-Aldrich MAK326
インドール3酢酸ELISAキット Abbexa Abx150354
寄託データ
メタゲノミクスデータ European Nucleotide Archive PRJEB58865; https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB58865
Metabolomics data - caecal contents Metabolomics workbench https://doi.org/10.21228/M89M7J; プロジェクトID： PR001945
Metabolomics data - colonic mucosa メタボロミクスワークベンチ https://doi.org/10.21228/M89M7J; プロジェクトID： PR001945
実験モデル 細胞株
ヒト HT29 結腸腺癌 Lucia™ AhR レポーター細胞 Invivogen カタログ番号: ht2l-ahr
実験モデル 生物／系統
マウス C57BL/6J Envigo 057
マウス C57BL/6J - 無菌および無菌コントロール Taconic Biosciences B6-M; B6-F から購入したマウスからその場で作製した F1
オリゴヌクレオチド
補足ファイル "表S3 オリゴヌクレオチドリスト "参照
ソフトウェアとアルゴリズム
概日リズム解析のためのオリジナル R 関数 Bastiaanssen et al.32 https://github.com/thomazbastiaanssen/kronos
LabScribe バージョン 4.34 World Precision Instruments https://www.wpiinc.com/support/software-download/
FastQC Babraham Bioinformatic https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Bowtie2 Langmead and Salzberg63 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
woltka Zhu et al.65 https://github.com/qiyunzhu/woltka/blob/master/doc/wolsop.sh
gomixer Valles-Colomer et al.33 http://www.raeslab.org/omixer/application/show?page=download
iNEXT Hsieh et al.70 https://cran.r-project.org/web/packages/iNEXT/index.html
Tjazi Bastiaansen 他 71 https://github.com/thomazbastiaanssen/Tjazi
Rstatix A. Kassambara https://CRAN.R-project.org/package=rstatix
Anansi Bastiaansen et al.36 https://github.com/thomazbastiaanssen/anansi
MetaboAnalyst Chongら.66 https://www.metaboanalyst.ca/home.xhtml
Trypnet Luほか.34 https://www.trpnet.ca/home.xhtml
その他
RM1A (P) 特別食サービス 801010
RM3A (P) スペシャルダイエットサービス 801030
2018 Teklad グローバル 18%タンパク質げっ歯類用飼料 Envigo 2018S
DVC-1000/EVC-4000 with LabTrax データ収集ハードウェア World Precision Instruments DVC3B-B; DVC1000; Y2006
ジルコニア/シリカビーズ BioSpec Products 11079125z
PCR精製用AMPure XP試薬 ベックマン・コールター・ライフサイエンス A63880
ナノドロップ分光光度計 ナノドロップテクノロジー ナノドロップND-1000
組織・細胞ホモジナイザー MP Biomedicals Model #6004 -500

リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるGerard Clarke教授(G.Clarke@ucc.ie)までご連絡ください。

材料の入手可能性
本研究では新規のユニークな試薬は作成していない。

データおよびコードの利用可能性

メタゲノミクスデータはEuropean Nucleotide Archiveに寄託されており、発表日現在一般に入手可能である。アクセッションナンバーはkey resources tableに記載されている。

メタボロミクスデータセットはMetabolomics Workbench74 Tbleに寄託されており、公開日現在で利用可能である。DOIは主要リソースの表に記載されている。

PCRおよびex vivoの実験データは、要請があれば主任研究者が共有する。

すべてのオリジナルコードはGithubに寄託され、一般に公開されている。URL は主要リソース表に記載されている。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要請があれば研究責任者から入手可能である。

実験モデルと研究参加者の詳細
動物実験
すべての動物実験は、本研究を開始する前にコーク大学の動物実験倫理委員会およびHealth Products Regulatory Authority（HPRA）の承認を得た。すべての実験は欧州指令2010/63/EUに従って実施され、コーク大学動物実験倫理委員会（Project Authorization AE19130/P160）および米国空軍Surgeon General's Office of Research Oversight and Complianceの両方から承認を得た。無菌マウスを用いた研究では、C57/BL6マウスの交配ペアをTaconic Biosciences社から入手し、すべての実験でF1世代の雌雄の子孫を用いた。無菌マウス、元無菌マウス、および従来型マウスは、12時間の明暗サイクル下で2～4匹/ケージ飼育し、オートクレーブ滅菌水とオートクレーブ滅菌ペレット状飼料（スペシャル・ダイエット・サービス社製）を自由摂取させた。無菌マウス、従来型マウス、コロニー形成無菌マウスの飼育条件は、温度（21±1℃）と湿度（55％～60％）の同じ環境条件に従った。無菌マウスはgnotobioticフレキシブルフィルムアイソレーターに収容した。コロニー形成された無菌マウスは出生後21日目までgnotobioticフレキシブルフィルムアイソレーター内で無菌マウスとして維持され、生後21日目にアイソレーターから取り出され、この研究の残りの期間、標準的な動物施設に再配置され、年齢および性別が一致した従来型マウスの使用済み寝具を入れたワイヤートップケージに収容された。実験は成体の雄マウス（20～39g、実験開始時8～10週齢）で行った。それ以外のすべての研究では、Envigo社から購入した成体雄性C57/BL6マウスを1ケージあたり2～3匹ずつ群飼し、室温22±1℃、12/12時間明暗サイクルで飼育し、水とオートクレーブ滅菌ペレット飼料（Envigo社製）を自由摂取させた。ZT23とZT11は動物ユニットの暗-明サイクルに基づいている。

細胞株での研究
動物糞便上清のAhR活性は、Human HT29 colon adenocarcinoma Lucia AhRレポーター細胞（InvivoGen）を用いて測定した。

方法の詳細
抗生物質カクテルによる腸内細菌叢の減少
マウスを14日間連続で抗生物質処理に供し、処理期間中は2日ごとに飲料水を交換した。抗生物質カクテルはアンピシリン（1 g/L）、ゲンタマイシン（1 g/L）、バンコマイシン（0.5 g/L）、イミペネム（0.25 g/L）で構成され、グラム陽性菌減少マウスにはバンコマイシン（0.5 g/L）を、グラム陰性菌減少マウスにはゲンタマイシン（1 g/L）を投与した。抗生物質はすべてDiscovery Fine Chemicalsで購入した。投与期間中、抗生物質を含む水は2日ごとに交換した。マウスは自由に水を飲むことができた。抗生物質を投与した最初の1週間は、体重と水分摂取量を毎日モニターした。

急性拘束ストレス
FITC in vivoおよびメタボロミクス研究では、8:00a.m.～2:00p.m.（ZTs1～7）の明期に急性拘束ストレスを与えた。概日-急性ストレス実験では、急性拘束ストレスをZT23（午前6時30分±15分）またはZT11（午後6時30分±15分）のいずれかに投与した。ケージは無作為に非ストレス群またはストレス群に割り付けられた。ストレスを受けた各マウスは50mLチューブに入れられ、15分間拘束された。15分間の拘束ストレスの後、マウスは拘束器から外され、すぐに淘汰室に運ばれるか、ホームケージに戻され45分間そのままにされた。輸送ストレスの変動をコントロールするため、非ストレスコントロール群のマウスを新しい寝具を入れた新しいケージに入れ、淘汰室に入る前に同じ距離を輸送した。

FITC in vivo
マウスを一晩絶食させ、急性拘束ストレスの30分前に滅菌PBS中600mg/kgの濃度でFluorescein-5-isothiocyanate（FITC；Sigma-Aldrich）4kDaを経口投与した。FITCのベースラインレベルを評価するためにストレス前に尾を出血させた後、マウスを上記のように急性拘束ストレスにかけた。ストレス処置後、マウスはケージ内で回復させたが、ストレス後の異なる時点（T0、T45、T90、T240）での尾部出血は行わなかった。全血をEDTA含有キャピラリーに採取した。その後、血液をチューブに移し、4℃で3500g、15分間遠心分離し、血漿を採取し、後の分析のために-80℃で保存した。血漿中のFITC-デキストラン濃度は、Victor 2プレートリーダー（PerkinElmer社製）を用い、励起波長490 nm、発光波長520 nmで評価した。

組織採取
淘汰室に入ったマウスは直ちに断頭し、体幹部血を採取し、組織を採取した。体幹部血はK2 EDTAラベンダートップバキュテナー（BD Life Sciences）に採取し、3500g、4℃で15分間遠心分離した。血漿を採取し、さらに分析するまで-80℃で保存した。腸管全層サンプルを摘出し、内容物を除去するために冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄するか、Ussing Chambers実験用に10mMグルコース含有クレブス緩衝液（1.2mM NaH2PO4, 116mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.2mM MgCl2, 25mM NaHCO3, 2.5mM CaCl2）で洗浄した。腸管サンプルは手作業で解剖し、PCRグレードのマイクロフュージチューブに入れ、分析まで-80℃で保存した。

ウッシングチャンバー
回腸遠位部（盲腸から1cm近位で採取した1.5cmのセグメント）および結腸近位部（盲腸から1cm遠位で採取した1.5cmのセグメント）のサンプルを、漿膜剥離後、4mmの円形開口部（露出組織面積0.126cm2）を持つUsingチャンバーに装着した。Krebs緩衝液を粘膜室と漿膜室の両方に加えた： クレブスバッファーには、漿膜チャンバーには10mM D-グルコース、粘膜チャンバーには10mMマンニトールが含まれ、タイトジャンクション透過性を増加させることが知られている小腸上皮細胞のナトリウム／グルコース共輸送体の活性化を避けた78。チャンバーは37℃に保たれ、カーボゲン（95％O2、5％CO2）が連続的に供給された。組織は、自動電圧クランプ（DVC-1000/EVC-4000、ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ）を用いてゼロ電圧にクランプした。短絡電流（Isc）はゼロ電圧クランプモードで記録した；経上皮電気抵抗（TEER）は2mVパルスを放電することにより測定した。すべての測定値は、LabTraxデータ収集ハードウェアを用いてコンピュータに連続的に記録し、Labscribeソフトウェア（World Precision Instruments）を用いて解析した。経上皮透過性は、FITCの粘膜-漿膜間フラックスを測定することにより調べた。FITCを最終濃度2.5mg/mlになるように粘膜チャンバーに添加し、30分ごとに漿膜チャンバーから200μLのサンプルを採取し、次の120分間は新鮮なKrebsと交換した。採取したサンプルは、励起波長485nm/発光波長535nmで測定した。

定量的RT-PCR
mirVana miRNA isolation kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、ビーズビーター（MP Biomedical社製）でジルコニア/シリカビーズ（BioSpec社製）を用いて、キットメーカーの指示に従って、近位結腸および回腸遠位サンプルからの全RNAを単離した。RNA濃度はNanodrop Spectrophotometer（Nanodrop Technologies）を用いて測定した。

TaqManアッセイ（Applied Biosystems）では、HighCapacity cDNA Reverse Transcription kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてRNAを再転写した。リアルタイムPCRにはTaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）を用いた。HPRTはハウスキーピング遺伝子として使用し、時間帯および実験グループのいずれにおいても安定に発現していた。目的の遺伝子は、腸組織のハウスキーピング遺伝子の平均値（HPRT）を用いて正規化した。相対的遺伝子発現の解析は、独立したキャリブレーターで正規化したΔΔCT法を用いて行った79。

AhR活性の測定
動物糞便上清のAhR活性は、ヒトHT29結腸腺がんLucia AhRレポーター細胞（InvivoGen社製）を用い、供給者の推奨に従って測定した。糞便上清を100 mg/mLの濃度で1xHBSS溶液に懸濁した。混合物を十分にボルテックスした後、4000g、4℃で10分間遠心した。得られた上清を0.45μmのフィルターで濾過し、再度遠心分離し、0.2μmで濾過した。糞便上清は、AhRレポーター細胞処理の直前まで-80℃で保存した。HT29-AhRレポーター細胞を透明な96ウェル標準細胞培養プレートに播種した。播種から24時間後、細胞を処理した糞便上清、50uMキヌレニン（既知のAhRリガンド、Sigma-Aldrich）、または完全な抗生物質カクテルで24時間刺激した。実験は3連で行い、各実験は少なくとも2つの生物学的複製を含む。ルシフェラーゼ活性は、Victor 2プレートリーダー（PerkinElmer社製）とQuanti-Luc試薬（InvivoGen社製）を用い、製造元の指示に従って相対発光単位（RLU）として定量した。結果は、コントロールの陰性ルシフェラーゼ活性を基準にして正規化し、MTTアッセイを用いて決定した細胞生存率で補正した。

MTT細胞生存率アッセイ
ルシフェラーゼアッセイのための培地回収の直後に、細胞から残りの培地を除去し、各ウェルに0.5% MTT（Sigma-Aldrich）を50μLずつ添加した。プレートに蓋をして37℃のインキュベーターに2-3時間置き、結晶を形成させた。その後、MTTをウェルから取り除き、100μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を各ウェルに加えた。プレートをプレートシェーカーに15-20分間置き、結晶を溶解させた。その後、吸光度570nmを測定した。未処理ウェルと比較した生存率は、死細胞を含むウェル（24時間50％DMSO）の平均測定値を差し引き、この数値を未処理ウェルの平均測定値から死細胞を含むウェルを差し引いた数値で割り、100を乗じてパーセンテージを算出した。

ショットガンシーケンスライブラリーの調製
キットの説明書に従い、QIAamp Fast DNA Stool mini kit（Qiagen）を用いて、糞便内容物からDNAを抽出した。全ゲノムショットガンシーケンスライブラリーは、Nextera XT DNA Library Preparation kit（イルミナ社製）を用い、Nextera XT DNA Library Preparation Guideに従って調製した。簡単に説明すると、DNA濃度を0.2ng/μLに希釈し、55℃で7分間インキュベートして断片化した。ペアエンドのNextera XTインデックスを加え、12サイクルの増幅工程を完了した。サンプルは、AMPure XPビーズ（Beckman Coulter Life Sciences）を用いて、製造元の指示に従って精製した。モル比を計算するために、DNA濃度はQubit dsDNA High Sensitivity Assay（Thermofisher Scientific）を用いて定量し、アンプリコンのサイズはAgilent Bioanalyser 2100で測定した。最後に、150 bpペアエンドシーケンスのためにIllumina NextSeqプラットフォームにロードする前に、1 mMのライブラリーをプールした。

分類学的および機能的解析
すべての糞便サンプルの生配列について、FastQCプログラムを用いて、デフォルトの品質スコア30閾値を用いた品質チェックを行った。その後、ショットガンメタゲノムシーケンスデータをクリーニングし、宿主ゲノム配列はBowtie281を用い、Kneaddata wrapperプログラムを介して以下のパラメータでフィルターした： ILLUMINACLIP:/NexteraPE-PE.fa:2:30:10, SLIDINGWINDOW:5:25, MINLEN:60, LEADING:3, TRAILING:3。リードはBowtie2を用いてWeb of Lifeデータベース82にアライメントし、微生物群集の分類学的および機能的プロファイリングをwoltkaを用いて行った83。次に、uniref.90 ベースの遺伝子存在量マトリックスを、woltka 内の "woltka tools collapse "機能を使って、KEGG Orthology (KO)タームマッピングによってさらに折りたたんだ。Woltka SOPはオンラインで入手可能(https://github.com/qiyunzhu/woltka/blob/master/doc/wolsop.sh)。Gut-Brain Modules（GBM）およびGut-Metabolic Modules（GMM）は、GomixerツールのRバージョンを使用して計算した39。

メタボロミクス
セカル内容物および大腸粘膜のメタボロミクスは、後述する超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を用いてMetabolon Inc.が実施した。サンプルはHamilton社の自動化MicroLab STARシステムを用いて調製した。QCの目的で、抽出工程の第一段階の前に、いくつかの回収標準物質を添加した。タンパク質を除去し、タンパク質に結合した低分子または沈殿したタンパク質マトリックスに捕捉された低分子を解離し、化学的に多様な代謝物を回収するために、タンパク質をメタノールで2分間激しく振盪しながら沈殿させ（Glen Mills GenoGrinder 2000）、その後遠心分離した。得られた抽出液を5つのフラクションに分けた。2つはポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いた2つの別々の逆相（RP）/UPLC-MS/MS法による分析用、1つはネガティブイオンモードのESIを用いたRP/UPLC-MS/MS法による分析用、1つはネガティブイオンモードのESIを用いたHILIC/UPLC-MS/MS法による分析用、そして1つのサンプルはバックアップ用に確保した。サンプルをTurboVap（Zymark）上に短時間置き、有機溶媒を除去した。サンプル抽出物は、分析準備の前に窒素下で一晩保存した。

すべてのメソッドで、Waters ACQUITY超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）およびThermo Scientific Q-Exactive高分解能/高精度質量分析計（加熱エレクトロスプレーイオン化（HESI-II）ソースおよび35,000質量分解能で動作するOrbitrap質量アナライザーと連動）を使用した。サンプル抽出物を乾燥させた後、4つのメソッドそれぞれに適合する溶媒に再構成した。それぞれの再構成溶媒には、注入とクロマトグラフィーの一貫性を確保するために、一定濃度の一連の標準物質が含まれていた。1つのアリコートを、より親水性の高い化合物に対してクロマトグラフィ的に最適化された酸性ポジティブイオン条件を用いて分析した。この方法では、0.05%のパーフルオロペンタン酸（PFPA）と0.1%のギ酸（FA）を含む水とメタノールを用いて、C18カラム（Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm、1.7 μm）から抽出液をグラジエント溶出した。別のアリコートも酸性のポジティブイオン条件下で分析したが、より疎水性の化合物用にクロマトグラフィーを最適化した。このメソッドでは、メタノール、アセトニトリル、水、0.05% PFPA、0.01% FAを用いて、前述のC18カラムから抽出液をグラジエント溶出し、全体的に高い有機含量で操作した。別のアリコートは、別の専用C18カラムを用い、塩基性マイナスイオンに最適化した条件で分析した。塩基性抽出物はメタノールと水を用いてカラムからグラジエント溶出したが、pH8で6.5mMの炭酸水素アンモニウムを添加した。第4の分注は、HILICカラム（Waters UPLC BEH Amide 2.1 × 150 mm、1.7 μm）から、水とアセトニトリルに10mMのギ酸アンモニウムを添加したグラジエント溶出を行い、pH10.8でマイナスイオン化して分析した。

生データは、Metabolonのハードウェアとソフトウェアを用いて抽出、ピーク同定、QC処理された。これらのシステムは、マイクロソフトの.NET技術を利用したウェブサービス・プラットフォーム上に構築されており、高性能アプリケーション・サーバーとファイバーチャンネル・ストレージ・アレイのクラスタ上で動作し、アクティブなフェイルオーバーとロードバランシングを提供する。化合物は、精製された標準物質または再発性の未知物質のライブラリエントリと比較することにより、次の3つの基準に基づいて同定されました：同定提案の狭いRIウィンドウ内の保持指標、ライブラリとの正確な質量一致±10ppm、および実験データと真正標準物質との間のMS/MSフォワードスコアとリバーススコア。ストレスによって変化することが判明した代謝物は、対応するHuman Metabolome Databaseの識別子にマッピングされ、MetaboAnalystオンラインパイプラインを使用して濃縮解析にかけられた84。

標的トリプトファン代謝物の定量化
インドールアッセイキット（Sigma-Aldrich）およびインドール3酢酸（IAA）ELISAキット（Abbexa）をそれぞれキットの説明書に従って使用し、糞便上清中のインドールおよびインドール3酢酸レベルを評価した。

定量と統計解析
バイオインフォマティクスと統計解析
データ処理はRstudio GUI（バージョン2022.2.2.485）を用いてR（バージョン4.2.0）で行った。α多様性を除くすべてのマイクロバイオーム解析において、比率はサブセット化に対して不変であり、本研究では組成データ解析技術を採用しているため、種レベルでの有病率が10％未満の分類群は解析から除外した85,86。主成分分析は、中心対数比変換（clr）値に対して実施した。β多様性はAitchison距離、またはclr変換データ間のユークリッド距離で計算し、veganパッケージを使用したPERMANOVAで評価した。α多様性はiNEXTライブラリを用いて計算した88。

概日リズムを評価するために、SingerとHugheyによって記述された方法と同様に、フーリエ分解されたサインとコサイン要素にclr変換された各特徴について線形モデルを当てはめた。変数は、閾値として0.1のq値を用いたBenjamini-Hochberg手順に基づいて選択された。この手続きは、多重検定のための逐次修正Bonferroni補正を用いて偽発見率（FDR）をコントロールする。カスタムRスクリプトと関数は、https://github.com/thomazbastiaanssen/Tjazi.89 からオンラインで入手できる。

残りの研究は、rstatixパッケージによる一般線形モデルを使用するか、https://github.com/thomazbastiaanssen/Tjazi から利用可能な関数を使用して分析した。適切な場合には、Tukeyの手順を用いて一対比較を行った。ヒートマップはrパッケージpheatmapを用いて作成した。

トリプトファン代謝の文脈における宿主遺伝子発現と微生物機能ポテンシャルとの関連を評価するため、関連するすべての遺伝子と機能をKEGGオルソログに変換し、KEGGパスウェイのメンバシップを共有する特徴のペア間で線形混合効果モデルを当てはめた。この方法は以前にここで実装され、現在プレプリントとして入手可能である90。カスタムRスクリプトと関数は、https://github.com/thomazbastiaanssen/anansi。

すべての統計的出力は表S1に報告されている。

トリプトファン代謝のインシリコ解析
従来のマウスから得られたメタゲノム解析の生カウントをTrpNetデータベース（https://www.trpnet.ca/home.xhtml）と相互参照した43。これにより、データベースで特徴付けられた各細菌株について、トリプトファン代謝物産生の可能性を推定することができた。次に、個々のマウスに存在するすべての細菌株について、各代謝物の予測存在量を合計し、TrpNetデータベースにおける各代謝物の予測存在量を推定した。TrpNetデータベースは、メタゲノム解析において細菌をトリプトファン代謝細菌とその他細菌に分類するために使用された。

謝辞
Friederike Uhlig、Lars Wilmes、Adam S. Lannon、Noalig Wyckens、Daisy Garde、Anna Ratsika、Michael Collins、Thaisa Barros dos Santos、Anna Golubeva、Gerard Moloney、Patrick Fitzgerald、Colette Manley、Frances O'Brien、Laicee Kenny、Ken O'Riordanの各氏の技術協力、およびMarina Schverer、Aonghus Lavelleの各氏の原稿に対する批判的レビューに感謝する。この研究はアイルランド科学財団（SFI/12/RC/2273_P2）の助成を受けたAPCマイクロバイオーム・アイルランドで実施された。このプロジェクトの一部は、欧州航空宇宙研究開発局（European Office of Aerospace Research and Development）、空軍科学研究局（Air Force Office of Scientific Research）、空軍研究所（Air Force Research Laboratory）711ヒューマン・パフォーマンス・ウィング（711 Human Performance Wing）の資金提供による共同契約（FA9550-17-1-0016）である。概日リズムを含む実験は、サックス・カバノー財団から一部資金提供を受けた。C.E.G.は欧州神経科学振興財団（スイス、ジュネーブ）の支援を受けている。S.-J.L.はアイルランド研究評議会博士研究員奨学金（GOPID/2021/298）を受けている。資金提供元は、研究デザイン、収集、分析、データ解釈、原稿執筆に影響や制約を与えることはなかった。

著者貢献
S.-J.L.、C.E.G.、G.S.S.T.、J.F.C.、G.C.が実験計画を立案・指揮した。S.-J.L.、C.E.G.、G.S.S.T.、J.M.L.がin vivo実験を行った。S.-J.L.はex vivoおよびin vitroの実験と解析を行った。C.G.、S.-J.L.、E.G.が分子解析を行った。C.S.とA.G.はメタゲノム解析を行った。T.F.S.B.はメタゲノムデータのバイオインフォマティクス処理を行い、データ解析のためのR関数を構築した。T.F.S.B.、S.-J.L.、C.E.G.は統計解析を行った。C.E.G.とS.-J.L.は最初の原稿を作成した。すべての著者がデータの解釈と重要な原稿の修正に参加し、投稿前に最終版を承認し、研究のすべての側面について責任を負うことに同意した。著者資格のある著者は全員記載されており、著者資格の基準を満たしている。

利益申告
J.F.C.は、ミード・ジョンソン、オルデサ、ヤクルト主催の会議で講演し、Reckitt、Nutricia、Dupont/IFF、Nestleから研究資金を受けている。G.C.はJanssen、Probi、Apsenから謝礼を受け取り、PharmaviteとFonterraから研究資金を受け取り、YakultとZentivaの有料コンサルタントを務めている。この支援は本プレビューに影響や制約を与えるものではなかった。著者らの見解は、米国政府、国防総省、または米国空軍の公式指導または見解を反映するものではない。一般公開を承認。配布は無制限。配布は無制限。AFRL-2022-5638、2022 年 12 月 2 日。

補足情報

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資料S1. 図S1-S8

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表S1. 統計解析。原稿全体を通して行われた統計解析のR出力を図ごとに整理したもの。

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表S2. Trypnet解析。Trypnetによって予測された全代謝物のリズム性の統計的評価。

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表S3. オリゴヌクレオチドリスト。半定量的PCRに使用したオリゴヌクレオチドのリスト。

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資料S2. 論文＋補足情報

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現住所 ラ・リオハ生物医学研究センター（CIBIR）腫瘍領域血管新生チーム、26006 Logroño, Spain

8
これらの著者は同等に貢献した

9
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