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研究論文
2024 年 1 月 17 日
代謝モデル予測により、精密プレバイオティクスによる標的マイクロバイオーム操作が可能になる

https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.01144-23


著者 Georgios Marinos https://orcid.org/0000-0002-6443-7696, Inga K. Hamerich https://orcid.org/0000-0002-3451-4574, Reena Debray https://orcid.org/0000-0001-8130-4871, Nancy Obeng https://orcid.org/0000-0001-9639-2130, Carola Petersen https://orcid.org/0000-0002-2164-6789, Jan Taubenheim https://orcid.org/0000-0001-7283-1768, Johannes Zimmermann https://orcid.org/0000-0002-5041-1954, SHOW ALL (15 AUTHORS), Christoph Kaleta https://orcid.org/0000-0001-8004-9514 c.kaleta@iem.uni-kiel.deAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.01144-23
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概要
はじめに
材料と方法
結果
考察
謝辞
補足資料
参考文献
情報と貢献者
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ABSTRACT
宿主と微生物叢の間の健康に有益な相互作用が数多く同定されている一方で、これらの相互作用を調節するための標的アプローチはまだ不足している。そこで我々は、目的のマイクロバイオーム構成種の存在量を特異的に調節する高精度プレバイオティクスを同定する。第一段階として、標的生物種のみに取り込まれ、他の生物種には取り込まれない化合物によって精密プレバイオティクスを定義することは、代謝ニッチが重複しているため、通常は不可能であることを示す。その後、代謝モデリングを用いて、免疫防御の標的種であるシュードモナス・ルリダ（Pseudomonas lurida）MYb11と、永続的なコロニー形成者であるオクロバクトラム（Ochrobactrum vermis）MYb71からなる、2種類の線虫マイクロバイオームコミュニティに対する精密プレバイオティクスを同定した。予測された精密プレバイオティクスのうち、L-セリン、L-スレオニン、D-マンニトール、γ-アミノ酪酸の4つが、MYb11の存在量を特異的に増加させることを実験的に確認した。L-セリンをさらにin vivoで評価したところ、ミミズの宿主においてもMYb11の存在量が増加した。全体として、代謝モデリングは、将来のマイクロバイオーム標的療法の重要な基礎となる精密プレバイオティクスの設計のための効果的なツールであることが示された。
重要性
マイクロバイオームが宿主の疾患プロセスに影響を及ぼす様々なメカニズムが同定されている一方で、マイクロバイオームに基づく治療への第一歩として、マイクロバイオーム組成の標的操作を可能にするアプローチはまだ数少ない。ここでは、マイクロバイオーム内に既に存在する健康に有益な微生物種の存在量を高めることを可能にするプレバイオティクスの概念を提案する。宿主に有益なシュードモナス・ルリダ（Pseudomonas lurida）MYb11と永続的なコロニー形成菌オクロバクトラム（Ochrobactrum vermis）MYb71からなる線虫Caenorhabditis elegansの最小微生物群に対して、MYb11の増殖を促進することを目的とした精密プレバイオティクスを予測するための制約ベースのモデリングパイプラインを紹介する。予測された精密プレバイオティクスのうち4つを実験的に検証した結果、これらのプレバイオティクスがin vitroおよびin vivoでMYb11の存在量を特異的に増加させることが確認された。これらの結果は、制約に基づくモデリングが、ヒトの疾患に対する標的微生物ベースの治療法を開発するための重要なツールになり得ることを示している。
はじめに
従来は常在菌と考えられてきたが、高等宿主生物の体内や体上に生息する微生物群集（すなわちマイクロバイオーム）は、宿主の生理学にとって不可欠な部分であることが次第に明らかになってきている。これらの微生物群集は、病原体の防御（1）、免疫系の教育（2）、ビタミンの生産（3）、異種生物の代謝（4、5）において重要な役割を果たし、進化的な課題に対応するために宿主の可塑性を高めている（6、7）。このように、微生物叢の組成は宿主の幸福と環境的課題への対応能力において重要な役割を果たしており（8, 9）、疾患（10）や環境ストレッサー（11）への曝露に伴って微生物叢の組成が頻繁に変化することが示されている。このような観察結果や動物モデルでの研究から、マイクロバイオームの組成そのものが宿主の健康状態や体力の重要な調節因子であり（12）、マイクロバイオームの組成を標的として調節することで、宿主を調節するためのまったく新しい道が開けるのではないかという考えが生まれた。
食事パターン（例えば欧米食）がマイクロバイオームの構造に影響を与えることが示されているが、その影響は一過性である(13)。マイクロバイオーム構成に及ぼす食事摂取の影響の他に、生物の微生物群集を改変するための様々なアプローチが用いられてきた(14)。微生物群集全体をドナーからレシピエント宿主に移植する方法（糞便移植）、特定の微生物種によって利用される化合物を提供する方法（プレバイオティクス）、天然または合成由来の微生物株を提供する方法（プロバイオティクス）、微生物由来の化合物を提供する方法（ポストバイオティクス）、およびそれらの組み合わせ（シンバイオティクス）である。糞便移植は、動物モデルにおいて微生物群集組成を調節するために最も一般的に用いられているアプローチであるが、微生物群集全体の移植を伴うため、望ましい形質のみの移植ではない。その結果、糞便移植が日常的に用いられている医療適応症は今のところ1つしかなく（15）、移植の安全性と生着安定性に潜在的な懸念がある（16）。
微生物操作の方法として、プレバイオティクス、プロバイオティクス、あるいはシンバイオティクスによる補充という概念が一般的に提唱されているが、これらのアプローチはまだ大きく制限されている。ヒトにおいては、オリゴ糖は微生物種によって発酵され、増殖して短鎖脂肪酸のような生物活性化合物を産生することができるため、構造的および機能的なレベルで微生物群集を変化させるプレバイオティクスとして提案されている(17)。しかし、微生物組成を変化させる可能性のある他の種類の化合物については、ほとんど知られていない。考慮すべきもう一つの重要な側面は、プレバイオティクスを用いて個々の標的微生物を操作できる特異性である。このように、オリゴ糖は有益であると考えられているが、関連性のない複数の種が類似したタイプのオリゴ糖を分解できるため（例えば、バクテロイデス属、乳酸桿菌、ビフィドバクテリウム属はフルクタンを分解できる）、どの種がそれを分解できるかについては不明確なことが多い（17, 18）。プロバイオティクスやシンバイオティクスをサプリメントで摂取する場合、他の懸念も提起されている。例えば、特定のビフィズス菌がヒトの腸内に安定的に定着する能力は、臨床試験参加者の⅓にしか報告されていない（19）。さらに、外因性細菌の導入は望ましくない副作用をもたらす可能性がある。例えば、水産養殖でプロバイオティクスとして使用されたバチルス属菌の中には、病原性や抗生物質耐性遺伝子を持っているものがあった（20）。したがって、現在のマイクロバイオーム操作アプローチにおけるこのような限界を克服するためには、常在微生物種の存在量を優先的に調節する、よく制御された作用様式（例えば、プレバイオティクスを分解できる既知の微生物経路に基づく）を持つプレバイオティクスに焦点を当てる必要がある。病原性のメカニズムは複雑で文脈特異的であることが多いため（21）、これらの微生物種が宿主のマイクロバイオームに常在していることが望ましい。本研究では、特定の宿主のマイクロバイオーム内で選択された細菌株の存在量を特異的に調節するプレバイオティクスを "精密プレバイオティクス "と呼ぶことにする。
このような精密プレバイオティクスを設計・評価するためには、線虫のような扱いやすいモデル系から始めることが不可欠である。無脊椎動物である線虫の本来の微生物群集は2016年に初めて報告されたが（22）、この線虫は宿主と微生物の相互作用を研究するモデルとしてすでに20年以上使われている（23）。同様に線虫-マイクロバイオーム研究を促進するために、12人のメンバーからなる線虫特異的マイクロバイオームリソースCeMbioが最近設立された(24)。このコンソーシアムの一部であるグラム陰性Pseudomonas lurida MYb11は、抗真菌作用（22）と抗菌作用を持つことが知られており、それによって病原体Bacillus thuringiensis（Bt）に対する防御を提供している（21, 25）。MYb11はその保護作用の他に、線虫の腸内に定着し(22)、線虫の感染時の体力を向上させることが知られている(25)。Ochrobactrum vermis MYb71はCeMbioコミュニティ(24)のもう一つのメンバーであり、宿主の生活史形質に影響を与え(24, 26, 27)、線虫を持続的にコロニー化し(22)、スペースや栄養素の面で他の細菌に対して競争的であると報告されている(27)。さらに、細菌株MYb11はMYb71と共培養した場合のみスクロースで増殖できたが、単独で培養した場合はできなかったことから、2つの細菌株は代謝的に相互作用していることが示唆された(27)。従って、有益な細菌と競合的な細菌からなる微生物群集は、マイクロバイオーム操作のための標的アプローチを開発する絶好の機会となる。
精密プレバイオティクスを開発するための重要な前提条件は、微生物群集内に存在する代謝機能と、特定の代謝介入がマイクロバイオームの代謝にどのような影響を与えるかを詳細に理解することである。微生物群集における代謝機能を調べるための重要なアプローチのひとつに、制約に基づく代謝モデリングがある(28-30)。これらの手法では、各細菌のレベル、あるいは群集全体の遺伝情報と生化学データベースを基に、微生物や群集の代謝反応を表す化学反応のネットワークをシミュレートすることができる(31)。そのためには、ゲノムデータからマイクロバイオーム内の細菌種のゲノムスケール代謝モデルを再構築する必要がある。これらのモデルは、生物内に存在する代謝機能を要約したもので、自動再構築アプローチ（32, 33）を用いて再構築することもできるし、既存のモデルリポジトリ（34）から入手することもできる。さらに、種の生育環境を考慮し（35）、個々の種に対するフラックスバランス解析（FBA）のような最適化アプローチ（28）や、制約に基づく群集モデリングアプローチ（36、37）を用いて、個々の種内の代謝活性や種間の相互作用を予測することができる。これらの方法はすでに、パーキンソン病患者（38）や炎症性腸疾患患者（39）のマイクロバイオームにおける代謝変化の同定や、薬剤-微生物-宿主の相互作用における線虫とその微生物叢の相互作用の研究に用いられている（30）。線虫については、MYb11とMYb71（24）および微生物叢の他のメンバーを含むCeMbioコミュニティの代謝モデルが利用可能である（27）。
本研究では、MYb11とMYb71の代謝ネットワークを用いて、Biolog増殖アッセイから得られた表現型情報も取り入れながら、宿主保護株であるMYb11の存在量をMYb71よりも特異的に高めることができる精密プレバイオティクスの計算機スクリーニングを行った。予測された化合物のうち、L-セリン、L-スレオニン、D-マンニトール、γ-アミノ酪酸（GABA）の4種類をin vitroで試験し、それらがMYb11の存在量を選択的に高めることを確認した。さらに線虫を宿主とする系に移し、線虫宿主に両方の細菌種をコロニー形成させた場合、L-セリンがMYb11の存在量を選択的に増加させることを示した。このように、制約に基づく微生物群集モデリングアプローチが、標的微生物群介入アプローチを設計するための重要なツールとなる可能性を示した。
材料と方法
計算手法
特異的取り込み化合物の同定
我々は、単一の細菌種にのみ取り込まれ、他の細菌種には取り込まれない個々の代謝産物が、個々の細菌種を標的とするサプリメントとしてどの程度機能しうるかを探索した。この目的のために、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定データが利用可能な1,280人の参加者からなるKielベースのヒトコホートの腸内細菌叢データを検討した。以前に報告したように、リードはAGORA細菌コレクション(34)に存在する細菌種のゲノムの16S配列にマッピングされ、各サンプルのリードカウントは合計1に正規化され、各サンプルの存在量が0.1%以下の種は除去された。ゲノムスケールの代謝モデルを再構築するためのモデルへの入力として、ヒトコホート（30）の平均的な食事摂取量を仮定し、同定された種のゲノム上でgapseqバージョン1.1（32）を使用した。その後、各細菌種について、どの代謝物を取り込むことができるかを同定した。このため、代謝物の交換反応ごとに、それぞれの反応を目的反応として設定した。慣例により、細菌の代謝物取り込みは交換反応によってモデル化され、順方向は化合物の排泄に対応し、逆方向（すなわち負のフラックス）はその取り込みに対応する。そこで、R-package sybil (41)に実装されているFBA (40)を使用して、各交換反応によるフラックスを最小化しました。交換反応によるフラックスの最小値がゼロでなければ、この代謝物を取り込むことができます。各交換反応についてこの手順を繰り返し、各生物種について取り込み可能な化合物を同定した。次に、各参加者の腸内細菌叢に含まれる個々の細菌種について、その参加者の細菌叢に含まれる他の細菌種では取り込めない化合物を取り込めるかどうかを判定した。最後に、各参加者について、腸内細菌叢に含まれる細菌種のうち、少なくとも1つのユニークな取り込み化合物を持っているのはどの割合かを決定した。同様に、gapseq version 1.2 (32)を用いて、線虫微生物叢に属する78の細菌モデルを、公開ゲノム(27)に基づいて再構築した。次に、モデルのサイズが大きくなるにつれてランダムなサブセットを作成し（2から78まで、各サイズについて50回の反復）、各コミュニティについてユニークな取り込み化合物を持つ菌株の割合を決定した。CeMbioコミュニティには、Zimmermannら(42)のgapseq 1.2(32)で再構築した代謝モデルを使用した。一般に、ソフトウェアgapseq (32)には、ゲノムスケール代謝モデルの再構築に関する広範な文書が公開されており、オンラインでも入手可能である(https://gapseq.readthedocs.io/en/latest/)。
計算補完実験
シミュレーションでは、P. lurida MYb11とO. vermis MYb71のゲノム配列(27)からgapseq (32) version 1.1を用いて作成した代謝ネットワークを利用した。生物の代謝能力に関する表現型マイクロアレイからの情報は、gapseqの "adapt "モジュールを用いてモデルに統合した。具体的には、Biolog EcoPlate（OD590-OD750>0.1の場合に成長と仮定）のデータを組み込んだ（24）。増殖シミュレーション中、計算上の線虫増殖培地（NGM）（30）と好気的条件を仮定することで、モデルの交換フラックスを制約した。これらの制約条件は表S1にある。さらに、銅と鉄の陽イオンの流入量を増やし、モデルの成長を制限しないようにした。発表されている方法(36)に従い、必要な動力学的情報が不足しているため、モデルの下限値にはNGM培地入力の濃度値を使用した。
個々の微生物と微生物群集のモデル化には、3つの異なるアプローチを用いた。各細菌の増殖を独立にモデル化するために、FBA（40）を使用した。また、BacArena(36) R-packageに基づく個体ベースのモデリングと、以前に説明したコミュニティ-FBAも利用した(39, 43, 44)。コミュニティ-FBAアプローチはR-パッケージMicrobiomeGS2 (www.github.com/Waschina/MicrobiomeGS2)に実装されており、その概要はPryorらによる出版物(30)に詳述されている。個々の種の成長に対するサプリメントの効果を測定するために、我々は発表されたアプローチを修正し、種の構成を固定せず、個々の種のバイオマスの最適化の一部として決定されるようにした。すべてのタイプのシミュレーションにおいて、対象種 MYb11 の成長を促進する栄養補助食品を特定することに重点を置いた。
個々の栄養補給実験では、両生物の代謝モデルを NGM 計算食で制約し、食餌化合物の分子値（分子量）が変換なしで直接モデルに取り込める（モデルの下界のフラックスとして）と仮定した。これは、化合物の取り込み速度は最大利用可能量によって描かれるという仮定に基づいている(36)。各代謝物の補充は、補充した代謝物の流入可能量を10 mmol/L増加させることで行った。単回成長に対するサプリメントの効果を調べるため、各モデルについて、サプリメントなしの成長と比較した成長速度の相対的増加を記録した。数値の不安定性を防ぐため、未処理値はすべて 6 桁目に四捨五入し、0.01 より大きな相対変化を考慮した。
群集FBAを用いたシミュレーションでは、両生物の代謝モデルを、コンパートメント化された1つの微生物群集モデルに統合した。なぜなら、群集の成長を最大化した後の個々の種の成長率を予測するために、群集FBAを採用したからである。従って、群集モデルは、前段落で述べたように、NGM食を個々のサプリメントで拡張したもので制約した。個々の種の成長率は、Rパッケージsybil (41)に実装されているように、個々の種の成長率の合計を最大化し、同時に全フラックスの合計を最小化することで予測した（目的関数のフラックスの合計の係数は-10-6）。補食は通常、群集全体の成長も増加させるので、各生物種の予測成長率は、群集のそれぞれの成長率で正規化した。MYb71と比較してMYb11の成長に大きな影響を与える化合物を特定するために、補足後の予測成長率を補足なしの成長率と対比した。数値的なアーティファクトを排除するため、このセクションでは6桁目までの四捨五入と化合物選択における0.01のカットオフも適用した。
微生物群集の個体ベース・モデリングのために、両種の代謝モデルを BacArena の仮想環境でシミュレートし、30 × 30 のグリッド上でランダムに移動・繁殖できるようにした（36）。増殖培地としては、NGM飼料（単位：mM）を使用した。NGM飼料を1,000倍に希釈したのは、そうしないと栄養が枯渇する前に細菌モデルがシミュレーション環境全体をオーバーグレートしてしまうからである。シミュレーションでは、増殖環境に各生物種の20個体を接種し、FBAを使用して各補足について15反復で12反復の細菌増殖シミュレーションを行った。FBAとは対照的に、BacArenaには、個体のランダムな初期配置、個体のランダムな移動、ランダムな細胞複製イベントなどの確率的要素が含まれているため、複製が必要である。個体の成長率を最大化しながら、総フラックスを最小化するという副次的な目的が適用された。補充実験をシミュレートするために、各対象化合物0.01 mMをシミュレーションの最初に1回添加した。各サプリメント後の個々の生物種の成長プロファイルにおける有意な変化を同定するために、plotGrowthCurve コマンドを使用してシミュレーションから細胞バイオマス情報を抽出し、各モデルのサプリメントによる総バイオマス値の相対変化（時間ステップ 13; 6 桁目に丸め）を計算した。次に、Wilcoxon順位和検定（45）を用いて細菌モデル間の相対変化を比較した。その結果得られたP値は、Rに実装されている偽発見率制御を用いて多重検定のために補正された。各モデルのそれぞれの相対的変化の中央値に基づいて、MYb71に対するよりもMYb11に対する効果が大きい化合物を選択した。
これらのシミュレーション技術に基づき、シミュレーション全体でMYb11を特異的にブーストした化合物を同定した。その後、Biolog実験（24, 27）からMYb11による取り込みが確認された化合物に、このリストをサブセットした。MYb11の成長をサポートする化合物の濃縮解析には、利用可能な代謝物クラスについてヒトメタボロームデータベース（HMDB）のアノテーションを使用した（46）。簡単に説明すると、候補化合物のセットが HMDB で定義されている代謝物クラスで濃縮されているかどうかを、フィッシャーの正確検定を用いて検証しました。基礎となる代謝物セットとして、さまざまな代謝物クラスで MYb11 の代謝モデルに含まれる代謝物を使用しました。
システム情報およびソフトウェア
シミュレーションと解析はR環境（バージョン4.0.0、4.0.3、4.2.1）で行った。モデルの再構築はgapseqソフトウェア（バージョン1.1および1.2）を用いて行った（32）。最適化は一般にsybilソフトウェア（バージョン2.1.5および2.2.0）を用いて行った（41）。具体的には、MicrobiomeGS2（バージョン0.1.5、www.github.com/Waschina/MicrobiomeGS2）というソフトウエアを用いてマルチモデル補完を行い、BacArena（バージョン1.8.2、コミットfdb02bf7）を用いてインシリコ共培養のシミュレーションを行った(36)。どちらもパイプラインにsybilを組み込んでいる。線形計画法ソルバーは、RパッケージcplexAPI（バージョン1.4.0）をベースにしたCPLEX（バージョン12.10.0と22.1.0）を使用した。データ管理には、dplyr（バージョン1.0.2、1.0.4、1.0.9）、tidyr（バージョン1.1.3）、tidyverse（バージョン1.3.2）（47）、data.table（バージョン1.14.2）を使用した。並列計算には、foreach（バージョン1.5.0および1.5.1）とdoMC（バージョン12.10.0）を用いた。プロットには、ggplot2（バージョン3.3.3および3.3.6）（48）、egg（バージョン0.4.5）、ggVennDiagram（バージョン1.2.2.
実験方法
細菌株
単培養および共培養での細菌増殖について、サプリメント添加の有無にかかわらず、計算セクションと同様に、2つの天然に存在する線虫微生物相分離株P. lurida MYb11およびO. vermis MYb71を使用した。蛍光標識したMYb11::dTomato (21)とMYb71::GFPを用いて、混合群集中の2つの細菌種を区別した。比較のため、MYb71::dTomatoとMYb11::sfGFPを用いた逆標識も試験し、蛍光標識の影響がないことを確認した（図S2）。MYb71とMYb11::sfGFP株の統合蛍光株は、発表された研究（49）に従い、attTn7部位へのトランスポゾン挿入により構築した。すなわち、(i) pTn7xKS-sfGFP (pTW415) または pTn7xKS-dTomato (pTW416) プラスミドを含むドナー株、および (ii) pTNS2 (pTW10) プラスミドを含むヘルパー株である。ドナー株、ヘルパー株（いずれも37℃）およびターゲット株（26℃）の液体培養液（5mL LB）を一晩撹拌しながら培養し、再培養後、OD 0.4～0.6で回収した。三者交配混合物は等量（1:1:1）からなり、26℃で一晩培養した後、ゲンタマイシン（10 µg/mL）とIPTG（1 mM）を含むLB寒天プレートで選択した。MYb71の蛍光コロニーは、glmS遺伝子領域に対する2対のMYb71特異的プライマーを用いたPCRおよび配列決定により確認した： (i）oDB097（5′-CGCTCTGATCGATGAGACC-3′）とoDB098（5′-TTGCGCGCTGRTCGAC-3′）、および（ii）oDB097とトランスポゾンWP11プライマー（5′-CACGCCCCTCTTTAATACGA-3′）（49）。MYb11::sfGFPも同様に、以前のプロトコール(21)に従ってPCRと配列決定により確認した。
各実験のために細菌を凍結ストックから解凍し、トリプティック大豆寒天（TSA）プレートにストリークし、25℃で16～42時間培養した。MYb11およびMYb71の細菌培養物は、液体NGM中、28℃で一晩、振盪培養した。培養液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でOD600 = 0.5に調整した。このようにして、相対的な細菌量に対する実験操作の影響を推論するために必要な、実験処理全体にわたる同一の開始条件を確保した。
試験管内での補充
L-セリン（1714.1）、D-マンニトール（8883.1）およびL-スレオニン（T206.1）はCarl Roth社（ドイツ、カールスルーエ）から、GABA（A2129）はMerck社（ドイツ、ダルムシュタット）から購入し、最大可溶濃度に応じて1Mまたは0.5Mのストックとして水に溶解した。液体NGMには、それぞれのサプリメントを最終濃度10 mMで補充した。in vitroでのサプリメント添加アッセイでは、96ウェルプレート中の95 µLの液体NGMに、サプリメントの存在下または非存在下で、5 µLの細菌の単培養または共培養のいずれかを添加した。処理は、プレートのレイアウトに関して無作為に行われた。プレートをEpoch2 BioTekプレートリーダーで、807CPMで二重軌道振盪しながら28℃で24時間インキュベートした。標準的なOD測定では不可能な2つの菌株の区別が可能であるため、寒天培地にプレートアウトした培養サンプルのコロニー形成単位（CFU）数を定量化することで、細菌量の変化を評価した。この方法では、標準的なOD測定では不可能な、2つの菌株を区別することができるからである。このアプローチのために、それぞれの単独培養または共培養の各処理菌懸濁液の異なる希釈液7μLをTSAプレートにプレーティングした。プレートは25℃で保存し、24～48時間後にCFUをスコア化した。統計計算とプロットはRソフトウェア（バージョン4.1.3）を用いて行った。試験管内での CFU 測定ではすべて、Wilcoxon 符号順位検定（45）を用いて統計比較を行った。
インビボでの補充
すべての in vivo 実験には、Caenorhabditis Genetics Center（CGC）から入手した線虫 N2 株を用いた。線虫は大腸菌OP50を接種したNGMプレート上で、標準的な手順に従って20℃で維持した（50）。アッセイプレートは、L-セリンを0、10、100 mMの濃度でNGMに添加して調製した。なお、セリンは線虫の採餌行動に影響を与える可能性がある(51)。しかしながら、我々の概念実証研究にとって重要なことは、線虫の採食に関する多くの研究（我々自身の長期にわたる経験（52-54）を含む）のどれもが、線虫が混合細菌芝から異なる細菌株を区別して取り込む能力があることを示していないことである。従って、セリンによって誘発される線虫の行動の変化が、線虫の腸内の細菌株の相対的な存在量に変化を引き起こす可能性は低い。MYb11とMYb71の一晩培養をPBS中でOD600 = 2.0に調整した。30～40頭の同調した1齢幼虫（L1）を、125 µLのMYb11とMYb71のそれぞれの単独培養液または共培養液を添加したNGMプレート上で増殖させた。72時間後、200µLのピペットチップの円形の先端を、縁やワムシを避けて芝生に押し込むことにより、バクテリアの芝生をサンプリングした。得られたディスクを、ジルコニアビーズを加えた PBS 中 で、Bead Ruptor 96（Omni International）を用い、30 Hz で 3 分間ホモジナイズした。
CFU 数を評価するため、M9 バッファー＋0.025% Triton X-100 を用いてワムシをプレートから洗い落とし、5 回洗浄した後、5 mM テトラミソールでマヒさせ、(24)に記載されているようにワムシのポンピングを停止させた。ミミズは(24)に従って表面殺菌し、PBSで2回洗浄して残留漂白剤を除去した。ワムシを新しいチューブに移し、正確なワムシ数（～20）を測定し、PBSを最終容量400 µLになるように加えた。ワムシを沈降させ、100 µLの上清を回収した（上清コントロール）。ビーズラプター96で1 mmジルコニアビーズを用い、30 Hzで3分間、残りのPBS中でワムシをホモジナイズした。ホモジナイズしたワムシ、芝、上清をPBSで連続希釈し、TSAプレートにプレーティングした。25℃で最長48時間後、適切な希釈度でコロニーをスコア化し、ワムシあたりのCFUを算出した。各コロニー形成実験は 3 回独立に実施し、生物学的複製数を等しくした。データは各実験でプールされ、線虫の細菌コロニー形成に対するL-セリン補給の効果を評価するために、各実験をコントロールする混合モデルが用いられた。すべてのL-セリンin vitroおよびin vivo実験について、特に断りのない限り、統計的比較は一般化線形モデルを用いて行った。我々は、芝生上で利用可能なMYb11の割合と、宿主フィルタリングによる細菌割合の観察されたシフトの積として、ワーム中のMYb11の期待割合を計算した：

プロットと統計解析はR（バージョン4.1.3）で行い、Inkscape（バージョン1.1.2）で編集した。
結果
マイクロバイオームのメンバー種間で代謝ニッチが重複しているため、精密プレバイオティクスとしてユニークな取り込み化合物を使用することができない。
微生物群集における特定の細菌種の存在量を特異的に増加させる最も単純なアプローチは、ターゲットとなる細菌種のみが取り込み、他の細菌種は取り込まない化合物を群集に供給することである。したがって、これらの化合物は、それぞれの細菌種にとってユニークな代謝ニッチに対応する。我々はまず、このようなユニークな取り込み化合物が細菌群集に一般的に存在するかどうかを、線虫だけでなくヒトのコホートの細菌群集を用いて計算で検証した(30)。特定の細菌群集の各細菌種について、その細菌群集の他の細菌種が取り込むことのできない代謝物を取り込むことができるかどうかを評価し、そのような特異的取り込み化合物を持つ細菌群集の細菌種の割合を求めた（材料と方法を参照）。ヒトのコホートでは、細菌群集は平均26～34菌種で構成されていた（分位数25～75％）。このコミュニティサイズ内では、平均して5～20％の細菌種が、それらの細菌種を標的として使用できる可能性のある特異的取り込み化合物を保有していると推察された。より小さなコミュニティでは、最大50％の細菌種が、より大きなコミュニティでは、わずか5～10％の細菌種がユニークな取り込み化合物を持っていた（図1A）。線虫については、ヒトのコホートのように、多数のサンプルの菌種存在量情報と、代謝モデリングのための対応する細菌種のゲノム配列とのマッチングデータがない。しかし、線虫とその環境から分離された菌株や、人工的な最小線虫群集を用いて、線虫微生物叢におけるユニークな取り込み化合物の頻度を概算することができる。このように、線虫とその環境から単離された78菌種のサンプルにおいて、線虫由来のマイクロバイオームサンプルで観察される細菌群集の典型的なサイズである30菌種以上からなる群集（55）では、ユニークな取り込み化合物を持つ菌種は通常3-5％しか同定されなかった（図1B）。同様に、人工CeMbio線虫モデルマイクロバイオームコミュニティでは、ユニークな取り込み化合物は通常、6種までの細菌種のサブセットでしか検出できなかった（図1C）。
図1

図1 マイクロバイオームにおけるユニークな取り込み化合物を持つ菌種の頻度。(A)ヒト腸内細菌群集、(BおよびC)線虫細菌群集における、これまでに報告された線虫マイクロバイオームメンバー種のサブセットであるユニークな取り込み化合物を持つ種の割合。
したがって、上記で分析したような典型的なマイクロバイオームでは、少数の細菌種に対してのみユニークな取り込み化合物を同定できると予想され、特定の細菌種を標的とする化合物は、通常、複数の細菌種によって消費されると予想される。したがって、MYb11に対する高精度プレバイオティクスの同定では、まずMYbを標的としたプレバイオティクスの探索において、MYb11によってのみ特異的に取り込まれる可能性のある20化合物を検索から除外した（20化合物、表S2参照）。注目すべきことに、MYb11とMYb71は全取り込み化合物の大部分（85%）を共有しており、MYb11とMYb71に特異的な取り込み化合物はそれぞれ10%と5%に過ぎなかった（図2A）。
図2

図2 メタボリックモデリングによる精密プレバイオティクスの同定。(A）モデルMYb11とMYb71の全交換反応の重複。(B）MicrobiomeGS2におけるPseudomonas lurida MYb11（ピンク）とOchrobactrum vermis MYb71（緑）の群集FBA補充。4-ヒドロキシ安息香酸、D-マンニトール、GABA、グリセロール-3-リン酸、L-セリン、L-スレオニン、プトレシン、およびトレハロースを添加した場合のMYb11およびMYb71の相対存在量の予測値を点で示し、線は何も添加しない場合の相対存在量の予測値を示す。(C) BacArenaにおけるPseudomonas lurida MYb11（ピンク）とOchrobactrum vermis MYb71（緑）のインシリコサプリメント。10mMの4-ヒドロキシ安息香酸、D-マンニトール、GABA、グリセロール-3-リン酸、L-セリン、L-スレオニン、プトレシン、またはトレハロースを添加した場合（実線）、または無添加の場合（破線）のMYb11およびMYb71の予測成長曲線。(D）MYb11とMYb71の共同体において、異なる計算アプローチで予測されたプレバイオティクスの精度（最初の3列）、およびバイオログのエコプレートとバイオログのGN2プレート（24、27）での生育データ（最後の2列）の比較。完全な正方形は、代謝物がMYb11の精密プレバイオティクスとして予測された場合を表し、空白の正方形は、モデリングによってMYb71よりもMYb11の成長が増加しないと予測された場合を表す。Biologのデータでは、塗りつぶされた三角形はそれぞれの化合物の異化が観察された場合を表し、異化が観察されなかった場合は空白である。丸印がない場合は、Biologプレートで試験されなかった化合物を示す。
P. lurida MYb11を標的とする精密プレバイオティクスの計算による同定
P. lurida MYb11に対する精密プレバイオティクスを導き出すために、フラックスバランス解析のインプットとして代謝ネットワークを用い、FBAの基本的アプローチとは別に、2つの異なるコミュニティーモデリングアプローチを用いた。1つは個体ベースのモデリングアプローチを組み込んだBacArenaをベースとしたもので、もう1つはMicrobiomeGS2に実装されたいわゆるコミュニティFBAである。これら2つのモデリングアプローチは、その基礎となる仮定が異なる。BacArenaでは、2つの細菌は個々の代謝ネットワークによってモデル化され、フラックスは個々の細菌のバイオマスフラックスを最大化することによって予測される。一方、コミュニティFBAでは、個々の細菌種の代謝ネットワークが、両細菌種のバイオマス・フラックスの合計が最大化されるコミュニティ・モデルに統合される。したがって、BacArenaを使用する場合、種間の代謝相互作用は通常、ある種が別の種が代謝できる最終産物を分泌することから生じます。一方、コミュニティFBAでは、全成長の最適化は、細菌種が代謝フラックスを調整し、全体的な成長が最大化されることを前提としています。したがって、MYb11とMYb71がどの程度相互作用しているかは不明であるため、BacArenaにおける完全に個々に最適化された行動から、コミュニティ全体の成長を最大化するためのフラックスの絶対的な調整まで、種間の潜在的相互作用のスペクトルの両端をカバーする。
FBAを用いて、単一増殖においてMYb11の増殖を増加させる可能性のある29の化合物を同定した。コミュニティモデリングアプローチを用いると、コミュニティFBAではMYb71よりもMYb11の成長を増加させる81化合物が、BacArenaでは17化合物が同定された（図2D）。MYb11をサポートする化合物の中で特定の化合物クラスが濃縮されているかどうかを調べるため、3つの異なるシミュレーションタイプでHMDBアノテーション(46)に基づく濃縮を行った。その結果、MYb11の成長をサポートする化合物は脂肪酸に富んでいることがわかった（フィッシャーの正確検定P値=3.16×10-5）。
興味深いことに、群集モデルの一部であったときのモデルの成長ダイナミクス（図2B）は、個々の生物として扱ったときのモデルの成長ダイナミクス（図2C）と異なっていた。例えば、MYb71のバイオマス・フラックスは、群集モデル、すなわちモデルMYb11と結合したときの方がはるかに高かった。これは、群集全体のバイオマスが最大化される場合に、群集FBAを使用した場合の典型的な観察結果である。特に小さなコミュニティの場合、これはしばしば、最も効率的に成長媒体をバイオマスに変えて最も強く成長するコミュニティ・メンバーの一人につながり、他のコミュニティ・メンバーはほとんど成長しない。一方、BacArenaのシミュレーションでは、これらの化合物のほとんどが、単一成長における両種の成長を促進することが観察されたが、その効果はMYb71よりもMYb11の方が大きかった（図2C）。BacArenaもFBAを使用して細菌の成長をシミュレートしているが、MYb71よりもMYb11の成長を増加させるFBA予測化合物のサブセットのみが、実際にBacArenaアプローチによっても同定された（29のうち17）。その理由として考えられるのは、FBAアプローチでは菌種間の潜在的な相互作用が考慮されていないこと、そしてBacArenaでは、例えば細菌の位置や移動、細胞複製イベントなどを決定するための確率的要素が組み込まれているため、菌種間の増殖速度のわずかな違いは、これらの確率的イベントによってフィルタリングされてしまう可能性があることである。同定された化合物のうち、17化合物が3つのシミュレーションで共有された。このうち8種類については、MYb11による取り込みに関する情報もBiologプレートから入手でき、MYb11がそれらを消費できることが確認された（24, 27）（図2D）。このように、モデリングアプローチとBiologプレートからのデータのクロスリファレンスを組み合わせることで、実験的にテストする候補のリストを、最も一貫した結果を与えるものにかなり減らすことができた。宿主の寿命（56、57）や生理学（58）におけるこれらの化合物の役割、栄養化合物（24、59）、または宿主と微生物の相互作用に関与する化合物（58、60）に関する利用可能な文献情報に基づき、MYb11の存在量を特異的に増加させる精密プレバイオティクスとして、さらに実験的試験を行う4つの候補を選択した。
予測された精密プレバイオティクスの試験管内検証
概念実証として、予測された精密プレバイオティクス化合物のうち L-セリン、L-スレオニン、GABA、D-マンニトールの 4 種類について、MYb71 との共培養で MYb11 の増殖を特異的に増加させる能力を実験的に検証した。L-セリンは食餌性アミノ酸であり、栄養-薬剤-宿主-微生物の相互作用に関与しており(60)、宿主の寿命をサポートすることができる(57)。必須アミノ酸であるL-スレオニン(59)は、その異化物であるメチルグリオキサール（低量）を介して、宿主の寿命にプラスの効果をもたらすこともある(56)。GABAは細菌の産物であることを除けば、宿主のニューロンを保護する(58)。最後に、D-マンニトールは一般的に使用されている糖アルコールであり（24）、栄養化合物としての使用は宿主にとって安全な選択肢となる。
MYb11およびMYb71を単独培養および共培養し、5時間後（図S1）および24時間後に液体NGM中でin vitroの細菌増殖を測定した。添加したサプリメントや単独培養または共培養とは無関係に、MYb11およびMYb71は、24時間後に10 mM L-セリン、L-スレオニン、GABA、およびD-マンニトールを補充すると、単独培養および共培養で増殖が増加した（図3A；表S6～S9）。さらに、細菌増殖を定量化するために、蛍光標識株を用いた。L-セリン（図3B；表S10）、L-スレオニン（図3C；表S12）、GABA（図3D；表S13）、およびD-マンニトール（図3E；表S14）の4つの化合物の存在下（10mM）または非存在下（0mM）の液体培養で24時間増殖させた後、単培養および共培養のCFUをプレーティングし、計数した。MYb11およびMYb71は、L-セリンおよびL-スレオニンを添加した場合、無添加の場合と比較して単培養でのコロニー数が増加した（図3BおよびC、ウィルコクソンの符号順位検定、それぞれP = 0.001、P = 0.006、P = 0.007、P = 0.032）。一方、D-マンニトールはMYb11の増殖にもMYb71の増殖にも影響を与えなかった（図3E、ウィルコクソンの符号順位検定、P = 0.259、P = 0.661、それぞれ）。このように、セリンとスレオニンは共培養で MYb11 の成長を無補 足の単細胞増殖に対して促進し、マンニトールと GABA は共培養で MYb11 の成長を無補 足の単細胞増殖に対して変化させませんでしたが、4 種 類の化合物すべてが試験管内で MYb71 よりも共培養の MYb11 の成長を 特異的に促進し、計算による予測を裏付けました（図 3B～E、 ウィルコクソンの符号付順位検定、それぞれ P = 0.25、P = 0.661）。図3B～E、Wilcoxon符号順位検定、P = 6.87E-06, P < 0.001, P = 7.15E-06, P = 7.07E-06、それぞれ）（表S11も参照）。
図3

図3 Pseudomonas lurida MYb11およびOchrobactrum vermis MYb71の単培養および共培養における、4種類のサプリメントを添加した24時間のin vitro増殖。(B、C、D、E）MYb11（左）とMYb71（右）の単培養、または共培養（中央）のコロニー形成単位（CFU/µL）。中央値を太い横線、四分位範囲をボックス、外側の四分位範囲をひげ、各レプリケートをドットで表した箱ひげ図が示されている。各レプリケートの CFU 数データは、対応する非補足対照処理（対照および実験データは表 S10, S12～S14 に記載）の CFU 数データの中央値を引くことで正規化した。黒色のアスタリスクは、サプリメント添加群と非添加群の中央値間の統計的比較を示し、灰色のアスタリスクは、MYb11とMYb71のサプリメント添加群の中央値間の統計的比較を示す。
in vitroにおけるL-セリン補給の濃度依存的効果
統計解析の結果、L-セリンはin vitroで検証された化合物の中で最も有望な精密プレバイオティクスであることが示唆された。MYb11の濃縮に最適な投与量を決定するため、濃度勾配を設けてin vitroでの補充実験を繰り返した。全体として、L-セリン濃度の上昇に伴い、MYb11の増殖およびMYb71の単培養における10mMおよび100mMの経時的増殖が増加した（図4A；表S15）。同じ濃度勾配での補充による成長を定量化すると（図4B；表S16）、1 mMから始めてもMYb11の割合（GLM、P = 0.778）、MYb71の存在量（GLM、P = 0.69）に有意な影響はなかった。しかし、10 mMを添加するとMYb11が濃縮され（GLM、P < 0.001）、MYb11とMYb71の共培養における割合に有意な差が認められた（GLM、P = 5.77E-07）。MYb11の濃縮（GLM、P = 0.004）、MYb11とMYb71の割合の有意差（GLM、P = 7.93E-05）など、100 mMでも本質的に同じ結果が得られた。(表S17も参照）。
図4

図4 in vitroでの細菌増殖に対するL-セリン添加の濃度依存的効果 （A）細菌増殖は、液体線虫増殖培地（NGM）中で、0、1、10、100 mMのL-セリンを添加した各菌種の単培養における光学密度（OD600）に基づいて測定した。点は個々の複製を示し、線は平均を示す、n = 12。(B）液体NGM中で、それぞれのサプリメント濃度で24時間培養した共培養株におけるMYb11（ピンク）とMYb71（緑）の相対存在量を、蛍光標識細菌のコロニー数に基づいて示した。中央値を太い横線、四分位範囲をボックス、外側の四分位範囲をひげ、各レプリケートを点で表した箱ひげ図が示されている。各レプリケートの細菌量は、各細菌株について対応する非補足コントロール（0 mM）の中央値を引くことで正規化した；それぞれの中央値は破線で示されている。統計的差異はGLMによって決定し、アスタリスクで示した（*** P < 0.001）。黒いアスタリスクは、補充した中央値と補充していない中央値の統計的比較を示し、灰色のアスタリスクは、MYb11とMYb71の補充した中央値の統計的比較を示す。
セリン補充は線虫の細菌コロニー形成を変化させる
最後に、固形増殖培地にL-セリンを補充することで、宿主である線虫の細菌比率が変化するかどうかを試験した。L1幼虫の同調集団を、0、10、100mMのL-セリンを添加した固形NGMプレート上のMYb11とMYb71のバクテリアローンにピペッティングした。72時間後、成虫を回収して細菌の割合を定量した。10mMのL-セリンを添加しても、非添加培地と比較して、ワムシの共培養におけるMYb11の割合は変わらなかった（GLM、P = 0.459、図5A左パネル）。しかし、L-セリンを100 mM補充すると、非補足培地と比較して、ワムシの細菌群集におけるMYb11の割合が増加した（GLM、P < 0.001、図5A右パネル）。次に、宿主のバクテリアの割合に対するサプリメントの効果が、単に芝生上で利用可能なバクテリアの割合（すなわち食餌）の変化を反映しているかどうかを調べた。芝生上のMYb11の相対存在量は、10 mMの補給では非補給と比較して変化しなかった（GLM、P = 0.61、図5A、左パネル）。しかし、MYb11の相対存在量は、非補充培地では約60％であったが、100 mMのL-セリン補給で約75％に増加した（GLM、P < 0.002、図5B、右パネル）。100mMのセリンで観察されたワムシ中のMYb11の割合は、MYb71と比較して、芝生中の割合、ひいてはコロニー形成確率から予想されるよりも有意に高かった（カイ二乗検定、Χ2 = 10.244, df = 1, P = 0.0013；材料と方法を参照）。このことから、セリンの供給は、芝生上で観察される濃縮とは別に、宿主中のMYb11を濃縮し、セリンによってMYb11が宿主中のMYb71との競合における成長の不利を克服できることが示唆される（表S18およびS19も参照）。
図5

図5 L-セリンの補充は線虫の細菌量を変化させる。(A）共培養を接種し、10 mM L-セリン（左パネル）または100 mM L-セリン（右パネル）を補充した固形NGMプレートから成虫を回収した。虫を洗浄し、表面殺菌して残留細菌を除去した後、緩衝液中でホモジナイズした。細菌の割合はコロニー数に基づいて定量した。(B）10mM（左パネル）または100mMのL-セリン（右パネル）を添加したNGMプレートから、標準サイズの寒天ディスクを切り取ることにより、バクテリアローンをサンプリングした。ディスクを緩衝液中でホモジナイズし、CFUを定量した。(A、B）中央値を太い横線、四分位範囲をボックス、外側の四分位範囲をひげ、各生物学的複製を記号で表した箱ひげ図である。各レプリケートと各細菌について、実験処理からの細菌量は、破線で示したように、対応する非補足対照（0 mM）の中央値を引くことで正規化した。統計的差異はGLMによって決定され、アスタリスクで示され（*** P < 0.001, **P < 0.01）、サプリメント添加と非添加の中央値間の比較を示す。
考察
マイクロバイオームの構成に影響を及ぼす要因は数多く知られているが［例えば、食事パターン、生活習慣、薬物療法(61)］、これらの変化を引き起こすメカニズムは完全には解明されていないことが多く、また多くの細菌種が影響を受けることが多い。我々は、マイクロバイオームの組成を調節する最も効果的な方法は、精密プレバイオティクスを用いて、健康に有益な効果を持つ既存の細菌種の存在量を調節または濃縮することであると提案している。このような精密プレバイオティクスを同定する直接的なアプローチは、標的細菌種に特異的に取り込まれる化合物を提供することであろう。しかし、線虫とヒトのマイクロバイオームデータの解析を通じて、そのようなユニークな取り込み化合物は、通常、微生物群集の数種にしか存在せず、特に大規模な群集ではそのような化合物は全く存在しないことを示すことができた。したがって、典型的なマイクロバイオームでは、複数の生物種に取り込まれる可能性のある化合物から、精密なプレバイオティクスを同定しなければならない。このような化合物を同定するために、線虫マイクロバイオームの2つの細菌、O. vermis MYb71と宿主を保護するP. lurida MYb11のゲノムスケールの代謝ネットワークと制約ベースのモデリングを併用し、MYb11の増殖を特異的に増加させる化合物を同定した。HMDBアノテーション(46)を用いると、脂肪酸がMYb11の予測成長支持化合物として濃縮されていることがわかった。これは、シュードモナス属の細菌がこれらの化合物を好むという以前の観察結果(62)と一致している。3つのシミュレーションアプローチすべてで同定された化合物を考慮し、Biologのデータと照合した結果、4-ヒドロキシ安息香酸、D-マンニトール、γ-アミノ酪酸（GABA）、グリセロール-3-リン酸、L-セリン、トレハロース、L-スレオニン、プトレシンがMYb11の精密プレバイオティクスになる可能性があることが明らかになった。われわれはこれらの候補化合物のうち、L-セリン、L-スレオニン、D-マンニトール、GABAの4つを試験管内で実験的に試験し、MYb11の増殖に特異的にプラスの効果を示すことを確認した。線虫の宿主系に移ると、宿主に両方の細菌種をコロニー形成させた場合、L-セリンはin vivoでもMYb11の存在量を選択的に高めることができることを示すことができた。興味深いことに、MYb11の濃縮にはバッチ培養では10mMのL-セリンで十分であったが、宿主を用いた増殖実験では100mMが必要であった。このことは、バッチ増殖と寒天培地での増殖とでは、L-セリンに対する細菌の取り込み速度、あるいは一般的な細菌の増殖に違いがあることを示唆している。さらに、MYb11は、芝生での存在量が非常に低いにもかかわらず、MYb71と同レベルまでワムシに強く濃縮されたが、L-セリンを供給すると、この濃縮はさらに強くなった。このように、制約に基づく微生物群集モデリングアプローチが、精密プレバイオティクスを用いた標的マイクロバイオーム療法の将来の開発にとって有効なツールであることが、今回の原理実証研究によって実証された。
セリンとスレオニンが宿主および／またはそのマイクロバイオームに及ぼす影響については、文献にも記載されている。例えば、スレオニンは宿主にとって必須アミノ酸である(59)。スレオニン（63）とセリン（57）を補充した場合にも、宿主の長寿効果が示されている。一方、化学療法剤である5-フルオロ2′デオキシウリジン（60）と一緒に補充した場合、食餌性セリンは細菌の代謝に作用して宿主の体力を低下させた。さらに、セリンはマウスの腸内で大腸菌LF82の増殖を促進することから（64）、この化合物が複数の菌種の存在量を変化させる可能性が示された。これと同様に、MYb71の増殖にもセリンの影響が観察されたが、MYb11を集団で増殖させた場合には、MYb71の方がより強かった。
栄養補助食品でマイクロバイオームを特異的に標的とするための重要な課題のひとつは、宿主によるサプリメントの取り込みや代謝を防ぐことである(65)。難消化性炭水化物のサプリメント（66）や、消化管を通過する間に溶ける化合物でサプリメントをコーティングするなど、バイオアベイラビリティを制限するための様々なアプローチが開発されている（67-69）。さらに、セリンの場合、サプリメントの濃度依存的効果の分析で示されたように、放出される化合物の特定の濃度と腸内での経時的安定性をコントロールする必要があるかもしれない。細菌側からは、Biologアッセイによって、MYb11がセリンを異化する能力を持つことが示された（図2D）。しかし、Biologプレートで使用されている具体的な濃度や、その濃度に依存していると思われる輸送のメカニズムは不明である。宿主側からは、宿主環境中の濃度を比較的一定に保つため、あるいは通常の濃度から逸脱させるために、ナノテクノロジー（70）、遅延放出、その他の薬物送達技術（71、72）などの高度な製剤が採用される可能性がある。
今回の計算と実験を組み合わせたアプローチは、精密プレバイオティクスの同定を目指した今後の研究の青写真となりうるが、それでもなお、いくつかの要因を考慮しなければならない。われわれが示したように、群集の中で1つの生物種だけに取り込まれる化合物を同定することは、ほぼ不可能である。この点は、様々な宿主に存在する数多くの異なる種を考えれば明らかである。例えば、線虫の合成細菌群集CeMbio（24）には12種のメンバーがいるが、ヒトに関連する細菌群集AGORAには800種以上のメンバーがいる(34)。したがって、重要な次のステップは、我々のアプローチをより複雑なコミュニティにスケールアップすることである。これは、すでに検出され配列決定されている数百から数千の細菌種を手作業で詳細に再構築することが事実上不可能なヒト腸内細菌叢の典型的な状況に似ている。さらに、ミミズの生理をヒトの生理と直接比較することはできないため、このアプローチの有効性と効果をより詳細に研究する必要がある。現時点では、様々な管轄区域における規制の複雑さ（例えば、栄養補給と投薬の定義、安全性の懸念）も過小評価すべきではない(74)。加えて、我々が用いたモデリングアプローチには多くの基礎的仮定があるが、そのおかげで実験的試験の候補となる代謝物をかなり絞り込むことができた。最後に、サプリメントを摂取した代謝産物が宿主であるミミズに及ぼす潜在的な副作用については考慮しておらず、また、例えばミミズの腸内でサプリメントを特異的に放出させるなど、投与方法の最適化も行っていない。これらすべてを考慮した結果、マイクロバイオームを調節するための標的サプリメント戦略のインシリコ設計は、実現可能であるだけでなく、将来のマイクロバイオームに基づく治療法の開発に有望であることが示された。
謝辞
共同研究センター「メタオーガニズムの起源と機能」CRC1182、サブプロジェクトA1におけるドイツ研究財団の支援をC.K.、K.D.、H.S.に感謝する、 また、C.K.はドイツ教育研究省（E:Med iTREAT、支援コード01ZX1902A）の支援を受けた。G.M.はCRC1182のYoung Investigator Awardによる支援を受けた。R.D.はDeutscher Akademischer Austauschdienst（ドイツ学術交流会）の短期研究助成による支援を受けた。また著者らは、NIH助成金DP2DK116645、NASA助成金80NSSC22K0250、およびJGI/DOE助成金CSP-503338（すべてB.S.S.に）による資金援助にも謝意を表する。
本研究の一部は、キール大学コンピューティングセンターのハイパフォーマンス・コンピューティング・リソースを利用した。線虫N2は、NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)の助成を受けたCaenorhabditis Genetics Center (CGC; https://cgc.umn.edu/)から提供された。
補足資料
補足図 - spectrum.01144-23-s0001.docx
図S1およびS2。
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補足表 - spectrum.01144-23-s0002.xlsx
表S1-S20。
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参考文献
1.
Kamada N, Chen GY, Inohara N, Núñez G. 2013. 腸内細菌叢による病原体と病原体の制御。Nat Immunol 14:685-690.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
2.
Zheng D, Liwinski T, Elinav E. 2020. 健康と病気における微生物叢と免疫の相互作用。Cell Res 30:492-506.
引用文献へ
相互作用
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
3.
Rowland I, Gibson G, Heinken A, Scott K, Swann J, Thiele I, Tuohy K. 2018. 腸内細菌叢の機能：栄養素およびその他の食品成分の代謝。Eur J Nutr 57:1-24.
引用文献へ
相互参照
PubMed
国際医療福祉大学
Google Scholar
4.
Clarke G, Sandhu KV, Griffin BT, Dinan TG, Cryan JF, Hyland NP. 2019. 腸内反応：ゼノバイオティクス-マイクロバイオーム相互作用を分解する。Pharmacol Rev 71:198-224.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
5.
Weersma RK, Zhernakova A, Fu J. 2020. 薬剤と腸内細菌叢の相互作用。Gut 69:1510-1519.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
6.
Kolodny O, Schulenburg H. 2020. 微生物が介在する可塑性は、いくつかの異なる時間スケールで宿主の進化を方向づける。Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 375:20190589.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
筑波大学
Google Scholar
7.
Henry LP, Bruijning M, Forsberg SKG, Ayroles JF. 2021. マイクロバイオームは宿主の進化の可能性を広げる。Nat Commun 12:5141.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
グーグル奨学生
8.
Liu H, Brettell LE, Qiu Z, Singh BK. 2020. 微生物が介在する植物のストレス抵抗性。Trends Plant Sci 25:733-743.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際農林水産業学会
Google Scholar
9.
Hou K, Wu Z-X, Chen X-Y, Wang J-Q, Zhang D, Xiao C, Zhu D, Koya JB, Wei L, Li J, Chen Z-S. 2022. 健康と疾患における微生物叢。Signal Transduct Target Ther 7:135.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
Google Scholar
10.
デュラックJ、リンチSV。2019. 腸内マイクロバイオーム：疾患との関係と治療の機会。J Exp Med 216:20-40.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
11.
Karl JP, Hatch AM, Arcidiacono SM, Pearce SC, Pantoja-Feliciano IG, Doherty LA, Soares JW. 2018. 心理的、環境的、身体的ストレス因子が腸内細菌叢に及ぼす影響。Front Microbiol 9:2013.
引用文献へ
Crossref
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
12.
Brugman S, Ikeda-Ohtsubo W, Braber S, Folkerts G, Pieterse CMJ, Bakker PAHM. 2018. A comparative review on microbiota manipulation: Lessons from fish, plants, livestock, and human research. Front Nutr 5:80.
引用文献へ
論文
PubMed
ISI社
Google Scholar
13.
モールズL、オタエギD. 2020。微生物叢の進化とヒトの健康に対する食事の影響。食事は微生物叢を調節するための適切なツールなのか？栄養素12:1654。
引用文献へ
相互参照
パブコメ
グーグル奨学生
14.
ソルバラMT、パマーEG。2022. 微生物に基づく治療法。Nat Rev Microbiol 20:365-380.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
15.
Merrick B, Allen L, Masirah M Zain N, Forbes B, Shawcross DL, Goldenberg SD. 2020. 糞便微生物移植の規制、リスク、安全性。Infect Prev Pract 2:100069.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
Google Scholar
16.
Park S-Y, Seo GS. 2021. 糞便微生物叢移植：それは安全か？Clin Endosc 54:157-160.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI
Google Scholar
17.
Guarino MPL、Altomare A、Emerenziani S、ディローザC、Ribolsi M、Balestrieri P、Iovino P、Rocchi G、Cicala M. 2020。プレバイオティクスの作用機序と成人における胃腸障害への影響。Nutrients 12:1037.

Crossref
PubMed
Google Scholar
18.
Davani-Davari D, Negahdaripour M, Karimzadeh I, Seifan M, Mohkam M, Masoumi SJ, Berenjian A, Ghasemi Y. 2019. プレバイオティクス：定義、種類、供給源、メカニズム、臨床応用。Foods 8:92.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
19.
Maldonado-Gómez MX, Martínez I, Bottacini F, O'Callaghan A, Ventura M, van Sinderen D, Hillmann B, Vangay P, Knights D, Hutkins RW, Walter J. 2016. ヒト腸内におけるビフィドバクテリウム・ロンガムAH1206の安定した生着は、常在細菌叢の個体差に依存する。Cell Host Microbe 20:515-526.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
20.
中国における商業養殖プロバイオティクスに使用されるバチルス菌の病原性遺伝子の有病率と抗生物質感受性。中国における商業養殖プロバイオティクスに使用されるバチルス菌の病原性遺伝子の有病率と抗生物質感受性。Aquac Rep 21:100784.
引用文献へ
クロスリファレンス
Google Scholar
21.
Kissoyan KAB, Peters L, Giez C, Michels J, Pees B, Hamerich IK, Schulenburg H, Dierking K. 2022. 宿主の生理機能に対する天然微生物叢の保護効果を探る。Front Cell Infect Microbiol 12:775728.

クロスレフ
PubMed
国際微生物学連合
Google Scholar
22.
Dirksen P, Marsh SA, Braker I, Heitland N, Wagner S, Nakad R, Mader S, Petersen C, Kowallik V, Rosenstiel P, Félix M-A, Schulenburg H. 2016. 線虫Caenorhabditis elegansのネイティブマイクロバイオーム：新しい宿主マイクロバイオームモデルへの入り口。BMC Biol 14:38.

Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
23.
Zhang R, Hou A. 2013. 線虫における宿主-微生物相互作用. ISRN Microbiol 2013:356451.
引用文献へ
論文
パブコメ
Google Scholar
24.
Dirksen P, Assié A, Zimmermann J, Zhang F, Tietje A-M, Marsh SA, Félix M-A, Shapira M, Kaleta C, Schulenburg H, Samuel BS. 2020. CeMbio-線虫マイクロバイオームリソース。G3 (Bethesda):3025-3039.

クロスレフ
PubMed
Google Scholar
25.
Kissoyan KAB, Drechsler M, Stange E-L, Zimmermann J, Kaleta C, Bode HB, Dierking K. 2019. 線虫の自然微生物叢は、ビスコシン群の環状リポペプチドの産生を介して感染から身を守る。Curr Biol 29:1030-1037.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
26.
Zhang F, Weckhorst JL, Assié A, Hosea C, Ayoub CA, Khodakova AS, Cabrera ML, Vidal Vilchis D, Félix M-A, Samuel BS. 2021. 自然な遺伝的変異が線虫腸内のマイクロバイオーム選択を促進する。Curr Biol 31:2603-2618.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
27.
Zimmermann J, Obeng N, Yang W, Pees B, Petersen C, Waschina S, Kissoyan KA, Aidley J, Hoeppner MP, Bunk B, Spröer C, Leippe M, Dierking K, Kaleta C, Schulenburg H. 2020. モデル線虫Caenorhabditis elegansの常在細菌叢に含まれる機能的レパートリー。ISME J 14:26-38.

クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
28.
Bordbar A, Monk JM, King ZA, Palsson BO. 2014. 制約に基づくモデルは、代謝と関連する細胞機能を予測する。Nat Rev Genet 15:107-120.

Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
29.
Gottstein W, Olivier BG, Bruggeman FJ, Teusink B. 2016. 制約に基づく化学量論的モデリング（単一生物から微生物群集まで）。J R Soc Interface 13:20160627.
引用文献へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
30.
Pryor R, Norvaisas P, Marinos G, Best L, Thingholm LB, Quintaneiro LM, De Haes W, Esser D, Waschina S, Lujan C, Smith RL, Scott TA, Martinez-Martinez D, Woodward O, Bryson K, Laudes M, Lieb W, Houtkooper RH, Franke A, Temmerman L, Bjedov I, Cochemé HM, Kaleta C, Cabreiro F. 2019. 宿主-微生物-薬剤-栄養素スクリーニングにより、メトホルミン療法の細菌エフェクターが同定された。Cell 178:1299-1312.

Crossref
PubMed
国際医学総合研究所
Google Scholar
31.
Ng RH, Lee JW, Baloni P, Diener C, Heath JR, Su Y. 2022. 代謝モデルの制約に基づく再構築と解析：オープンソースのPythonツールとがんへの応用。Front Oncol 12:914594.
引用文献へ
Crossref
パブコメ
ISI社
Google Scholar
32.
2021年 gapseq: 細菌代謝経路の情報による予測と正確な代謝モデルの再構築。Genome Biol 22:81.

クロスリファレンス
PubMed
ISIデータベース
Google Scholar
33.
Machado D, Andrejev S, Tramontano M, Patil KR. 2018. 微生物種と群集のゲノムスケール代謝モデルの高速自動再構築。Nucleic Acids Res 46:7542-7553.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際標準化機構(ISI)
Google Scholar
34.
Magnúsdóttir S, Heinken A, Kutt L, Ravcheev DA, Bauer E, Noronha A, Greenhalgh K, Jäger C, Baginska J, Wilmes P, Fleming RMT, Thiele I. 2017. ヒト腸内細菌叢の773メンバーのゲノムスケール代謝再構築の生成。Nat Biotechnol 35:81-89.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
35.
Marinos G, Kaleta C, Waschina S. 2020. ゲノムスケール代謝モデルのための栄養入力の定義：ロードマップ。PLoS One 15:e0236890.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
Google Scholar
36.
Bauer E, Zimmermann J, Baldini F, Thiele I, Kaleta C. 2017. BacArena: 複雑な群集における異種微生物の個体ベースの代謝モデリング。PLoS Comput Biol 13:e1005544.

Crossref
PubMed
ISI（独立行政法人産業技術総合研究所
Google Scholar
37.
Heinken A, Thiele I. 2022. 微生物群集の効率的で扱いやすいモデリング。Bioinformatics 38:2367-2368.
引用文献へ
引用
パブコメ
ISI社
グーグル
38.
Baldini F, Hertel J, Sandt E, Thinnes CC, Neuberger-Castillo L, Pavelka L, Betsou F, Krüger R, Thiele I, NCER-PD Consortium. 2020. パーキンソン病に関連した腸内細菌叢の変化は、代謝機能の疾患関連変化を予測する。BMC Biol 18:62.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
39.
Aden K, Rehman A, Waschina S, Pan W-H, Walker A, Lucio M, Nunez AM, Bharti R, Zimmerman J, Bethge J, Schulte B, Schulte D, Franke A, Nikolaus S, Schroeder JO, Vandeputte D, Raes J, Szymczak S, Waetzig GH, Zeuner R, Schmitt-Kopplin P, Kaleta C, Schreiber S, Rosenstiel P. 2019. 腸内微生物の代謝機能は、炎症性腸疾患患者における腫瘍壊死因子拮抗薬の有効性と関連する。Gastroenterology 157:1279–1292.

クロスレフ
PubMed
国際医療福祉大学
Google Scholar
40.
Orth JD, Thiele I, Palsson BØ. 2010. フラックスバランス解析とは何か？Nat Biotechnol 28:245-248.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
41.
Gelius-Dietrich G, Desouki AA, Fritzemeier CJ, Lercher MJ. 2013年. sybil - 効率的な制約ベースのモデリング in R. BMC Syst Biol 7:125.

クロスリファレンス
論文リスト
ISI（国際標準化機構
Google Scholar
42.
Zimmermann J, Piecyk A, Sieber M, Petersen C, Johnke J, Moitinho-Silva L, Künzel S, Bluhm L, Traulsen A, Kaleta C, Schulenburg H. 2023. 線虫の一生を通じたマイクロバイオーム構築の過程で、腸関連機能が優先される。
引用文献へ
引用
Google Scholar
43.
Effenberger M, Reider S, Waschina S, Bronowski C, Enrich B, Adolph TE, Koch R, Moschen AR, Rosenstiel P, Aden K, Tilg H. 2021. 微生物による酪酸合成は、IBD患者におけるアザチオプリンの治療効果を示す。J Crohns Colitis 15:88-98.
引用文献へ
クロス
PubMed
グーグル奨学生
44.
Heinken A, Sahoo S, Fleming RMT, Thiele I. 2013年。哺乳類腸内における宿主-微生物代謝共生のシステムレベルでの特徴づけ。Gut Microbes 4:28-40.
引用文献へ
論文
パブコメ
ISI研究所
グーグル
45.
ウィルコクソン F. 1945. 順位法による個体比較。Biometrics Bulletin 1:80.

Crossref
Google Scholar
46.
Wishart DS, Guo A, Oler E, Wang F, Anjum A, Peters H, Dizon R, Sayeeda Z, Tian S, Lee BL, et al. HMDB 5.0：2022年のヒトメタボロームデータベース。Nucleic Acids Res 50:D622-D631.

クロスリファレンス
PubMed
ISIデータベース
Google Scholar
47.
Wickham H, Averick M, Bryan J, Chang W, McGowan L, François R, Grolemund G, Hayes A, Henry L, Hester J, Kuhn M, Pedersen T, Miller E, Bache S, Müller K, Ooms J, Robinson D, Seidel D, Spinu V, Takahashi K, Vaughan D, Wilke C, Woo K, Yutani H. 2019. tidyverseへようこそ。J Open Source Softw4:1686.
引用へ
クロスリファレンス
グーグル・スカラー
48.
Wickham H. 2016. ggplot2: elegant graphics for data analysis. Springer, Cham. http://link.springer.com/10.1007/978-3-319-24277-4.
引用文献へ
Crossref
グーグル・スカラー
49.
Wiles TJ, Wall ES, Schlomann BH, Hay EA, Parthasarathy R, Guillemin K. 2018. mBio 9:e01877-18.

Crossref
PubMed
グーグル奨学生
50.
Stiernagle T. 2006. 線虫の維持。WormBook:1-11.
引用文献へ
相互参照
PubMed
Google Scholar
51.
d-セリンとd-アラニンはNMDA受容体を介して適応的採餌行動を制御する。J Neurosci 40:7531-7544.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
国際標準化機構
グーグル
52.
Hasshoff M, Böhnisch C, Tonn D, Hasert B, Schulenburg H. 2007. このような研究は、生物学的見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から行われている。FASEB J 21:1801-1812.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
53.
Nakad R, Snoek LB, Yang W, Ellendt S, Schneider F, Mohr TG, Rösingh L, Masche AC, Rosenstiel PC, Dierking K, Kammenga JE, Schulenburg H. 2016. 単一の遺伝子、線虫神経ペプチド受容体遺伝子npr-1によって引き起こされる無脊椎動物の対照的な免疫防御行動。BMC Genomics 17:280.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
ISI社
Google Scholar
54.
Schulenburg H, Müller S. 2004. 寄生虫学128:33-433: Bacillus thuringiensisに対するCaenorhabditis elegansの反応における自然変異。Parasitology 128:433-443.
引用文献へ
クロスレフ
PubMed
国際生物工学会
グーグル
55.
Johnke J, Dirksen P, Schulenburg H. 2020. C.エレガンス本来のマイクロバイオームの群集形成は、時間、基質、個々の細菌分類群に影響される。Environ Microbiol 22:1265-1279.
引用文献へ
相互参照
PubMed
ISI社
グーグル
56.
Ravichandran M, Priebe S, Grigolon G, Rozanov L, Groth M, Laube B, Guthke R, Platzer M, Zarse K, Ristow M. 2018. L-スレオニンの異化を阻害すると、メチルグリオキサールを介したプロテオホルミシスにより健康寿命が促進される。Cell Metab 27:914-925.

Crossref
PubMed
国際アイソトープ学会
Google Scholar
57.
Liu YJ, Janssens GE, McIntyre RL, Molenaars M, Kamble R, Gao AW, Jongejan A, Weeghel M van, MacInnes AW, Houtkooper RH. 2019. グリシンはメチオニンサイクル依存的に線虫の長寿を促進する。PLoS Genet 15:e1007633.

クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
58.
ウルティアA、ガルシア-アングーロVA、フエンテスA、カネオM、レギュM、ウルキーザS、デルガドSE、ウガルデJ、ブルディッソP、カリクストA。細菌が産生する代謝産物が線虫の神経細胞を変性から守る。PLoS Biol 18:e3000638.

Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
59.
Zečić A, Dhondt I, Braeckman BP. 2019. 線虫の栄養要求性。Genes Nutr 14:15.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
60.
Ke W, Saba JA, Yao C-H, Hilzendeger MA, Drangowska-Way A, Joshi C, Mony VK, Benjamin SB, Zhang S, Locasale J, Patti GJ, Lewis N, O'Rourke EJ. 2020. 食餌性セリン-微生物叢相互作用は、薬物変換を変えることなく化学療法毒性を増強する。Nat Commun 11:2587.

Crossref
PubMed
グーグル奨学生
61.
Quigley EMM, Gajula P. 2020. マイクロバイオーム制御における最近の進歩。F1000Res 9:F1000 Faculty Rev-46.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
グーグル奨学生
62.
Stanier RY, Palleroni NJ, Doudoroff M. 1966. 好気性シュードモナド：分類学的研究。J Gen Microbiol 43:159-271.
引用文献へ
相互参照
PubMed
グーグル奨学生
63.
Kim J, Jo Y, Cho D, Ryu D. 2022. L-スレオニンは線虫のフェリチン依存性フェロプトーシス阻害を促進することで健康寿命を延ばす。Nat Commun 13:6554.
引用文献へ
引用文献
PubMed
グーグル奨学生
64.
北本聡、Alteri CJ、Rodrigues M、長尾-北本秀樹、杉原和彦、Himpsl SD、Bazzi M、三好正樹、西岡孝明、林 彰他、2020年。食餌性L-セリンは、炎症腸内細菌科細菌に競争上の優位性を与える。Nat Microbiol 5:116-125.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
グーグル奨学生
65.
孫Q、ベガNM、セルバンテスB、マンキューソCP、マオN、テイラーMN、コリンズJJ、カリルAS、ゴアJ、ルーTK。2022. 腸内細菌叢の改変による栄養ニッチと宿主防御の強化。Mol Syst Biol 18:e9933.
引用文献へ
論文
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
66.
Lee HL, Shen H, Hwang IY, Ling H, Yew WS, Lee YS, Chang MW. 2018. in situ腸内マイクロバイオーム操作のための標的アプローチ。Genes (Basel) 9:351.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI研究所
グーグル
67.
Philip AK, Philip B. 2010. 大腸を標的とした薬物送達システム：一次および新規アプローチに関する総説。Oman Med J 25:79-87.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
グーグル奨学生
68.
Naeem M, Awan UA, Subhan F, Cao J, Hlaing SP, Lee J, Im E, Jung Y, Yoo J-W. 2020. 大腸を標的としたナノ薬物送達システムの進歩：課題と解決策。Arch Pharm Res 43:153-169.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
69.
Fangmann D, Theismann E-M, Türk K, Schulte DM, Relling I, Hartmann K, Keppler JK, Knipp J-R, Rehman A, Heinsen F-A, Franke A, Lenk L, Freitag-Wolf S, Appel E, Gorb S, Brenner C, Seegert D, Waetzig GH, Rosenstiel P, Schreiber S, Schwarz K, Laudes M. 2018. マイクロカプセル化遅延放出ナイアシンによる標的マイクロバイオーム介入は、ヒトのインスリン感受性に有益な影響を及ぼす。Diabetes Care 41:398-405.
引用文献へ
相互参照
PubMed
ISI研究所
グーグル
70.
Cao S-J, Xu S, Wang H-M, Ling Y, Dong J, Xia R-D, Sun X-H. 2019. Nanoparticles: Oral delivery for protein and peptide drugs. AAPS PharmSciTech 20:190.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
71.
Vargason AM, Anselmo AC, Mitragotri S. 2021. 商業的薬物送達技術の進化。Nat Biomed Eng 5:951-967.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
グーグル奨学生
72.
2020年。先進的ドラッグデリバリーの2020年とその先：未来への展望。Adv Drug Deliv Rev 158:4-16.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
73.
Singal AG, Higgins PDR, Waljee AK. 2014. A primer on effectiveness and efficacy trials. Clin Transl Gastroenterol 5:e45.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
74.
Dwyer JT, Coates PM, Smith MJ. 2018. 栄養補助食品：規制上の課題と研究資源。Nutrients 10:41.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
Google Scholar
75.
Krawczak M, Nikolaus S, von Eberstein H, Croucher PJP, El Mokhtari NE, Schreiber S. 2006. PopGen：複雑な遺伝子型-表現型関係の解析のための患者および対照の集団ベースのリクルート。Community Genet 9:55-61.
引用文献へ
引用文献
PubMed
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